転写因子mitf抑制作用を...

転写因子MITF抑制作用を

有するメラニン色素抑制剤

秋田大学教育文化学部

生活者科学講座

池本敦

メラニン色素産生抑制機能を有する成分の探索

① チロシナーゼ阻害作用

② 抗酸化能

③ 細胞を用いたメラニン産生の評価

マウス由来 B16 melanoma 細胞

各種刺激剤

① チロシナーゼによる酵素反応

② 酸化による重合反応

メラニン色素の

生成過程

成分の生理

機能の評価

ヨブスマソウ

（イヌドウナ）

・キク科コウモリソウ属の多年草

・5、6月頃伸びた若芽を食用とする

・秋田では標高200メートル以上、関東では1500メートル以上で生育する

・民謡「秋田おばこ」にも登場する秋田を代表する山菜

秋田の地域食資源の中からメラニン色素産生を抑制する素材を探索した結果、ヨブスマソウが非常に有効なことを見出した。

メラニン色素産生抑制機能を有する成分の探索

秋田では「ホンナ」、山形では「ボンナ」と

呼ばれ、食用山菜として親しまれている

ヨブスマソウ抽出物のチロシナーゼ阻害作用

A b s o

r b a n

c e 4

9 0 n

m

ヨブスマソウ抽出物（mg/ml）

0 . 0

0 . 2

0 . 4

0 . 6

0

0 . 0

0 . 2

0 . 4

0 . 6

0 . 8

1 . 0

0 50 100 150

A b

s o r b

a n c e 4

9 0 n

m

熱水

MeOH

70% EtOH抽出物

熱水熱水抽出物

MeOH MeOH抽出物

ヨブスマソウのチロシナーゼ阻害作用は７０％エタノールで抽出した

ものが最も効果的であった。

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Abso

rban

ce 5

17 n

m

熱水 70%

EtOH

MeOH 熱水 70%

EtOH

MeOH

ヨブスマソウ(10 mg/ml)

モミジガサ(10 mg/ml)

Contr

ol

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Abso

rban

ce 5

17 n

m

熱水 70%

EtOH

MeOH 熱水 70%

EtOH

MeOH



Contr

ol

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Ab

sorb

ance

49

0 n

m

熱水 70%

EtOH

MeOH 熱水 70%

EtOH

MeOH



Co

ntr

ol

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Ab

sorb

ance

49

0 n

m

熱水 70%

EtOH

MeOH 熱水 70%

EtOH

MeOH



Co

ntr

ol

キク科コウモリソウ属：ヨブスマソウ（イヌドウナ、ホンナ）とモミジガサ（シドケ）の比較

チロシナーゼ阻害作用抗酸化能

同じキク科コウモリソウ属の山菜の中でも、モミジガサ（シドケ）よりも

ヨブスマソウ（イヌドウナ、ホンナ）の方がチロシナーゼ阻害作用と

抗酸化能が強かった

0

40

80

120

160

200

Control IBMX

Mela

nin

(mg/

mg

prote

in)

細胞のメラニン含量

熱水 70% EtOH

MeOH 熱水 70% EtOH

MeOH

ヨブスマソウ (25 mg/ml)

モミジガサ (25 mg/ml)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Control IBMX

Mel

anin

(m

g/m

g pr

ote

in)

培地に放出されたメラニン含量

熱水 70% EtOH

MeOH 熱水 70% EtOH

MeOH

ヨブスマソウ (25 mg/ml)

モミジガサ (25 mg/ml)

キク科コウモリソウ属：ヨブスマソウ（イヌドウナ、ホンナ）とモミジガサ（シドケ）の比較

モミジガサよりもヨブスマソウの方がメラニン産生抑制作用が強かった

ヨブスマソウ70%EtOH抽出物を逆相カラムHP-20で分画

1362 gのヨブスマソウから成分を70%エタノールで抽出（44.5 g）

抽出物（42.0 g）を30％エタノールに

縣濁し、逆相樹脂Daiaion HP-20を

詰めたカラムに注入

30％メタノールで溶出：分画１（36.3 g = 88.5%）

75％メタノールで溶出：分画２（1.2 g = 2.9%）

100％メタノールで溶出：分画３（1.9 g = 4.6%）

酢酸エチルで溶出：分画４（1.6 g = 3.9%）

脂溶性

低

高

ヨブスマソウ分画のチロシナーゼ阻害作用と抗酸化能

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 20 40 60 80 100

Abs

orb

ance

490

nm

濃度（mg/ml）

分画1

分画2

分画3

分画4

チロシナーゼ阻害作用

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 1 2 3 4 5 6 濃度（mg/ml)

Abs

orb

ance

517

nm

分画1

分画2

分画3

分画4

抗酸化能

チロシナーゼ阻害作用と抗酸化能はいずれも分画２が最も強く、次いで分画１が強かった。分画３・４にはチロシナーゼ阻害作用はほとんど見られなかった。

0

40

80

120

160

200

Mel

anin

(µg/

mg

prote

in)

Control IBMX


分画 1

分画 2

分画 3

分画 4

Mel

anin

(m

g/m

g pr

ote

in) 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Control IBMX

培地に放出されたメラニン含量

分画 1

分画 2

分画 3

分画 4

ヨブスマソウ分画のメラニン産生に及ぼす影響

チロシナーゼ阻害作用と抗酸化能はいずれも分画２が最も強く、次いで分画１が強かったが、細胞におけるメラニン産生の抑制は分画３が最も強く、次いで分画4が強かった

小眼球症関連転写因子 MITF による (Microphthalmia-associated transcription factor )

チロシナーゼ遺伝子の発現促進とメラニン産生

チロシン

チロシナーゼ

MITF リン酸化

DNA

UV

転写

プロモーター配列チロシナーゼ遺伝子

色素細胞特異的

転写因子

チロシナーゼmRNA

発現増強

メラニン産生

DNA Mﾎﾞｯｸｽ



DCT遺伝子

チロシナーゼ遺伝子

TRP-1 遺伝子

DCT酵素

TRP-1 タンパク質

チロシナーゼ酵素

メラニン色素

MITF

転写ON

小眼球症関連転写因子 MITF は (Microphthalmia-associated transcription factor )

色素細胞のマスター転写因子である

ヨブスマソウ分画３が遺伝子発現に及ぼす影響

0

50

100

150

200 TRP-1 mRNA

TR

P-1/b-A

ctin (%

of C

ontr

ol)

IBMX

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳFr.3(mg/ml) 3 1.5

+ + +

- -

- 0

50

100

150

200

DCT mRNA

DC

T/b-A

ctin

(% o

f C

ontr

ol)

IBMX


+ + +

- -

-

0

50

100

150

200 MITF mRNA

MIT

F/b-A

ctin

(%

of C

ont

rol)

IBMX


+ + +

- -

- 0

50

100

150

200

250

Tyr

osi

nase

/b-A

ctin

(%

of co

ntro

l)

Tyrosinase mRNA

IBMX


+ + +

- -

-

ヨブスマソウ分画３がメラニン産生に及ぼす影響

0

20

40

60

80

100

120 細胞のメラニン含量

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳFr.3

IBMX + +

1.5 mg/ml

-

- +

0.75 mg/ml

-

Mel

anin

(mg/

mg

prote

in)

0.0

0.3

0.6

0.9 培地に放出されたメラニン含量

Mel

anin

(m

g/m

g pr

ote

in)

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳFr.3

IBMX + +

-

- +

- 1.5 mg/ml

0.75 mg/ml

ヨブスマソウ分画３はMITFの発現を抑制することで、メラニン産生を低濃度で抑制した。

ヨブスマソウ分画３・４と既存のメラニン抑制剤の比較 mRNA発現

0

50

100

150

200

MITF mRNA

MIT

F/b

-Act

in(%

of

Cont

rol)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Tyr

osi

nase

/b-A

ctin

(%

of

cont

rol)

Tyrosinase mRNA

Control

IBMX Fr.3

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳ (1.5mg/ml)

Fr.4

ｱﾙﾌﾞﾁﾝ（mg/ml）

15 30

ｺｳｼﾞ酸 (mg/ml)

15 30 －＋＋＋＋＋＋＋

Control

IBMX Fr.3


Fr.4


15 30


15 30 －＋＋＋＋＋＋＋

ヨブスマソウ分画３と４はMITFの発現を抑制したが、アルブチンとコウジ酸は高濃度でも抑制作用は見られなかった。

0

20

40

60

80

100

120

140 細胞のメラニン含量

Mel

anin

(mg/

mg

prote

in)

Control

IBMX Fr.3


Fr.4


15 30


15 30 －＋＋＋＋＋＋＋

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2


Mel

anin

(m

g/m

g pr

ote

in)

Control

IBMX Fr.3


Fr.4


15 30


15 30 －＋＋＋＋＋＋＋

ヨブスマソウ分画３・４と既存のメラニン抑制剤の比較メラニン産生

ヨブスマソウ分画３と４は、アルブチンやコウジ酸よりも低濃度で強くメラニン産生を抑制した。

刺激剤の種類によるﾖﾌﾞｽﾏｿｳ分画３の効果の比較 mRNA発現

Forskolin

0

50

100

150

200

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳFr.3 (1.5mg/ml)

+ + + + - - - -

control a-MSH IBMX

MIT

F/b-A

ctin

(%

of C

ont

rol)

MITF mRNA

0

50

100

150

200

Tyr

osi

nase

/b-A

ctin

(%

of

Cont

rol)

Tyrosinase mRNA

+ + + + - - - -

control Forskolin a-MSH IBMX

ヨブスマソウ分画３は、どの刺激剤においてもMITFのmRNA発現を強く抑制し、チロシナーゼmRNAの発現を抑制した。

刺激剤の種類によるﾖﾌﾞｽﾏｿｳ分画３の効果の比較メラニン産生

ﾖﾌﾞｽﾏｿｳ Fr.3 (1.5mg/ml)

Forskolin

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Mel

anin

(mg/

mg

prote

in)


+ + + + - - - -

control a-MSH IBMX

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4


Mel

anin

(m

g/m

g pr

ote

in)

+ + + + - - - -

control Forskolin a-MSH IBMX

ヨブスマソウ分画３は、どの刺激剤においてもメラニン産生を抑制した。

ヨブスマソウ分画３の抗ガン作用

悪性黒色腫（B16メラノーマ）肺ガン細胞（A549）に対して選択的に抗ガン作用を示した

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

濃度（mg/ml) C

ell vi

abili

ty (

% o

f C

ontr

ol)

20 ×103

cells/ml

5×103

cells/ml

B16 4A5 メラノーマ

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

B164A5

C3H

HepG2

A549

U937

3T3-L1

濃度（mg/ml)

Cel

l vi

abili

ty (%

of

Cont

rol)

ガン細胞の種類による選択性細胞密度による効果の相違

細胞が高密度の時に抗ガン作用が強く発揮された

MITF転写因子

プロモーター配列チロシナーゼ遺伝子

DNA

mRNA核転写

チロシナーゼ

翻訳チロシン

（アミノ酸）

酵素反応

酸化重合

生理活性組成物

抗酸化成分

チロシナーゼ阻害成分

MITF抑制成分

メラニン色素

UV、ホルモン

第２の効果

第１の効果

第３の効果

ヨブスマソウ抽出物のメラニン抑制剤としての有用性

複数の作用点の異なる有効成分を含有しているため、既存の高純度の

メラニン抑制剤と比較しても、粗抽出物でも低濃度で有効性を発揮できる

ヨブスマソウ抽出物の抗ガン剤としての有用性

紫外線UV 活性酸素

発ガン物質

DNA損傷

X

炎症細胞増殖刺激

悪性化高転移性

抗ガン剤耐性

癌化

X X X

促進促進

従来の抗ガン剤のターゲット

抑制

ヨブスマソウ

分画３

悪性黒色腫

色素細胞特異的

転写因子MITF

最近になってＭＩＴＦは悪性黒色種の原因遺伝子であることを示す知見が

相次いで報告されている

Nature. 480(7375), 94-98 (2011) A SUMOylation-defective MITF germline mutation predisposes to melanoma and renal carcinoma

Nature. 480(7375), 99-103 (2011) A novel recurrent mutation in MITF predisposes to familial and sporadic melanoma

新技術の特徴・従来技術との比較

• 既存のチロシナーゼ酵素阻害剤であるアルブチンやコウジ酸よりも低濃度でメラニン産生を抑制する。

• 既存のメラニン抑制剤とは異なった作用機序：色素細胞特異的転写因子MITF発現を抑制することで効果を発揮する。

• MITF抑制成分以外にも、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化

成分を含有し、粗抽出物で効果的に作用するため、低コストで原料を製造でき、実用性が高い。

• ヨブスマソウ／イヌドウナは秋田を中心に東北・北海道で食用山菜として利用されてきた長い歴史があり、安全・安心である。資源としても豊富に存在し、栽培も可能である。

• MITF抑制成分は、選択性の高く、かつ副作用の小さい抗ガン剤として有用な可能性がある。

想定される用途と業界

• 美白用化粧品、医薬部外品

• 健康食品、サプリメント

• 医薬品

（悪性黒色腫、肺ガンなどに対する抗ガン剤）

化粧品、製薬業界、健食業界

など

実用化に向けた課題と企業への期待

○ 美白用化粧品・医薬部外品

・基本的に40～70%エタノール粗抽出物のままで、化粧品や医薬部外品用の原料として使用できる

・化粧品・医薬部外品の規格へ対応した品質基準を満たすことが課題である

○ 医薬品（抗ガン剤）

・ヨブスマソウ分画３のMITF抑制成分の精製・構造解析

・リード化合物からの構造の最適化

・医薬品としての開発

これらの課題を共同研究で解決していく

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：

メラニン抑制及びＭＩＴＦ抑制作用を有する美白用組成物及び抗ガン剤

• 出願番号：特願2012-025967

• 出願人：国立大学法人秋田大学

• 発明者：池本敦

お問い合わせ先

秋田大学産学連携コーディネーター伊藤慎一

ＴＥＬ０１８－８８９－２７０２

ＦＡＸ０１８－８３７－５３５６

e-mail [email protected]

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