Protocolos – Sandro R. Valentini

ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE

POLIACRILAMIDA - SDS (SDS-PAGE)

- Misturar as amostras protéicas com tampão de amostra q.s.p. 1X (loading buffer-

2X). Ferver as amostras 96oC por 5 minutos.

- Montar as placas – Mini protean III- Bio Rad.

- Preparar o gel de resolução (tabela 18.3 – Maniatis).

- Aplicar o gel de resolução no aparato até o nível desejado (no mínimo 0,5 cm

abaixo do pente). Aplicar água Milli-Q para nivelar o gel.

- Após polimerização, retirar a água e secar com papel de filtro.

- Aplicar o gel de empacotamento (tabela 18.4 – Maniatis) e inserir o pente.

- Montar o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida.

- Realizar eletroforese (100 V a 200 V).

- A seguir, o gel pode ser submetido ao ensaio de western blot ou corado com

coomassie blue por 30 minutos a temperatura ambiente seguido de tratamento

com o descorante.

- Após coloração por coomassie blue, acondicionar o gel no "bastidor" entre duas

folhas de papel celofane umidecidas em água. Manter a temperatura ambiente

até secagem do gel.

SOLUÇÕES:

• Tampão de Amostra 2X (Loading buffer-2X)

Tris/HCl pH 6,8 100mM

SDS 4,0%

Azul de bromofenol 0,2%

Glicerol 20,0%

Antes do uso, adicionar dithiotreitol q.s.p. 200mM (estoque: 1 M armazenado a –20 oC)

• Tampão de corrida 10X

Tris 250mM

glicina pH 8,3 2,5M

SDS 1%

• Corante coomassie blue (1L) • Descorante (1L)

Coomassie blue 2,5g Metanol 450mL

Metanol 450mL Ácido acético glacial 100mL

Ácido acético glacial 100mL Água Milli-Q 450mL

Água Milli-Q 450mL

Protocolos – Sandro R. Valentini