ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA

D. Manojlović, Hemijski fakultet Beograd

DEFINICIJADEFINICIJA

Biosenzor se može definisati kao uređaj koji ima ugrađenu biološki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fizičko-hemijskim pretvaračem i procesorom elektronskog signala

Shema biosenzora

Analit odinteresa Smetajućavrsta

Biokomponenta

Pretvarač

ProcesorSignal

Pretvarača (transducer) - pretvara uočenu promenu (fizičku ili hemijsku) u mereni signal

Prepoznavajućeg agensa – koji omogućava merenje samo one vrste koja nam je od interesa a koja se nalazi u smeši sa drugim vrstama

Svaki senzor i biosenzor se sastoji od:

Enzim

Antitelo

Mikro-org.

Ćelija

Molekul prepoznavajućimaterijal

Princip biosenzora

Pretvarač signala

Električni signal

Elektroaktivna supstanca

Elektrode

pH promenaPoluprovodničke pH elektrode

Toplota Termistori

Svetlost

Brojač fotona

Promena mase

Piezoelektrični uređaj

BIOKOMPONENETEBIOKOMPONENETE

EnzimiAntitelaMembraneOrganeleĆelijeTkivaReceptori

PRETVARAČIPRETVARAČI

Elektrohemijski OptičkiPiezo-električniKalorimetrijskiAkustični

Enzimi

Biološki elementi koji se najčešće koriste

Mogu biti korišćeni u čistom obliku ili prisutni u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja

Aktivnost mnogih enzima uključuje oksidaciju i redukciju koje mogu biti detektovane elektrohemijski

Postoji pet glavnih klasa enzima.

Oksidoreduktaze

Transferaza

Hidrolaze

Liaze

Izomeraze

OksidoreduktaOksidoreduktazeze

Dehidrogenaze

Oksidaze

Peroksidaze

Oksigenaze

Prednosti enzima:

1. lako se vežu za odgovarajući supstrat

2. visoko su selektivni

3. imaju katalitičku aktivnost

4. brzo se aktiviraju

Enzimi su najčešće korišćene biološke komponente

Mane enzima:

1. skupi su

2. često gube aktivnost dok se imobilizuju na pretvaraču

3. gube aktivnost posle relativno kratkog vremenskog perioda

Antitela

Vezuju se specifično za odgovarajući antigen

Prednosti:

1. veoma su selektivni2. ultra osetljivi3. veoma se snažno vezuju

Jedina mana im je što nemaju katalitički efekat

Nukleinske kiseline

slične antitelima

koriste se za detekciju genetskih bolesti, kancera i virusnih infekcija

DNK istraživanja često uključuju dodatak označene DNK u sistem dodatkom nekog radioaktivnog elementa ili elektrofore

Metode imobilizacije

Povezivanje selektivnih elemenata

adsorpcijom selektivnog elementa na površinu

kovalentnim vezivanjem

mikrokapsulacijom

cross-linking – koristi se bifunkcionalni agens da hemijski poveže pretvarač i selektivnu komponentu

‘zarobljavanjem’ - selektivni element se nalazi uhvaćen unutar gela, paste, ili polimera

TIPOVI BIOSENZORATIPOVI BIOSENZORA

Enzim/metabolički biosenzori– Enzimske elektrode i ćelijske elektrode

Bioafinitetni senzori

– Antitela– Nukleinske kiseline– Lektin

Enzim/metabolički senzoriEnzim/metabolički senzori

Supstrat + Enzim

Supstrat-enzmski kompleks

Proizvod + Enzim

Meri se odnos potrošnje supstrata premaoslobađanju proizvoda i pretvara u kvantifikovani signal

Bioafinitetni senzoriBioafinitetni senzori

Ovi senzori se baziraju na interakcijama povezivanja između imobilizovanih biomolekula i analita od interesa.

Ove interakcije su visoko selektivne.

Pimeri obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i lektin za šećer

Bioafinitetni senzori

AntiteloAnalitodinteresa(antigen)

Ometajućevrste

Antitelo-antigen kompleks

PretvaračiPretvarači

– Potenciometrijski

– Amperometrijski

– Konduktometrijski

POTENCIOMETRIJSKI POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI BIOSENZORI

Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili elektrodnoj površini, koja je u kontaktu sa rastvorom, povezan je sa koncentracijom analita

Potencijal se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi (relativni)

pH elektroda je osnovni potencionetrijski pretvarač u biosenzorima.

POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORIPOTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI

E = Eo + RT/nF ln[analit]

– Eo konstanta za sistem

– R univerzalna gasna konstanta

– T apsulutna temperatura

– n broj izmenjenih elektrona

– F Faradejeva konstanta

– ln[analit] prirodni logaritam od aktiviteta analita.

Najpoznatiji potenciometrijski senzor je jon-selektivna elektroda (ISE)

Tečne polimerne membranske elektorde su komercijalno raspoložive i rutinski se koriste selektivnu detekciju nekoliko jona (K+, Na+, Ca2+, NH4

+, H+, CO32-) u složenim biološkim

osnovama

Antibiotici nonactin i valinomicin služe kao neutralni nosači za određivanje NH4

+ i K+

Ag/AgCl referentna elektroda

Unutrašnji vodeni rastvor za punjenje

Membrana/soni most

Porozna membrana koja sadrži jonoforu

Tečni jonoizmenjivač

Enzim može biti imobilizovan na pH elektrodi korišćenjem želatina i glutaraldehida

Glukoza

glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2 enzim:GOD

dolazi do promene pH zbog nastanka glukonske kiseline

merenjem promene potencijala (pH) možemo odrediti koncentraciju glukonske kiseline (a samim tim i glukoze)

Penicinpencilinaza

Penicilinska Kiselina

U kontaktu sa pH elektrodom.

ISE koje se koriste u kombinaciji sa imobilizovanim enzimoma mogu da služe kao osnova elektroda koje su selektivne za specifične enzimske supstrate

Od njih su dva glavna: za ureu i za kreatinin.

Ove potenciometrijske enzimske elektrode se prave ubacivanjem enzima ureaze i kreatinaze na površinu katjon osetljive (NH4

+) ISE

Urea

CO(NH2)2 + 2 H2O → (NH4)2CO3

koncentraciju uree možemo određivati primenom katjonske amonijum selektivne elektrode

ili možemo napraviti alkalni rastvor i određivati slobodni amonijak koristeći amonijum selektivnu gasnu elektrodu

Osetljivost odnosno granica detekcije iznosi (10-6 M )

Oksalati

C2O42- → 2 CO2 + H2O oksalat oksidaza

Određivanje oksalata u urinu je značajno prilikom dijagnostike hiperokslurije

Potenciometrijski pretvarač kod biosenzora koji se koristi za određivanje koncentracije CO2 (odnosno oksalata u mokraći) je CO2 gasna elektroda

Primeri potenciometrijskih senzora

Glukoza

Koristimo jodid selektivnu elektrodu

glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2

enzim:GOD

H2O2 + 2 I- + 2 H+ → I2 + 2 H2O enzim:PO

Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida što je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida

AMPEROMETRIJSKI BIOSENZORIAMPEROMETRIJSKI BIOSENZORI

Kod amperometrijskih biosenzora elektrodni potencijal se drži na konstantnoj vrednosti dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od interesa (ili supstance elektrohemijski vezane za nju)

Jačina struje koja protiče je proporcijonalna koncentraciji analita

Id = nFADsC/d

e tok

Radna elektroda

Pomoćna elektroda

Referentna Elektroda(Ag/AgCl, SCE)

( Pt žica)

( Pt, Au, C)

Mešalica

Puferski rastvor (Tris, DPBS, Citrat)Koji sadrži elektrolit( KCl, NaCl)

Primer

Glukoza + O2GlukozaOksidaza

Glukonska kiselina + H2O2

Proizvod, H2O2, se oksidovuje na +650mV u odnosu na Ag/AgCl referentnu electrodu.

Zbog toga se primenjue potencijal od +650mV i meri oksidacija H2O2 .

Struja je direktno proporcionalna koncentraciji glukoze.

0

50

100

150

5 10 15 20

I (nA)

[Glukoza], mM

Amperometrijske enzimske elektrode koje se baziraju na oksidazama u kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodama postale su najuobičajeniji biosenzori

Kod ovih reakcija prati se, potrošnja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida

Prvi razvijeni biosenzor bazirao se na korišćenju kiseonične elektrode

Enzim glukooksidaza (GOD) imobilisan je u poliakrilamidnom gelu na gas-propusnoj membrani koja pokriva elektrodu

Kroz razvoj biosensora se susrećemo hronološki sa tri generacije na osnovu mehanizma dejstva:

1. prva generacija – senzori bazirani na kiseoničnim elektrodama

2. druga generacija – senzori bazirani na medijatorima i

3. treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima

Klarkovakiseoničnaelektroda-+

Platinska katoda

Srebrna anoda

Telo elektrode

KCl rastvor

Mana kiseoničnih senzora je što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika

Zbog toga pratimo koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida, a ne kiseonika koji se troši u reakciji

H2O2 → 2H+ + 2e- + O2

Na primenjenom potencijalu anodne oksidacije vodonik peroksida različita organska jedinjenja se oksiduju (vitamin C, mokraćna kiselina, glutation itd.)

flavin-adenin-dinukleotida (FAD)

Preduzeti su različiti pristupi za povećanje selektivnosti detektujuće elektrode, njenim hemijskim modifikacijama, korišćenjem:

1. membrana2. medijatora3. metalizovanjem elektroda4. polimera

1.Membrane.

Razvijene su različite permiselektivne membrane, koje kontrolišu vrste koje stižu do elektrode, na bazi naelektrisanja i veličine

Primeri obuhvataju

celuloza acetat (naelektrisanje i veličina),nafion (naelektrisanje) i polikarbonat (veličina).

Nedostatak korišćenja membrana je njihov uticaj na difuziju.

2. Medijatori druga generacija biosenzora

Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste veštačkeelektron akceptorske molekule, koji se nazivaju medijatori

Medijator je niskomolekulski redoks par koji može da prenese elektrone sa aktivnog mesta enzima na površinu elektrode, i na taj način uspostavlja električni kontakt izmađu njih

Ovi medijatori imaju širok opseg struktura, a samim tim i osobina, uključujući i opsege redoks potencijala

Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi

Jedan od boljih medijatora je ferocen(Fc) – sendvič kompleks gvožđa i dva ciklopentadienil(Cp) anjona

Princip dejstva medijatora na bazi ferocena

glukoza + GODOx → glukonolakton + GODR + 2H+

GODR + 2Fc+ → GODOx + 2Fc

2Fc – 2e- → 2Fc+

Oksidacija glukoze se ostvaruje preko flavin-adenin-dinukleotida (FAD), komponente enzima GOD, koji se pretvara u redukovani oblik FADH2, koji se kasnije reoksiduje do FAD pomoću Fc+ (medijatora), dok se Fc reoksiduje direktno na elektrodi strujom koja će kasnije biti merena pri određivanju koncentracije glukoze

Dobri medijatori bi trebalo da:

1. brzo reaguju sa enzimima2. reverzibilno izvode transfer elektrona3. imaju mali nadpotencijal pri

regeneraciji4. nezavisni su od pH vrednosti5. stabilni su i u oksidovanom i u

redukovanom obliku6. ne reaguju s kiseonikom7. nisu otrovni

Ferocen zadovoljava sve uslove

Primeri medijatora koji se obično koriste:

– Ferocen (nerastvoran)– Ferocen dikarbonska kiselina (rastvoren)– Dihloro-indofenol (DCIP)– Tetrametil-fenilenediamin (TMPD)– Fericijanid – Rutenium hlorid– Metilen Plavo (MB)

3. Metalizovne elektrode

Svrha korišćenja metalizovanih elektroda je u tome da se steknu uslovi pri kojima se oksidacija enzimski generisanog H2O2 može postići na nižem primenjenom potencijalu, stvarajući jako osetljivu katalitičku površinu

Pored toga smanjujući efekat smetnji, zbog nižeg primenjenog potencijala, odnos signal/šum raste zabog povećanja elektrohemijski aktivne površine

Metalizacija se postiže taloženjem odgovarajućegplemenitog metala na glas karbon elektrodu (GC), korišćenjem ciklične voltametrije

Uspešni rezultati su postignuti sa nekoliko plemenitih metala-platina, paladijum, rodijum i rubidijum od kojih se najviše može očkivati

Odg

ovor

Potencial

Odg

ovor

PotencialPotencial

Odg

ovor

Potencial

Odg

ovor

GC elektroda Metalizovana GC

GC elektroda ne katalizuje oksidaciju H2O2

GC metalizovana elektroda sa ruteniumom, rodiumom, paladijuom ili platinom katalizuju oksidaciju H2O2

Primeri uobičajeno upotrebljavanih polimera:

– polipirol– politiofen– polianilin– diaminobenzen– polifenol

Kao i membrane polimeri imaju ulogu da sperče ometajuće vrste da stignu do površinu elektrode i izvode diferencijaciju na osnovu veličine i naelektrisanja

4. Polimeri

Treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima

Neophodan je da medijator bude ugrađen zajedno sa enzimom u elektrodu

Nema redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi da bi se sprečila denaturacija na površini elektrode i gubitak enzimsku aktivnost

NANOSENZOR

Vrh nanosenzora

Nanosenzor u ćeliji

eSensor TM Motorola

Senzor je razvijen ispitivanjem sendvič hibridizacija ima tri osnovne komponente koje sadrže svi današnji uređaji (sonda za hvatanje, ciljna proba i signalna proba).

Signalna sonda je obeležena ferocenom i služi kao cilj za hibridizaciju

Tok elektrona prema elektrodi se javlja samo ako se specifično hibridizuju sonda za hvatanje, ciljna proba i obeležena proba

eSensor TM Motorola

eSensor TM Motorola

Sonda za hvatanje

Ciljna DNA

Hibridizacija sa ciljnom DNA

Hibridizacija sa feracen označenom probom

Merenje ferocen označenog signala

Senzor za odrđivanje nitrata

SEM makroporozne mikroelektrode SEM mreže

Ultramikro makroporozna elektroda za određivanje teških metala u životnoj srediniu