einführung in die nmr-spektroskopie
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Vorlesungsfolien - Einführung in die NMR-SpektroskopieTRANSCRIPT
NMR-Spektroskopie
8.10. – 10.10.2012
NMR-Spektroskopie
• NMR = Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy oder Kernspinresonanzspektroskopie
• Kernspins im Magnetfeld• Spektroskopie: Absorption von Lichtquanten, deren
Frequenz (umgekehrte Wellenlänge) der Energiedifferenz zwischen zwei Zuständen entsprechen
E = h·(h = Planck‘sches Wirkungsquantum, h = 6,63 ·10-34 J·s )
Prinzip der NMR-Spektroskopie
• Die meisten Atomkerne haben einen intrinsischen Drehimpuls (Kernspin).
• Die Größe des Kernspins kann nur bestimmte Werte halb- oder ganzzahlige Werte haben. Dies ist durch die Spinquantenzahl I charakterisiert (I = 0, 1/2, 1, 3/2, 2…).
• Die Spinquantenzahl ist charakteristisch für ein Isotop.
• Der Spin (bewegte Ladung) ist bei Atomkernen mit einem magnetischen Moment verknüpft.
I
I
| | ( 1)I I I
Die Magnetquantenzahl mZ
Quantenmechanik:Ein Spin der Spinquantenzahl I kann im Magnetfeld (2I+1) stabile
Orientierungen einnehmen (stationäre Zustände) die durch die Magnetquantenzahl mZ charakterisiert sind: mZ= -I, -I+1,-I+2…I
+ 1/2
mZ
- 1/2
I
I = 1/2
= 54,7°
- 1
+ 1mZ
I
I = 1
0
= 45°
Spin-1/2-Kerne
• Kerne der Spinquantenzahl I= ½, sind besonders gut geeignet für die NMR-Spektroskopie
• Beispiele: 1H, 13C, 15N und 31P• Diese Kernspins können im äußeren
Magnetfeld 2 Zustände einnehmen, die als (parallel zum äußeren Magnetfeld) und (antiparallel zum äußeren Magnetfeld) bezeichnet werden.
• Quantenmechanik: Die exakte räumliche Ausrichtung eines Kernspins kann nicht ermittelt werden (Heisenberg)
Prinzip der NMR-Spektroskopie
• Im Magnetfeld haben die Zustände und unterschiedliche Energien• Die Energiedifferenz E zwischen zwei Zuständen ist proportional zum
Magnetfeld am Kernort• Außerdem hängt die Energiedifferenz von der Art des Kerns ab.• Das gyromagnetische Verhältnis gibt an, wie groß die
Energiedifferenz zwischen den beiden Eigenzuständen des Kernspins in einem gegebenen Magnetfeld ist.
B
E
E = ·h·B0/2
Ausgewählte Isotope und ihre KernspinsIsotop Kernspin Häufigkeit [%] γ [107 rad T-1s-1]
1H 1/2 99.985 26.75192H 1 0.015 4.106610B 3 19.6 2.874611B 3/2 80.4 8.584313C 1/2 1.11 6.7314N 1 99.6 7.215N 1/2 0.37 -2.7117O 5/2 0.04 -3.6319F 1/2 100 25.1827Al 5/2 100 6.97631P 1/2 100 10.873Ge 9/2 7.8 -0.935779Br 3/2 50.7 6.702
NB: 12C und 16O, die häufigsten Isotope dieser Elemente, haben einen Kernspin I = 0 und geben damit kein NMR-Signal
NMR-Spektroskopie
• Besetzungsunterschied zwischen und : Boltzmann-Verteilung:
• Bei 300K und einem Feld von 18,8 T (800 MHz Protonenfrequenz): N = 0,99987·N
• Auf 10000 Spins im -Zustand kommen 10001,3 Spins im -Zustand
• NMR-Spektroskopie ist eine relativ unempfindliche Methode!
0exp expN BEN kT kT
NMR-Spektroskopie
• Spektroskopie: Durch Einstrahlung von Lichtquanten geeigneter Energie lässt sich ein System vom energiearmen in den energiereichen Zustand überführen.
• Dabei werden Lichtquanten absorbiert.• Aus der Wellenlänge des absorbierten Lichtes kann auf die
Energiedifferenz zwischen den Zuständen geschlossen werden (→ Erkenntnisgewinn!):E = h· = ·h · B0/2
= · B0/2• Die Frequenz hängt vom äußeren Magnetfeld ab (rf-
Wellenbereich, bei 9,4 T ist die Resonanzfrequenz für Protonen 400 MHz, die höchste Frequenz ist 1GHz)
• Welche Erkenntnis wollen wir denn aus dem NMR-Spektrum gewinnen?
Chemische Verschiebung
E1
1
23
E2 E3
Unterschiedliche
Resonanzfrequenzen für
unterschiedliche Kerne
Im Molekül sind Atomkerne von Elektronenhüllen umgeben, die
das äußere Magnetfeld teilweise abschirmen. Diese Abschirmung hängt von der chemischen Umgebung ab.
→ Das Magnetfeld am Kernort gibt Auskunft über die
chemische Umgebung eines Atomkerns.
→ chemische Verschiebung
Die chemische Verschiebung ist proportional zum angelegten Magnetfeld
4.7 T
9.4 T
Die chemische Verschiebung wird in ppm angegeben
Referenzierung:
• Die chemische Verschiebung einer Referenzsubstanz wird willkürlich auf 0 ppm gesetzt (für Protonen und 13C Tetramethylsilan, TMS, für 15N flüssiges NH3)
• Damit ist unabhängig vom Magnetfeld
6[ ] 10 ref
ref
ppm
Puls-FT-NMR-Spektroskopie
Das Vektormodell (vereinfacht)
• z-Magnetisierung als Summe der einzelnen magnetischen Momente
• Im Gleichgewichtszustand ist die makroskopische Magnetisierung parallel zum angelegten Magnetfeld
0exp( / ) exp( / 2 )n
E kT hB kTn
Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 5·10-5
Vektormodell: magnetisches Moment
0exp( / ) exp( / 2 )n
E kT hB kTn
Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 5·10-5
Präzession im Magnetfeld
0M B
dLM r Fdt
I
0 0 sindIM I B I B edt
→ Das magnetische Moment eines Kernspins führt zu einem Drehmoment M
(Änderung des Drehimpulses mit der Zeit) senkrecht zum Drehimpuls I des
Kernspins.
→ Der Drehimpuls ändert seine Richtung, aber nicht seinen Betrag
→ Kreisbewegung (Präzession) um die Richtung des angelegten Magnetfeldes
→ Präzession mit der Larmorfrequenz des Kernspins
Wie kann der Magnetisierungsvektor von der Richtung des äußeren Magnetfeldes weggedreht
werden?
Indem man das Magnetfeld kurzzeitig ausschaltet und ein Magnetfeld senkrecht dazu anlegt, um das der Magnetisierungsvektor dann präzediert.
Der Rotationswinkel ist dann proportional zur Zeit, die das Magnetfeld angelegt wurde, und zur Stärke des Magnetfeldes.
Exkurs: Oszillierendes Magnetfeld
Ein oszillierendes Magnetfeld kann als Summe zweier in entgegengesetzter Richtung rotierender Magnetfelder betrachtet werden.
Rotierendes Koordinatensystem
Wenn ein Radiofrequenzfeld, das mit der Larmor-Frequenz eines Kernspins oszilliert, spürt dieser rotierende Kernspin ein konstantes Magnetfeld, das senkrecht zum äußeren Magnetfeld ist.
Kreisbewegung (freie Präzession um die z-Achse)
• Die Kernspinmagnetisierung präzediert im rotierenden Koordinatensystem mit der Kreisfrequenz um die Richtung des äußeren Magnetfeldes.
• Mit der Larmorfrequenz L und der Rotationsfrequenz des Koordinatensystems 0
cos sin
cos sin
tx x y
ty y x
M M t M t
M M t M t
0[ / ]L rad s
Rf-Pulse
• Durch das Einstrahlen kurzer, intensiver Radiofrequenzpulse der Intensität B1 nahe der Larmorfrequenz lässt sich der makroskopische Magnetisierungsvektor um die Einstrahlrichtung rotieren.
• Vorteil: RF-Pulse lassen sich mit jeder beliebigen Phase und für definierte Zeiten einstrahlen
• Das äußere Magnetfeld muss dazu nicht abgeschaltet werden.
Wirkung von Radiofrequenzpulsen
→ Durch Einstrahlen von rf-Feldern mit definierter Frequenz und Phase kann man den Magnetisierungsvektor nach Belieben manipulieren („Spin-Choreographie“)
Transversale Magnetisierung
• - und -Zustand sind nun gleichbesetzt. Dafür zeigen Kernspins nun Phasenkohärenz (bevorzugte Ausrichtung in der xy-Ebene)
• Die transversale Magnetisierung präzediert (rotiert) in der xy-Ebene, und zwar jede Komponente mit ihrer Larmorfrequenz .
• Rotierende Magnetisierungsvektoren induzieren einen Wechselstrom in einer rf-Spule und kann somit detektiert werden.
Fazit
• Transversale Magnetisierung präzediert mit der Larmorfrequenz der Kernspins
• Der Magnetisierungsvektor kann mit Hilfe von rf-Pulsen von der Richtung des äußeren Magnetfeldes weg rotiert werden.
• Wird der rf-Puls im rotierenden Koordinatensystem in Richtung des Magnetisierungsvektors eingestrahlt, so hat das rf-Feld keinen Einfluss („spin lock“).
Free Induction Decay FID
• Präzedierende Magnetisierung erzeugt in einer rf-Spule ein zeitabhängiges Signal, das freier Induktionszerfall oder FID genannt wird.
• Dieses Signal entspricht einer gedämpften Schwingung mit mehreren Frequenzkomponenten (Akkord, der auf dem Klavier angeschlagen oder auf der Gitarre gezupft wird, Paukenschlag, Erdbebenstoß).
• Das Signal klingt ab, weil– Die Spins mitunter aus dem Takt geraten („transversale
Relaxation“)– Der Gleichgewichtszustand (Überschuß an -Spins ohne
Phasenkohärenz) wieder erreicht wird („longitudinale Relaxation“)
• Analyse der Frequenzkomponenten (Fourier-Transformation) ergibt das Spektrum.
NMR-“Spektroskopie“
E1
1
23
E2 E3
Unterschiedliche Resonanzfrequenzen
für unterschiedliche Kerne
Fourier-Transformations-NMR / rf-Pulse
t
+
+
1
23
0
S( ) s(t) exp( i t2 )dt
x
z
yx
z
y
rf-Puls
x
z
y
Fourier-Transformation
• Der freie Induktionszerfall (freeinduction decay, FID) kann dargestellt werden als die Summe aus frequenzabhängigen Komponenten, und deren einhüllender Funktion
• Die Oszillationsfrequenz k bestimmt die Lage des k-ten Signals, die Einhüllende fk(t) die Linienform
• Die Fourier-Transformation ist umkehrbar
Jean-Baptiste Fourier, 1768-1830( ) ( ) exp( 2 )k k
k
s t f t i t
Fourier-Transformation
Fourier-Paare
k = 50 Hz
k = 250 Hz
k = 1000 Hz
FT
Fourier-Paare: konstante Amplitude( ) exp( 2 )s t i t ( ) ( )S
k = 100 Hz
k = 1000 Hz
( ) exp( )f t t
= 1000 Hz
Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall
2 22( )kF
= 100 Hz
Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall
( ) exp( )exp( 2 )s t t i t 22
2( )S
Fourier-Paare: Rechtecksfunktionsin(2 )( )
2kF
1, 0
( )0,
if tf t
if t
= 1 ms
= 2 ms
Fourier-Paare: Rechtecksfunktion
exp( 2 ), 0( )
0,i t if t
s tif t
= 5 ms
sin(2 ( ) )( )2 ( )
S
Fazit FT-NMR
• Je länger der FID, umso schmaler das Signal• Die Oszillationsfrequenz bestimmt die Lage des
Signals• Die Linienform hängt von der Form des FID ab• Die Form des FID hängt unter anderem von der
Lebensdauer des Kernspinzustandes ab.
FT-NMR- wozu?
• Große Zeitersparnis: Statt alle Wellenlängen einzeln durchzufahren (Dauer: Minuten) wird mit einem einzigen kurzen Puls das gesamte Spektrum angeregt (Dauer: wenige Sekunden)
• Vor allem die NMR-Spektroskopie von Kernen mit geringem gyromagnetischem Verhältnis und geringer natürlicher Häufigkeit wird dadurch ermöglicht (13C NMR-Spektroskopie in natürlicher Häufigkeit).
• Wir erinnern uns: Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis S/N ist proportional zum Quadrat der Anzahl der aufgenommenen scans (das heißt, wenn wir in zwei Minuten 100 scans statt eines scans aufnehmen können, steigern wir die Empfindlichkeit um den Faktor 10)
Richard R. Ernst,
Nobelpreis 1991
Das gepulste NMR-Experiment
Frage: Wie lange dauert es, bis wir den nächsten FID aufnehmen können?
Relaxation
Zwei Arten der Kernspinrelaxation:• T1: longitudinale Relaxation (Spin-Gitter-Relaxation)
beschreibt die Zeit, bis die Magnetisierung wieder den Glechgewichtszustad erreicht hat (und der Magnetisierungsvektor entlang der z-Richtung ausgerichtet ist).
• T2: transversale Relaxation (Spin-Spin-Relaxation)beschreibt die Zeitkonstante, mit der der die spinsirreversibel (?!?) dephasieren (die Spins haben ihre Phaseninformation verloren, unter Umständen ist der Gleichgewichtszustand aber noch nicht wieder erreicht).
a=100Hz
Homogene Linienverbreiterung: kurze Lebensdauer des Spinzustandes
exp(-at) 1/(1+(2/a)2
a=1kHz
Inhomogene Linenverbreiterung:Jeder Kernspin hat eine etwas andere
Larmorfrequenz
Rekapitulation: Präzession
+
+
1
23
x
y
Unterschiedliche Larmorfrequenzen→ unterschiedliche Präzessionsfrequenzen
x
z
yx
z
y
rf-Puls
x
z
y
Inhomogene Linenverbreiterung:Jeder Kernspin hat eine etwas andere
Larmorfrequenz
Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich refokussieren – homogene nicht
Inhomogen! Homogen!
x
y
Spinecho
Homogene/Inhomogene Linienbreiten -Lochbrennen
rf
Einstrahlung einer rf-Frequenz sättigt alle Übergänge dieser Frequenz
Inhomogene Linienverbreiterung: Lochbrennen
Homogene Linienverbreiterung: Das gesamte Signal wird gesättigt
Fazit
• Transversale Relaxation führt zu homogener Linienverbreiterung
• Wenn die Phaseninformation verloren ist, kann sie nicht mehr zurückgewonnen werden.
• Inhomogene Linienverbreiterungen können durch einen 180°-Puls refokussiert werden (Spinecho).
NMR von Proteinen
• Sekundäre chemische Verschiebungen• Kernsorten in Proteinen• Labelling• Multidimensionale NMR-Spektroskopie:Prinzip• COSY, NOESY, Transfer, TOCSY
NH (Amidprotonen)
H,N-HSQC von Kanamycin-
Kinase (Protein mit 264 Aminosäuren).Jedes Signal entspricht der
Amidgruppe einer Aminosäure.
(aufgenommen bei 21.1T, oder 900
MHz Protonenfrequenz)
© Dr. Matthias Stoldt
2D-NMR-Spektroskopie
2D-NMR
• Präparation: Die Magnetisierung wird angeregt (in die xy-Ebene gebracht)
• Evolution: Die Magnetisierung präzediert in der xy-Ebene, jede Komponente enthält am Ende der Evolution eine Phase, die proportional zur Evolutionszeit und der Larmorfrequenz ist.
• Mischen: Durch geeignete Radiofrequenzpulse kann Magnetisierung zwischen verschiedenen Kernspins übertragen werden. Dazu können J-Kopplungen oder die räumliche Nachbarschaft ausgenutzt werden. Der Transfer ist homo-oder heteronuklear möglich.
• Detektion: Der FID wird aufgenommen.
2D-NMR-Spektroskopie
Dieser Vorgang wird wiederholt, und mit linear
zunehmenden t1-Evolutionszeiten
durchgeführt.
2D-NMR-Spektroskopie
Fourier-Transformation in t2 ergibt eine Serie von Spektren. Jedes Signal ist entlang t1 amplitudenmoduliert.
→ Projektion auf t1 ergibt…
2D-NMR-Spektroskopie
…ein Signal, das in t1ebenfalls mit einer charakteristischen Frequenz oszilliert.Dieses Signal lässt sich selbstverständlich auch in t1 fourier-transformieren.
2D-Spektrum
Darstellung als Höhenlinien
Informationsgehalt von 2D-Spektren
• Wenn während des Mischens „Magnetisierung“ von einer Spinart auf die andere übertragen wurde, erscheint im Spektrum ein Kreuzkorrelationssignal („Crosspeak“), das in beiden Dimensionen unterschiedliche Frequenzen hat.
• Die beiden Kernspins, die diese Larmorfrequenzen haben, stehen also in irgendeiner Beziehung zueinander.
• Z.B. J-Kopplung, aber auch räumliche Nähe (je nach Art der Mischsequenz)
2D NMR-Spektren
• Es gibt ein großes Arsenal an verschiedenen 2D-NMR-Experimenten, die sich in der Art der Präparation und der Art des Magnetisierungstransfers unterscheiden.
2D NMR-Spektren
• Homonuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt zwischen Kernspins der gleichen Sorte (meist Protonen)
• Heteronuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt zwischen verschiedenen Kernspins (1H/13C oder 1H/15N)
• Verschiedene Transfermechanismen für die Mischsequenz: – Durch Bindungen (Information über die chemische Struktur)– Durch den Raum (Information über die räumliche Struktur in
Proteinen)
Homonukleare 2D-NMR-Experimente
• COSY (COrrelation SpectroscopY): Nutzt J-Kopplungen aus, Kreuzkorrelationssignale zwischen Protonenspins, die über 3 Bindungen miteinander verbunden sind.
• TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY): Magnetisierungstransfer zwischen allen Kernspins, die über J-Kopplungen miteinander verbunden sind
• NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY): Transfer durch den Raum über dipolare Kopplungen (Abstandsinformation)
J-Kopplungen homonuklear: COSY
Frage: Welche Spinsystemeliegen in diesem Substanzgemisch vor?
TOCSY: TOtal Correlation SpectroscopY
• Alle miteinander gekoppelten Protonen ergeben Kreuzkorrelationssignale
• Jede Aminosäure gibt einen miteinander korrelierten Signalsatz
TOCSY
Frage: Welche Spinsystemeliegen in diesem Substanzgemisch vor?Und: Welches Spektrum sagt mehr über die Moleküle aus: das COSY oder das TOCSY?
Einfachstes 2D-Spektrum: H,H COSY (COrrelation SpectroscopY)
Zwischen Kernspins, die miteinander koppeln, gibt es Kreuzkorrelationssignale.
1H von 1-13C-Glucose
H1H1
J(H,C) = 179 Hz
© Dr. Rudolf Hartmann
J(H,C) = 167 Hz
H,H-COSY von 1-13C-Glucose
H1
H1H2
H3
H4
H5
H6
© Dr. Rudolf Hartmann
H1
H1
H2
H3
H4 H5
2xH6
TOCSY von Valin
Abstandsinformation
• J-Kopplungen geben Auskunft über chemische Struktur und sind daher für die chemische Analyse organischer Moleküle sehr wertvoll
• Die chemische Struktur von Proteinen sollte allerdings bekannt sein, bevor es mit NMR-Spektroskopie untersucht wird.
• Wie bekommt man Abstandsinformation?• Wir erinnern uns: Atomkerne sind kleine
Magnetnadeln, die als solche auch ein Magnetfeld um sich herum aufbauen.
• Frage: Was spüren Nachbarkernspins von diesem Magnetfeld?
Dipolare Kopplungen
B0
Dipolare Kopplungen
B0
Fazit Dipolkopplungen
• Das Magnetfeld, das ein Kernspin von seinem Nachbarn spürt, hängt von drei Dingen ab– Dem Kernspinzustand des Nachbarn (mZ)– der Entfernung r der beiden Spins– der relativen Orientierung des Abstandsvektors zum äußeren
Magnetfeld (charakterisiert durch den Winkel , zwischen r und dem äußeren Magnetfeld)
21 23 3cos 1Z
AB
D mr B0
rAB
Wie macht sich die Dipolkopplung im NMR-Spektrum bemerkbar?
• In Flüssig-NMR-Spektren: zunächst gar nicht.• Wir erinnern uns: NMR-Spektroskopie ist eine langsame
Methode und misst oft nur zeitliche Mittelwerte• Der Mittelwert der dipolaren Kopplung über alle Orientierungen
ist 0• Für Moleküle mit einem Molekulargewicht < 30 kDa in wässriger
Lösung sind dipolare Kopplungen durch die schnelle Reorientierung ausgemittelt (keine Aufspaltung)
• Bei größeren Proteinen: Linienverbreiterung (deshalb auch Größenlimitierung), wenn die Ausmittelung zu langsam erfolgt.
• Festkörper-NMR-Spektroskopie: Wenn die Moleküle statisch im Magnetfeld liegen, sind Dipolkopplungen sichtbar!
Kreuzrelaxation, NOE2 2 2
1 6 2 2
320 1
I I S c
I c
Wr
Normale Relaxation in den Grundzustand (→keine Crosspeaks)
2 2 2
0 26 2
110 1
I S c
I S c
Wr
Nullquantenkreuzrelaxation (große Moleküle )
2 2 2
2 26 2
35 1
I S c
I S c
Wr
Doppelquantenkreuzrelaxation (kleine Moleküle )
→ Dipolar gekoppelte (räumlich benachbarte)
Kernspins können durch den Raum Magnetisierung
miteinander austauschen
2D NOESY-Spektroskopie
→ Kreuzrelaxation während der longitudinalen Mischzeit führt zu Crosspeaks im 2D-Spektrum
→ Treten Crosspeaks auf, so wissen wir, dass diese Kernspins räumlich benachbart sind
(Abstandsinformation).
Abstände zwischen Protonen
Ausschnitt aus einem 2D NOESY; zeigtKreuzsignale zwischen Amidprotonenund aliphatischen Protonen
Kreuzsignale:- zuordnen- kalibrieren- quantifizieren
NOE ~ rAB-6
rAB
2D-NOESY- schematisch
Welches Proton ist zu wem räumlich benachbart?
→ Abstände sind wertvolle Strukturinformationen.→Kennt man genügend
Abstände, lässt sich daraus die gesamte Molekülstruktur
rekonstruieren
Fazit 2D-NMR
• Zweidimensionale NMR-Spektroskopie bietet ein Arsenal an Möglichkeiten, Informationen über Konnektivitäten (J-Kopplungen) oder räumliche Nähe (Kopplungen durch den Raum) in einem Molekül zu bekommen.
• Die Methoden lassen sich noch erweitern:– Heteronuklearer Transfer (von H auf N oder C)– Dreidimensionale NMR-Spektroskopie: Das Spektrum ist ein Würfel,
in dem jeder Punkt im Raum eine gewisse Signalintensität hat.
Protein-Flüssig-NMR-Spektroskopie
P
nicht auf Proteine beschränkt:
- Nukleinsäuren (RNA, DNA)- Polysaccharide- Membransysteme- Molekülkomplexe- ganze Zellen („in cell NMR“)
Aufbau Puls-FT-NMR-Spektrometer
-> in Jülich während Praktikum P
• Was verstehen wir unter 3D Proteinstruktur?• Warum experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur?
• Wie funktioniert das mit Flüssig-NMR-Spektroskopie?
• Ligandenbindung und NMR-Spektroskopie
Was verstehen wir unter 3D Proteinstruktur?
• Kartesische (Raum)Koordinaten aller Atome zusammen mit der Kenntnis der kovalenten (chemischen) Struktur
oder• Torsionswinkel zusammen
mit der Kenntnis der kovalenten Struktur
Eigentlich Konformation!Verschiedene Betrachtungsebenen:- Primärstruktur (Aminosäuresequenz, kovalente (chemische) Struktur- Sekundärstruktur (Konformation des Proteinrückgrates- Tertiärstruktur (gesamte Struktur, Faltung)- Quartärstruktur (Oligomere, Komplexe, supramolekulare Strukturen)
P
Warum experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur?
• Proteinstruktur bestimmt Funktion des Proteins (Enzyme, Ionenkanäle, Rezeptoren, Strukturproteine, Regulationsproteine etc.; Proteinfehlfaltungen -> Krankheiten)
• Vertieftes Verständnis nur mit/durch die 3D Struktur
Wie funktioniert das mit Flüssig-NMR-Spektroskopie?
Strukturvalidierung und -interpretation
Strukturrechnung
Sammeln von Struktureinschränkungen (NOE-Zuordnung, 3J, sekundäre chem. Versch.)
Präparation der Protein-NMR-Probe
Aufnahme der NMR-Spektren
Sequenzspezifische Resonanzzuordnung (Proteinrückgrat)
Resonanzzuordnung der Seitenketten
Protein-NMR-Probe
• Konzentration: ca. 1 mM• Reinheit > 95%• ab ca. 50 Aminosäurereste -> Isotopenanreicherung mit
13C und 15N: warum?• monodisperse Probe (keine Aggregation, keine
verschiedenen Zustände)• langzeitstabil
Protein-NMR-Probe
Transformation
Protein-NMR-Probe
Protein-NMR-Probe
• Zellaufschluß• Proteinreinigung (chromatographische Methoden)• Konzentrierung der Proteinprobe (Ultrafiltration)• Vorcharakterisierung der Probe (Reinheit: SDS-PAGE,
lichtspektroskopische Methoden, Lichtstreuung usw.)
• 13C/15N-Isotopenanreicherung: spezielle, künstliche Wachstumsmedien für Bakterienkulturen -> Minimalmedium, z.B. M9 (Kohlenstoffquelle z.B. 13C-Glukose, Stickstoffquelle 15N-Ammoniumsalze)
Protein-NMR-Probe
Alternative Expressionssysteme:
- Hefe- oder Insektenzellkulturen (posttranslationaleModifikationen eukaryotischer Proteine) -> sehr teuer
- Zellfreie Expression (Zellextrakte mit allen wichtigen Komponenten)
Aufnahme NMR-Spektren
methyl
aliphatic
Hbackbone HN
aromatic
side-chain HN
1D Protonenspektrum („Lieblingskern“: höchste Empfindlichkeit)
P
Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-TOCSY (28 Aminosäurereste-Peptid, Zink-Finger)
Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-COSY (128-aa Protein, Lysozym)
Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-NOESY (85 aa, HPr)
Ausweg: Heteronukleare NMRAusweg: Höherdimensionale NMR
Ausweg: Heteronukleare NMR1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)
(1H) [ppm]
(15
N) [
ppm
]
P
Ausweg: Heteronukleare NMR1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)
(1H) [ppm]
(15
N) [
ppm
]=1/(4*1JHN)
4=1/1JHN=1/90-95Hz=10-11 ms
Ausweg: Heteronukleare NMRAusweg: Höherdimensionale NMR-> 3D Zuordnungsexperimente
Ausweg: Höherdimensionale NMR-> 3D Zuordnungsexperimente
3D Zuordnungsexperimente
3D HNCACB
13C
15N1HN
3D Zuordnungsexperimente
3D HNCACB
C(i)
C(i-1)
C(i)
C(i-1)
P
3D Zuordnungsexperimente
3D Zuordnungsexperimente
2D (1H-15N)-HSQC zugeordnet!
P
3D Zuordnungsexperimente
Struktureinschränkende Parameter(experimentell aus NMR-Spektren!!)
• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungskonstanten
• Torsionswinkel-Einschränkungen () aus chemischen Verschiebungen des Rückgrates
• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austauschexperimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten
• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen
Struktureinschränkende Parameter
• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungs-konstanten -> Karplus-Beziehung
Beispiel: Torsionswinkel φ des Proteinrückgrates aus3JHN-Hα
C)60cos(B)60(cosA)(J 2
Struktureinschränkende Parameter
• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungs-konstanten -> Karplus-Beziehung
Struktureinschränkende Parameter• Torsionswinkel-Einschränkungen () aus chemischen
Verschiebungen des Rückgrates: C, C, C‘, H u.a.-> sekundäre chemische Verschiebung (chemischer-Verschiebungs-Index, CSI)
P
Struktureinschränkende Parameter• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austausch-
experimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten
P
Struktureinschränkende Parameter• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austausch-
experimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten
2hJHN-C‘=0,5 Hz
Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)
2 2 2
1 6 2 2
320 1
I I S c
I c
Wr
Normale Relaxation in den Grundzustand (→keine Crosspeaks)
2 2 2
0 26 2
110 1
I S c
I S c
Wr
Nullquantenkreuzrelaxation (große Moleküle )
2 2 2
2 26 2
35 1
I S c
I S c
Wr
Doppelquantenkreuzrelaxation (kleine Moleküle )
→ Dipolar gekoppelte (räumlich benachbarte) Kernspins können durch den Raum Magnetisierung
miteinander austauschen
Kern (nuclear)-Overhauser-Effekt (enhancement)
Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)
Kreuzsignale:- zuordnen- kalibrieren- quantifizieren
rAB < 5Å
Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)
3D (1H-1H-15N)-NOESY-HSQC
2D (1H-15N)-HSQC
INOE ~ r-6
1H [ppm]
Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Helix
P
Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Helix
P
Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Faltblatt parallel
P
Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Faltblatt antiparallel
P
Struktureinschränkende Parameter• Sekundärstruktur-Elemente zusammen gefaßt
Strukturberechnung• Möglichst alle gemessenen NOEs zuordnen
1H [ppm]
HN
HNOE
Strukturberechnung
HN V275
1H [ppm]
Strukturberechnung1H
[ppm]
HA V275
HB V275
HG2 V275HG1 V275
1H [ppm]
Strukturberechnung
HN V275
HA V275
HB V275
HG2 V275HG1 V275
HN F274
HD F274
HA F274
HBs F274
HN F295
HA F295
HN A294
HB A294
HA P292
HN V276
P292F295
A294
V276
F274
1H [ppm]
Strukturberechnung• Möglichst alle gemessenen NOEs zuordnen
StrukturberechnungDie potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Molekülmechanik / Kraftfeld
StrukturberechnungDie potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Molekülmechanik / Kraftfeld
Strukturberechnung
Die potenzielle Energie einer Modell-Struktur plus zusätzliches Potential (Energie) für NOE-Abstandseinschränkungen
StrukturberechnungMolekulardynamik-Simulation
Lösen der Newtonschen Bewegungsgleichungen für alleAtome i im Potentialfeld U
Kinetische Energie folgt einem Temperaturprotokoll
Koordinaten des Protein-Modells ändern sich mit t
Ziel: Minimierung der potenziellen Energie
P
StrukturberechnungMolekulardynamik-Simulation
Movie!
StrukturberechnungStrukturschar
r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:
Proteinrückgrataller Schweratome
r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:
Proteinrückgrataller Schweratome
0.037 nm0.070 nm0.037 nm0.070 nm
r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:
Proteinrückgrataller Schweratome
0.037 nm0.070 nm
cAMP-freie CNBD
Konformerenschar (15 Strukturen)
cAMP-freie CNBD
Konformerenschar (15 Strukturen)
NC
P
StrukturberechnungValidierung
- Anzahl und Stärke von Verletzungen (Nichteinhalten) der experimentellen Einscränkungen
- Ramachandran-Plot (erlaubte -Bereiche)- Allgemeine Geometrie der Struktur, van-der-Waals-
Zusammenstöße- Machen lokale Interaktionen Sinn? (polare WW -> H-
Brückenbind., Salzbrücken; unplolare WW -> hydrophober Kern)
- Beantwortet die Struktur biologische Fragen?
P
Bindungsstudien mit NMR
LPLP 'onk
offk
.
.
..
..
.koff groß
koff klein
Bindungsstudien mit NMR
1H chemische Verschiebung [ppm]
15N
che
mis
che
Vers
chie
bung
[ppm
]
CNBDcAMP-frei
NMR-Titrationsexperiment von CNBD mit cAMP
CNBD+ 250 µM cAMP
Bindungsstudien mit NMR
cAMP-freie CNBDcAMP-freie CNBD cAMP-gebundene CNBDcAMP-gebundene CNBD
-> starker Binder (hohe Affinität): zwei komplette Strukturen lösen!
Bindungsstudien mit NMR-> schwächere Binder (geringere Affinität): Mapping des Bindeepitops sehr schnell möglich!Titrationsexperimente mit 15N-Protein und unmarkiertem Ligand (natürliche Isotopenhäufigkeit)
NMR-Struktur(GABAA-Rezeptor
assoziierte Protein
GABARAP)
Interaktions-Partner (Trp)
Interaktions-analyse
Zeitskalen
From M.H. Levitt, „Spin Dynamics“
Alle Zustandsänderungen, die schneller als die
spektrale Zeitskala sind, führen dazu, dass im
Spektrum ein Mittelwert beobachtet wird (z.B. Entkopplung, dipolare
Kopplungen, Austausch von Protonen)
Alle Zustandsänderungen, die langsamer als die
spektrale Zeitskala sind, führen dazu, dass im Spektrum
zwei getrennte Signale beobachtet
werden.
Wechselwirkungen
• Zeeman-Wechselwirkung HZ: Wechselwirkung mit dem äußeren Magnetfeld
• Chemische Verschiebung HCS: Modulation des äußeren Magnetfeldes durch die Elektronenhülle
• Magnetfelder benachbarter Kernspins, die im Magnetfeld unterschiedliche stationäre Zustände einnehmen können:– Durch den Raum (Dipolkopplungen) HD
– Über Bindungen vermittelt (indirekte, oder J–Kopplungen) HJ
NMR –Wechselwirkungen sind orientierungsabhängig
• NMR Wechselwirkungen hängen von der Orientierung im Magnetfeld ab
• Sie werden durch einen orientierungsabhängigen Tensor repräsentiertB0k
rk
11 21 31
12 22 32
13 23 33
ˆA A A
A A A AA A A
0ˆI A B
Beispiel chemische Verschiebung
0
0
0 0
00
CSx xx xy xz xzCSy yx yy yz yzCSz zx zy zz zz
B BB BB B B
0ˆCSB B
Tensoren
• Tensoren repräsentieren Vektortransformationen (Drehungen, Streckungen)• Tensoren beschreiben die Wechselwirkungen zweier vektorieller Größen in
Abhängigkeit der Orientierung• Die Spur eines Tensors (A11+ A22+ A33) ist orientierungsunabhängig• Für drei Orientierungen beschreibt der Tensor eine Streckung ohne
Drehung. • In diesem Fall liegt der Tensor in Diagonalenform vor
• Axx, Ayy und Azz sind die drei Tensorhauptwerte• Ein Tensor wird durch drei Tensorhauptwerte sowie
drei Winkel, die ihn im Raum orientieren, vollständigcharakterisiert.
0 00 00 0
xx
yy
zz
AA A
Ax y
z
Tensoren
• Jeder Tensor ist durch drei Hauptwerte Axx, Ayy und Azz sowie drei Winkel, die ihn relativ zum Bezugskoordinatensystem orientieren, charakterisiert.
• Alternativ zu den drei Werten Axx, Ayy und Azz lassen sich auch drei andere charakterisitsche Größen angeben, die die Form des Tensors anschaulicher wieder geben und folgendermaßen von den drei Tensorhauptwerten abhängen:
• Der isotrope Wert Aiso= 1/3(Axx+Ayy+Azz)
Konvention |Azz-Aiso| ≥ |Axx-Aiso| ≥ |Ayy-Aiso|
• Die Anisotropie A = Azz - Aiso
• Die Asymmetrie = (Ayy - Axx)/A
Azz
AyyAxx
Die chemische Verschiebung hängt von der Orientierung des Moleküls im Magnetfeld ab (CSA = Chemical Shift Anisotropy)
Pulverspektrum (Summe über alle Orientierungen) CSA Tensor ist ein Maß für die Elektronenverteilung
Chemische Verschiebungs-Anisotropie
32
1
1 (3cos 1)3
obs iso k kkk
zz
yy
xx
0 0.5 1
0 0.5 1
>0
xx
yy
zz
yy
yy yy yy
yy xx
zz xx
xx
xx zzzz
zz xx zz
Chemische Verschiebungs-Anisotropie
Dipolare Kopplungen
B0
Dipolare Kopplungen
B0
Dipolare Kopplungen
21 23~ (1 3cos )DH
r
„Pulverspektrum eines isolierten Spinpaares
Dipolare Kopplungen
21 23~ (1 3cos )DH
r
B0
r
Reduktion der Linienbreiten (I): Orientierte ProbenAlle Moleküle werden gleichausgerichtet (Einkristall, Lipiddoppelschicht, auf Glasplatten aufgetragen) Chemische Verschiebungund Dipolkopplung gebenAufschluss auf Orientierungdes Tensors (und damit auchdes Moleküls)
Linienverschmälerung(I): Orientierung
Einkristall in verschiedenen Orientierungen (31P-Spektrum)Naito, A.; Sastry, D. L.; McDowell, C. A. Chem. Phys. Lett. 1985, 115, 19.
Orientierte ProbenPISEMA : 2D Correlationspekrum (dipolare NH-Kopplung) (Abstand bekannt) mit 15N Verschiebung korelliert (CSA tensor bekannt) Orientierungen aller AMidgruppen. Powder Spectrum
NH
Dip
olar
Cou
plin
g
15N Chemical Shift
M. Bak, J.T. Rasmussen, N.Nielsen, J. Magn. Reson. 2000, 147, 296-330.
Homonuclear Decoupling
t1
DECCP
CP
1H
15N
t2
Orientierte Lipiddoppelschichten
Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.
PISEMA Spektren Orienter Helices
Circular patterns(PISA Wheels) depend on the tiltangle of the helixaxis
Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.
30°
NH
dip
olar
cou
plin
g (k
Hz)
250 150 50250 150 50
=0° 60°
90°
15N Chemical Shift (ppm)
PISA Wheels of Membrane Proteins
Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.
Residue-type labeling of amino acids facilitates sequential assignments
Ile Val
Ala Leu
full
simulated
Imitation der Brown’schen Molekularbewegung durch schnelle Rotation um den magischen Winkel
54.7°
32
1
1 (3cos 1)3
obs iso k kkk
21 23~ (1 3cos )DH
r
1arccos 54.73
Reduktion der Linienbreiten: Magic Angle Spinning
Magic-Angle Spinning (MAS)
• >: isotropes Signal (wie in Lösung)
• Inhomogene Linienbreiten (z.B. CSA):Rotationsseitenbanden im Abstand ±n·rot von der isotropen chemischen Verschiebung
• Homogene Verbreiterungen (Netzwerk dipolar gekoppelter Kerne):Keine vollständige Elimination der Linienverbreiterungen; Spindiffusionseffekte
Rotationsseitenbanden: Warum?
+
+
1
23
x
y
Unterschiedliche Resonanzfrequenzen → unterschiedliche Präzessionsfrequenzen
x
z
yx
z
y
rf-Puls
x
z
y
Anisotrope Verschiebungen-Der statische Fall
Verschiedene Orientierungen
x
y
t
t
MAS
x
y
Rotationsechos
2 kHz
4 kHz
Rotationsechos und Rotationsseitenbanden
trot
1rot
rot
t
t
FT
Rotationsechos und die zugehörigen Seitenbanden
2 kHz
4 kHz
Rotationsechos (Glycin, simuliert)
Magic Angle Spinning – Zwischenbilanz
• Magic-Angle-Spinning eliminiert anisotrope Linienverbreiterungen
• Ist die Rotationsfrequenz kleiner als die Anisotropie, so treten Rotationsseitenbanden im Abstand ± nrot auf.
• Dies gilt exakt nur für inhomogene Linienverbreiterungen (Chemische Verschiebungsanisotropie, Dipolkopplungen zwischen isolierten Spinpaaren).
• Homogene Linienverbreiterungen (homonukleare Dipolkopplungen in einem Netzwerk stark gekoppelter Spins) lassen sich durch Magic-Angle-Spinning nicht vollständig eliminieren.
Inhomogene Linienverbreiterung
→ jedes Molekül hat eine definierte Resonanzfrequenz
a=100Hz
Homogene Linienverbreiterung: kurze Lebensdauer des Spinzustandes
exp(-at) 1/(1+(2/a)2
a=1kHz
Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich refokussieren – homogene nicht
Inhomogen! Homogen!
x
y
Homogene/Inhomogene Linienbreiten -Lochbrennen
rf
Einstrahlung einer rf-Frequenz sättigt alle Übergänge dieser Frequenz
Inhomogene Linienverbreiterung: Lochbrennen
Homogene Linienverbreiterung: Das gesamte Signal wird gesättigt
1 23~DH
r
Netzwerk homonuklearer dipolar gekoppelter Spins
• „Flip-flop“-Übergänge (Nullquantenübergänge)
• Je stärker die dipolare Kopplung (je größer das gyromagnetische Verhältnis und je höher die Dichte an Kernspins), desto wahrscheinlicher ist so ein Übergang.
• Im 3D-Netzwerk wird Magnetisierung sehr schnell ausgetauscht und durch die gesamte Probe weitergereicht.
→ Spindiffusion.
• Vor allem Protonen (hohes gyromagnetisches Verhältnis, hohe Dichte).
t
Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar
x
y
t
Dipolkopplungen - Netzwerk
y
x
Protonen in der Festkörper-NMR-Spektroskopie
800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz
HNNH
+H3N
CO2-
+
H2H
H21
H12
NH
Aromaten+ NH3
HH
DQ(SPC5)
Konsequenzen
• Hochauflösende Festkörper-NMR-Spektroskopie von Protonen ist oft nicht realisierbar
• Stattdessen: 13C und 15N Isotopenmarkierung• Heteronukleare Kopplung zum Protonennetzwerk macht
auch 13C- und 15N-Linienbreiten homogen • Protonenentkopplung
– Einstrahlung von rf-Strahlung auf dem 1H-Kanal während der Evolutions-und Detektionsperioden
– Dadurch wechseln die Protonen so häufig ihren Spinzustand, dass benachbarte 13C- und 15N Kerne nur noch einen gemittelten Duchschnittsuzstand sehen.
Protonen in der Festkörper-NMR-Spektroskopie
800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz
HNNH
+H3N
CO2-
+
H2H
H21
H12
NH
Aromaten+ NH3
HH
DQ(SPC5)C
C
C
CC
CO
13C-Spektrum mit high-power Protonenentkopplung
Isotopenmarkierung
• Kurze Peptide, Festphasensynthese: Vollständig markierte Aminosäuren oder spezifisch isotopenmarkierte Aminosäuren können beliebig und sequenzspezifisch eingeführt werden.
Abstandsmessung zwischen einzelnen Spins möglich
• Rekombinant exprimierte Proteine:
Minimalmedium aus isotopenmarkierten Nährstoffen; markierte Isotope werden statistisch eingebaut.*
*Geib, K. H.; Bonhoeffer, K. F., Z Phys Chem. A 1936, 175, 459-468.
Festkörper-NMR:Experimente
E. HahnJ.S. Waugh
A. Pines
1H
X
1H
X
,RF
S,RF
90
Kreuzpolarisation (Cross Polarisation CP)
• Signalverstärkung
• Umgehen der oft langen T1-Relaxation für Heterokerne
• Selektion bestimmter Spinpaare
• Spinlock der 1H-Magnetisierung
• Durch gleichzeitiges Einstrahlen eines rf-Feldes auf dem X-Kanal wird der Polarisationstransfer auf X begünstigt, wenn I,RF = S,RF
CP MAS 1 1 , 1,2I S Rk k
CP MAS
I-S/R=-2 -1 1 2
Magnetisierungstransfer ist möglich, wenn:
1H
X
,RF
S,RF
90
Hartmann-Hahn-Bedingung
Mixing time [ms]
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4 5 6
1.5 2.5 3.5 Distance inÅ
I-S=MASSignal buildup
Abstandsmessung ist möglich
1H
X
Cross-Polarization 2D
t1
t2
I
S
CP
CP
Entkopplung
I
S
HETCOR-Spektren:Korrelation zwischen dipolar gekoppelten Kernen
Selektiver Transfer auf CO oder Cmöglich: Specific-CP
Baldus, M.; Petkova, A. T.; Herzfeld, J.; Griffin, R. G. Mol. Phys. 1998, 95, 1197-1207.
N/C transfer: intraresidue N/C correlation
N/CO transfer: interresidue N/C correlation
CP für heteronuklearen Transfer
2D Spektren
Tripeptid AGG (Ala-Gly-Gly)
Imitation der Brown’schen Molekularbewegung durch schnelle Rotation um den magischen Winkel
54.7°
32
1
1 (3cos 1)3
obs iso k kkk
21 23~ (1 3cos )DH
r
1arccos 54.73
Wiedereinkopplung (Recoupling)
Dipolar Recoupling
Homonuklear:
Rotational resonancerotary resonanceHORRORRFDRC-Sequences (SPC5, POST-C7 ect)R-sequences (R18, R14)
Heteronuklear:
REDOR
Double-quantum Hamiltonian:
HDQ =deff (I1+I2+ + I1-I2-)
Zero-quantum Hamiltonian:
HZQ = deff (I1+I2- + I1-I2+)
Idee: Wird die periodische Modulation der
Dipolkopplung mit einer zweiten periodischen
Modulation überlagert, so wird die Ausmittelung
aufgehoben.
Heteronukleare Wiedereinkopplung
2 180°-Pulse pro Rotorperiode
t
Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar
x
y
t
REDOR Recoupling
y
x
REDOR Signal:dephasiert aufgrund der Dipolkopplung
Abstandsmessung15N
13C13C
REDOR Abstandsmessung
1
2
R
R
RR Bedingung
Rotational Resonance (RR)
13C
13CR.G. Griffin
Symmetrie-basierte Pulssequenzen
C-Sequenzen R-SequenzenM. H. Levitt
Homonuclear Dipolar Recoupling: Longitudinal Mixing
exc t1 Recoupling t2
Diagonal peaks: I(1,1) = I(2,2) = cos2(defftmix)
Cross-peaks: I(1,2) = I(2,1) = ±sin2(defftmix)
k l
k
l
Doppelquantenspektroskopie
t1DQ excitation t2
01
-1
1 2 rec
p11 + p22 = -rec
p1 = ±2p2 = -11 = {0°,90°,180°,270°}4
2 = {0°}4 {90°}4 {180°}4 {270°}4
rec= {0°,180°}2 {90°,270°}2 {180°,0°}2 {270°,90°}2
DQ reconversion
Ohne t1-Evolutionszeit: Doppelquantenfilter (siehe Praktikum)
-2
2
Doppelquantenspektroskopie
t1DQ excitation t2
1 2 rec
DQ reconversion
1 2
1+2
3
1+3
2+3 Keine Diagonalsignale.
Cross-Relaxation (Spin Diffusion)
exc t1 t2mix
Spin-Diffusion: Austausch von Magnetisierung zwischen dipolar gekoppelten Kernen
Protonen
Heterokerne: keine Protonenentkopplung während des Mischens
Fazit
• Im Festkörper sind chemische Verschiebung und dipolareKopplungen zwischen den Kernspins abhängig von der Orientierung des Moleküls im Magnetfeld.
• MAS eliminiert die anisotrope Linienverbreiterung.
• Die Ausmittelung durch MAS kann durch rotor-synchronisierte rf-Felder ausgeschaltet werden.
• Wechselwirkungen können so kurzzeitig ein- und ausgeschaltet werden. → Großes Arsenal an Möglichkeiten.
Festkörper-NMR-Spektroskopie von Biomolekülen Wozu?
• Röntgenkristallographie setzt kristalline Proben voraus
• Flüssig-NMR setzt lösliche Proben voraus
• Proteine in ihrer natürlichen Umgebung sind oft weder löslich nochkristallin. (Membranproteine, Protzeinaggregate, molekulareKomplexe mit großer Masse)
MAS NMR von extensiv isotopenmarkiertenProteinen
Heise, H.; Hoyer, W.; Becker, S.; Andronesi, O. C.; Riedel, D.; Baldus, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 15871-15876.
Erster Schritt: sequenzielle ZuordnungBeispiel: 140 Proteinfibrille aus einem Protein mit 140-Aminosäuren (-Synuclein)
Luca, S.; Heise, H.; Baldus, M. Acc. Chem. Res. 2003, 36, 858-865.
2D Homonukleare 13C Korrelationsspektroskopie
CO C C
Doppelquantenkorrelation
Homonuklear: SD, DQ-mixingIntraresidue transfer-> spin systems
160
60
20
180
40
CO C C
Einquantenkorrelation
Tripeptid: Ala-Gly-Gly
Die Zukunft: Sensitivity, sensitivity, sensitivity
• Größter Nachteil der NMR-Spektroskopie: die geringe Empfindlichkeit
Boltzmann:
• N/N ~ exp(-E/kT)
• 600 MHz, RT: auf 500000 -spins kommen 500001 spins im -Zustand.
DNP
• Dynamic Nuclear Polarization (historischer Name, nicht wirklich aussagekräftig): Magnetisierung wird von Elektronen auf Kernspins übertragen
• Der Original-Overhauser-Effekt beruht auf dem Magnetisierungstransfer von Elektronen auf Kernspins durch Kreuzrelaxation (Elektronen-Kern-NOESY)
• Overhauser-Effekt: Doppelquanten-Kreuzrelaxation• Solid-Effekt: Verbotene Übergänge werden angeregt• Cross-Effekt/Thermal mixing: Dreispinprozess