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高速条件付きノックアウト動物作成法

群馬大学 生体調節研究所

生体情報ゲノムリソースセンター

教授 畑田 出穂

コンディショナルノックアウト動物は創薬研究に不可欠

通常のノックアウト動物×

疾患モデル動物を用いた病態解明、標的妥当性評価に必要

特定の臓器だけ遺伝子破壊

・ほとんどの遺伝子の解析が可能。・薬剤の効果や副作用が起こる臓器

を特定できる。

コンディショナルノックアウト動物

Cre/loxP

Floxマウス

loxP(34bp) loxP(34bp)

標的遺伝子exon

遺伝子が機能

・６割の遺伝子が胎生致死で解析不能・薬剤の効果や副作用が起こる臓器を

特定不可能。

CRISPR/Cas9で作製容易

CRISPR/Cas9で作製困難(ES細胞で年単位で作製)

loxP 左右のloxPがCreによる組換えでexon欠損

組織特異的Creリコンビナーゼ発現マウス

× 交配

loxPの組換えをおこなう

本発明の経緯１

標的20bp PAM配列

gRNA

Cas9

非相同的末端結合（NHEJ)(挿入・欠失） 相同組換え修復（HDR)

遺伝子ノックアウト 遺伝子ノックイン

ドナーDNAゲノムの特異的切断

遺伝子改変部位

CRISPR/Casゲノム編集法

本発明の経緯２

Exon

染色体欠失 (Deletion)が起きやすいため、Floxになりにくい

1ステップ法（従来法）

loxP loxP

両方同時に切断してノックイン

CRISPR/Cas法

問題点

２ステップ法は染色体欠失が起きにくい

２ステップ法（新規法）

Exon

染色体欠失 (Deletion)が起きにくいため、Floxになりやすい

loxP

loxP

Exon

Exon

片方ずつ切断してノックイン

受精卵

2細胞胚

CRISPR/Cas法

組換え

組換え

～

相補配列+ loxPオリゴ

本発明の内容１

Mecp2遺伝子

マイクロインジェクション法では、２-stepはFlox効率は上昇するが、生存率が極めて悪い。

0%

5%

10%

15%

20%

25%

1-step 2-step

Flox効率（Flox数／胚盤胞数）

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1-step 2-step

染色体欠失（欠失数／胚盤胞数）

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1-step 2-step

生存率（胚盤胞数／受精卵数）

本発明の内容２

導入法の比較検討

マイクロインジェクション法

1) マイクロマニピュレーターの習熟が必要。2) 処理に時間がかかる（100個／１時間）。3) 設備費が高い（1,000万円程度）。4) 受精卵への物理的ダメージ大きい。5) 受精卵に何でも導入可能。

いろんな装置が必要

エレクトロポレーション法

1) 初心者でも可能！2) 処理時間は一瞬（100個／10分）！3) 設備費が安い（100万円程度）！4) 受精卵への物理的ダメージ少ない。5) 大きな物質は導入できない。

(Kaneko et al., 2014; Takemoto & Hashomoto, 2015)

本発明の内容３

エレクトロポレーション法はインジェクション法に比べ受精卵へのダメージが少ないため、生存率が高い

生存率（胚盤胞数／受精卵数）

エレクトロポレーション

インジェクション

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1-step 2-step 1-step 2-step

Flox効率(生存率考慮）（1-step インジェクションを x1とす

る)）

エレクトロポレーション

インジェクション

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1-step 2-step 1-step 2-ste

X 5

X 20

X 10

X 15

X 1

(従来法）

本発明の内容４

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

1-step 2-step

染色体欠失

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

1-step 2-step

Flox効率

0%2%4%6%8%

10%12%14%16%

1-step 2-step

Flox効率

2-stepのエレクトロポレーションによりFloxマウスが効率良く産まれた

Mecp2 遺伝子 Tet3 遺伝子

× 0.14× 7.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

1-step 2-step

染色体欠失

× 0.27×3.0

組織特異的Creマウスで直接作製でも同様の成績

エレクトロポレーション

本発明の内容５

野生型♀

×第１ステップ 第２ステップ

左のlox挿入 右のlox挿入

Cre/loxマウス受精卵 ２細胞期胚

エクソン

胚移植

Flox

Creマウス♂

特定の臓器で遺伝子破壊

新規法

最短１ヵ月

交配

×

現行のコンディショナルノックアウトマウス作製ES細胞でFlox作製 キメラマウス

×

１～２年

交配 交配

野生型

Flox

Creマウス

Cre/loxマウス

Flox

特定の臓器で遺伝子破壊

Floxマウス

エクソン

先行技術との比較

先行技術との比較して迅速である

2

新技術の特徴・従来技術との比較

1. 非常に簡便な技術であるため大量生産に適している。

・Cas9タンパク質, gRNA, 合成オリゴDNA(155bp：ドナー)などすべて 購入した素材を用いている。⇔他の方法だと長いplasmidドナー(kb単位) 、１本鎖DNAなどを使用するため作製に熟練と労力が必要。・エレクトロポレーションを用いるので熟練が不要。

2. 迅速である：１ヶ月

3. 安価である：１５万円(作製のみの材料実費）

3

想定される用途

• 本技術の特徴を生かすためには、疾患モデル動物製造に適用することで開発研究の迅速化のメリットが大きいと考えられる。

4

企業への期待

• 従来作製に時間を要した条件付きノックアウト動物作製については、本技術により克服できると考えている。

• マウス以外の動物や大型動物の技術を持つ、企業との共同研究を希望。

• また、製薬会社など疾患モデル動物を多量に作製し創薬開発への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：条件付きノックアウト動物の製造方法

• 出願番号 ：特願2016-254276• 出願人 ：群馬大学• 発明者 ：畑田出穂、堀居拓郎

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産学連携の経歴

• 2001年 （株)DNAチップ研究所とDNAチップを用いたメチル化解析法に関る特許を共同出願

• 2006年 JST A-Step事業に採択• 2006年- （株)DNAチップ研究所にてDNAチップを用

いたメチル化解析法の受託解析を開始

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お問い合わせ先

群馬大学 産学連携・知的財産活用センター

〒376-8515 群馬県桐生市天神町1-5-1

TEL ０２７７－３０－１１７１～１１７５

FAX ０２７７－３０－１１７８

e-mail ｔｌｏ＠ｍｌ.ｇｕｎｍａ－ｕ.ａｃ.ｊｐ

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