Connectiue Tissue

Vol. 8， No. 1. 1~13

軟骨内骨化とムコ多糖

一長管骨における層状分析一

寺 島 洋 治

野 上 京~

広 瀬 )1民 子

愛知県心身障害者コロニー

発達障害研究所発生学部門

LよZ

正王 田 久

名古屋大学医学部整形外科学教室

Zonal Analysis of Glycosaminoglycans in Epiphyseal Bone

Biochemical and Morphological Observation in the

Human Fetus and the Newborn Rat-

-1-

Epiphyseal bones from a human fetus and newborn rats were separated into 7 and 4

zones respectively. Glycosaminoglycans were analyzed biochemically and morphologically

in four zones， which histologically corresponded to resting zone， transforming zone，

ossifying zone and bone.

1n ossifying cartilage， biochemical differences were characteristic compared with other

zones ; contents of glycosaminoglycan and hexose were reduced. This reduction was

mainly based on that of chondroitin 4 sulfate and it might contribute to release of Ca++

ion to calcify matrices. 1ncreased hyaluronic acid might have relationship with activation

of osteoblastic di妊erentiation.

From the results of gel filtration in each zones， it was found that there two types

of glycosaminoglycan pool， i. e. those of smaller moleclar size from cartilage matrices

and of larger molecular size from calcified matrices.

Histologically， proteoglycans in calcified matric巴swer己 resistant to th巴巴xtraction

with 4M-guanidium hydrochloride and to the digestion by chondroitinase ABC. 1n res-

ting and transforming zones， however，呂lcianblue staining easily turned negative by these

treatment.

* Institute for Developm巴ntalResearch， Aichi Prefectural Colony， Kasugai， Aichi.

Present Address : Department of Orthopaedic Surgery， Nagoya University， School of Medicine

65 Tsuruma-cho， Showa-ku， Nagoya

** Institute for Developmental Research， Aichi Prefectural Colony， Kasugai， Aichi.

*** Department of Orthopaedic Surgery， Nagoya University， School of Medicine. Nagoya.

- 2 ー 結合 組織

Peculiar composition， structure and extractability of glycosaminoglycans in calcified

matrices might play important roles on calcification of epiphyseal bone.

軟骨・骨の発生・分化・成長 (morphogene-

sis)にともない，細胞間基質 (matrix)の酸性

ムコ多糖体が，質的・量的に変動を示すことか

ら酸性ムコ多糖体が morphogenesisに重要

な役割を演じていることは，多く論じられてい

るところである。 軟骨内骨化 (endo綱

chondral ossification)をはじめとして，骨化の

機序は現在のところ依然としてなお不詳であ

る。

Endochondral ossification にみられる形態

学的所見としては，軟骨細胞の形態とその配列

から，静止層 (restingzone)，柱状層および泡

状層 (transformingzone)，石灰化層 (ossify-

ing zone)ついで骨にわけられ，幼若な軟骨細

胞から次第に成熟した細胞に移行し，泡状層

(hypertrophic zone)の matrix こ石灰化がみ

られ，軟骨細胞の崩壊とともに，血管の侵入，

骨芽細胞の出現が認められる。

上記の軟骨細胞の変化につれ，軟骨細胞聞の

matrix に存在する酸性ムコ多糖が質的・量的

に異なることが岩田口により報告されており，

さらにムコ多糖たんぱく複合体 (proteoglycan)

をより自然な状態で抽出する (dissociativeext-

raction)方法2) を用いて，軟骨細胞の成熟度に

対応した prot巴oglycanの性状の差異の検討が

行われるおにいたり，次第に軟骨から骨への

morphogenesisに対する proteoglycanの役割

が明らかにされつつある。

今回，著者は人工流産児よりえられた長管骨

と，ラット新生仔期の長管骨を対象として，こ

れを肉眼的に分割し，それぞれの分割部位が組

織学的に軟骨細胞各層および骨であることを確

認の上，分割した各層の酸性ムコ多糖を抽出・

分析した。さらに，新生;子期ラット長管骨のム

コ多糖組織化学についてもあわせ検討を行っ

た。

材料および方法

ヒト胎生5か月の人工流産胎児(両親の御好

意により研究用に資した〉の全身長管骨を可及

的に軟部組織を除いたのち，肉眼的にAからG

の7層に分割した。組織学的に確認の上， rest司

ing zoneを A・B・C V:::. 3等分し transfor-

ming zoneを D・E に2等分した。 Ossifying

zoneをFとし，骨をGとした。 Transforming

zoneは restingzoneに比べ透明度が高いこと

から restingzoneからは容易に分別可能であ

った。 Ossifyingzoneと transforming zone

の聞は用手剥離で分離され， 骨と ossifying

zoneは容易に区別された。

Sprague Dawley系ラット生後3臼自の乳仔

30匹を用い，大腿骨・腔骨を筋および骨膜から

P紙上で可及的剥離除去し，ヒト胎児の長管骨

と同様に肉眼的に A: resting zone， B trans-forming zone， C: ossifying zon弓 D:骨に分

割した。 ラットに対してはめら硫酸(日本

アイソトープ協会)1μCijgを腹腔内投与し，

3時間後に長管骨の軟骨を採取し，軟骨を分割

することなくムコ多糖分析に用いた。

生化学的方法

分割採取した標本は湿重量測定ののち，アセ

トンで脱脂・乾燥させ，乾燥重量を測定した。

骨標品についてはアセトン乾燥に先立ち， 5%

EDTA中で48時間脱灰し， ついで、流水透析し

た脱灰標品を作製した。アセトン乾燥後，10ml

のトリス塩酸緩衡液 (pH7.3)中で， 1/50量

の pronase(科研〉を加え，3TC， 24時間 mc-

ubateし， IN NaOHを finalO. 3 Nになるよ

うに加え 4時間 i江cubateしアルカリ処理を

行った。その後 6N塩酸で中和し， 55% TCA

(final 5%)で除たんぱくし， 遠心分離後， 上

清を 2日間流水透析した。その後 1%酢酸カリ

ウムを含むエタノールを加えて24時間， 40Cに

寺島洋治:軟骨内骨化とムコ多糖 -3-

放置し，沈澱をえた。この沈澱をエタノール，

エーテルで沈浄・乾燥させ 1mlの蒸留水に

溶解し，粗性ムコ多糖標品とした4)。

ウロン酸は Bitter& Muir5) の方法により

グノレクロノラクト γをスタンダードとして測定

した。ヘキソースはガラクトースをスタンダー

ドとしてアンスロ γ法めにて測定した。硫酸含

量は Dodgeson& Price7)の比濁法を用い測定

した。

この標品に対し，ウロン酸含量測定後， Saito

の方法的にしたがい，コンドロイチナーゼ、 ABC

〈以下 Ch-aseABC と略す〉および AC(以下

Ch-as巴 ACと略す〉を用い(生化学工業)，コ

ンドロイチン硫酸(以下Ch.S. と略す〉の異性

体分別定量を行った。マーカーのLlDi-6S，

LlDi-'4S， LlDi-OS， LlDi-OSHは Ch.S. -C， Ch.-

S.-B， Ch.およびヒアノレロン酸(以下 HAと

略す〉を Ch-aseABCで分解したものを用い

た。

35S_硫酸は Aloka 液体シンチレーションカ

ウンターを用いカウントした。

Sephadex G-200によるゲノレF過は 1.6X85

cmのカラムを用い， O.2M酢酸ナトリウム

(pH6.8)で溶出したω。各フラグションは1.8

mlずつ採取し， それぞれのフラグションのウ

ロン酸，アンスロン値を測定した。 35S_硫酸を

とりこませたムコ多糖標品に対しては同時に

35Sのカウントを測定し A・B・C の3つの

フラグションに別け，ムコ多糖を再回収した。

組織化学の方法

それぞれ分割したヒト胎児，ラット乳仔期の

長管骨をヘマトキシリンエオジンおよびアルシ

アンフやルー (pH2.5)で染色した。

さらに乳仔期生後3日目の腔骨を 4Mグアニ

ジウム塩酸 (GuHCl)，pH 5.8， 40C 中で sti-

rringし 1週間放置した。 4MGuHClで処

理した長管骨を中性緩衡ホルマリンで固定し，

脱水，パラフィン切片として，ヘマトキシリン

エオジン，アルシアンフゃルー (pH2.5)， critical

巴lectrolyteconcentration法 (CEC法)10によ

る O.4MMgCl2ーアルシアンプ、ルー (pH5.8)

および O.8M MgCI2-アルシアンブルー (pH

5.8)染色を行った。ついで vanGieson， Ch-

ase ABC消化後のアルシアンプルー染色と，

アルシアンプゃル-van Gieson重染色を行っ

た。対照としては，酢酸緩衡液 (pH5.8)中で

1週間 stirring した乳仔期生後3日目の腔骨

Table. 1 Zonal analysis of glycosaminoglycans in epiphyseal bon巴sfrom human

fetus and suck1ing rats守

Zonal analysis from human fetus

A B C D E

Dry weight/wet weight 0.15 0.15 0.15 0.17 0.24

Uronic acid/dry weight* 354 352 342 438 294

Hexose/dry weight* 99 60 96 154 297

Hexose/uroni・cacid** 0，28 0.17 0.28 0.45 0.68

Sulphur/uronic acid料 4 0.65 0.78 0.78 0.78 0.82

Zonal analysis from suckling rats

A B C

Dry weight/wet weight 0.12 0.12 0.22

Uronic acid/dry weight* 352 632 64

Hexose/dry weight* 127 227 94

Hexose/uroni・cacid料 0.36 0.36 1. 45

Sulphur/uronic acid桝 0.58 0.37 0.75

* pmole/g

料 molarratio

F

0.38

73

61

0.84

0.83

D

0.25

19

21

1.11

0.75

G

0.56

5

6

1. 20

0.83

織

児長管骨，ラット乳仔長管骨ともに， ossifying

zone，骨で 0.83で最大値を示したが， ヘキソ

ースのウロン酸に対するモル比に比較するとそ

の変裁は小さかった (Table1)。ヘキソースの

骨化にともなう増量は，ケラト硫酸，あるいは

ムコ多糖抽出時に共存する糖たんぱく，または

グリコーゲンの増加によるものと考えられる。

硫酸主主の骨化にともなう増量は，ケラ卜硫酸

の増量を推定さぜる。

ヒト胎児長管骨各層における Ch.S. 異性体

および HAの分別走量では， 各具性体Jこ対す

る百分率でみると， .dDi-6Sは ossifyingzone，

骨で漸減し， .dDi-4Sは ossifyingzoneで特異

的に低下し，骨では最も高かった。.dDi-OSは

transforming zoneで最も少なく， restmg zone

で比較拘高値を示した。.dDiーOSHは ossifying

zO:leに特異的に高値を示した (Fig. 1)0 Ossi

fying zon告における.dDi-OS~-I の増量.dDi-

6Sの減少が最も著明な組成変化と考えられる。

新生仔ラットに in'vivoで 355_硫酸をとり

こませた 3時間後に四肢長管骨軟骨を採取し，

抽出した粗性ムコ多糖の SephadexG-200にお

ける溶出ノ4ターンでは (Fig.2)， ウロン酸の

曲線と 35S_硫酸の溶出曲線が一致せず，分子サ

イズの高い方の溶出容積 (elutionvolume)に

組J之、仁3

生化学的所見

乾燥重量当りのウロン酸含量はtransforming

zoneでヒト胎児で 432.8μmol巴/g， ラット乳

仔で 63l.8μmole/g，乾燥重量と最も多く，

ossifying zoneで急激に低値を示しヒト胎児

で transformingzoneの 1μ， ラット乳仔で

1/10であった (Table1)。

湿重量当りの乾燥重量ではウロン酸含量とは

逆に骨から restingzoneに向かい低下する傾

向を示し，ムコ多糖のもつ水分保持能を考えあ

わせれば当然の結果といえよう (Table1)。

乾燥重量当りのヘキソース含量は t:'a::sfor-

ming zoneでヒ卜胎児で 297.3μmoleg， ラッ

ト乳仔で 227.4μmole/g，乾燥重量と， ともに

最も多く，ウロン酸含量と同様の傾向を示し

た。ウロン酸に対するヘキソースのモル比をみ

ると (Table 1)， ヒト胎児長管骨では resting

zoneから骨に向かし、漸増する傾向がみられ，

骨で最大値l.20をえた。ラット乳仔でも同様で

transforming zoneで最大値1.45，骨で1.1の

そル比を示した。

硫酸基のウロン酸に対するモル比は，

結-4-

を用い上記の染色を行った。

結 果

ヒト胎

100

60

. 。

o

o

E

4

2

ωらω孟OωFおパV占口』戸

3m二

ejvpOLhucozuhFomu↑cuυEhωヰ

O

ZQne

Fig. 1 Isomeric chondroitin s司lphateand hyaluronic acid were zonally analyzed in glycosaminoglycans of epiphyseal bones from human fetus

ムDi4Se-e， ムDi6S0-0， ムDiQS，L三一一一ムムDiQSH企一-A

多糖を回収し，それぞれのフラグションのウロ

ン酸量，へキソース量 358_硫酸のカウント，

硫酸含量を測定した (Table2)。

その結果は図-2の溶出パターンと一致した

ものであり，ウロン酸に対する硫酸のモル比は

Cフラグションで最も高く，さらに Ch-aseA

BC消化に抵抗性でぺーパグロマトグラム上原

点にとどまる， いわゆる resistantcomponent

のおら硫酸のカウントはフラグションCで最も

高かった。したがって， void volumeに出現す

るヘキソースがケラト硫酸を示しているとは考

え難しヘキソースを多量に含む物質，すなわ

ち糖たんぱくあるいはグリコーゲ、ンの存在が示

唆された。

ついで，ヒト胎児長管骨の各層別に抽出した

粗性ムコ多糖をそれぞれ， 8ephadex G-200で

溶出し，その溶出液のウロン酸，アンスロン値

を測定した (Fig.3)。

その結果， ウロン酸は elutionvolume中に

major peakを，そして voidvolum巴に minor

peakをもっ溶出曲線を示した。 各層別にウロ

ン酸の peakの変動をみると， resting zoneか

ら ossifyingzoneに向かう軟骨層で溶出 peak

の前後への shiftはみられなかったが major

peak vま restingzoneヵ、ら ossifyingzone に

向かうにしたがし、低くなり， void volumeに出

- 5ー寺島洋治:軟骨内骨化とムコ多糖

0.1

0.'

4 a

o -0.3 ，.， " F > E U

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0.'宮前

" " 。0.1

0.1

4

3

2

1

0

0

0

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ggeaae

ベ

Fig. 2 Glycosaminoglycans in the epiphyseal cartilage of newborn rats were eluted on ~

Sephadex G-200. A column (1. 2x 80cm) ，~

was eluted with 0.2 M sodium acetate 司buffer (pH 6.8). Effuluent fractions >1

(0.6ml) were analyzed for uronic acid .， (0-0)， hexose (口一一口) and 出s- ，~

叫 hatecou山(ム一一ム〉， ;

shift L --c to f) ，この時期では， 既存の細胞間i基質ムコ多糖よりも，分子サイズの大きい硫酸

化ムコ多糖を合成していることが考えられた。

アンスロン法で測定したヘキソースの溶出曲

線の peakは voidvolumeに一致してみられ，

ウロン酸の溶出曲線に一致した minorpeakが

存在した。これらの溶出液をヘキソースの ma-

jor peak，ウロン酸の majorpeakを中心に，

A， B， C の3つに subfractionationし，ムコ

句釘胸

effue"t凶 1，喧(，.1)

Table. 2

C (50-71)

Per cents of total fraction

Uronic acid 20.2 54.8 25.0

3;SO， specific acti vity* 41.2 30.4 28.4

Hexose 46.8 20.8 32.4

Sulfur 19.7 53.9 26.8

Molar ratio

Hexose/Uronic acid 0.74 0.13 0.43

Sulfur/Uronic acid 0.83 0.89 0.96

Chondroitin sulfate isomers(%)

Ch6-S 5.7 6.1 10.5

Ch4-S 87.8 87.0 77.3

ChO-S 4.5 5.1 8.6

Resistant components 2.0 1.8 3.6

B (38-49) A (26ー37)Fraction

* 3;S04， cpm/μmole of uronic acid

織組ノ』p 結- 6ー

D

/J/AγliJitJlolli--lJ46It--fλγfj

l

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Fig. 3 Glycosaminoglycans in the epiphyseal cartilage and cone from human fetus were eluted

on Sephadex G-200. Effuluent fractions (1).6ml) were analyzed for uronic acid (0--0) and hexose (e一一一.)

A ; resting zone， D ; transforming zone， F ; ossifying zone， G ; bone.

volume中の majorpeakは認められなかっ

た。

他方，ヘキソースの溶出曲線は各層ともに軟

骨におけるウロン酸の minorpeak，骨の ma-

現する minor peak が漸高ずる傾向をえた。

骨では， ウロン酸の majorpeakは voidvol-

meの位置に(軟骨各層では minorpeakであ

った位置〕出現し，軟骨にみられた elution

寺島洋治.軟骨内骨化とムコ多糖 - 7ー

jor peakに一致する voidvolume に最大の

peakをもち elutionvolume でのウロン酸の

peakに一致した minorpeakが認められた。

ヘキソースの majorpeal王は restingzone か

ら骨に向かうにつれて漸増する傾向を示した。

軟骨が restingzoneから ossifyingzone に

向かうにつれ，ムコ多糖鎖の分子サイズの大き

な構成成分が増加し，骨ではこの大きな構成成

分が主成分となっており，さらに総ヘキソース

量の restingzoneから骨への増加は voidvo-

lume に出現するへキソースの増加を意味して

いることが判明し7こ。

組織化学的所見

4M GuHCl処理群では restingzone全般

と， transforming zoneの周辺部でアルシアン

ブ、ルー染色が陰性化し， transforming zone中

心部 0宮sifyingzone 骨でアルシアンブルー染

色が陽性であった (Fig.4)0 4M GuHCl処理

群を Ch-aseABCで消化後アルシアンブルー

染色を行うと， transforming zone中心部の染

色性も失なわれ， ossifying zoneでは染色性に

変化はなく (Fig.5)，この部位が 4MGuHCl

抽出にも Ch-aseABC消化にも抵抗性の，い

わゆる resistant proteoglycanが存在すること

が推定された。

Q.9M MgCbーアルシアンブルー染色では，

ossifying zone， 骨でやや染色性が低下するの

が認められた。

van Gieson染色では， 対照群無処理群で染

色性が少なく薄桃色を呈したが， 4M GuHCl

処理群ではアルシアンフ事ルー染色の陰性化した

部位での染色性が増加し，赤色に濃染した。さ

らに， アルシアンフゃル-van Gieson重染色で

アルシアンプソレー陰性化の部位にのみコラーゲ

ンの濃染が確認された (Fig.6)。軟骨におけ

るコラーゲンの染色性は proteoglycanにより

マスクされており， proteoglycanの除去によ

り，コラーゲンの染色性が増強したものと思わ

れ， コラーゲンと proteoglycanの強い結合性

あるいは int巴ractionが示唆された。

他方，軟骨細胞は 4MGuHCl処理により，

アルシアンプノレーが陰性化しコラーゲン染色が

濃染化した部位， すなわち proteoglycanの除

去された部位で著明な aggregationを起こして

おり，細胞相互の連絡支持の役割が proteo-

glycanの除去により失なたれたものと考えら

れた。

考按

結合組織は支持組織としての役割をもち，細

胞間構成物質としてコラーゲン proteoglycan

が主成分である。そのなかでも，軟骨・骨組織

は支持組織として機能が大きく，コラーゲン，

proteoglycanの組織中で占める機能的・量的比

重は大きい。

線維間物質としての proteoglycan は上記υ

の組織構材物質としての役割のほかに， 2)親

水性の大きなことから細胞外液の容量調節機

能， 3)ムコ多糖鎖の酸性基のもつイオン調節

機能， 4)石灰化・骨化に対する役割， 5)組

織の線維化の調節， 6)滑剤としての役割など

があげられ11l7)最近は上記の機能とあわせ，

細胞分化の phenotypicexpressionにおける最

も重要な epigeneticfactorのひとつとしての

proteoglycanの役害U12)が注目されている。

今回の著者の実験では， proetoglycanのもつ

多くの生体機能のうち， proteoglycanの石灰化

.骨化における機能を追究することを目的とし

て，ラット乳仔期・ヒト胎生 5か月の長管骨の

酸性ムコ多糖の zonalanalysisを行った。

ラット軟骨中の酸性ムコ多糖は95%がCh-4S

とされ1へその酸性ムコ多糖の質的変化を細胞

機能と対比して検討するのは適当ではないと容

易に推測されるが，寺島によれば山，組織学的

に軟骨組織の器官としての分化の完了した胎生

15日のラット軟骨中の酸性ムコ多糖の分析か

ら， Ch-6Sが約 25%存在し，胎生末期から新

生仔期になるにしたがい， Ch-4Sが増加し，

Ch-6Sが減少する傾向が認められた。 この結

果は，岩田 Mathewsらによるヒト肋軟骨の

酸性ムコ多糖の加令にともなう変動結果と一致

し，彼等の報告によれば，ヒト胎生期では，

Ch-6Sの Ch-4Sに対する比率が高く，新生児

期に向かうにしたがL、Ch-4Sの比率が高くな

り，その後加令とともに， Ch-6Sの Ch-4Sに

- 8一 結合組織

〆

，

Fig. 4 Tibial bones from newborn

rats were lincubated with 4M

GuHCl (pH 5.8) at 40C for 7

days. After incubation， samples were fixed in neutral buffered

forma1in and stained with alci-

an blue. Alcian blue stain明 as

positive in bone， ossifying car-tilage and the deep area of tr-

ansforming zone. Fig. 4-A ; x40， Fig. 4-B xl00

寺島洋治;il次骨内骨化と ムコ多糖 - 9 ー

-ー1 ・.

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，

Fig， 5 Tibial l:ones from newborn

lats were sequentially treated

with 4恥1:GuHCl and d:ondroi-

tinase ABC. Alcian blue stain-

ing materials remained in ossト

fying zone. xlOO.

Fig. 6 Combined stainins of tibial

I:ones from newl:orn rats with

van Gieson-alcian blue after

incubation with 4M GuHCl.

Tl:e area of tl:e matrix， where

alcian blue stain became nega-

tive， was stained more exten，

sively by van-Gieson after Gu-

HCl extraction. xl00

VG ; van-Gieson staining area， AB ; alcian blue staining area.

-10ー 結合組織

対する比率は再度上昇すると L、う。ラット軟骨

の場合，幼若期，成熟ラットでは Ch-4Sが大

部分でこの加令変動はヒトの場合とは異ってい

た。

生体の軟骨ムコ多糖組成比は Mathewsによ

れば，下等脊椎動物では Ch-6Sが主成分であ

り，高等な脊椎動物では比較的 Ch-4Sの占め

る割合が高く，さらにヒト軟骨とは異なり，加

令とともに Ch-4Sが増大する傾向を示し，

Ch-6Sは胎仔期に特有であると L、う。 ムコ多

糖組成からみた個体発生と系統発生の聞の関係

と，その生理学的意義についても検討が加えら

れているが，少なくとも，胎生ラットの軟骨細

胞が分化を了えた時点から，軟骨内骨化のはじ

まる時期までのムコ多糖の加令変化は，ヒトの

場合と同様の傾向を示しており，軟骨細胞の成

熟化と，配列の決定そして軟骨内骨化の準備段

階という一定の biologicalsequence にムコ多

糖の存在様式が密接な関係をもっていることを

推測さぜる。

軟骨細胞の成熟・配列は組織学的には， rest-

ing zone， transforming zoneとして観察され

軟骨細胞が肥大し (hypertrophicci1rtilage)，

壊死に近ずくにつれ matrix中に石灰化がお

こり，この層は槍状に骨幹部に向かつて延び，

ossifying zoneとして観察される。

これらの層を肉眼的に分割し，ムコ多糖を抽

出した今回の実験では，必ずしもそれぞれの分

割部位が各層に完全に一致したとはいえない

が，ヒト胎児・ラット乳仔の長管骨の各層のム

コ多糖収量が resting zone でほぼ一定し，

transforming zone で最大となり ossifying

zoneで著減し， 骨で最小となった結果は， 組

織学的にラット乳仔長管骨において transfor-

ming zoneで最もムコ多糖染色が強く，さらに

35S一硫酸によるオ-]:-ラジオグラム所見で最も

grainのとりこみが多く，ついで restingzone，

ossifying zone， 骨の 11慣にとりこみが少なくな

ったという中)11の結果15) と一致しており， 中

村16)，Campo17jの牛肩甲骨 zonalanalysis の

報告とも一致しており，ほぼ samplingしてえ

た粗製ムコ多糖標品の分析結果は長管骨各層を

反映したものと考えられた。

また，ラットの骨端核出現は生後約7日から

8日にみられ18) ラット生後3日目は骨端核出

現の影響力が少なく，さらに肉眼的分割が可能

な大きさをもっという利点があった。

Ch. S 異性体および HAの組成の各層での

分布はラット乳仔では JDi-4Sが95%以上の部

位のみで，その差異は認められなかったが，ヒ

ト胎児の場合においては， resting zoneにおけ

る JDi-OSの増量， ossifying zoneの HAの

著増， JDi-4Sの減少，骨の JDi-4Sの増加と

いう一連の変化がみられた。 restingzoneにお

ける JDi-QSの増量の生物学的意義については

不詳であるが，ヒト胎生期肋軟骨の加令変化

で，初期に JDi-QSが増加し，漸減していくと

いう岩田の報告とあわせ考えると，分化初期の

幼若期軟骨および，軟骨基質ムコ多糖分泌の旺

盛でない restingzoneの細胞は， 硫酸転移の

おこなわれていない，あるいは脱硫酸化された

JDi-QSを産生していることが推定される。

Ossifying zoneは石灰化の initiation がお

こなわれる部位であり，その軟骨基質中のムコ

多糖の組成変化は組織における機能的変化と対

比される。この軟骨層では組織学的には血管侵

入とともに，血管内皮細胞・血液細胞・間葉系

細胞の侵襲がみられる。骨芽細胞への分化(骨

芽細胞の起源となる細胞については議論の多い

ところであるが，形態的には軟骨細胞の壊死・

崩壊に続いて，骨芽細胞が出現すると考えられ

る19))に先立ち， HAが増量するという点につ

いては，間葉系細胞の軟骨細胞への分化に先立

ち HAが増量L， ヒアルロニダーゼ、活性の上

昇により HAが減少し分化がおこるという報

告別)，2lJとあわせ考えると， 未分化な細胞の分

化がおこなわれる部位には先き立つ HAの増

量が，さらに HAの増量した場が必要であり，

HAの除かれた場に細胞分化がおこなわれるも

のと考えられる。したがって未分化な細胞群が

HAを産生し，骨芽細胞への分化(，こ役割をはた

しているものといえよう。

ムコ多糖含量の減少および JDi-4Sの減少に

について， Jibri122) は牛肩甲骨のたんぱく分解

酵素を調べ， ossifying zoneでその活性上昇を

認め prot巴oglycan のたんぱく部分が分解さ

寺島洋、治:軟骨内骨化とムコ多糖 -11ー

れムコ多糖鎖の組織内保持が不可能となり，組

織中のムコ多糖含量が減少するものと考えた。

さらに Woodwardら23)の Ch.S. Aーたんぱく

複合体が Cζイオンを抱合し，たんぱく部分の

分解とともに Caイオンが放出され，石灰化に

利用されるという 2つの説を，著者らの実験結

果は支持することになる。しかし，たんぱく分

解酵素活性の上昇が存在するとしても， Ch-4S

が分解をうけやすく， Ch-6Sが分解をうけ難

いのか，あるいは軟骨細胞以外の侵入した細胞

群が HA以外に合成した Ch.Sの影響はどう

か，など多くの問題を含んでいる。今回の実験

結果からは合成・分解両者のバランスの上に立

った Ch-S組成の変化が中心で， この結果か

ら合成・分解いずれの影響が主体かは論じられ

なL、。いずれにしても，こういったムコ多糖鎖

成分の変化が軟骨基質の石灰化という現象に最

も至適な状況をつくりだしていることが推測さ

れる。

ムコ多糖鎖の組成上の変化だけではなく，多

糖鎖全体の， そして proteoglycanの分子とし

ての大きさの生物学的意義についても，最近多

くとりあげられている。 Muir24) は豚関節軟骨

の proteoglycanには分子サイズの大きなもの

と，小さなものにわけられ，胎生期で分子サイ

ズの大きなものが多く抽出性もよいが，出生後

には分子サイズの小さなものが増し，抽出性も

おちるとL、う o Kimeta25) は鶏匪12日目の長管

骨の軟骨の proteoglycanは比重の大きい成分

Hと比重の小さい成分Lに分離され， Lは細胞

内， Hは細胞外に見出され，骨端部で Lが多

く，さらにH，L¥， 、ずれにおいても多糖鎖部分

では骨化に近い層ほどその長さを増すと L、う。

今回の著者らの実験結果から，ムコ多糖鎖部分

においても，分子サイズの大きな成分と，分子

サイズの小さな成分にわけられ restingzone

から骨に移行するにつれて，分子サイズの大き

な多糖鎖成分が増す傾向をえた。さらにヘキソ

ース量は restingzoneから骨に移行するにつ

れて増量し， その SephadexG-200溶出曲線

は，ウロン酸の分子サイズの大きい成分と一致

する voidvolumeに出現した。 このへキソー

ス溶出部は硫酸含量が少なく，さらに 35S一硫酸

の Ch-aseABC抵抗成分へのとりこみも，そ

の他の溶出部位よりも少ないことから，ケラト

硫酸とは断定し難い。ムコ多糖抽出時に共沈し

た糖たんぱくあるいはグリコーゲ、ンとも考えら

れ，このヘキソースの同定は今後の問題である

が， zonal analysisにおけるシアル酸の存在が

報告されており26um， その Caイオンとの結

合性についても述べられている加が，詳細は不

詳である。ただ ossifyingzone の部位より

PAS染色が陽性化する傾向にあり 29) ヘキソ

ース量の増量と PAS染色陽性の所見が一致

し，その石灰化とし、う局在に何らかの役割をし

めていることも考えられる。

こういった長管骨の酸性ムコ多糖の量的・質

的変化が各層別に存在する一方，細胞開基質の

主成分の一つで、あるコラーゲンfi，そのコラー

ゲン分子 (3本鎖〉として皮膚・骨などのコラ

ーゲン [α1(I)J2的とは異なり， [α1 (II)J ~O) とい

う組成をもち，さらに骨・皮膚にみられる 640

Aの周期性横紋よりもその局期性が短かい3))と

され，軟骨層別では軟骨端から骨化点に移行す

るにつれコラーゲン合成が旺盛になる32)ことが

認められてし、る。組織学的に各層を検索する

と vanGiesonによるコラーゲン染色は淡染

するにすぎない。しかし， 4M GuHClによる

proteoglycanの抽出後，アルシアンプやルー染色

の陰性化した部位にコラーゲン染色が濃染する

ことから proteoglycan の存在下ではコラー

ゲンの染色は不顕化し， コラーゲンと proteo圃

glycanの強い結合性が推定された。さらに4M

GuHClで proteoglycan の抽出に抵抗する，

いわゆる resistantprot巴oglycan33)が ossifying

zoneに局在し， またこの部分は Ch-aseABC

消化にも抵抗性であって，骨化の initiateする

この層でケラト硫酸の局在，さらに Caイオン

の結合という点で石灰化に重要な関連をもっコ

ラーゲン34)の量的・質的変動にともなう，コラ

ーゲンと proteoglycanの結合性の増加， さら

には糖たんぱく成分の増加といったことが，こ

ういった resistantproteoglycanを生ぜ、しめる

ものと考えられる。

現在のところ，なお骨化の機序は不詳である

が，ムコ多糖の質的・量的変動， コラーゲン合

- 12一 結合組織

成の克進 resistantproteoglycanの存在，あ

るいはヘキソースの増量など，各軟骨層の変化

が骨化の initiationの場である ossifyingzone

に集約されており，細胞間基質の変動が細胞機

能により修飾されていると同時に，細胞自身の

もつ機能をも規定するという可能性を考える

と，こういった細胞間基質の性状の変化が骨化

におよぼす影響は重要な意義をもっているもの

と考えられる。

まとめ

ヒト胎児および乳仔期の長管骨を restmgzone

transforming zone， ossifying zone，骨に分割

し，それぞれ抽出した酸性ムコ多糖の量的・質

的変動を追究した。 ムコ多糖含量は transfor-

mmg zoneで最も多く， ossifying zoneで激減

し，さらに ossifyingzone ではムコ多糖組成

上 HAの増量， Ch-4Sの減量という特異的な

変化がみられ， HAの増量は骨化に関連する未

文

分化細胞の機能に， Ch-4S の減量は軟骨基質

の石灰化に関連した変化と考えられた。

ムコ多糖鎖の各層における差異は，各層とも

に分子サイズの大きな成分と，小さな成分にわ

けられるが， resting zoneから骨に移行するに

つれ，サイズの大きな成分が増加する傾向がみ

られ，さらにヘキソースの増量が認められた。

4M GuHClで長管骨中の proteoglycanを抽

出し，抽出後にムコ多糖染色を行うと， ossify-

ing zone は特異的に抽出に抵抗性であり，さ

らにこの部位は Ch-as巴 ABC消化にも抵抗性

であることから resistant proteoglycanの局

在部であると考えられ，コラーゲンとの強い結

合性によるものと推測された。上記のムコ多糖

の質的変動とあわせ，軟骨の石灰化に重要な役

割をはたしているものと推定された。

(本論文の要旨は第5回結合組織研究会総会に

おいて発表した。〉

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