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赛默飞生命科学质谱临床检验液质解决方案

Clinical Research and Forensic Toxicology

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服务科学，世界领先 ── 赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额 170 亿美元，在 50 个国家拥有员工约

50,000 人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决

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赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国已超过 30 年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉

等地设立了分公司，员工人数超过 3800 名。为了满足中国市场的需求，现有 8 家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北

京和上海共设立了 6 个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海

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Thermo ScientificTM 品牌下生命科学质谱（Life Science Mass Spectrometry）前身为著名的质谱先驱－美国菲尼根（Finnigan）质谱仪制造商。从 1967 年成立至今的五十年来，Finnigan 质谱一直以无与伦比

的研究成果保持着质谱技术的世界领先地位，拥有最全的质谱产品线。Thermo ScientificTM 专利独有的 3 大质量分析器技术：可

以产生完美理论电场的共轭双曲面四极杆、可以用于定量定性的线性离子阱（LTQ）以及超高分辨的静电场轨道阱（Orbitrap）。

Thermo ScientificTM 色谱与质谱产品进入中国二十多年来，与改革开放中的中国一起成长壮大。在北京、上海、广州等多个地区设

有分支机构，发展并建立了以客户需要为中心的组织架构，业务内容覆盖中国大陆及香港地区，并拥有广大用户的积极认可与支持。

在环保、农业、公安、商检、石油、化工、地质、检疫、制药、卫生、核科学等领域与中国研究单位开展积极的科研合作。

服务科学 · 世界领先

赛默飞世尔科技

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1967 Finnigan 成立于美国加利福尼亚的 Palo Alto

1968 世界上第一台四极杆型 GC/MS ( Model 1015 ) 用于斯坦福大学

1971 世界上第一台智能 GC/MS/DS 用于美国环境保护局 ( EPA )

1976 历史上最成功的质谱仪，推出 4000 系列 GC/MS 和 INCOSTM MS 数据系统

1977 推出世界上第一台商品化 LC/MS

1978 发展了具有专利权的脉冲正负离子化学电离源；推出世界上第一台配备冷柱头进样器的定量毛细管 GC

1980 推出世界上第一台三重四极杆 MS/MS ( TSQ® ) 质谱仪

1981 MAT 公司是世界上著名的有机磁质谱仪和气体同位素质谱仪的生产厂商， Finnigan 与之合并并重新命名为 Finnigan

MAT 公司。生产高灵敏度、高准确度和高精密度的气体同位素比质谱仪 ( Model 251/261 )

1982 推出低价位、结构紧凑的 Delta 系列同位素比 MS

1983 推出获得专利权的离子阱 DetectorTM ( ITDTM ) 和热喷雾 LC/MS 接口

1986 推出全数字化三重四极杆质谱仪 ( TSQ® 70 ) 和磁式质谱仪 ( MAT 90 )

1989 LDC/Milton Roy 被 Thermo Electron 收购；ESI 源作为 LC/MS 的接口用于 TSQ® 70 质谱仪

1990 Finnigan MAT 被 Thermo Electron 收购

1991 推出世界上第一台 MALDI/TOF ( LASERMATTM )

1993 Spectra-Physics Analytical 被 Thermo Electron 收购

1995 Finnigan 推出 GCQTM 和 LCQTM 台式离子阱质谱仪；并推出 ELEMENT，高分辨的磁式 ICP/MS

1997 推出 TraceTM GC 和 GC/MS 多进样器 / 多检测器毛细管系统、AQATM 台式四极杆 LC/MS；推出全面兼容 MSn 数据系

统的 XcaliburTM 质谱控制及数据处理软件

1999 推出 LCQTM DUO 和 LCQTM DECA 离子阱质谱仪；TRITON TI 同位素比 MS

2000 推出 TEMPUSTM 超快速 GC/TOF-MS；NEPTUNE 多接收器高分辨 ICP-MS

用于 LC/MSn 的 SurveyorTM HPLC；Polaris QTM EI/ CI GC/MS/MS

2001 推出世界上第一台高分辨、超小型的台式三重四极杆质谱仪 TSQ Quantum

2001 推出第三代离子阱质谱仪 LCQTM Advantage 和 LCQTM DECA XP

2002 推出世界上最小的液质联用仪 Surveyor-MSQ、更高灵敏度的 LCQTM DECA XP plus、最领先的第五代气质联用仪 Trace

DSQTM、超快速气相色谱 FastGC、Focus GC 和高通量蛋白质组学研究平台 ProteomeX

2003 推出线性离子阱 - 高分辨傅立叶回旋共振质谱 LTQ FTTM MS，可精测质量的高分辨三重四极杆质谱 TSQ Quantum

Ultra AM 和线性离子阱质谱 LTQTM

2004 推出单通道气质联用仪 Focus DSQ、第二代 Proteome X LTQ、TSQ Quantum Discovery MAX 和 vMALDI 源；推出

MSQ Plus 单级四极杆质谱系统；推出 LCQTM Advantage MAX 和 LCQTM DECA XP MAX

2005 推出结合了精确质量数测定和多级质谱功能的新一代仪器 LTQ Orbitrap，适合于超高要求的蛋白质组学和药物研究；推

出 LXQ 线性离子阱，推出 Focus PolarisQ 和新型高分辨磁质谱 DFS

2006 推出灵敏度更高的 Trace DSQTM Ⅱ和更高性价比的 TSQ Quantum Access

2007 推出 LCQ Fleet，结合 ETD 电子转移解离裂解源这一创新技术的 LTQ XLTM

2008 推出结合电子转移解离 ( ETD ) 和基质辅助激光解析电离 ( MALDI ) 能力的 LTQ OrbitrapTM 系列高分辨组合质谱

2011 推出世界首款商业化混合型四极杆静电场轨道阱质谱 Q Exactive

2013 推出世界首款商业化三合一 FusionTM TribridTM 质谱仪以及全新一代高性能三重四极杆液相质谱仪 TSQ Endura 和

TSQ Quantiva

2014 推出专为常规分析应用而设计的 Q Exactive TM Focus 四极杆 Orbitrap 组合型质谱仪，确保系统的稳定运行和超高的分析

性能；推出 TSQ 8000TM Evo 三重四极杆 GC-MS/MS，提供高质量分析结果

赛默飞生命科学质谱悠久的技术传统历史

赛默飞生命科学质谱源于质谱先驱－美国菲尼根（Finnigan）质谱，拥有业内最为完整的质谱产品线。

我们非常愿意与您分享长达 50 年的科学质谱仪器的制造和使用经验，可以为您提

供临床检验和研究分析的完整解决方案。

Transcend Ⅱ TLX & LX 系统使用

赛默飞专利独有的在线前处理技

术 TurboFlow，有效缩短样品前

处理的时间，提高分析测试效率。

Prelude SPLC ™ 系统为质谱

仪分析复杂样品提供自动净化

功能的同时，能够保持高重现

性和高效率的分离功能，定量

准确性也更易应用于临床研究

和毒理学实验室。

TSQ 三重四极杆液质联用

系统使用赛默飞专利独有的

严格的共轭双曲面四极杆质

量分析器，独有高分辨率的

SRM 检测模式。

TSQ 8000 Evo 三重四极杆

气质联用系统使用 EvoCell

技术，具备更高的灵敏度和

分析速度。

LTQ 系列线性离子阱液质联用系统使用赛

默飞专利独有的线性离子阱质量分析器，

具有更高的离子阱容量、更高的捕获效率，

是兼顾定性和定量的质谱仪。

Orbitrap FusionTM TribridTM 质谱

仪集赛默飞独有的共轭双曲面

四极杆质量分析器、线性离子

阱质量分析器和超高分辨率的

Orbitrap 于一体，具备了创新

性的三合一质量分析器结构，

能够对复杂生物样品进行前所

未有的深度分析。

LTQ Orbitrap 系列超高分辨液质联用系统

使用赛默飞专利独有的高分辨质谱技术

Orbitrap，实现超高质量精确度，分辨率，

动态范围和灵敏度。

Q Exactive 系列超高分辨液质联

用系统将共轭双曲面的四极杆质

量分析器与具有超高分辨率和质

量精度的 Orbitrap 检测技术相结

合，提供优异定性和高分辨定量

能力。

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014年赛默飞保留所有权利，所有其他商标归赛默飞及其子公司所有。

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TraceFinderTM 软件

集定量、筛查、报告功能为

一体的质谱工作站

● 集仪器控制、方法编辑、数据采集、自动数

据处理和报告一体的流程化操作软件

● 兼容常规分辨率质谱和高分辨率质谱的数据

分析

● 拥有定量检测和定性筛查功能

● 客户个性化定制的报告模板

● 内置质谱方法和化合物数据库，可以用于多

种项目的定量检测和定性筛查

适用于质谱分析的部分化合物列表

在临床检验与研究中

激素及内源性物质

精氨酸 Arginine

同型半胱氨酸 Homocysteine

谷氨酸 Glutamic Acid

牛磺酸 Taurine

γ- 氨基丁酸 γ-Aminobutyric Acid

亮氨酸 Leucine

缬氨酸 Valine

酰基肉碱 Acyl Carnitine

尿嘧啶 Uracil

尿苷 Uridine

腺苷 Adenosine

腺嘌呤 Adenine

多巴胺 Dopamine

高香草酸 Homovanillic Acid

五羟色胺 Serotonin

抗坏血酸 Ascorbic Acid

变肾上腺素 Metanephrine

去甲变肾上腺素 Normetanephrine

左旋多巴 Levodopa

卡比多巴 Carbidopa

甲羟戊酸 Mevalonic Acid

心磷脂 Cardiolipin

去甲肾上腺素 Norepinephrine

肾上腺素 Epinephrine

3,4- 二羟基苯甲胺 3, 4-Dihydroxy Benzoic Amine

叶酸 Folic Acid

血管紧张素 I Angiotensin I

血管紧张素 II Angiotensin II

25- 羟维生素 D2 25-Hydroxy Vitamin D2

25- 羟维生素 D3 26-Hydroxy Vitamin D3

1,25 - 双羟基维生素 D2 1,25-Dihydroxy Vitamin D2

1,25 - 双羟基维生素 D3 1,25-Dihydroxy Vitamin D3

雌酮 Estrone

雌二醇 Estradiol

雌三醇 Estriol

双烯雌酚 Dienestrol

己烯雌酚 Diethylstilbestrol

己烷雌酚 Hexestrol

可的松 Cortisone

氢化可的松 Hydrocortisone

醛固酮 Aldosterone

去甲雄酮 Nandrolone

勃地酮 Boldenone

脱氢表雄酮 Dehydroepiandrosterone

氧雄龙 Oxandrolone

睾酮 Testosterone

表睾酮 Epitestosterone

福美司坦 Formestane

康力龙 Stanozolol

羟甲睾酮 Oxymesterone

氯司替勃 Clostebol

氟甲睾酮 Fluoxymesterone

羟司坦唑醇 3-Hydroxystanozolol

皮质醇 Cortisol

皮质酮 Cortisone

胰岛素 Insulin

TDM 治疗药物监测

阿立哌唑 Aripiprazole

阿米替林 Amitriptyline

阿普唑仑 Alprazolam

埃罗替尼 Erlotinib

安非他明 Amphetamine

安非他酮 Bupropion

奥氮平 Olanzapine

奥卡西平 Oxcarbazepine

奥沙西泮 Oxazepam

巴氯芬 Baclofen

苯巴比妥 Phenobarbital

苯海拉明 Diphenhydramine

苯妥英钠 Phenytoin sodium

苯乙基丙二酰胺 Phenylethylmalonamide

丙氯拉嗪 Prochlorperazine

丙咪嗪 Imipramine Hydrochloride

丙戊酸 Valproic Acid

丙氧芬 Propoxyphene

布洛芬 Ibuprofen

达沙替尼 Dasatinib

地尔硫卓 Diltiazem

地西泮 Diazapam

地昔帕明 Desipramine

杜冷丁 Meperidine

度硫平 Dosulepin

度洛西汀 Duloxetine

多虑平 Doxepin

多西拉敏 Doxylamine

凡德他尼 Vandetanib

非尔氨酯 Felbamate

吩噻嗪 Phenothiazine

奋乃静 Prochlorperazine

氟奋乃静 Fluphenazine

氟伏沙明 Fluvoxamine

氟哌啶醇 Haloperidol

氟西泮 Flurazepam

氟西汀 Fluoxetine

环孢霉素 A Cyclosporine A

环孢霉素 D Cyclosporine D

环氧卡马西平Carbamazepine-10,11-

epoxide

加巴喷丁 Gabapentin Hydrochloride

甲丙氨酯 Meprobamate

咖啡因 Caffeine

卡马西平 Carbamazepine

可替宁 Cotinine

喹硫平 Quetiapine

拉科酰胺 Lacosamide

拉莫三嗪 Lamotrigine

拉帕替尼 Lapatinib

利多卡因 Lidocaine

利眠宁 Chlordiazepoxide

利培酮 Risperidal

利扎曲坦 Rizatriptan

莨菪碱 L-hyoscyamine

硫利达嗪 Thioridazine

卢非酰胺 Rufinamide

氯丙嗪 Chlorpromazine

氯氮平 Clozapine

氯米帕明 Clomipramine

氯硝西泮 Clonazepam

马普替林 Maprotiline

霉酚酸 Mycophenolic Acid

美沙酮 Methadone

美索哒嗪 Mesoridazine

美托洛尔 Metoprolol

咪达唑仑 Midazolam

米安色林 Mianserin

米氮平 Mirtazapine

米尔塔扎平 Mirtazapine

米那普伦 Milnacipran

奈法唑酮 Nefazodone

尼罗替尼 Nilotinib

帕罗西汀 Paroxetine

哌甲酯 Ritalin

扑尔敏 Chlorpheniramine

扑痫酮 Primidone

普拉克索 Pramipexole

普里米酮 Primidone

异丙嗪 Promethazine

普瑞巴林 Pregabalin

曲唑酮 Trazodone

去甲氯氮平 Desmethylclozapine

噻加宾 Tiagabine

三氟拉嗪 Trifluoperazine

三甲丙咪嗪 Trimipramine

三唑仑 Triazolam

舍曲林 Sertraline

舒马普坦 Sumatriptan

舒尼替尼 Sunitinib

司替戊醇 Stiripentol

索拉非尼 Sorafenib

他克莫司 Tacrolimus

替马西泮 Temazepam

托吡酯 Topiramate

维拉帕米 Verapamil

文拉法辛 Venlafaxine

西罗莫司 Sirolimus

西酞普兰 Citalopram

西替立嗪 Cetirizine

伊马替尼 Imatinib

依维莫司 Everolimus

右美沙芬 Dextromethorphan

子囊霉素 Ascomycin

左乙拉西坦 Levetiracetam

佐匹克隆 Zopiclone

唑吡坦 Zolpidem

唑尼沙胺 Zonisamide

滥用药物毒物

吗啡 Morphine

6- 单乙酰吗啡 (6-MAM) 6-Actylmorphine

吗啡 -3- 葡萄糖醛酸 (M3G) Morphine-3-glucuronic Acid

吗啡 -6- 葡萄糖醛酸 (M6G) Morphine-6-glucuronic Acid

氧吗啡酮 Oxymorphone

芬太尼 Fentanyl

可待因 Codeine

氢可酮 Hydrocodone

二氢吗啡酮 Hydromorphone

吗啡 Morphine

氧可酮 Oxycodone

羟吗啡酮 Oxymorphone

……………………………………… 11

…………………………………………………… 15

………………………………… 20

…………… 24

………………………………………………… 28

………………………………… 31

……………………………………………………… 34

…………………………………………………………… 37

……………………………… 40

…………………………… 46

…………………………………………… 49

…………………………………… 55

………………………………………………… 60

………………………………………… 62

………………………………………………………………………………………………………………………… 69

内源性激素检测

雌酮和雌二醇的全自动在线样品前处理及三重四极杆 LC-MS/MS 定量分析方法

采用 TurboFlow 技术串联三重四极杆质谱定量分析人血清中的睾酮

神经递质类化合物分析

LC-MS/MS 与柱前衍生法用于脑脊液和脑微透析液中神经递质类物质的代谢靶标分析

血浆游离型甲氧基肾上腺素类物质的全自动在线样品前处理及液相色谱 - 串联质谱技术定量分析方法

维生素检测

采用 TSQ 三重四极杆质谱仪定量分析血浆中单羟基及双羟基维生素 D

免疫抑制类药物检测

联合 Prelude-SPLC 系统和 TSQ 质谱仪进行全血中免疫抑制类药物的定量分析方法

采用 TurboFlow HPLC-MS/MS 串联质谱定量分析血浆中的霉酚酸

采用三重四极杆质谱仪定量分析干血点样品中的免疫抑制剂

治疗药物监测

尿液中 6 种阿片类和 14 中苯二氮卓类药物的三重四极杆 LC-MS/MS 高通量定量分析

抗抑郁和抗精神病药物的全自动在线样品前处理及三重四极杆 LC-MS/MS 定量分析方法

人血浆中 17 种抗癫痫药物及其代谢物的三重四极杆 LC-MS/MS 定量分析

尿液中阿片类药物低至 ng/mL 水平兼具高分辨率高质量精度的质谱定量分析方法

全面毒物药物筛查

尿液中多种药物的全自动在线样品前处理及串联质谱筛查与定量方法

采用高分辨质谱和简化的高效筛查软件对尿液中的多种药物进行法医学筛查

附录

目录

临床检验工作流程

用于临床检验的样品通常具有基质复杂、干扰物多、待分析化合物浓度低等特点，大量的样品检测任务使日常检测工作变得异常

困难，因此专为临床检验提供一个适用于高通量样品分析的工作流程显得尤为重要。赛默飞生命科学质谱致力于为医疗专业人士

提供更高效、更可靠的先进实验室分析技术，专门针对临床分析建立解决方案。TSQ® 三重四极杆质谱仪使用了可以拟合出教科书

般完美理论电场的真正的共轭双曲面四极杆质量分析技术，完全可以胜任大批量样品的日常临床检测，同时结合高效可靠的数据

处理软件，帮助您轻松应对日益繁重的日常检验工作。

简便快捷的检验报告保证数据完整性的同时简便快捷地提供报告

受试人群采集样品标本用于临床检测

样品前处理采用蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取等方法去除基质干扰

高重现性的液相分离采用 Prelude SPLCTM 系统提供高重现性和高效率的分离功能，使质谱分析复杂样品成为可能

准确稳定的质谱分析使用 TSQ 三重四极杆质谱分析样品，采用 SRM 或 H-SRM 数据采集方式，专属性强，显著降低背景噪音，提高灵敏度，确保数据的可靠性

高效可靠的数据处理采用专为临床检验开发的 TraceFinderTM Clinical Research 软件，为患者提供准确的临床检验结果

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雌酮和雌二醇的全自动在线样品前处理及三重四极杆 LC-MS/MS 定量分析方法

Xiang He and Marta Kozak， Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA

关键词

Transcend TLX 系统；Accucore RP-MS 色谱柱；临床研究；

TurboFlow 技术

目标

建立一种快速、灵敏的 LC-MS/MS 分析方法与全自动在线样

品前处理 TurboFlowTM 技术联用，同时定量血清中未经衍生的

E1 和 E2。

前言

雌酮（E1）和雌二醇（E2）是两种具有生物活性的主要雌激素。

这两种雌激素的定量测定在临床研究中非常重要。

血清中雌激素的定量分析常通过免疫检测和气相色谱 - 质谱

（GC-MS）分析进行，但是，与免疫分析和其它分析技术相比，

液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析的特异性更高，是雌

激素分析更好的选择。因此，我们建立了一种简单、快速、灵

敏的分析方法，利用 LC-MS/MS 大气压化学电离（APCI）法

来检测血清或血浆中未经衍生的 E1 和 E2。

Thermo ScientificTM TurboFlow 技术是一种全自动在线样品前

处理技术，该技术与 LC-MS/MS 分析方法的联合已经被用于

多种生物样品的定量分析。目前，该技术已被报道应用于临床

研究、制药分析、生物分析、环境监测、食品安全和法医毒理

检测等多个领域。

实验方法

样品前处理

取 0.5 mL 样品与 0.5 mL 内标（E2-d5， IS）溶液混合（甲醇

溶解）。涡旋震荡混合后，在 -30ºC 条件下静置 30 min，然

后在室温下以 16,000 g 离心 3 min，此步骤重复一次以达到彻

底的蛋白沉淀。取上清液 300 µL 直接进行 TurboFlow LC-MS/

MS 分析。

LC-MS/MS 方法

总运行时间为 10 min。质谱仪使用 APCI 离子源，在负离子模

式下运行，数据采集方式为选择反应监测（SRM）模式。

Step Start Sec Flow Grad %A %B %C %D Tee Loop Flow Grad %A %B %C

1 0.00 45 2.00 Step 100.0 - - - ==== out 0.60 Step 100.0 - -

2 0.75 60 0.10 Step 100.0 - - - T in 0.60 Step 100.0 - -

3 1.75 60 2.00 Step - 100.0 - - ==== in 0.60 Ramp 40.0 60.0 -

4 2.75 120 2.00 Step 100.0 - - - ==== in 0.60 Ramp 20.0 80.0 -

5 4.75 60 2.00 Step - 100.0 - - ==== in 0.60 Step - 100.0 -

6 5.75 90 2.00 Step 100.0 - - - ==== out 0.60 Step 100.0 - -

图 1. TurboFlow 和 LC 方法

上样

上样： A：水； B：甲醇。洗脱： A：水； B：甲醇。

洗脱

应用文献 558

LC 系统配有 Accela 1250 的 Thermo Scientific Transcend TLX-1 系统

色谱柱

TuboFlow 柱：TurboFlow Cyclone P

分析柱：Accucore RP-MS solid core (100 × 3 mm， 2.6 µm)

流动相 A 水

流动相 B 甲醇

柱温箱温度室温

TurboFlow 和 LC 梯度方法

参见图 1

12

方法验证

方法验证需要考察的内容包括：1）样品提取回收率；2）最低

定量下限（LLOQ）、动态范围、准确度；3）方法精密度；4）

离子抑制；5）残留情况。

结果与讨论

人体血浆含有内源性 E1 和 E2，因此除精密度的测定以外，不

适合用于方法验证的其他方面，所以我们使用活性炭吸附血清

（CSS）作为基质进行方法验证。

回收率

回收率在两个浓度水平（20 和 100 pg/mL）进行了考察。较

之样品纯溶液，CSS 中 E1、E2 和内标的绝对回收率在 61.2%

至 65.6% 范围内。E1 和 E2 相对于内标的相对回收率，则为

99.0% 至 107.1%。

表 1. LLOQ，线性范围和准确度

E1 E2

稀释因子理论浓度

（pg/mL）实测浓度

（均值， pg/mL）CV

（n=3，%）准确度

（n=3，%）实测浓度

（均值， pg/mL）CV

（n=3，%）准确度

（n=3，%）

256 3.9 3.8 5.0 97.8 3.7 11.7 94.6

128 7.8 8.0 9.0 102.9 8.8 13.9 112.3

64 15.6 16.1 5.1 102.8 15.7 7.4 100.4

32 31.3 32.2 8.4 103.2 29.0 7.6 92.7

16 4.2 59.7 0.8 95.5 62.7 4.4 100.3

8 62.5 123.3 9.9 98.7 129.4 9.8 103.5

4 125.0 245.9 7.0 98.4 253.1 3.7 101.2

2 250.0 503.5 2.3 100.7 478.9 4.1 95.8

1 1000.0 1000.9 4.5 100.1 993.1 5.3 99.3

均值 100.0 100.0

最低定量下限（LLOQ）、线性范围和准确度的测定

用 CSS 制备浓度为 1000 pg/mL 的 E1 和 E2 储备液。用空白

CSS 进行 2 倍梯度稀释，制备 9 个不同浓度水平的 E1 和 E2

分析样品，浓度范围为 3.9 – 1000 pg/mL。每个浓度的分析样

品平行测定三次。将被分析物与内标峰面积的比值对理论浓度

作图得到标准曲线。

本方法检测 E1 的线性范围为 3.8 – 1000.9 pg/mL，准确度（n=3）

为 95.5% 至 103.2% ；E2 的线性范围为 3.7 – 993.1 pg/mL，

准确度（n=3）为 92.7% 至 112.3%（表 1，图 2 和 3）。E1 和

E2 的 LLOQ 分别为 3.8 pg/mL 和 3.7 pg/mL（表 1 和图 4）。

图 2. CSS 中 E1 的标准曲线图 3. CSS 中 E2 的标准曲线

浓度（pg/mL）浓度（pg/mL）

峰面积比

峰面积比

E1Y=0.0137+0.028XR2 = 0.9949 W: 1/X2

30 10

0 00 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000

E2Y=-0.00396+0.0092XR2 = 0.9885 W: 1/X2

13

图 4. CSS 中 E1 和 E2 浓度为 LLOQ 时的 SRM 色谱图

精密度

方法精密度的测定使用分别添加了低浓度和高浓度标样的 CSS 和人血浆进行。分析批间（n=15）和分析批内（n=5）的变异系数

（CV）在 3.5% 和 18.0% 之间（表 2）。

离子抑制

为考察方法的离子抑制情况，将 E2-d5（100 ng/mL）以 5 µL/min 的流速从柱后直接用 T 形管加入流动相中，同时用经过沉淀

蛋白（protein-crashed）后的人血浆（未加入内标）或流动相（空白）从液相进样，并在整个色谱梯度运行过程中监测 E2-d5 的

离子对。与溶剂空白（60% 甲醇的水溶液）相比，未观察到 E2-d5 的色谱图中有任何明显的离子抑制现象（图 5）。

E1 E2

活性炭吸附血清低

（15 pg/mL）高

（364 pg/mL）低

（15 pg/mL）高

（357 pg/mL）

批次 1分析批内精密度（n=5，%）

9.9 9.6 13.5 11.5


17.1 3.5 12.4 4.3


14.6 7.2 17.2 4.8

批次 1 - 3分析批间精密度（n=15，%）

13.1 8.1 14.0 8.4

加标混合人血浆低

（12 pg/mL）高

（239 pg/mL）低

（11 pg/mL）高

（227 pg/mL）


5.3 5.8 18.0 7.9


12.9 7.1 16.3 4.3


10.0 6.8 12.3 9.0

批次 1 - 3分析批间精密度（n=15，%）

9.3 6.3 17.3 7.1

表 2. 精密度数据

图 5. 离子抑制情况考察

保留时间（min）

信号强度

100

06.2 6.5 6.8 7.1 7.4 7.7 8.0

E1: m/z 269 1453.8 pg/mL

E2: m/z 271 1833.7 pg/mL

红色箭头指示的是 E2 的出峰时间


信号强度

空白溶剂血浆样品

4.6 8.0

1490

1192

894

298

596

0

14

残留情况

向 CSS 中添加 E1 和 E2，分别制备高浓度水平（>500 pg/mL）和低浓度水平（8 pg/mL）样品。低浓度（Low1）和高

浓度样品（High）依次进样进行 LC-MS/MS 分析，然后马上再次进行低浓度水平样品的进样分析（Low2）。通过检测加

标的 CSS 样品，未观察到残留现象，其中 E1 样品浓度为 Low1（9.9 pg/mL）- High（556.0 pg/mL）- Low2（9.1 pg/

mL），E2 为 Low1（10.0 pg/mL）- High（582.5 pg/mL）- Low2（8.9 pg/mL）。

临床研究样品数据实例

图 6 和 7 所示为 E1 和 E2 在两个不同血浆样品中的 SRM 色谱图。

图 6. E1 和 E2 在人血浆样品 1 中的 SRM 色谱图（女性）图 7. E1 和 E2 在人血浆样品 2 中的 SRM 色谱图（男性）

保留时间（min）保留时间（min）

信号强度

信号强度

E1: m/z 269 14511.9 pg/mL

E2: m/z 271 1833.1 pg/mL

E1: m/z 269 1456.9 pg/mL

E2: m/z 271 1835.1 pg/mL

结论

本研究为临床实验室建立了一种用于定量分析血清中 E1 和 E2 的新颖方法，本方法使用 TurboFlow 技术，仅需 10 min 即可完成

LC-MS/MS 分析。此外，本方法快速、灵敏，并且大大减少了样品前处理的工作。由于 Accucore HPLC 分析柱的卓越表现，在本

方法中被选做色谱分离的分析柱。本方法对雌酮的最低定量下限为 3.8 pg/mL，对雌二醇的最低定量下限为 3.7 pg/mL。本方法中，

雌酮的线性范围是 3.8 – 1000.9 pg/mL，雌二醇的线性范围是 3.7 – 993.1 pg/mL，雌酮的检测准确度为 95.5% 至 103.2%，雌二

醇的检测准确度为 92.7% 至 112.3%。雌酮和雌二醇在低浓度及高浓度水平下的加标活性炭吸附血清和混合人血浆样品中，分析

批间和分析批内的变异系数值范围为 3.5% 至 18.0%。

应用文献 558

198 100

0 06.2 6.5 6.8 7.1 7.4 7.7 8.0 6.2 6.5 6.8 7.1 7.4 7.7 8.0

15

应用文献609

采用 TurboFlow 技术串联三重四极杆质谱定量分析人血清中的睾酮

Sarah Fair Wandland， Marta Kozak， Thermo Fisher Scienti�c， San Jose， CA

关键词

睾酮；TurboFlow；样品前处理液相色谱仪；质谱仪；人血清

目标

评价 Thermo ScientificTM TurboFlowTM 与 Thermo ScientificTM TSQ

系列三重四极杆质谱联用技术在临床研究中定量分析人血清中

睾酮的应用，比较了两种定量分析方法，一种采用在线 Thermo

ScientificTM TurboFlowTM 样品净化技术，另一种采用离线样品净

化方法。

前言

当前，在临床研究中分析人血清中的睾酮有很多不同的样品前

处理方法。本文评价了TurboFlow 技术与系列质谱联用技术（图

1）分析睾酮的应用，采用了两种样品前处理方法：在线样品

净化和离线样品净化方法。其中，两种方法分别建立了不同的

色谱分离条件，但是质谱条件相同。

实验方法

样品前处理

采用两种不同的样品前处理方法。

采用 TurboFlow 在线样品前处理

第一种方法为 TurboFlow 柱在线净化的样品前处理方法和分

析柱分离技术。吸取 200 µL 血清样品到微量离心管中。加入

200 µL 含内标物的的甲醇水溶液（1:1，v/v）来稀释样品。然

后涡旋混匀，离心，将上清液转移到干净的 HPLC 进样瓶中。

将 100 µL 样品上样到 TurboFlow 柱中。

离线液液萃取样品前处理方法

第二种样品前处理方法是离线液液萃取（LLE），提取试剂为

样品体积两倍量的甲基叔丁基醚。取 50 µL 处理后的样品上样

到分析柱中。

表 1. 在线 TurboFlow（SPLC）和离线 LLE（HPLC）条件

在线TurboFlow 离线LLE

TurboFlow 柱 Thermo ScientificTM Cyclone-PTM 柱， 50 x 0.5 mm NA

分析柱 Thermo ScientificTM AccucoreTM aQ 色谱柱， 2.6 µm， 50 x 3.0 mm Accucore aQ 柱， 2.6 µm， 50 x 3.0 mm

上样流动相 A 含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的水溶液 NA

上样流动相 B 含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的甲醇溶液 NA

上样流动相 C 异丙醇 / 乙腈 / 丙酮（45:45:10） NA

洗脱流动相 A 含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的水溶液含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的水溶液

洗脱流动相 B 含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的甲醇溶液含 10 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸的甲醇溶液

所有流动相使用的溶剂均为 Fisher Chemical 品牌。

16

表 2. LC 方法：（a）在线净化方法和（b）离线净化方法

（a）

（b）

上样分析

步骤开始秒数流速梯度 %A %B %C 三通进样环流速梯度 %A %B

1 0.00 40 2.00 阶梯式 100.0 - - - 出 0.60 阶梯式 90.0 10.0

2 0.67 60 0.20 阶梯式 10.0 90.0 - T 进 0.60 阶梯式 90.0 10.0

3 1.67 5 2.00 阶梯式 10.0 90.0 - - 进 0.60 阶梯式 33.0 67.0

4 1.75 60 2.00 阶梯式 10.0 90.0 - - 进 0.60 阶梯式 33.0 67.0

5 2.75 30 2.00 阶梯式 - - 100.0 - 出 0.60 阶梯式 - 100.0

6 3.25 45 1.50 阶梯式 100.0 - - - 出 0.60 阶梯式 90.0 10.0

步骤开始秒数流速梯度 %A %B

1 0.00 20 0.40 阶梯式 95.0 5.0

2 0.33 5 0.40 阶梯式 60.0 40.0

3 0.42 210 0.40 斜坡上升 20.0 80.0

4 3.92 85 0.40 阶梯式 0.0 100.0

5 5.33 70 0.50 阶梯式 95.0 5.0

质谱方法

质谱方法采用加热电喷雾离子源（HESI）。在选择反应监测

（SRM）模式下采集数据（表 3）。

色谱方法

在线和离线样品净化方法对应的分析柱和流动相如表 1 所示。

在线提取的样品前处理液相色谱方法如表 2a 所示。离线提取样品采用的液相色谱方法如表 2b 所示。

分析物母离子

m/z（Q1）子离子

m/z（Q3） CE 射频透镜

睾酮 289.2 97.2，109.2 26 102

睾酮 -13C3 293.4 100.2 21 109

方法验证

在线样品前处理方法的标准曲线线性范围为 20.0 到 10,000

pg/mL，离线样品前处理方法的线性范围为 10.0 到 10,000

pg/mL，标样用活性炭吸附后的血清（CSS）配制。两种方法

的质控样品（QC）也是用 CSS 配制，浓度分别为 60,450 和

表 3. SRM 离子对

8,000 pg/mL。准确度和精密度的测定为在三天内每天五次重

复分析三个浓度的质量控制样品，并在每批次运行开始和结束

时用标准曲线进行定量。比较配制在基质中的 QC 样和配制在

干净的溶液中的 QC 样来测定基质效应，同时在每批次实验中

监测内标物信号。另外，在稀释研究的实验中使用 CSS 稀释

基质。最后，在进样定量上限（ULOD）浓度的标样后进基质

空白样品，用其总分析物信号除以定量下限（LLOD）浓度下

的总分析物信号来评价残留量。残留量不得超过 LLOD 信号的

20%。

结果与讨论

两种方法都符合血浆和血清中睾酮分析的要求。两种方法的定

量检出限，线性范围和残留限量如表 4 所示。日内和日间精密

度数据如表 5 所示。

17

在线净化离线净化

LOQ 20 pg/mL 10 pg/mL

标准曲线范围 20–10,000 pg/mL 10–10,000 pg/mL

残留量上限 10,000 pg/mL 10,000 pg/mL

表 4. 方法性能表 5. 方法精密度

%RSD

在线净化离线净化

低浓度QC 样

中等浓度 QC样

高浓度QC 样

低浓度QC 样

中等浓度 QC样

高浓度QC 样

日内精密度

18

图 4. 标准曲线标样和血浆捐赠样品的内标物信号（数据采自

在线净化方法）

表 6 为 TurboFlow 在线净化方法的稀释研究结果。图 4 为标准

标样和捐赠样品的内标物信号。

表 6. 在线净化方法的稀释研究结果

稀释因子真实值 pg/

mL实验值 pg/

mL%回收率

无稀释 4172

x2 2086 2089 100%

x4 1043 1061 102%

x8 521 512 98.2%

x16 261 252 96.6%

采用双通道 Prelude SPLC 可以使两种方法的样品分析通量加

倍（图 6）。

标样

捐赠样品

图 5. 在线和离线净化方法测定浓度为 20 pg/mL血浆捐赠样品的色谱图（如图为定量和定性离子）

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

相对强度

相对强度

Testosterone RT: 3.88 | 114 RT: 3.87 | 114

相对强度

相对强度

RT(min)

RT(min)

RT(min)

RT(min)

RT: 2.70

SN: 63.66

RT: 3.88

SN: 130.28

Testosterone RT: 2.70 | 313

RT: 2.70

SN: 81.97

RT: 3.87

SN: 143.58

RT: 2.70 | 313

2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9

3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1

定性离子在线净化

定量离子

离线净化

19

图 6. 双通道的多路在线样品净化方法

通道 1，进样 1 通道 1，进样 2 通道 1，进样 3

总分析时间 = 4.0 min

数据采集窗 = 1.0 min

通道

1通道

2

通道 2，进样 1 通道 2，进样 2 通道 2，进样 3

睾酮

睾酮

睾酮

睾酮

应用文献609

结论

本文成功评价了 TurboFlow 技术与 TSQ 系列质谱仪联用技术采用在线和离线两种样品净化方法分析人血清中的睾酮的方法性能。

提供了两种快速 LC 方法，在线净化方法和离线净化方法分别只需要 4 分钟和 6.5 分钟。两种方法的基质效应均可以忽略不计。

TSQ 系列质谱的高灵敏度为两种方法提供了很低的定量检出限。

20

LC-MS/MS 与柱前衍生法用于脑脊液和脑微透析液中神经递质类物质的代谢靶标分析

吴泽明1，董迎旭2，马洁2，江峥1

1. 赛默飞世尔科技（中国）公司色谱质谱部，上海，中国 201206

2. 沈阳药科大学药理教研室，沈阳，中国 110016

关键词

LC-MS/MS；代谢靶标分析；神经递质；脑脊液

前言

在广义的代谢组学（Metabolomics）研究中，代谢靶标分析是

一种常见的研究策略，它以处于特定代谢通路上具有相似/相

近生物功能的一系列小分子物质群为研究标的，通过对其绝对

或相对定量，进而对实验涉及的生物学问题进行验证。芳香

族氨基酸代谢产生的单胺神经递质多巴胺（Dopamine）、去

甲肾上腺素（Norepinephrine）、5-羟色胺（5-HT）及其代谢

终产物高香草酸（HVA）、3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、5-

羟基吲哚乙酸（5-HIAA），以及谷氨酸（Glutamate）及其

脱羧生成的抑制递质γ-氨基丁酸（GABA），连同乙酰胆碱

（Acetylcholine）、抗坏血酸（Ascorbic acid）等小分子物质

都是神经药理学领域中尤为关注的分析对象。高灵敏、高特异

与快速地离体或在体定量测定脑脊液与脑微透析液中这类代谢

物的准确含量，对于神经生物学研究意义重大。采用经典的电

化学方法，囿于这类物质的酸碱性差异悬殊、基质干扰复杂

等不利条件，常在方法特异性与分析通量上受到限制。而直

接使用 HPLC-MS/MS 方法时，又面临色谱保留弱（反相分离

RP）、基质干扰大、样品中缓冲盐浓度大、ESI 电离效率低下

（RP&亲水作用色谱 HILIC）等种种挑战。

利用 Thermo ScientificTM TSQ 系列质谱 LC-MS/MS，本文报

道了一种测定上述神经递质与相关代谢物含量的代谢靶标分析

方法。采用苯甲酰化柱前衍生，本方法可有效提高强极性目标

分析物的疏水性，并显著改善其 ESI 电离效率，从而有效克服

复杂基质干扰，提高检测灵敏度，适用于神经生物学、临床样

本检测、神经药效学评价等研究。

AN

_C_LC

MS

MS

-3-201502

实验方法

生物样品准备与衍生化

小鼠脑脊液与脑微透析液样本由沈阳药科大学药理学教研室采

集并提供，脑脊液使用乙腈脱蛋白，微透析液直接使用。衍生

方法参考文献进行[1,2]，简述为：取适量样品置于尖头管中，

按照1/2样品体积的比例，依次加入催化剂 100 mM 四氢硼酸

盐缓冲液与衍生化试剂 5% 苯甲酰氯-乙腈溶液（V/V），涡旋

混匀后室温下反应，离心取上清，供 HPLC-MS/MS 分析。抗

坏血酸与乙酰胆碱，以及其余 8 种单胺神经递质与其代谢物的

化学结构与衍生位点、反应途径见图 1。

图 1. 代谢靶标分析物的结构（红色标记为反应位点）与苯甲

酰化反应式

21

表 1. 代谢靶标分析 Timed-SRM 方法参数

表 2. HPLC 色谱条件表 3. TSQ Quantum Access MAX 质谱条件

标准溶液配置

取所有分析物混标母液，使用人工脑脊液逐级稀释至一定浓度

后，再进行苯甲酰化衍生。所得样品 HPLC-MS/MS 分析，外

标法定量。

HPLC-MS/MS方法

使用 Thermo Scientific AccelaTM 600 HPLC 进行分离，Thermo

ScientificTM TSQ 系列串联三重四极杆质谱检测方法使用 EZ

Method 模式编辑，定时选择反应监测 timed SRM 主要参数见

表 1，其余分析条件见表 2、3。

数据处理

采用 Thermo Scientific TraceFinderTM 软件（version 3.2）进行

数据处理。

Metabolites KEGG ID RT/min ESI Polarity Tube lens Collision Energy SRM transition*

抗坏血酸 C00072 1.01 - 941321

175.0

22

结果与讨论

柱前衍生反应中目标代谢物均有 1~3 个酚羟基或胺基位点与苯甲酰基结合（乙酰胆碱与抗坏血酸除外），这所带来的疏水性增加与 ESI

电离活性改善，使得本方法相较于未衍生直接分析方法的特异性与灵敏度显著提高。图 2 为实验条件下各个代谢物的色谱图，均峰形对

称良好。图 3 为多巴胺与高香草酸衍生产物的 MS/MS 谱图及其裂解规律，苯甲酰衍生产物 MS/MS 断裂时会产生极其优势的 m/z 105.1

C7H5O+ 碎片，这也非常有助于保证检测方法灵敏度提高的显著性。

图 2. 代谢靶标分析目标物的色谱图

图 3. 苯甲酰化反应产物的 MS/MS 典型谱图与裂解途径

（上图：多巴胺 dopamine；下图：高香草酸 HVA）

23

图 4. TraceFinder 软件用于代谢靶标分析定量数据处理的结果界面

表 4. 实验小鼠脑脊液神经活性物质代谢靶标分析的部分测定结果

图 4 为利用 TraceFiner 软件对本实验代谢靶标定量数据处理后的结果界面，TraceFinder 高度集成的信息展示与并行处理能力，尤适合于

大样本代谢靶标分析中的高通量数据处理。本实验采用的柱前衍生方法操作简便，反应迅速充分。方法学考察表明，代谢靶标分析方

法的线性、重现性与稳定性良好，利用 TSQ 系列质谱能获得远低于 ng/mL（ppb）级的检测灵敏度，完全能够满足这类神经活性物质

生理浓度测定的技术要求。表 4 为利用本文方法对神经药理学实验中正常小鼠脑脊液实际样品进行测定的部分结果。

结论

本文利用 TSQ Quantum Access MAX 串联液质与苯甲酰化柱前衍

生建立了一种对脑脊液与脑微透析液中痕量神经活性物质群进行

快速高灵敏度与高特异性检测的代谢靶标分析方法，可应用于神

经生物学、神经药理学等相关研究领域。

浓度（ng/mL）

5-HT dopamine norepinephrine HVA DOPAC 5-HIAA glutamate GABA

Mean（n=5） 0.46 0.26 1.24 11.58 8.55 261.41 206.03 1.84

SD（n=5） 0.05 0.17 0.21 2.71 1.69 99.28 37.34 0.92

参考文献

[1] Andrej Kovac, et al, Talanta 119 (2014) 284–290

[2] Peng Song, et al, Anal. Chem. 2012, 84, 412-419

AN

_C_LC

MS

MS

-3-201502

24

血浆游离型甲氧基肾上腺素类物质的全自动

在线样品前处理及液相色谱-串联质谱技术定量分析方法Xiang He and Marta Kozak， Thermo Fisher Scienti�c， San Jose， CA

关键词

临床研究；TurboFlow 技术；甲氧基肾上腺素；MN；甲氧

基去甲肾上腺素；NMN；Pmets；嗜铬细胞瘤

目标

建立一种定量分析血浆游离型甲氧基肾上腺素类物质的全自

动方法，该方法与离线 SPE 方法相比在保持原有分析性能的

同时，所需时间更短。

前言

血浆中游离甲氧基肾上腺素（MN）和甲氧基去甲肾上腺素

（NMN），合称 Pmets，在临床研究中是嗜铬细胞瘤的首选生

物标记物。由于液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）具有很

高的分析特异性，因此被广泛用于测定 Pmets。

最近，我们建立了一种利用离子对固相萃取（IP-SPE）和多孔石

墨碳（PGC）柱固定相来测定 Pmets 的 LC-MS/MS 方法 1，2。虽

然该方法运行速度较快且灵敏度较高，不过仍可以通过使用在线

样品前处理技术替代原有的离线样品前处理方法，进一步节省时

间和成本。

Thermo ScientificTM TurboFlow 是一种全自动在线样品前处理

技术，通过将该技术与 LC-MS/MS 联合，可以应用于许多生

物样品的快速定量分析。

到目前为止，该技术已经在临床研究、药品分析、生物分析、

环境检测、食品安全和法医毒理分析等方面中广泛应用并有文

献报道。

应用文献 563

实验方法

样品前处理

分别向 0.5 mL 人血浆样品和活性炭/葡聚糖处理血清（CSS）

样品中加入内标（IS），再与 0.25 mL 10% 三氯乙酸水溶液

（w/v）混合。将混合物涡旋震荡后在 –30 ℃ 静置 30 min。再

将样品以 16,000 g 的速度离心 10 min，取 100 µL 上清液进行

LC-MS/MS 分析。

LC-MS/MS 方法

LC 系统Thermo Scientific Transcend TLX-1 液相色谱系统

色谱柱

TuboFlow 柱：TurboFlow Cyclone MCX-2

分析柱：Thermo ScientificTM Hypercarb 色谱柱（50×3 mm，5.0 µm）

分析柱温箱温度 70℃

TurboFlow 和 LC 梯度方法参见图 1

LC 方法运行时间 12 min

25

上样洗脱

图 1. TurboFlow 和 LC 方法

上样：

洗脱：

A：0.1% 全氟庚酸（PFHA）水溶液B：60% ACN 水溶液C：异丙醇、ACN 和丙酮（1:1:1 v/v/v）以及 0.3% 甲酸的混合物D：5 mM NH4Ac 和 50% ACN 水溶液

A：50 mM NH4FA 和 1% 甲酸水溶液B：0.1% 甲酸的 ACN 溶液C：异丙醇、ACN 和丙酮（9:9:2 v/v/v）的混合物D：0.1% PFHA 水溶液

应用 Thermo Scientif icTM TSQ 三重四极杆质谱仪采用加

热电喷雾离子源（HESI-II），正离子检测模式，选择反应监测

（SRM）的数据采集方式。

方法验证

方法学验证包括以下六个方面：1）回收率；2）定量下限

（LLOQ）、动态范围、准确度；3）精密度；4）离子抑

制；5）残留问题；6）干扰问题。

结果与讨论

通过混合实验方法首次评价CSS与人类血浆的相似性3，确定

了 CSS 是一种适用于考察方法学的试验基质。

在线萃取（mean ± CV）b

直接进样（mean ± CV）

绝对回收率（%）相对回收率（%）

MN (500 pg/mL)a

NMN (250 pg/mL)a60281 ± 2.7%

32186 ± 5.6%

106866 ± 10.5%

51878 ± 9.4%

56.4

62.0

90.9

97.8

MN-d3 (500 pg/mL)a

NMN-d3 (500 pg/mL)a40716 ± 1.1%

28983 ± 3.7%

66790 ± 11.4%

46482 ± 11.8%

61.0

62.4

N/A

N/A

MN NMN

Dilution factor

Expected (pg/mL)

Measured (pg/mL)

CV of triplicates

(%)

Accuracy (%)

Expected (pg/mL)

Measured (pg/mL)

CV of triplicates

(%)

Accuracy (%)

128 3.91 5.5 17.2 71.1 7.8 7.4 35.3 94.9

64 7.81 6.3 13.7 80.6 15.6 12.6 10.7 80.9

32 15.6 13.9 7.2 88.8 31.3 30.8 1.6 98.7

16 31.3 27.5 4.9 88.0 62.5 61.0 6.0 98.1

8 62.5 56.6 10.3 90.6 125.0 121.2 9.2 96.9

4 125.0 112.2 4.0 89.8 250.0 254.2 9.4 101.7

2 250.0 233.7 3.1 93.5 500.0 496.9 2.7 99.4

1 500.0 455.4 4.0 91.1 1000.0 954.5 3.3 95.5

Mean (%) 88.9 95.9Stdev (%) 4.1 6.9

表 1. 回收率

表 2. LLOQ、动态范围及准确度

a MN、NMN、MN-d3 和 NMN-d3 按表中列出浓度添加至流动相中 b 测得的峰面积的 CV（n=2）

回收率

通过比较 MN、NMN、MN-d3 和 NMN-d3（以流动相为溶

剂，n=2）直接进样和 TurboFlow 进样的结果，评价提取回收

率。MN、NMN 及其内标的绝对回收率在 56.4% 到 62.4% 的

范围之间，MN 和 NMN 的相对回收率分别为 90.9% 和 97.8%

（表 1）。

LLOQ，线性范围和准确度

向 CSS 中加入 MN 和 NMN，最终浓度分别为 500 和 1000

pg/mL。将该 CSS 样品进行对倍间隔的梯度稀释，制备 8 个

浓度水平的线性范围分析样品，MN 浓度范围为 3.9 至 500

pg/mL，NMN 浓度范围为 7.8 至 1000 pg/mL。线性范围内

每浓度水平分析样品进行三次平行分析。以被分析物浓度为横

坐标，被分析物与内标峰面积比值为纵坐标，制作标准曲线。

试验表明，MN 的线性范围为 6.3 至 455.4 pg/mL， NMN 的线

性范围为 12.6 至 954.5 pg/mL。在线性范围内，MN 的检测准确

度为 80.6% 至 93.5%，NMN 的检测准确度为 80.9% 至 101.7%

。MN 的各浓度水平分析样品的 CV（n=3）是 3.1% 到 13.7%

，NMN 是 1.6% 至 10.7% （表 1 及图 2 和 3）。MN 和 NMN

的 LLOQ 分别是 6.3 pg/mL 和 12.6 pg/mL（表 2）。

26

精密度

方法的精密度通过分析添加标准品的 CSS 进行评价。对两个被分析化合物来说，分析批间和分析批内的 CV 值在低浓度和高浓度

的质控样品下均在 2.0% 到 10.5% 之间（表 3）。

离子抑制

我们利用 LC-MS/MS 技术测定了相同浓度的 MN-d3 和 NMN-d3

（均为 400 pg/mL）在溶剂中（n=4）和人血浆样品（n=4）中的

质谱信号响应，并分别计算了MN-d3 和 NMN-d3 在溶剂中和人血

浆样品中的平均质谱响应（积分面积）。MN-d3 和 NMN-d3 在血

浆样品（n=4）及溶剂（n=4）中信号响应强度的标准偏差分别

为 113.3% ± 18.4% 和 126.4% ± 18.0%。此结果表明本方法无

明显的离子抑制或增强效应。

MN NMN

活性炭/葡聚糖处理血清 31.3 pg/mL 250.0 pg/mL 62.5 pg/mL 500.0 pg/mL

Intra 1 (%) n=5 6.7 4.2 4.5 5.4

Intra 2 (%) n=5 4.9 3.0 10.5 4.2

Intra 3 (%) n=5 7.3 4.7 10.0 2.0

Inter-assay (%) n=15 8.4 7.7 8.9 4.8

表 3. 精密度数据

图 2. CSS 中 MN 的标准曲线

图 3. CSS 中 NMN 的标准曲线

残留情况

未检测到任何残留。

干扰

肾上腺素（EPI）和 NMN 的 SRM 离子对相同，因此无法单凭

MS/MS 分析区分。利用 HypercarbTM 分析柱可以实现 EPI 和

NMN 峰的基线分离（相距 0.3 分钟）。

临床研究样品的数据实例

图 4. MN 和 NMN 在血浆样品中的 SRM 色谱图

图 5. MN（31.0 pg/mL）和 NMN（61.0 pg/mL）在 CSS 样品

中的 SRM 色谱图

27

结论

本研究建立了一种快速、自动、灵敏的 LC-MS/MS 分析方法，适

用于临床研究上血浆中游离型甲氧基肾上腺素的测定 4。

相较于此前发表过的离线 IP-SPE 方法，本方法通过使用

TurboFlow 技术大大简化了样品前处理过程。本方法成功的关

键是在在线样品处理过程中加入 PFHA。甲氧基肾上腺素的色

谱分离使用 PGC 色谱柱实现，整个在线萃取及色谱分析时间

为 12 min。本方法对甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素检

测的线性范围分别为 6.3 至 455.4 pg/mL 和 12.6 至 954.5 pg/

mL，准确度分别为 80.6% 至 93.5% 和 80.9% 至 101.7%。甲

氧基肾上腺素的定量下限为 6.3 pg/mL，甲氧基去甲肾上腺素

的定量下限为 12.6 pg/mL。甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上

腺素在低浓度和高浓度水平下的分析批间及分析批内的精密度

范围在 2.0% 至 10.5% 之间。

综上所述，本研究中的自动在线 TurboFlow 方法的分析表现堪

比此前报道过的离线 SPE 方法 2。更重要的是在线方法节约了

超过 50% 的样品前处理时间，同时也节省了 SPE 柱所需的成

本。

参考文献

1. He, X. and Kozak, M. Quantitative Measurement of

Plasma Free Metanephrines by Ion-Pairing Solid Phase

Extraction and LC-MS/MS with Porous Graphitic

Carbon Column, Thermo Scientific Application Note:

AN539.

2. He, X.; Gabler, J.; Yuan, C.; Wang, S.; Shi, Y.; and

Kozak, M. Quantitative Measurement of Plasma Free

Metanephrines by Ion-pairing Solid Phase Extraction and

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

with Porous Graphitic Carbon Column, J. Chromatogr. B

Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2011, 879(23), 2355-

2359.

3. Yuan, C; Kosewick, J; He, X; Kozak, M and Wang, S.

Sensitive Measurement of Serum1, 25-dihydroxy-vitamin

D by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry

after Removing Interference with Immunoaffinity Extraction,

Rapid Commun Mass Spectrom. 2011, 25(9), 1241-1249.

4. He, X and Kozak, M. Development of a Liquid

Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

Method for Plasma-Free Metanephrines with

Ion-pairing Turbulent Flow Online Extraction,

Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402(9), 3003-3010.

应用文献 563

28

采用 TSQ 三重四极杆质谱仪定量分析血浆中单羟基及双羟基维生素 D

Claudio De Nardi，Thermo Fisher Scientific，Dreieich，Germany

Katarina Hartmann，Barbara Hoyer，Immundiagnostik，Bensheim，Germany

关键词维生素 D；液相色谱串联质谱；TSQ；25-羟基维生素 D2；25-

羟基维生素 D3；1,25-双羟基维生素 D2；1,25-双羟基维生素

D3；25-D2；25-D3；1,25-D2；1,25-D3

目标采用 Thermo ScientificTM TSQ 三重四极杆质谱仪评价

Immundiagnostik AG KM1000 试剂盒在人血浆中维生素 D 及

其代谢物定量分析中的应用。被分析物包括 25-羟基维生素 D2

(25-D2) 和 D3 (25-D3) 以及 1,25-双羟基维生素 D2 (1,25-D2) 和

D3 (1,25-D3)。

前言在过去的十年中，液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）已经

越来越多的用于分析血浆中的维生素 D 及其代谢物。在临床

研究中，质谱仪出色的灵敏度和稳定性是检测分析维生素 D

的有力保证。

实验方法

样品前处理

首先，使用 Immunodiagnostik AG 的专利技术对血浆样本中

表 1. 标准曲线中的标样浓度

应用文献620

的维生素 D 进行清除处理。通过向处理过的血浆中添加标准

品来平行制备六份标样，其中含 25-D2 和 25-D3 的标样数为六

个，含 1,25-D2 和 1,25-D3 的标样数为八个，最终标注浓度参

见表 1。

25-D2 和 25-D3 使用六氘代 25- 羟基维生素 D3 作为内标，

1,25-D2 和 1,25-D3 使用六氘代 1,25-双羟基维生素 D3 作

为内标。标样使用 Immundiagnostik 的 LC-MS/MS 试剂盒

KM1000 中描述的方法进行提取，然后取 50 µL 上清液于 LC-

MS/MS 进样分析。

色谱方法

LC 系统Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 快速分离 LC（RSLC）

LC 色谱柱试剂盒方法包中提供

流动相 A 含 0.1% 甲酸的水溶液

流动相 B 含 0.1% 甲酸的甲醇溶液

进样体积 50 µL

LC 洗脱梯度参见表 2

被分析物标样 1 标样 2 标样 3 标样 4 标样 5 标样 6 标样 7 标样 8

25-羟基维生素 D2（nmol/L） 1.90 3.80 7.60 15.2 30.3 60.5 N/A N/A

25-羟基维生素 D3（nmol/L） 2.00 3.90 7.80 15.6 31.3 62.5 N/A N/A

1,25-双羟基维生素 D2（pg/mL） 2.50 5.00 10.0 20.0 40.0 80.0 160 320

1,25-双羟基维生素 D3（pg/mL） 2.50 5.00 10.0 20.0 40.0 80.0 160 320

29

质谱方法

LC 系统与 TSQ 三重四极杆质谱仪串联使用。

结果与讨论在试剂盒注明的浓度范围内，所有被分析物均制备了线性标准

曲线。每种被分析物的标准曲线浓度范围、截距、斜率和相关

因子（R2）等数据参见表 3。

每种被分析物的标准曲线参见图 1 至图 4。所有标样的实测浓

度与理论浓度之间的偏差均远小于 15% 的标准。每个浓度的

六份平行样品间的最大相对标准偏差 RSD 为 9.2%。每种被分

析物包括内标，在最低定量限（LOQ）浓度下的代表性色谱图

参见图 5。

图 1. 25-羟基维生素 D2 的标准曲线

图 2. 25-羟基维生素 D3 的标准曲线

图 4. 1,25-双羟基维生素 D3 的标准曲线

图 3. 1,25-双羟基维生素 D2 的标准曲线

表 2. LC 洗脱梯度

时间 (min)

流速 (mL/min)

A (%)

B(%)

曲线

0.0 0.500 95 5 5

7.0 0.500 20 80 3

7.1 0.500 0 100 5

9.0 0.500 0 100 5

9.1 0.500 95 5 5

10.0 0.500 95 5 5

源类型加热电喷雾离子源（HESI）

离子化模式正离子

RF 透镜 100 V 雾化温度 300 ºC

离子传输管温度 350 ºC

喷雾电压 4000 V

鞘气 50 AU

吹扫气 2 AU

辅助气 20 AU

数据采集模式选择反应监测（SRM）

色谱峰过滤峰宽 3.0 s

碰撞气压 1.5 mTorr

循环时间 0.35 s

Q1 (FWMH) 0.7 u

Q3 (FWMH) 0.7 u

数据处理

使用线性拟合进行数据定量分析，以 1/x 权重来建立标准曲线。

标样和质控样品的理论浓度值和通过计算后得到的实际浓度值

的偏差范围需小于 15% 。此外，研究中还考察了各分析物在

每个浓度水平的相对标准偏差 RSD。

0 10 20 30 40 50 60nmol/L

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 10 20 30 40 50 60 70nmol/L

0

2

4

6

8

10

12

14

0 50 100 150 200 250 300 350pg/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 50 100 150 200 250 300 350pg/mL

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

30

图 5. 每种被分析物（包括内标）在最低定量限（LOQ）浓度下的代表性色谱图

表 3. 标准曲线浓度范围、截距、斜率和相关因子（R2）

被分析物标曲浓度范围截距斜率 R2

25-羟基维生素 D2 1.9 – 60.5 (nmol/L) 0.0054 0.0179 0.997

25-羟基维生素 D3 2.0 – 62.5 (nmol/L) 0.9209 0.1949 0.997

1,25-双羟基维生素 D2 2.5 – 320 (pg/mL) 0.0018 0.0015 0.998

1,25-双羟基维生素 D3 2.5 – 320 (pg/mL) 0.0732 0.0037 0.998

结论本研究使用 TSQ 三重四极杆质谱仪评价了血浆中维生素 D2 和 D3 及其代谢物（即 25-羟基维生素 D2 和 D3 ，以及 1,25-双羟

基维生素 D2 和 D3）的定量分析方法的灵敏度、线性和重现性。实验结果表明，采用本研究方法得到的 LOQ 要低于大多数

其他分析方法对相同被分析物的 LOQ 检测结果。

d6-1,25-双羟基维生素 D3

Time(min)

1,25-双羟基维生素 D2

1,25-双羟基维生素 D3

RT: 7.78

RT: 7.85

RT: 7.78

RT: 7.09

RT: 7.20

RT: 7.08

d6-25-羟基维生素 D3

25-羟基维生素 D2

25-羟基维生素 D3

6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.0

100

50

0

100

50

0100

50

0100

50

0100

50

0

100

50

0

应用文献620

31

关键词

免疫抑制类药物；Prelude SPLC；TSQ

目标

建立一种快速、灵敏、高选择性和稳定性的 LC-MS/MS 方法，

用于检测全血中环孢霉素 A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司

的浓度。

前言

与传统免疫检测方法相比，LC-MS/MS 方法的选择性更好并且

成本更低。除此之外，LC-MS/MS 方法可在单次分析测试过程

中同时分析多种不同化合物。在本应用案例中，我们通过单次

分析精密准确的检测了全血中四种免疫抑制类药物（ISD）浓

度。我们采用具有样品前处理功能的液质联用系统，即 SPLC-

MS/MS 系统，该系统使用 Thermo ScientificTM TurboFlowTM

技术，将样品前处理与液相分离完美结合起来。Thermo

ScientificTM Prelude SPLCTM 系统的特色是具有两个相互独立的样

品处理和色谱分离通道，因此 Prelude SPLC 系统可以同时运行

两套色谱分离方法，并且两个通道的方法既可以相同也可以不

同。 Prelude SPLC 还可以将这种双通道运行的色谱洗脱液经自

动优化后引入质谱仪依次进行检测，从而提高了质谱仪的使用

效率和方法通量，同时也降低了分析成本。Prelude SPLC 注射

泵和高压且低体积的梯度混合不但提高了 HPLC 的色谱表现，

而且与双活塞往复泵相比，也改善了峰形和分辨率，并使保留

时间更为稳定。

实验方法

样品前处理

向 1.5 mL 离心管中加入 200 µL 全血样品和 300 µL 硫酸锌

溶液（0.1 M），涡旋震荡 30 s。再加入 500 µL 溶有内标

联合 Prelude-SPLC 系统和 TSQ 三重四极杆质谱仪进行全血中免疫抑制类药物的定量分析方法

Bill Yu， Joe DiBussolo， Kristine Van Natta， Marta KozakThermo Fisher Scienti�c， San Jose， CA

应用文献 604

（40 ng/mL D12-环孢霉素 A 和 4 ng/mL 13CD2-他克莫司）的甲

醇（Fisher Chemical brand）溶液，涡旋震荡 30 s。将混合物

在 4000 RCF 离心 10 min，取 40 µL 上清液进行分析。

色谱方法

LC 系统

Prelude SPLC 在线样品净化及液相系统Thermo Scientific Transcend TLX-1 系统

色谱柱

TuboFlow柱：Cyclone-PTM（0.5 x 50 mm）

分析柱：AccucoreTM C8（3 x 30 mm，2.6 µm）

分析柱温箱温度 70℃

LC 方法运行时间 5 min

TurboFlow 和 LC 梯度方法参见图 1

图 1. SPLC 方法细节

每次进样的总溶剂消耗

为 3.37 mL A、3.25 mL

B 和 1.5 mL C

32

质谱方法

质谱分析采用 TSQ 系列三重四极杆质谱仪。表 1 所示为质

谱条件，表 2 所示为四种药物和两种内标的选择反应监测

（SRM）离子对信息。

标准和对照实验

免疫抑制类药物的全血标样和质控（ Q C ）样品购自

ChromSystems Instruments & Chemicals GmbH，依照说明

对冻干的标准物和质控样品进行了活化。

结果与讨论

使用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件进行数据采集和处

理。图 2 所示为标样在最低浓度时的代表性色谱图。所有标准

曲线均线性良好，且 R2 值大于 0.9943。所有质控样品的测定

结果与生产商表明浓度的差异均小于 20% （表 3）。表 4 所示

为四种药物的线性范围和 R2 值，而图 3 所示为四种药物具有

代表性的标准曲线。图 4 所示为不同捐献者的血浆样品中他克

莫司和西罗莫司的提取离子色谱图及计算浓度。

离子化模式加热电喷雾离子化（HESI）

雾化温度 450 ℃

离子传输管温度 200 ℃

喷雾电压 3500 V

鞘气 52 AU

辅助气 20 AU


色谱峰宽 3 s

碰撞气压 2 mTorr

循环时间 0.2 s

Q1 (FWMH) 0.7

Q3 (FWMH) 0.7

SRM 参数参见表 2

化合物名称线性范围（ng/mL） R2

他克莫司 2.1–38.5 0.9971

环孢霉素 A 23.3–919 0.9951

西罗莫司 2.3–46.1 0.9943

依维莫司 2.2–41.1 0.9973

化合物名称Q1

(m/z) Q3

(m/z) RF 透镜碰撞能量

他克莫司 821.6 768.5 224 24 13CD2-他克莫司 824.6 771.6 224 24

环孢霉素 A 1202.8 425.4 250 58

D12-环孢霉素 A 1214.8 437.4 250 58

西罗莫司 931.7 864.5 250 23

依维莫司 975.5 908.5 224 23

西罗莫司理论量计算量差值（%）

QC1 2.90 2.66 -8.41

QC2 10.1 10.8 6.78

QC3 20.4 22.4 9.63

QC4 38.5 35.8 -7.09

环孢霉素 A 理论量计算量差值（%）

QC1 53.0 56.9 7.37

QC2 276 320 15.8

QC3 514 500 -2.75

QC4 1110 1190 6.77

依维莫司理论量计算量差值（%）

QC1 2.30 2.21 -3.83

QC2 4.40 3.80 -13.6

QC3 8.50 9.42 10.8

QC4 28.8 27.1 -5.89

他克莫司理论量计算量差值（%）

QC1 2.60 3.04 16.8

QC2 7.30 7.66 4.86

QC3 16.7 17.4 4.08

QC4 34.2 32.3 -5.60

表 1. 质谱条件

表 2. SRM 参数

表3. 质控样品测定结果

表 4. 线性范围

他克莫司

西罗莫司

依维莫司

环孢霉素 A

时间（min）

相对丰度

图 2. 标准品在最低浓度时的色谱图

33

他克莫司西罗莫司

依维莫司环孢霉素 A

峰面积比

峰面积比

峰面积比

峰面积比

图 3. 所有四种 ISD 药物的标准曲线

Y=1.809e-1X; R2:0.9971; Origin: Force; W:1/X: Area




理论量样品量差值（%）

Aa Aa Aa

2.100 2.038 -2.95

5.500 5.876 6.84

10.800 10.935 1.25

16.000 15.573 -2.67

22.300 21.011 -5.78

38.500 39.766 3.29


Aa Aa Aa

2.300 2.143 -6.83

6.200 7.260 17.10

12.100 11.521 -4.79

18.900 17.460 -7.62

28.500 28.288 -0.74

46.100 47.429 2.88


Aa Aa Aa

23.300 26.354 13.11

122.000 112.754 -7.58

291.000 275.375 -5.37

476.000 458.294 -3.72

762.000 728.971 -4.33

919.000 991.552 7.89


Aa Aa Aa

2.200 2.152 -2.18

5.700 5.898 3.47

11.200 10.455 -6.65

16.400 17.636 7.54

23.400 23.052 -1.49

41.100 40.806 -0.72

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A B

0.0

0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

图 4. A：其中一位捐献者全血分析的他克莫司定量色谱峰，计算浓度为 13.6 ng/mL（免疫检测结果为 15.1 ng/mL）；B：其

中一位捐献者全血分析的西罗莫司定量色谱峰，计算浓度为 22.3 ng/mL（免疫检测结果为 22.4 ng/mL）

结论

通过使用 Prelude SPLC 系统，建立了一种高通量高稳定性的 LC-MS/MS 分析方法，实现了全血中免疫抑制类药物的精确测

定。本方法满足了分析实验室对检测准确度和精密度的要求。

Prelude SPLC 系统能够提供全自动在线样品前处理和双通道运行技术，从而简化样品前处理步骤，同时提高分析通量。SPLC 的

总运行时长为 5 min，数据采集窗口为 1.75 min。通过使用 Prelude SPLC 系统的复合双通道分析，24 h 内可分析 576 个样品。

相对丰度

RT：0.70AA：19443.93AH：6993.63SN：INF

RT：0.76MA：4848.18MH：1881.07SN：INF

保留时间（min）保留时间（min）

应用文献 604

34

关键词

霉酚酸；TurboFlow 在线提取方法；APCI；治疗药物监测研

究；MPA；免疫抑制剂；器官移植

目标

利用 Thermo ScientificTM TurboFlowTM 技术，建立一种精密且

准确的检测方法，用于血浆中总霉酚酸（MPA）的定量分析。

前言

霉酚酸（MPA）是一种免疫抑制药物，常用于器官移植过程

中。MPA 在 90 年代已经投入使用，然而血浆中 MPA 水平监

测的优势至今仍未明确1。许多研究实验室并不开发分析方法，

而是通过购买商业测试方法来测定血浆浓度。目前，一些已发

表的方法可以同时分析 MPA、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司

以及依维莫司。可是将这些被分析物纳入同一个分析方法并不

值得推荐，因为 MPA 需要在血浆中测定其浓度，而其他药物则

在全血中测定，这就需要分别进行独立的、基质相符的实验分

析。因此，建立一个简单、快速的方法来分析 MPA 是十分必要

的。

为了能够以最少的样品前处理步骤，实现准确、高通量的 MPA

测定，我们建立了联合 LC-MS/MS 和 TurboFlow 技术的测定方

法。所有经方法验证的试验都符合目前的指导要求2，3。

实验方法

样品前处理

为避免霉酚酸葡萄糖苷（MPAG）降解成 MPA，静脉采血后

24 h 之内必须将血浆从经 EDTA 抗凝血处理过的全血中分离出

来。血浆样品在等待分析期间需储存在 4–8 ℃ 环境中。血浆样

品、标准样品（Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH，

采用 TurboFlow HPLC-MS/MS 串联质谱定量分析血浆中的霉酚酸Neil Leaver1，2， Sarah Robinson3

1Royal Brompton & Hare�eld NHS Foundation Hospital， Hare�eld， UK2Imperial College， London， UK3Thermo Fisher Scienti�c， Hemel Hempstead， UK

应用文献 612

德国）和质控样品（More Diagnostics，Inc，CA，USA）的提取

方法如下：混合 100 µL 样品、100 µL 内标溶液（吲哚美辛）和

800 µL 提取试剂（含硫酸锌的甲醇溶液）；将混合液涡旋震

荡后以 >10，000 g 的速度离心 5 min。然后将上清液转移至微

孔板中并用硅胶封口膜覆盖，再放入温度保持在 10 ℃ 的自动进

样器中等待分析。

LC 系统 TranscendTM TLX-II LC 系统

色谱柱TuboFlow 柱：TurboFlowTM C18 XL 柱（50 x 0.5mm）

分析柱：Hypersil GOLDTM 柱（1.9 µm，50 x 2.1 mm）

流动相 A 添加 10 mM 乙酸铵的水溶液

流动相 B 添加 10 mM 乙酸铵的甲醇溶液

流动相 C乙腈 /2- 丙醇 / 丙酮（40:40:20 v/v/v）（用于清洗 TurboFlow 柱并作为自动进样器的清洗液）

TurboFlow 和 LC梯度方法

参见表 1

LC-MS/MS 方法

35

表 1. 2D TurboFlow 色谱的HPLC 梯度表

表 2. APCI 模式下 MPA 分析的源参数

表 3. MPA， MPAG，和内标（吲哚美辛）的 SRM 离子对

母离子 m/z 子离子 m/z 碰撞能量 Tube LensMPA 321.1 159， 207， 303 35， 23， 12 103

MPAG 514.0 321 18 103

内标 357.9 111， 129， 138 43， 33， 22 108

参数数值

放电电流 6.0 µA

鞘气 50 arb

辅助气 5 arb



上样系统洗脱系统

步骤开始时间（s）

流速 mL/min

梯度 %A %B %C %D Tee Loop流速

mL/min梯度 %A %B %C %D

1 00:00 40 2.00 Step 100 - - - - Out 0.60 Step 90 10 - -

2 00:40 80 0.20 Step 100 - - - T In 0.40 Step 90 10 - -

3 02:00 120 2.00 Step - - 100 - - In 0.60 Ramp - 100 - -

4 04:00 20 2.00 Step 10 90 - - - In 0.60 Step - 100 - -

5 04:20 60 2.00 Step 100 - - - - Out 0.60 Step 90 10 - -

采用 Thermo ScientificTM TSQ 系列三重四极杆质谱仪，离子源为大气压化学电离（APCI）源，离子模式为正离子扫描模式，具

体信息请参见表 2。选择反应监测（SRM）离子对在表 3 中列出。数据采集使用 Thermo ScientificTM XcaliburTM 软件和 Thermo

ScientificTM AriaTM 系统控制软件。使用 Thermo ScientificTM LCQuanTM 软件进行数据分析。

结果与讨论

使用 LC-MS/MS 技术测定 MPA 是具有挑战性的，因为在实际样品中可观察到标准品和加标空白血浆中并不存在的干扰物。例如

MPA 的 ac0079l葡糖苷酸代谢物 MPAG， MPAG是一个干扰物，因为它会在离子源中碎裂成 MPA，在电喷雾离子源（ESI）和

APCI 源中都有可能发生碎裂。因此，使 MPA 和 MPAG 得到充分的色谱分离至关重要。

表 4. MPA 的日间精密度研究（四个浓度水平的质控样品，每个浓度水平进行 10 次平行检测，连续重复五天）

QC1 QC2 QC3 QC4

平均值 mg/L 1.7 6.9 11.3 33.5

标准偏差 0.1 0.4 0.7 1.9

CV% 6.4 6.3 6.2 5.8

36

参考文献

1. Kuypers, D.R.; Le Meur, Y.; Cantarovich, M., et al. Consensus

report on therapeutic drug monitoring of mycophenolic acid in

solid organ transplantation. Clinical Journal of the American

Society of Nephrology: CJASN 2010;5:341-58.

2. COMMISSION DECISION of 12 August 2002 implementing

Council Directive 96/23/EC concerning the performance of

analytical methods and the interpretation of results. Official

Journal of the European Communities. L 221/8. 17.8.2002.

http://faolex.fao.org/docs/pdf/eur49615.pdf

3. U.S. Food and Drug Administration, Guidance for Industry,

Bioanalytical Method Validation 2001. (http://www.fda.gov/

downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformati

on/Guidances/UCM070107.pdf).

应用文献 612

图 1. MPA （上）， MPAG （中）和内标（下）的提取离子色谱图

图 1 所示为三个经 SRM 扫描的色谱图。在 MPA 的 [M+H]+ 离

子扫描中，MPA 和 MPAG 峰的保留时间相差约为 0.6 min。对

代谢物定量分析而言，MPAG 至 MPA 转化的极大值出现于优

化离子化过程中。标准曲线在 0.2 mg/L 至 40 mg/L 的范围内

线性良好。精密度数据见表 4，本方法在线性范围内的 CV 为

5.8–6.4%。

结论

本文采用 TurboFlow 技术建立了一种能够实现 MPA 准确检测

和定量的分析方法。除此之外，本方法检测迅速，仅需极少的

样品前处理步骤，并且符合目前的分析指导原则。

霉酚酸

（MPA）

霉酚酸葡萄糖苷

（MPAG）

吲哚美辛

（ISTD）

37

采用三重四极杆质谱仪定量分析干血点样品中的免疫抑制剂

Pavel Aronov1， Katerina Sadilkova2， Jane Dickerson2， Marta Kozak1

1Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA; 2Seattle Children‘s Hospital， Seattle， WA

关键词

免疫抑制类药物；干血点样品；TSQ

目标

建立一种快速、灵敏、高选择性且成本合理的 LC-MS/MS 方法，

用于检测尺寸小至 3 mm 的干血点中的环孢菌素 A，他克莫司

和西罗莫司的浓度。

前言

免疫抑制剂（IMS）的治疗窗很窄，因此有必要进行常规监

测。干血点（DBS）纸片采样法是一种适合作为样品收集的方

法，该方法只需满足最低的安全要求，就可以在现场样品收集

后发回实验室进行分析。通常使用 8 mm 的干血点，然而如果

可以将干血点尺寸减小到 3 mm ，不但能够将样品的体积降低

7 倍，而且还能用标准办公打孔器来裁剪干血点，使样品前处

理步骤实现自动化。但是，由于样品体积的减少，要求灵敏度

更高的 LC-MS/MS 方法。在本应用案例中，我们使用 Thermo

ScientificTM TSQ 系列三重四极杆质谱仪对干血点中的 IMS 进

行定量分析。

实验方法

样品前处理

向乙腈中添加子囊霉素（AsC）、西罗莫司 -d3（d3-SrL）和环

孢菌素 D（CsD）至 6 ng/mL（AsC 和 CsD）和 30 ng/mL（d3-SrL）

的浓度。

IS 溶液的配制方法为：在水中混合两份 IS 储备液和一份 0.01

M 硫酸锌溶液，至 AsC、CsD 和 d3-SrL 的终浓度依次为 4ng/

mL、4ng/mL 及 20 ng/mL，IS 溶液可以在 4 ℃ 环境中存储 3

个月。

表 1. 色谱梯度

应用文献 603


流速（mL/min）

% B

1 0.00 0.500 30

2 0.25 0.500 30

3 0.50 0.500 100

4 1.50 0.500 100

5 1.51 0.750 30

6 2.00 0.750 30

用 8 mm 打孔器将干血点卡裁剪至 2 mL 离心管中。然后加入

150 µL 含 0.01 M ZnSO4 的 IS 溶液，确保整个血点都被浸透。

将离心管轻轻涡旋震荡 3 s，15700 rcf 离心 3 min。接下来

将样品混合摇匀 20 min，而后马上将上清液转移至自动进样

器的样品瓶中，用 66% 乙腈再稀释七倍以模拟 3 mm DBS，

LC-MS/MS 系统的进样量为 20 µL。

色谱方法

LC 系统Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM HPG3400-RS 泵，UltiMate WPS-3000 自动进样器，UltiMate TDS-3000 柱温箱

色谱柱专利产品

流动相 A含 10 mM 甲酸铵 /0.1% 甲酸水溶液（Fisher ChemicalTM brand）

流动相 B含 10 mM 甲酸铵 /0.1% 甲酸的甲醇溶液（Fisher ChemicalTM brand）

LC 梯度参见表 1

38

26 ng/mL

ng/mL % Diff

26 10.9

53 -8.5

106 -0.9

212 -4.3

425 2.6

850 0.1

1.3 ng/mL

ng/mL % Diff

1.3 1.7

2.5 -3.8

5.0 5.8

10 -2.5

20 -3.2

40 1.7

1.5 ng/mL

ng/mL % Diff

1.5 0.4

3 17.3

6 -16.6

12 2.5

24 -7.9

48 4.3

RT: 0.58 - 1.11

0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 0.82 NL: 3.31E3TIC F: + c ESI SRM ms2 1220.00 [1202.80] MS ICIS SCH_Immunosuppresants_STD_level1_001

RT: 0.56 - 1.02

0.6 0.7 0.8 0.9 1.0Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance


RT: 0.58 - 0.98

0.6 0.7 0.8 0.9Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance


质谱方法

质谱分析使用 TSQ 系列三重四极杆质谱仪（图 1）。MS 条件

如下：

结果与讨论

所有数据的采集处理过程均使用 Thermo ScientificTM

TraceFinderTM 软件完成。TSQ 系列三重四极杆质谱仪 SRM

检测的高选择性可以使用 10 mm 短柱进行快速色谱分离（2

min）并得到峰形完美的色谱峰（图 1）。我们为每个被分析

物都建立了相应内标标准曲线（图 2–4）。对每个 QC 样品和

捐献者样品均进行了三次平行分析，加标和测量结果的吻合度

良好（表 3）。

离子化模式加热电喷雾离子化（HESI）



喷雾电压 1000 V

鞘气 45 AU

辅助气 5 AU

吹扫气 1 AU


色谱过滤峰宽 3 s

碰撞气压 2 mTorr

循环时间 0.5 s

Q1（FWMH） 0.7

Q3（FWMH） 0.7

SRM 参数参见表 2

表 2.SRM 离子对

图 2. 环孢菌素 A 标准曲线

图 3. 他克莫司标准曲线

化合物名称母离子(m/z )

子离子(m/z )

碰撞能量(V)

RF 透镜电压(V)

子囊霉素 809.75 756.4 21 203

他克莫司 821.6 768.45 20 187

西罗莫司 931.85 864.5 17 191

西罗莫司 -d3 934.85 864.5 17 191

环孢菌素 A 1220 1202.8 17 224

环孢菌素 D 1234 1216.85 17 220

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

他克莫斯

Y=6.94e-2X+2.404e-2; R2:0.9989; Origin:lgnore; W:1/X; Area

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

环孢菌素 A

Y=6.786e-3X+4.073e-4; R2:0.9989; Origin:lgnore; W:1/X; Area

图 1. 色谱图

西罗莫司

环孢菌素 D

环孢菌素 A

d3 西罗莫司

他克莫司

子囊霉素

横坐标：时间（min）

纵坐标：相对丰度

100

0100

0100

0100

0100

0100

00.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0.79

0.79

0.82

0.82

0.79

0.79

ng/mL

ng/mL

面积比

面积比

图 4. 西罗莫司标准曲线

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

4.24.03.83.63.43.23.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

西罗莫斯

Y=7.731e-2X-4.513e-2; R2:0.9926; Origin:lgnore; W:1/X; Area

ng/mL

面积比

39

表 3. QC 样品和未知样品测定结果

结论

我们建立了一种高通量且成本合理的研究方法，采用 TSQ 系列三重四极杆质谱仪检测干血点中的免疫抑制类药物。本方法满

足了分析实验室对 3 mm 干血点样品分析的精密度和准确度要求。

他克莫司西罗莫司环孢菌素 A

加标值（ng/mL）

测量值 [ 均值 ± 标准偏差 ]

（ng/mL）


测量值[ 均值 ± 标准偏差 ]

（ng/mL）


测量值[ 均值 ± 标准偏差 ]

（ng/mL）

低质控浓度 6.0 6.2 ± 0.2 3.6 3.2 ± 0.3 76 74 ± 2

中质控浓度 12 13.1 ± 0.5 7.9 11.0 ± 0.4 199 175 ± 3

高质控浓度 22 21.2 ± 2.8 17.4 17.6 ± 4.2 311 276 ± 9

被测样品 1 10 11.0 ± 1.0 5.3 6.2 ± 0.5 0 < LOQ

被测样品 2 4.2 4.9 ± 0.4 0 < LOQ 0 < LOQ

被测样品 3 0 < LOQ 2.1 3.0 ± 0.9 59 57 ± 3

应用文献 603

40

关键词

阿片类；苯二氮卓类； Prelude SPLC

目标

建立一种高通量、低溶剂消耗、操作简便的定量分析方法，用

于尿液中 6 种阿片类和 14 种苯二氮卓类药物的法医检测定量

分析。

前言

阿片类和苯二氮卓类药物的分析是法医毒理实验室最常进行

的分析工作之一。为了满足高通量分析的需要，我们开发出

一种快速、简便且经济有效的检测方法。本方法包括水解、

简单尿液稀释、液相色谱分离和质谱检测分析等步骤。我

们在本方法中使用了 Thermo ScientificTM Prelude SPLCTM 系

统，该系统的特色是拥有两套相互独立的样品前处理和色谱

分析通道（SPLC），因此该系统既可以同时在两个分析通道

里平行运行不同的 LC 方法（图 1），也可以运行相同的 LC

方法（图 2），多通道的洗脱液再依次进入质谱进行检测。

质谱依序检测多通道色谱分离的方法能够改善质谱的使用效

率，提高法医毒理学实验室的分析通量，降低分析成本。此

外，Prelude SPLC 系统配备的注射泵和高压且小体积梯度混

合器还改善了 HPLC 表现，使峰形和分辨率都得到优化，保

留时间也更为稳定。

尿液中 6 种阿片类和 14 种苯二氮卓类药物的三重四极杆 LC-MS/MS 高通量定量分析

Bill Yu， Kristine Van Natta， Marta Kozak， Thermo Fisher Scientic， San Jose， CA

应用文献 588

图 1. 6 种阿片类药物（10 ng/mL）和 14 种苯二氮卓类药物（25 ng/mL）在多通道复合模式下的平行分析

采集相关质谱数据

14 种苯二氮卓类药物（每个 25 ng/mL）

14 种苯二氮卓类药物（每个 25 ng/mL）

6 种阿片类（每个 10 ng/mL）

6 种阿片类

14 种苯二氮卓类药物

14 种苯二氮卓类药物

传统 LC-MS/MS

Prelude SPLC 多通道

进样 1

通道 1

通道 2

进样 1

进样 1

进样 2

进样 2

进样 2

进样 3

进样 3

41

图 2. 在多通道复合模式下用双通道分析 6 种阿片类药物（10 ng/mL）

6 种阿片类（每个 10 ng/mL）

6 种阿片类 6 种阿片类 6 种阿片类

采集相关质谱数据

Prelude SPLC 多通道复合 —两个通道使用相同方法

进样 1 进样 2

通道 1

通道 2

进样 1 进样 2 进样 3

实验方法

样品前处理

表 1 和表 2 列出了本方法中分析的阿片类和苯二氮卓类药

物。样品由葡糖苷酸水解然后稀释。向 200 µL 尿液样品中加

入 10 µL 内标溶液和 100 µL β-葡萄糖醛酸苷酶的乙酰胺缓冲

溶液（pH = 5.0），在 60 ℃ 水浴两小时。加入 200 µL 甲醇终

止酶反应。冷却后离心，用去离子水稀释 20 倍。取 20 µL 样

品进行液质联用分析。

表 1.阿片类药物分析方法中的 SRM 离子对列表

化合物母离子

m/z定量子离子

m/z定性子离子

m/z吗啡 286.1 152.1 185.1

吗啡-d3 289.1 152.1 185.1

氧吗啡酮 302.1 227.1 198.1

氧吗啡酮-d3 305.1 230.1 201.1

氢吗啡酮 286.1 185.0 157.1

氢吗啡酮-d6 292.1 185.1 157.1

可待因 300.2 152.1 165.1

可待因-d3 303.1 152.1 215.1

氧可酮 316.2 241.1 256.1

氧可酮-d3 319.2 241.1 259.1

氢可酮 300.1 199.1 171.1

氢可酮-d3 303.1 199.1 171.1

色谱方法

阿片类药物分析的全部梯度时间为 5.3 min，苯二氮卓类药物

的分析时间为 6 min（图 4）。阿片类和苯二氮卓类药物的数

据采集窗口分别为 2 min 和 2.8 min。

LC 系统 Prelude SPLC 系统

色谱柱AccucoreTM PFP (50 x 2.1 mm, 2.6 µm)

流动相 A添加 0.1% 甲酸和 10 mM 甲酸铵的水溶液

流动相 B 甲醇

TurboFlow 和 LC 梯度方法参见图 3 和图 4

图 3. 阿片类药物分析的 LC 梯度设置

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