昭和60年12月20日 1175

原 著

蛍 光 抗体 法 に よ る慢 性 下気 道感 染 症 にお け るHaemophilus

influenzaeの 動 態 に関す る研 究

奈良医大第2内 科(主 任:三 上理一郎教授)

国 松 幹 和

(昭和60年6月13日 受付)

(昭和60年9月14日 受理)

Key words:Chronic lower airway infection,Haemophilus influenzae,Fluorescent technique

要 旨

Haemophilus influenzaeは 慢 性 下気 道感染 症 の重要 な起 炎菌 で あ るが,下 気 道 にお け る分 布,動 態 に

関 しては 明か に され て いな い.こ の問題 に取 り組 むた め に,H.influenzae(non capsulatd strain)に

対 す る抗体 を作 成 し,慢 性下気 道感 染症 患者 の気 管支壁 につ いて,蛍 光抗体 法 を用 いH.influenzaeの 分

布を調 べ た.対 象 は経気 管 吸引法(TTA)に てH.influenzaeが 検 出 された慢 性下 気道 感染 症患 者8例

で,陰 性 コン トロール としてTTAに てBranhamella catarrhalis,Klebsiella pneumoniaeが それ ぞれ検

出 された慢 性下 気道 感染 症患 者2例 を用 いた.気 管支 壁 は経気 管支 的気管 支生 検 にて慢 性下 気道 感染症

患者 の主気 管支 お よび 区域気 管支(B7)よ り採取 し,蛍 光 抗体 法 に よ り染 色 した.

1.H.influenzeaは 主 気管 支 には8例 中1例 も検 出 されな か った が,区 域気 管支 に は8例 全例 に検 出

され た.

2.組 織 学的 にみ る とH.influenzaeは 全 例,気 道 分泌物 お よび気 道粘 膜上 に認 め,そ の うち1例 は気

道粘膜 下組 織(非 腺 組織)に も検 出 された.

3.他 菌 の検 出 された対 照 の2例 で はH.influenzaeは 検 出 され な か った.

以上 の こ とか ら慢 性下 気道 感染 症 にお いて,気 道上 のH.influenzaeに は定着 しやす い部 位 が あ る こ

とが推測 され た.

緒 言

Haemophilus influenzaeは 慢 性 下 気 道 感 染 症

の 起 炎 菌 と して 最 も高 頻 度 に 認 め られ,我 々 も経

気 管 吸 引 法(Transtracheal aspiration,以 下

TTA)の 研 究 か ら同様 の 成 績 を得 て い る.し か し,

H.influenzaeの 下 気 道 に お け る分 布,動 態 に関 し

て は 未 だ に推 測 の 域 を で て い な い.今 回H.influ-

enzaeに 対 す る抗 体 を 作 成 し,経 気 管 支 的 気 管 支

生検(Transbronchial bronchial biopsy,以 下

TBB)に よ り採 取 した 気 管 支 壁 を 蛍 光 抗 体 法 に よ

り染 色 し,H.influenzeaの 分 布 に つ い て 検 討 を

行 った.

対象と方法

1.対 象

対 象 はTTAに てH.influenzaeが 培 養 され た

慢 性 下 気 道 感 染 症 患 者8例 で,Table 1の ご と く

男 性7例,女 性1例,平 均 年 齢 は59.4歳 で 診 断 は

び ま ん性 汎 細 気 管 支 炎(Diffuse panbronchiolitis,

以 下DPB)4例,気 管 支 拡 張 症2例,慢 性 気 管 支

炎2例 で あ った.TTAに てBranhamella catarr-

halis,Klebsiella pneumoniaeが そ れ ぞ れ 培 養 さ

れ た 慢 性 気 管 支 炎,お よ びDPBの2例 を 陰 性 コ

ン トロー ル と した.

別刷請求先:(〒634)奈 良県橿原市四条 町840

奈良県立医科大学附属病院第2内 科学教

室 国松 幹和

1176 感染症学雑誌 第59巻 第12号

Table 1

A) Patients with isolation of H.influenzae

B) Patients without isolation of H.influenzae

1) S:patient with chronic sinusitis

2) BE:bronchiectasis

3) DPB:diffuse panbronchiolitis

4) CB:chronic bronchitis

2.方 法

A) H.influenzaeに 対 す る抗 体 の 作 成

1) 抗 原 の作 成

a) H.influenzaeの 液 体 培 養1):坂 ロ フ ラ ス コ

内 に培 養 液(蒸 溜 水100mlにBHI 3.7g,NAD1

mg hemoglobin 1mg,glucose 160mgを 溶 か した

も の)100mlを 加 え,患 者 喀 痰 よ り分 離 し たH.

influenzae(non capsulatd strain)を 加 えrotary

shakerで37℃,150rpmで8時 間培 養

b) 培 養 液 を4℃,10,000rpmで 遠 心 後 上 清 を

捨 てphosphate buffered saline(PBS)で3回 洗

浄

c) 菌 を1%ホ ル マ リ ン を 含 むPBS中 に 懸 濁

し,4℃ に て1夜 放 置 して 殺 菌,遠 心 後0.5%ホ ル

マ リ ンを 含 むPBS中 に 懸 濁 し,菌 数 を5×109/

mlに 調 整 し抗 原 と した.

2) 抗 血 清 の 作 成

Cherryら2)の 方 法 を 一 部 改 変 して,ウ サ ギ に下

記 の ス ケ ジ ュー ル で 免 疫 を行 った.

1日 目:死 菌 フ ロ イ ン ド完 全 ア ジ ュバ ン ト混 合

液2mlを,ウ サ ギ の背 部 に10か ら20ヵ 所 に分 け て

皮 下 注 す る.

昭 和60年12月20日 1177

Fig.1 Right upper:positive finding,left upper and right lower:negative

finding,left lower:weak positive finding

Table 2 Specificity of and H.

influenzae antibody

31日 目:死 菌 フ ロイ ン ド完 全 ア ジ ュバ ン ド混 合

液 を,ウ サ ギ の 両 側 後 肢 の 大 腿 筋 に1mlず つ 筋 注

す る.

38日 目:耳 静 脈 に2mlの ホ ル マ リン死 菌 を 静 注

す る.

45日 目:耳 静 脈 に2mlの ホ ル マ リン死 菌 を 静 注

す る.

52日 目:耳 動脈 よ り採 血 す る.

3) 抗 体 の 精 製

Fig.2 This preparation contains the bronchial

mucosa,submucosal tissue and bronchial secre-

tion.H.influenzae is found in bronchial secretion.

Background is stained by ethidium bromide(E.

B.),(magnification:×400;inset:×1,000)

抗 血清 に飽 和硫 安 を用 い た 塩 析 法 に て 精 製 し,

さ ら にDEAE celluloseを 通 し てIg-G分 画 を 得

た.こ の 抗体 の 力 価 は2,048倍 で あ っ た.

1178 感染症学雑誌 第59巻 第12号

Fig.3 This preparation contains bronchial mu-

cosa and submucosa.H.influenzae is found on

the mucosa Background is stained by E.B.(ma-

gnification:•~400;inset:•~1,000)

Fig.4 This preparation contains only submucosal

tissue and H.influenzae is found in it.(ma-

gnification:•~1,000)

Fig.5 Preparation of main bronchus.H.in-

fluenzae is not found.Background is stained by E.

B.(magnification:×200)

Fig.6 Preparation of bronchial tissue obtained

from negative control.H.influenzae is not found.

There is autofluorescence of submucosal tissue.

Background is stained by E.B.(magnification:•~

200)

Fig.7 Biopsy of lower lobe bronchus.Ciliated

epitherial cells are taller.Cilia are not of uniform

height,and shorter.Infiltration of inflammatory

cells,(mainly monocytes)and slight edema are

seen in submucosal tissues.(H.E.staining,

magnification•~200)

4) 特 異 性 の 検 定

この 抗 体 のH.influenzaeに 対 す る特 異 性 を 調

べ るた め に,上 気 道 の 常 在 菌 と して 高 頻 度 に検 出

され る B.catarrhalis,K.pneumoniae,ƒ¿-stre-

ptococcus,Neisseria pharingis,Staphylococcus

aureus,Pseudomonas aeruginosa,Streptococcus

pneumoniae‚¨‚æ‚ÑHaemophilus parainfluenzae

等 の 他, Haemophilus hemolyticus,Haemophilus

parahemolyticusに つ い て,後 述 す る 間 接 蛍 光 抗 体

法 に て 反 応 性 を 調 べ た.そ の 結 果,Table 2の よ う

昭和60年12月20日 1179

Table3 Detection of H. influenzae

Patients with isolation of H. influenzae

* :onciliatedcel1

** :onciliatedcellof

squamousmetaplasia

Patients without isolation of H. influenzae

abbreviation A : acute, C : chronic

にS.pneumonia,H.parainfluenzae,H.

hemolyticus,H.parahemolyticzcsに 弱 い反 応 を 認

め た.Fig.1に 陽 性,弱 陽 性,陰 性 例 を 示 した.

5) 吸 収 操 作

a) 上 記 の 弱 陽 性 反 応 を 消 去 す るた め に,抗H.

influenzea抗 体 に つ い て,弱 陽 性 反 応 を 呈 した 菌

で 吸 収 操 作 を行 った.

b) また,剖 検 時 に 得 られ た 病 変 を 認 め な い ヒ

ト肺 組 織 に て も吸 収 を行 った.

B) 実 施 方 法(間 接 蛍 光 抗 体 法)

1) TBBに て主 気 管 支 お よび 区 域 気 管 支(B7)

を採 取 し,ド ラ イ ア イ ス ・ア セ トン液 中 で 凍 結 片

を 作 成 す る.

2) 凍 結 片 を4μ に 切 り,凍 結 切 片 を作 成 す る.

3) 凍 結 切 片 と256倍 希 釈 した 抗H.influenzae

抗 体 を,moist chamber内 で 室 温 に て60分 間 反 応

させ る.

4) staining bufferで3回 洗 浄 す る.

5) 切 片 に20倍 希 釈 したFITC標 識 した 抗 ウ サ

ギIg-G抗 体(Cappel社)を か け,moist chamber

内 で 室 温 に て60分 間 反 応 させ る.

6) staining bufferで3回 洗 浄 後,グ リセ リン封

入 し,蛍 光 顕 微 鏡(Nikon VFS-R)で 観 察 す る.

7) 各 症 例 に つ い て,気 管 支 鏡 ・組織 所 見,お よ

び エ ロ ソ ール 吸入 シ ネ シ ン チ グ ラ フ ィも あわ せ て

検 討 を 加 えた.

結 果

1.蛍 光 抗 体 法 に よ るH.influenzaeの 検 出

Table 3に 示 す よ うに 蛍 光 抗 体 法 に よ り,8例

中8例 にH.influenzaeを 検 出 した.解 剖 学 的 に

み る とH.influenzaeは 主 気 管 支 に は1例 も検 出

さ れ な か った が,区 域 気 管 支 に は全 例 検 出 され た.

組 織 学 的 にみ る と,気 道 分 泌 物 中 お よ び気 道 粘 膜

上 に は8例 全 例 に検 出 され,気 道 粘 膜 下 の非 腺 組

織 に は1例 検 出 され た.気 道 粘 膜 上 に検 出 され た

H.influenzaeは,線 毛 細 胞 上 お よ び扁 平 上 皮 化 生

1180 感染症学雑誌 第59巻 第12号

した細胞上におのおの1例 ずつ存在が認められ,

他の6例 については存在す る細胞 を識別 できな

かった.

Fig.2に 気道分泌物中に存在するH.influenzae,

Fig.3に 気道粘膜上に存在す るH.influenzae,

Fig.4に 気道粘膜下に存在す るH.influenzaeを

示した.Fig.5に 主気管支の蛍光像を示 したが,

H.influenzaeは 検出 され ていない.Fig.6は 陰

性コン トロール群 の蛍光像で,H.influlenzaeは

認められない.

2.気 管支鏡および組織学的所見

対象例および陰性 コン トロールにおいて,気 管

支鏡所見では粘膜の発赤,腫 脹,萎 縮,気 管支の

狭窄および気道内の粘液の貯溜などを認めた.ま

た組織学的所見では,粘 膜において線毛円柱上皮

の過形成,杯 細胞の増生,一 部に扁平上皮化生な

どを,粘 膜下には細胞浸潤,浮 腫などの炎症所見

を,そ れぞれ中等度から高度に認めた.す なわち,

全例に慢性炎症所見を認めたが,急 性炎症所見を

示 している症例 も半数に認められた.対 象例 と陰

性 コン トロールの間に著名な差はなかった.Fig.

7に 光顕による定型的 な組織像 の1例 を呈示す

る.

3.エ ロソール吸入シネシンチグラフィ所見

伊藤 らのエロソール吸入シネシンチグラフィに

よる,主 気管支および気管支でのbolus移 動の分

類3)(Fig.8)で は,Table 3に 示すように対象8

例中IV型5例,III型2例,I型1例 であった.ま

た陰性 コン トロールでは,IV型2例 で,気 道の粘

膜線毛輸送系が高度に侵されている所見を呈 して

いた.対 象 と陰性 コントロールの間に著名な差を

Fig.8 Classification of the bolus movements on

the main bronchus and the trachea

Type I:rapid and smooth movement,Type II:

slow movement,Type III:stasis at the carina,

Type IV:no significant change.

Type I Type II Type III Type IV

認 め な か った.

考 案

H.influenzaeは,1931年Pittman4)に よ り血 清

学 的 にtype a,b,c,d,e,fの6種 類 の莢 膜 形

成 株(capsulated strain)と,non typableす な わ

ち 莢 膜 非 形 成 株(non-capsulated strain)に 分 類

され た.本 菌 は 上 気 道 で は 常 在 菌 と して 存 在 す る

が,ふ る くか ら慢 性 下 気 道 感 染 症 との 関 連 性 が指

摘 され て い た.1950年 代Mayら の精 力 的 な 研 究

に よ って,H.influenzaeと くに 莢 膜 非 形 成 株 が 慢

性 下 気 道 感 染 症 の 重 要 な起 炎 菌 で あ る こ とが,広

く認 め られ る よ うに な った5).我 が 国 で も,本 菌 は

慢 性 下 気 道 感 染 症 の 起 炎 菌 中 第1位 を 占 め,と く

に そ の急 性 増 悪 に最 も関 与 し て い る と考 え られ て

い る.当 教 室 の 澤 木 らのTTAに よ る研 究 か ら も

同様 の結 果 が得 られ6),更 に 本 菌 の 持 続 感 染 を 示

唆 す る成 績 も得 られ て い る7).

しか しそ の病 態 につ い て は 不 明 の点 が 多 い.H

influenzaeの 呼 吸器 との 親 和 性,気 道 上 の存 在 部

位 な どは ほ とん ど知 られ て い な い.慢 性 下 気 道 感

染 症 の 急 性 増 悪 に つ い て も,H.influenzaeの 関

連 は認 め られ て い る もの の,そ の 引 き金 に な るの

はvirus,特 にrhinovirus8),あ る い はinfluenza

virus9)の 先 行 感 染 が あ っ て,そ の 後 にH.in-

fluenzaeの 増 殖 が生 じて くる とい う報 告 もあ る.

又 慢 性 下 気 道 感 染 症 の 寛 解 期 に は,H.influ-

enzaeは 下 気 道 よ り消 失 し て い る の か,あ る い

は存 在 し続 け て い るの か も明 らか に は され て い な

い.

これ らの 問 題 に取 り組 む た め に,一 般 に細 菌 に

対 す る特 異 的 な抗 体 を 作 成 し,蛍 光 抗 体 法 を 用 い

て,組 織 中 の 菌 の存 在 部 位,分 布 を 検 索 す る こ と

は1つ の有 効 な 方 法 で あ る.

こ の よ うな 方 法 は 最 近,Legionella pneumo-

phila2),Chlamydia trachomatis10)で は 実 施 さ れ

て お り,診 断 に も応 用 さ れ て い る.し か し な が

ら,慢 性 下 気 道 感 染 症 に お い て この よ うな 方 法 で

な され た 検 索 は少 な い.我 が 国 で は 稲 富 ら11)がP.

aernginosaに 対 す る抗 体 を作 成 し,蛍 光 抗 体 法 に

てDPB患 者 の剖 検 肺 で,P.aeruginosaの 分 布 を

調 べ て い るに す ぎ な い.

昭和60年12月20日 1181

H.influenzaeに ついては,Clarkeら12)がH.

influenzaeの 菌体中の可溶性抗原に対する抗体を

持つ ヒトの血清を用いて,気 管支の組織片を染色

しているが,ヒ トの血清を使用 してヒ トの組織を

染色しているところに問題がある.

今回我々が ウサギにH.influenzaeを 免疫 して

作成 した抗体は,力 価 も2,048倍 と高 く,特 異性に

おいては検索 した3種 のHaemophilus属 とは弱

陽性を示すものの,上 気道の常在菌については,

S.pneumoniae以 外 とは反応 しなかった.従 って

使用にさいしては抗体を,弱 陽性を呈した菌で吸

収後使用したので,特 異性については問題がない

と考える.

TTAに てH.influemaeが 培養 された慢性下

気道感染症患者8例 より,TBBに て気管支組織

片を採取し,こ の抗体を用いて蛍光抗体法にてH.

influenzaeの 存在を検索した ところ,解 剖学的に

は主気管支には1例 も検出されず,区 域気管支に

は8例 中すべてに検出された.主 気管支 と区域気

管支で,H.influenzaeの 検出率の差違が認め られ

た所見は,下 気道において本一菌の定着 しやすい部

位の存在を示 している.

この成績はどのような理 由によるものであろ う

か.最 近教室の龍神 らは13),99mTc-Milli Micros-

phere human serum albuminを 用いた,エ ロソー

ル吸入シネシンチグラフィによ り粘膜線毛輸送機

構の障害に関する研究を行っている.そ れによる

と慢性下気道感染症の代表的疾患であるDPB,慢

性気管支炎では吸入されたエロソールは区域気管

支以下の気管支に沈着 しやすいとい う結果を得て

いる.ま た伊藤 ら3)もエロソール吸入 シネシンチ

グラフィーにより,咳 によるbolusの 排出効果を

みているが,そ れによると喉頭に近づ くにつれ,

咳によるbolusの 排出効果は良好 とな り,遠 ざる

かるにつれ悪 くなっている.こ れ らの成績は慢性

下気道感染症において一旦下気道に吸入された微

粒子は区域気管支以下に沈着しやす く,か つ排出

されにくいことを意味してお り,こ のことは上記

の成績 と関連 して考えると興味深い.

慢性下気道感染症においてH.influenzaeが 組

織学的に,気 道上のどこに存在 しているかは,疾

患の病態の病態生理を考える上で重要な問題であ

る.H.influenzaeに 限定せずひろく細菌 としてこ

の問題 を考えると,Spencer14)は 気道内に蓄積 し

た粘液中で細菌が増殖す ると述べている.ま た,

吉村 ら15)はP.aeruginosaが 検出された,DPB患

者の気管支の光顕的研究 では,気 道分泌物中に

あったとしている.し か しH.influenzaeに 関す

る記載はない.

今回の研究でH.influenzaeは,8例 全例 に気

道分泌物および気道粘膜上に検出された.こ の所

見は,H.influenzaeの 気道粘膜上皮上に付着す る

事実を実証するものであろう.気 道粘膜は,正 常

では線毛細胞 と杯細胞の比が,5対1の 割 り合い

であるが,粘 膜に炎症が生 じると杯細胞が増加す

ることと16),扁平上皮化生が生じることが知 られ

ている.H.influenzaeは これらのどの上皮細胞上

にも存在するのか,ま たは特定の細胞上に存在す

るのかは,最 近 とみに関心の高まっている,細 菌

の細胞への付着 の問題17)と関連 して興味深い.

Apicellaら19)は,直 接喀痰 よ り分離 されたnon-

typableのH.influenzaeの40か ら50%に,電 顕

に よってfimbriaeが あ ることを示 し,H.influ-

enzaeが 病原性を有 していることを示唆している.

今回の結果では,蛍 光抗体法による組織像では,

杯細胞 と線毛細胞の識別は困難で,6例 は判定不

能であったが,識 別 しえた2例 では,1例 は線毛

細胞上,1例 は扁平上皮化生化 した細胞上に存在

していた.今 後症例を重ねて検討したい.

また8例 中1例 にH.influenzaeが,気 道粘膜

下の非腺組織内にも検出された.こ の症例は副鼻

腔気管支症候群を伴 う気管支拡張症で,臨 床症状

が強 く,気 管支鏡的にも気管支の組織所見におい

ても炎症所見が高度で,H.influenzaeの 持続感染

が示唆 された例である.

今回得られた成績は,新 しい知見ではあるが,

慢性下気道感染症におけるH.influenzaeの 動態

に関する研究の一端にすぎず,今 後更に発展 させ

たい と考えている.

ま と め

1.TTAに てH.influenzaeが 検出された慢性

下気道感染症患者8例 か ら,TBBに て主気管支

1182 感染症学雑誌 第59巻 第12号

お よ び 区 域 気 管 支(B7)よ り気 管 支 壁 を 採 取 し,

蛍 光 抗 体 法 に よ りH.influenzaeが,気 道 内 に存

在 す る こ とを 実 証 した.

2.H.influenzaeは 主 気 管 支 に は1例 も検 出 さ

れ な か っ た が,区 域 気 管 支 に は8例 全 例 に検 出 さ

れ た.

3.組 織 学 的 に み る とH.influenzaeは 全 例,気

道 分 泌 物 お よび 気 道 粘 膜 上 に 認 め,そ の うち1例

に は 気 道 粘 膜 下 組 織 の 非 腺 組 織 に も検 出 され た.

4.他 菌 の 検 出 さ れ た 対 照 の2例 で は,H.

influenzaeは 検 出 され なか っ た.

以 上 の こ とか ら,慢 性 下 気 道 感 染 症 に お い て 気

道 上 のH.influenzaeに は,定 着 しや す い 部 位 が

あ る こ とが 推 測 さ れ た.

本研究の費用 の一部 は,文 部省科学研究費補助金(一 般

研 究《B》)に よった.

又本論文の要 旨は第59回 日本感染症学会総会において発

表 した.

稿を終えるにあた り,種 々御指導並 びに御校 閲をいただ

きました第2内 科学教室三上理一郎教授 に心 より感謝の意

を表 します とともに,御 校 閲いただ きました奈良県立医科

大学細菌学教室樫葉周三教授,病 態検査学教室中野 博教

授に深謝 いた します.ま た,蛍 光抗体法を御指導下 さいま

した順天堂大学第2病 理学教室白井俊一教授,本 研究を御

援助下 さった第2内 科学教室澤木政好助手,堅 田均助手,

今井照彦助手,三 笠桂一助手および諸兄姉,な らびに中央

臨床検査部細菌検査室播金収先生 に感謝 の意を表 します.

文 献

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Studies of the Existence and Distribution of Haemophilus influenzae in thePatients of Chronic Lower Airway Infections by fluorescent Technique

Mikikazu KUNIMATSU

The Second Department of Internal Medicine,Nara Medical University

H.influenzae is considered to be the most important pathogenic organism in patients with chroniclower airway infections(CLAI).But its existence and distribution of tracheobronchial trees is not clearlyrecognized.I made antibodies to H.influenzae(non capsulated strain)and examined the existence anddistribution of H.influenzae in bronchial tissues of patients with CLAI,by using the fluorescenttechnique.Subjects were 8 patients with CLAI who were demonstrated H.influenzae in their aspiratesobtained by transtracheal aspiration(TTA).As negative control,2 patients with CLAI demonstrated B.catarrhalis or K. pneumaonia instead of H.influenzae by TTA were examined.Bronchial tissues wereobtained from the main bronchus and segmental bronchus(By)of the patients with CLAI by tran-sbronchial bronchial biopsy(TBB).

1.H.influenzae was not detected at main bronchus in all of 8 patient,but was detected at segmentalbronchus in eight of all patients.

2.Histologically,H.influenzae was detected in the bronchial secretion and bronchial mucosa ineight of all patients,and in one of them,H.Influenzae was detected in submucosal tissue.

3.H.influenzae was not detected in the case of negative control.From these results,it is suspected that in the lower airway of patients with CLAI,there is the place

where H.influenzae tends to exist.