eda puntarić utjecaj nanočestica srebra na vodenu lećudigre.pmf.unizg.hr/3978/1/eda.pdflijekova,...

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Eda Puntarić

Utjecaj nanočestica srebra na vodenu leću

(Lemna minor L.)

Diplomski rad

Zagreb, 2014.

Ovaj rad je izrađen u Laboratoriju za Fiziologiju bilja na Botaničkom zavodu Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom doc. dr. sc. Sandre Radić

Brkanac. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra struke znanosti o okolišu.

Posebno i veliko hvala mentorici doc. dr. sc. Sandri Radić Brkanac jer bez njezinog

odobrenja i dobre volje ne bi ni bilo ovog diplomskog. Hvala na neizmjernom

strpljenju, vedrom raspoloženju, na stručnim, ali i na onim malo manje stručnim

savjetima.

Puno hvala i prof. Valeriji Vujčić na potpori i velikoj pomoći u labaratoriju i ugodnom

društvu.

Hvala mojoj obitelji koja je bila cijelo vrijeme uz mene. Hvala tati na savjetima i trudu

oko čitanja, a mami, Idi i Adi na moralnoj potpori.

Hvala i mojim prijteljima i kolegama koji su mi uljepšali studenske dane.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad

UTJECAJ NANOČESTICA SREBRA NA VODENU LEĆU (Lemna minor L.)

Eda Puntarić

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska Nanočesticama smatramo tvari čije su sve tri dimenzije manje od 100 nm. Zbog veće aktivne površine po masi, nanočestice su se pokazale biološki aktivnije od njihovih "većih dvojnika" (čestice mikrometarskih dimenzija) istog kemijskog sastava. Povećano korištenje nanočestica rezultira otpuštanjem istih u okoliš. U ovom je radu istražen učinak nanočestica srebra u rasponu koncentracija 0,1, 0,5, 1, 2 i 5 mg L-1 na vodenu leću (Lemna minor L.) koja je često korištena testna biljka. Primijenjen je statički oblik standardiziranog Lemna-testa (test inhibicije rasta) u trajanju od sedam dana koji se temelji na stopama rasta. Osim rasta, određen je sadržaj srebra u biljkama i podlogama, sadržaj klorofila a i b, karotenoida, te pojedini pokazatelji oksidacijskog stresa u vodenoj leći. Nanočestice srebra značajno su smanjile stopu rasta broja listića i mase svježe tvari te sadržaj mjerenih fotosintetskih pigmenata. S druge strane, taj je metal uzrokovao povećanje oksidacijskog oštećenja lipida te promjene u aktivnosti antioksidacijskih enzima (superoksid dismutaze, askorbat peroksidaze i katalaze). Dobiveni rezultati ukazuju na toksičnost nano čestica srebra za vodenu leću što je vjerojatno posljedica povećanog nakupljanja nanočestica u biljnom tkivu. Rezultati također pokazuju da je oksidacijski stres uključen u mehanizam toksičnosti nanočestica srebra.

(39 stranica, 10 slika, 2 tablice, 59 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: nanočestice, srebro, vodena leća, toksičnost, oksidacijski stres

Voditelj: Doc. dr. sc. Sandra Radić Brkanac Ocjenjitelji: Doc. dr. sc. Sandra Radić Brkanac Izv.prof. Renata Matoničkin Kepćija Izv.prof. Blanka Cvetko Tešović Izv.prof. Danijel Orešić Rad prihvaćen: 28.11.2014.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology Graduation Thesis

THE EFFECT OF SILVER NANOPARTICELS ON DUCKWEED (Lemna minor L.)

Eda Puntarić

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia Nanoparticles are substances with all three dimensions less than 100 nm. Due to the larger active surface area per mass, nanoparticles have proven to be biologically active than their "larger duplicates" (particles of micrometer dimensions) of the same chemical composition. Increased use of nanoparticles results in their release into the environment. This thesis examines the effect of silver nanoparticles in the concentration range of 0.1,0.5,1,2 and 5 mg L-1) on duckweed (Lemna minor L.), which is often used as a test plant. A static test design of the standardized Lemna toxicity test (a growth inhibition test) based on growth rates in the duration of seven days was applied. In addition to growth, Ag content of media and plant material, chlorophylls, carotenoids and certain indicators of oxidative stress in duckweed have been determined. Silver nanoparticles significantly reduced growth rate and content of photosynthetic pigments. On the other hand, metal nanoparticles caused oxidative damage to lipids as well as the modulation of antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase). The obtained results confirm the toxicity of silver nanoparticles to duckweed, which is probably due to increased accumulation of silver nanoparticles in plant tissue. Furthermore, the results indicate that oxidative stress is involved in the toxicity mechanism of silver. (39 pages, 10 figures, 2 tables, 59 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: nanoparticles, silver, duckweed, toxicity, oxidative stress

Supervisor: Dr. Sandra Radić Brkanac, Asst. Prof. Reviewers: Dr. Sandra Radić Brkanac, Asst. Prof., Dr. Renata Matoničkin Kepćija, Assoc. Prof. Dr. Blanka Cvetko Tešović, Assoc. Prof. Dr. Danijel Orešić, Assoc. Prof. Thesis accepted: November 28th, 2014

Sadržaj

1.UVOD ................................................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1. Toksičnost nanočestica srebra za bakterije ................... Error! Bookmark not defined.

1.2. Toksičnost nanočestica srebra za stanice sisavaca in vitro .......... Error! Bookmark not

defined.

1.3. Toksičnost nanočestica srebra za biljke ........................ Error! Bookmark not defined.

1.2. Toksičnost nanočestica srebra na okoliš ....................... Error! Bookmark not defined.

1.2.1. Utjecaj na zajednice u tlu ....................................... Error! Bookmark not defined.

1.2.2. Utjecaj na vodene ekosustave ................................ Error! Bookmark not defined.

1.3. Oksidacijski stres ........................................................... Error! Bookmark not defined.

1.3.1 Lipidna peroksidacija .............................................. Error! Bookmark not defined.

1.4. Antioksidacijski sustav .................................................. Error! Bookmark not defined.

1.4.1. Enzimski antioksidacijski sustav ............................ Error! Bookmark not defined.

1.4.1.1. Superoksid dismutaza .......................................... Error! Bookmark not defined.

1.4.1.2. Katalaza ............................................................... Error! Bookmark not defined.

1.4.1.3. Peroksidaze .......................................................... Error! Bookmark not defined.

1.4.2. Neenzimski antioksidacijski sustav ........................ Error! Bookmark not defined.

1.4.2.1. Karotenoidi .......................................................... Error! Bookmark not defined.

1.4.2.2. Glutation .............................................................. Error! Bookmark not defined.

2. CILJ ISTRAŽIVANJA ........................................................ Error! Bookmark not defined.

3. MATERIJALI I METODE .................................................. Error! Bookmark not defined.

3.1. Vodena leća (Lemna minor L.) ..................................... Error! Bookmark not defined.

3.2. Kultura vodene leće (Lemna Minor L.) u uvjetima in vitro ......... Error! Bookmark not

defined.

3.3. Lemna-test i biokemijski pokazatelji u vodenoj leći ..... Error! Bookmark not defined.

3.3.1. Lemna-test (ISO 20079) - stopa rasta vodene lećeError! Bookmark not defined.

3.3.2. Određivanje sadržaja srebra u vodenoj leći i hranjivim podlogama ............... Error!

Bookmark not defined.

3.3.2.1. Priprema uzoraka za mjerenje tehnikom ICP-OES ............ Error! Bookmark not

defined.

3.3.2.2. Određivanje sadržaja metala tehnikom ICP-OES Error! Bookmark not defined.

3.3.3. Određivanje sadržaja pigmenata u vodenoj leći ..... Error! Bookmark not defined.

3.3.4. Određivanje sadržaja malondialdehida u vodenoj leći .......... Error! Bookmark not

defined.

3.3.5. Određivanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći ...... Error! Bookmark not

defined.

3.3.6. Ekstrakcija topivih proteina i aktivnost antioksidacijskih enzima u ............. Error!


vodenoj leći ...................................................................... Error! Bookmark not defined.

3.4. Statistička obrada podataka ........................................... Error! Bookmark not defined.

4. REZULTATI ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

4.1. Stopa rasta vodene leće ............................................... Error! Bookmark not defined.

4.2. Sadržaj srebra u vodenoj leći ....................................... Error! Bookmark not defined.

4.3. Sadržaj pigmenata ........................................................ Error! Bookmark not defined.

4.3.1. Sadržaj klorofila ..................................................... Error! Bookmark not defined.

4.3.2. Sadržaj karotenoida ................................................ Error! Bookmark not defined.

4.4. Sadržaj malondialdehida .............................................. Error! Bookmark not defined.

4.5. Sadržaj neproteinskih tiola ........................................... Error! Bookmark not defined.

4.6. Sadržaj ukupnih proteina .............................................. Error! Bookmark not defined.

4.7. Aktivnost antioksidacijskih enzima .............................. Error! Bookmark not defined.

4.7.1. Aktivnost superoksid dismutaze ............................. Error! Bookmark not defined.

4.7.2. Aktivnost askorbat peroksidaze ............................. Error! Bookmark not defined.

4.7.3. Aktivnost katalaze .................................................. Error! Bookmark not defined.

5. RASPRAVA ......................................................................... Error! Bookmark not defined.

5.1. Učinak nanočestica srebra na rast i funkcionalnost fotosinteze vodene leće ......... Error!


5.2 Učinak nanočestica srebra na pokazatelje oksidacijskog stresa u vodenoj leći ...... Error!


6. ZAKLJUČAK ...................................................................... Error! Bookmark not defined.

7. LITERATURA ..................................................................... Error! Bookmark not defined.

Uvod 1

1. UVOD

Nanotehnologija je postala brzo rastuća znanost koja se bavi proizvodnjom i

korištenjem nanočestica. Sinteza nanočestica ima primjenu u raznim područjima znanosti i

tehnologije, posebice na polju biomedicine i prirodnih znanosti (genska terapija, unos

lijekova, mikrokirurška tehnologija, kontrastni agensi, DNA probe, fluorescentne oznake),

agronomije (nanokapsulirani herbicidi i pesticidi) optike i elektronike; nanočestice su našle

primjenu u mnogim proizvodima široke potrošnje uključujući elektroničke komponente,

kozmetiku (kreme za sunčanje), prehrambene proizvode (nanokapsulirani vitamini i

antioksidansi), proizvode za čišćenje, filtere za cigarete, antimikrobna vlakna i sprejeve kao i

tekstil otporan na mrlje i samočisteće staklo (Savolainen i sur., 2010.). Nanočesticama

smatramo tvari čije su sve tri dimenzije manje od 100 nm. Zbog veće aktivne površine po

masi, nanočestice su se pokazale biološki aktivnije od njihovih "većih dvojnika" (čestice

mikrometarskih dimenzija) istog kemijskog sastava.

Nanočestice srebra su jedan od najčešće korištenih nanomaterijala koje su našle

upotrebu u elektroničkim napravama, u pakiranju prehrambenih proizvoda, u tekstilnim

proizvodima koji djeluju baktericidno, u medicinskim uređajima, u zavojima te kao

dezinficijens za vode, kao lijek za liječenje mentalnih bolesti, ovisnosti o nikotinu, a gel na

bazi nanočestica srebra koristi se za liječenje opeklina, gastroenteritisa i zaraznih bolesti

poput sifilisa i gonoreje. Na stotine proizvoda koje sadrže nanočestice srebra su trenutno na

tržištu i njihov broj ubrzano raste. No, nanočestice srebra nisu toksične samo za nama

"štetne" (patogene) bakterije već i za korisne bakterije. Također je dokazano da su nanočestice

srebra vrlo toksične za stanice mozga, jetre i matične stanice, a dugotrajno izlaganje tim

česticama uzrokuje kožne bolesti (Chen i Schluesener, 2008.) . Ove nanočestice su prijetnja i

za život u vodi, kada se kao ostatak i otpad ispuštaju u vodene recipijente. Od posebnog je

interesa činjenica da bi nanočestice srebra potencijalno mogle negativno utjecati i na korisne

bakterije u okolišu, osobito u tlu i vodi. Kao snažan baktericid nanočestice srebra prijete

bakterijama koje podupiru normalno funcioniranje ekosustava. Korisne bakterije su od vitalne

važnosti za tlo, biljake i životinje. Bakterije u tlu igraju važnu ulogu u fiksiranju dušika i

razgradnji organske tvari, a neke ulaze u simbiotske odnose s biljkama iz porodice mahunarki.

Denitrifikacijske bakterije imaju važnu ulogu u održavanju čiste vode uklanjanjem nitrata iz

vode koja je zagađena prekomjernom uporabom umjetnih gnojiva. A zbog sve veće uporabe

1

Uvod 2

nanočestica srebra postoji opravdan rizik od nastanka otpornosti patogenih bakterija na

srebro, ali i na nekolicinu trenutno korištenih antibiotika (Bharadwaj Punita, 2012.).

1.1. Toksičnost nanočestica srebra za bakterije

Većina znanstvenih istraživanja o nanočesticama srebra istraživala su njihove učinke

na bakterije. Nanočestice srebra vrlo su otrovne za nekoliko sojeva bakterija, uključujući

gram pozitivne bakterije kao što su Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae, te

gram negativne bakterije, uključujući E. coli i Pseudomonas aeruginosa. Na ovaj način

nanočestice srebra su odgovorne za liječenje infekcija koje su se odupirale uobičajenim

antibioticima.

Otpornost bakterija na konvencionalne antibiotike prijeti ljudskom zdravlju diljem

svijeta. Povećana reakcijska površina nanočestica zaslužna je za uspješno uništenje bakterija i

drugih mikroba. Stvarni mehanizam kojim nanočestice srebra utječu na bakterije još je

nejasan. Neka istraživanja ukazuju da nanočestice srebra oštećuju bakterijske stanice

uništavajući enzime koji pomažu pri transportu hranjivih tvari u stanicu i oslabljuju stanične

membrane, što dovodi do povećanja propusnosti stanica i konačno smrti stanice. Međutim

drugi istraživači vjeruju da nanočestice srebra uništavaju sposobnost bakterijske DNA da se

replicira (Bharadwaj Punita, 2012.).

1.2. Toksičnost nanočestica srebra za stanice sisavaca in vitro

Pored učinkovitog baktericidnog djelovanja, nanočestice srebra toksične su za stanice

sisavaca in vitro. Otkriveno je (Hussain i sur., 2005.) da su nanočestice srebra vrlo otrovne za

jetrene stanice BRL3A kod štakora. Funkcija mitohondrija se značajno smanjila u stanicama

koje su bile izložene djelovanju nanočestica srebra od 5-50 μg/ml dok drugi metalni oksidi

nisu pokazali mjerljiv učinak na tim dozama. Također je otkriveno da su nanočestice srebra

toksične za uzgojene linije neuroendokrinih stanica (fenotip PC-12), koji se koristi kao in

vitro model za moždane stanice. Proučavana je morfologija stanica, funkcija mitohondrija i

razina dopamina nakon 24 sata izlaganja nanočesticama srebra. Razina dopamina bila je na

visokoj, citotoksičnoj razini (50 lg/ml). Mitohondrijska aktivnost je smanjena u rasponu od 10

do 50 lg/ml u usporedbi s neobrađenim stanicama. Morfologija stanica se također promijenila.

Nanočestice srebra su toksične i za reproduktivne matične stanice sisavaca u in vitro

istraživanjima. Kada se nanočestice srebra koriste kao antimikrobni agens u cementu za kosti

2

Uvod 3

i drugim implantacijskim materijalima, utvrđeno je da mogu toksično djelovati na okolne

stanice i tkiva (Bharadwaj Punita, 2012.).

1.3. Toksičnost nanočestica srebra za biljke

Biljke pružaju potencijalni put za transport nanočestica u okoliš i služe kao važan put

za bioakumulaciju nanočestica u hranidbenom lancu. Biljna stanična stijenka djeluje kao

barijera za lak unos bilo kojeg vanjskog agensa uključujući tako i ulazak nanočestica u biljne

stanice. Promjer pora stanične stijenke u rasponu je od 5 do 20 nm pa prema tome u biljne

stanice mogu lako ući samo nanočestice ili nanočestični agregati promjera manjeg od

promjera pora stanične stijenke. Osim kroz staničnu stijenku nanočestice mogu ući u stanicu i

pomoću proteinskih nositelja ili kroz ionske kanale. Ulaskom u citoplazmu, nano čestice se

mogu vezati na različite organele i utjecati na metaboličke procese na tom mjestu.

Nakupljanje nanočestica na fotosintetski aktivnoj površini uzrokuje zagrijavanje listova što

može rezultirati modifikacijama u izmjeni plinova i začepljenju puči (Nair i sur., 2010.).

1.4. Toksičnost nanočestica srebra na okoliš

1.4.1. Utjecaj na zajednice u tlu

Do sada je rađeno vrlo malo istraživanja o utjecaju nanočestica srebra na mikrobne

zajednice tla in situ. Istraživanja su pokazala da srebro, čak i u obliku čestica većih dimenzija,

inhibira rast mikroba. Srebro pokazuje toksični učinak i na heterotrofne i kemotrofne bakterije

u tlu. Ovi organizmi osiguravaju mnoge ključne hranjive tvari koje su bitne u nastanku tla.

Pokazujući potencijalni toksični učinak na denitrificirajuće bakterije, srebro narušava

denitrifikacijske procese. Nanočestice srebra čak i u vrlo niskim koncentracijama od 0,14

µg/ml pokazuju toksičan učinak za nekoliko vrsta nitrifikacijskih bakterija.

Zbog sve veće upotrebe nanočestica srebra u potrošačkim proizvodima, od perilice

rublja, tkanina za čišćenje u kućanstvu i slično postoji opravdan rizik da će ovaj materijal biti

pušten u kanalizaciju, u postrojenja za pročišćavanje vode i na kraju u rijeke, potoke i jezera.

Uz navedeno otkriveno je da su nanočestice srebra izuzetno toksične te da uništavaju

dobroćudne vrsta bakterija koje se koriste za obradu otpadnih voda (Bharadwaj Punita,

2012.). Osim toga, nanočestice srebra povećavaju stvaranje reaktivnih oblika kisika koje

također mogu inhibirati rast bakterija koje se koriste za obradu otpadnih voda. Otpadni mulj

3

Uvod 4

nastao tim putem se često koristi kao gnojivo na poljima pa bi i tim načinom nanočestice

srebra mogle dospjeti u hranidbene lance.

1.4.2. Utjecaj na vodene ekosustave

Zbog sve veće primjene nanočestica srebra primjećuju se i sve veće količine srebrnih

nanočestica u otpadnim vodama, a na kraju i u rijekama i potocima, što rezultira

neočekivanim toksičnim učinkom na vodni ekosustav. Dokazan je akutni toksični učinak Ag+

u slatkovodnih riba, prvenstveno na škrgama, pri čemu dolazi do inhibicije aktivnosti

bazolateralne Na+- i K+-ATP-aze. Rezultati ispitivanja toksičnosti na makro beskralješnjacima

u zaljevu San Francisca pokazali su da srebro negativno utječe na zdravlje estuarijskog

sustava.

Dva neovisna istraživanja na slatkovodnoj ribi Danio rerio (zebrica) pokazala su da

izloženost riba nanočesticama srebra veličine 5-46 nm te u koncentracijama nižim od 5 μg/ml

rezultira povećanom smrtnošću, povećanim brojem srčanih malformacija te drugim razvojnim

deformacijama. Istraživan je i učinak nanočestica srebra na vodeni ekosustav zaljeva

Chesapeake, te je utvrđeno da su vrste Daphnia magna (vodenbuha), Lumbriculus variegatus

(kalifornijski crv), Paleomonetes sp. vrlo brzo uginule pri koncentraciji nano srebra od 27 ppb

(Pand, 2006.).

Također je uočeno da nanočestice srebra pokazuju sekundarnu toksičnost. In vitro

ispitivanja utvrdila su da su kalifornijski crvići izloženi nanočestima srebra doveli do smrti

jedinki Paleomonetes sp koje su hranjene bilo živim ili mrtvim kalifornijskim crvićima.

Sekundarna toksičnost koja ima mogućnost utjecati na organizme u svim segmentima

prehrambenog lanca, može biti čak i gora od primarne toksičnosti jer sekundarna toksičnost

može utjecati na organizme koji u pravilu nisu izvorno izloženi zagađivaču. Nanočestice

srebra u koncentraciji od 27 ppb pokazale su i jako alergeno svojstvo (Bharadwaj Punita,

2012.).

1.5. Oksidacijski stres

Biljke su na svom prirodnom staništu često izložene stresnim uvjetima uslijed

djelovanja različitih čimbenika kao što je suša, ekstremne temperature, nedostatak ili suvišak

vode u tlu, povećan salinitet, izloženost ozonu, teškim metalima, herbicidima i drugim štetnim

spojevima, napad patogena i dr. (Wang i sur., 2005.). U stresnim uvjetima fotosintetski aparat

4

Uvod 5

apsorbira više svjetlosti nego što može koristiti za fiksaciju ugljika. Apsorbirana energija se

prenosi na molekule kisika i nastaju kratko živuće vrste aktiviranog kisika (ROS) poput

superoksidnog radikala (O2-), hidroksilnog radikala (•OH), vodikovog peroksida (H2O2) i

singletnog kisika (1O2) koje mogu nespecifično djelovati s biomolekulama u stanici i oštetiti

ih. Kloroplasti su posebno pogođeni slobodnim radikalima jer sadrže relativno visoku

koncentraciju kisika koji se reducira elektronima što "pobjegnu" iz fotosustava pretvarajući ga

u superoksidni radikal. Izvori ROS u biljnim stanicama, su i transportni lanci elektrona u

mitohondrijima. Glioksisomi i peroksisomi također produciraju velike količine reaktivnih

oblika kisika, posebice H2O2. Superoksidni radikal nastaje na nivou membrane u većini

biljnih organela dok vodikov peroksid nastaje kao produkt enzimske reakcije superoksid

dismutaze i različitih oksidaza u peroksisomu (Noctor i Foyer, 1998.). Hidroksilni radikal

može nastati u željezom kataliziranoj Haber-Weiss reakciji, a singletni kisik uglavnom nastaje

u u kloroplastu. Superoksidni radikal i vodikov peroksid nastaju u velikim količinama u

normalnom metabolizmu jer su uključeni u sva područja aerobne biokemije (disanje,

fotosintetski elektronski transport, oksidaciju različitih supstrata). Njihova toksičnost temelji

se na mogućnosti da započnu kaskadu reakcija koja će rezultirati nastankom vrlo opasnog

hidroksilnog radikala koji može reagirati sa skoro svim staničnim komponentama te

uzrokovati denaturaciju proteina, mutaciju DNA i peroksidaciju lipida.

Kada se razina ROS-a neznatno poveća, uključuje se antioksidativni sustav koji ih

učinkovito razgrađuje, ali kada stanica izgubi kontrolu nad njihovim stvaranjem i

razgradnjom, nastupaju velika stanična oštećenja. Biljke stoga posjeduju veoma učinkovit

antioksidativni sustav kojim se regulira razina ROS-a u stanicama (Cassells i Curry, 2001.).

Oksidacijski stres je uzrokovan neravnotežom između aktivnosti oksidansa i antioksidansa i u

normalnim uvjetima unutarstanične razine ROS se održavaju na niskim razinama uz pomoć

različitih enzimskih i neenzimskih sustava.

1.5.1. Lipidna peroksidacija

Lipidna peroksidacija je jedan od pokazatelja oksidacijskog stresa u biljnom

organizmu do kojeg dolazi kada stvaranje toksičnih oblika kisika premaši mogućnosti

mehanizama za uklanjanje tih spojeva. Stresni uvjeti uzrokuju promjene u staničnoj

membrani, a time utječu i na procese vezane uz provođenje signala i stvaranje energije. U

normalnim biološkim uvjetima, molekula kisika neenzimatskom oksidacijom povremeno

oduzima elektrone drugim molekulama, što uzrokuje nastanak slobodnih radikala. Višestruko

5

Uvod 6

nezasićene masne kiseline (PUFA) često su meta stvorenih slobodnih radikala kao glavne

sastavnice staničnih membrana, što posljeduje lipidnom peroksidacijom. Reaktivni oblici

kisika, prije svega hidroksilni radikal, imaju sposobnost da izdvoje atom vodika iz

metilenskih (-CH₂-) skupina nezasićenih masnih kiselina koji pokreće niz peroksidacijskih

reakcija (Štefan i sur., 2007.). Lanac reakcija radikala lipidne peroksidacije prekida se

neenzimskim i enzimskim načinom. Vrlo važan antioksidans je tokoferol (vitamin E), sastojak

membrana topiv u lipidima, koji prekida lanac lipidne peroksidacije i popravlja radikale

masnih kiselina.

1.6. Antioksidacijski sustav

Antioksidansi su kemijske tvari koje sprečavaju oksidaciju spojeva podložnih

oksidaciji. Biljke posjeduju vrlo učinkovit enzimski i neenzimatski antioksidativni obrambeni

sustavi koji štite biljne stanice od oksidativnog oštećenja koje vežu ROS kad su oni u štetnom

suvišku tj. kad je koncentracija slobodnih radikala veća nego što je potrebno za odvijanje

normalnih fizioloških procesa (Sarvajeet i Narendra, 2010). Antioksidansi inaktiviraju

djelovanje slobodnih radikala donirajući im elektrone pa tako zaustavljaju lančanu reakciju

stvaranja novih radikala i sprječavaju njihovo štetno djelovanje. Antioksidacijski mehanizmi

nisu ograničeni samo na stanične organele, već su prisutni u manjoj mjeri i u citoplazmi i

apoplastu. Komponente antioksidacijskog obrambenog sustava dijele se na enzimske i

neenzimske antioksidanse. Najdjelotvorniji enzimski antioksidansi u biljakama obuhvaćaju

superoksid-dismutazu, katalazu i enzime glutation-askorbatnog ciklusa. Neenzimski

antioksidansi uključuju askorbat, tokoferol, karotenoide, tiolne antioksidanse (glutation,

tioredoksin i lipoičnu kiselinu), flavonoide te druge fenolne spojeve (Arora i sur. 2002, Gill i

Tuteja 2010).

1.4.1. Enzimski antioksidacijski sustav

1.4.1.1. Superoksid dismutaza

Superoksid dismutaza (SOD) pripada skupini metaloenzima, a živi organizmi su

razvili tri tipa SOD-a, koji se razlikuju po metalnim kofaktorima (Štefan i sur. 2007.).

Superoksid dismutaza štiti stanice od slobodnih radikala obrambenim mehanizmom koji

uključuje katalizu reakcije dismutacije superoksida:

6

Uvod 7

2O2•- + 2H+ → H2O2 + O2.

Spontana dismutacija je vrlo brza. Među enzimima SOD ima najveći pretvorbeni broj čime je

naglašena izuzetna biološka važnost dismutacije (Šmuc, 2009.). Kako je superoksidani radikal

prvi produkt jednovalentne redukcije kisika i također prvi oblik koji se formira u mnogim

biološkim sustavima, SOD se smatra primarnom obranom protiv kisikovih radikala.

Lokaliziran je u kloroplastima, citosolu, mitohondrijima i peroksisomima (Vranova i sur.,

2002.).

1.4.1.2. Katalaza

Katalaza (KAT) je biokatalizator koji pospješuje raspadanje vodikova peroksida na

kisik i vodu. Brza razgradnja vodikova peroksida potrebna je jer je on snažan oksidans koji

može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati poremećaje u metabolizmu stanice.

Vodikov peroksid nastaje kao produkt u procesu fotosinteze, fotorespiracije i staničnog

disanja, a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što je superoksid dismutaza.

Katalaza se nalazi u gotovo svim živim organizmima koji su izloženi kisiku, a nalaze se u

organelima koji se zovu peroksisomi (Rogić i Štimac, 2009.).

2 H2O2 → O2 + 2 H2O

1.4.1.3. Peroksidaze

Peroksidaze (oksidoreduktaze vodikovog peroksida) su enzimi koji kataliziraju H2O2 i

oksidiraju različite supstrate. Nalazimo ih u životinjama, biljkama i mnogim

mikroorganizama gdje su uključene u brojne biološke procese (Begović, 2013.).

Biljne peroksidaze su glikoproteini sačinjeni od jednog polipeptidnog lanca. S

obzirom na fiziološku ulogu i supstratnu specifičnost peroksidaze su podijeljene u dvije

skupine (Asada, 1992.). U jednoj skupini su peroksidaze koje koriste vodikov peroksid za

različite oksidacijske procese u stanici i čija je karakteristika slaba supstratna specifičnost.

Zbog slabe supstratne specifičnosti kao donor elektrona mogu poslužiti pirogalol, gvajakol

(GPOD), siringaldazin i drugi fenolni spojevi. Ova skupina uključena je u procese biosinteze

7

Uvod 8

lignina i suberina, razgradnje auksina, zaraštavanje rana, obrane od patogena i uklanjanje

toksičnih spojeva peroksida (Hiraga i sur., 2001.).

Druga skupina su peroksidaze kojima je glavna uloga uklanjanje vodikovog peroksida

i organskog peroksida, a među kojima su askorbat i glutation peroksidaza. Za redukciju

toksičnog vodikovog peroksida potreban je reducirajući supstrat koji je uglavnom askorbat.

Peroksidaze za redukciju H2O2 koriste reducirajući supstrat, a u biljaka je to uglavnom

askorbat. Da bi se jedna molekula H2O2 reducirala potrebne su dvije molekule askorbata.

Produkt ove reakcije su dvije molekule vode i dvije molekule monodehidroksiaskorbata

(MDHA):

2 askorbat + H2O2 → 2 MDHA + 2 H2O

Askorbat peroksidaza se većinom nalazi u kloroplastima, a rjeđe u citosolu i glioksisomima

(Asada, 1992.).

1.4.2. Neenzimski antioksidacijski sustav 1.4.2.1. Karotenoidi Karotenoidi imaju karakterističnu žuto-narančastu boju, a najjače apsobriraju svjetlost

valnih duljina između 380 i 550 nm, proširujući tako spektar boja koje mogu pokretati

fotosintezu. Karotenoidi imaju također i zaštitnu ulogu. Naime, velike količine energije koju

apsorbiraju pigmenti mogu oštetiti fotosintetske membrane, ako se ta energija ne pohrani

fotokemijski. Ako pobuđeno stanje klorofila brzo ne prestane, dolazi do reakcije s

molekulskim kisikom, nastaje singletni kisik koji je vrlo reaktivan i može oštetiti mnoge

stanične sastojke, osobito lipide. Karotenoidi djeluju zaštitno tako da brzo ugase pobuđeno

stanje klorofila. Pobuđeno stanje karotenoida nema dovoljno energije za nastanak singletnog

kisika i brzo se vraća u osnovno stanje, otpuštajući višak energije u obliku topline (Pevalek-

Kozlina, 2003.).

1.4.2.2. Glutation

Glutation (GSH), u svom reduciranom obliku je tripeptid (γ-glutamil-cistein-glicin) sa

slobodnom sulfhidrilnom (tiolnom) grupom (-SH) koja potječe od cisteinskog ostatka. Upravo

je slobodna –SH skupina redoks-aktivna te je odgovorna za antioksidacijska svojstva

glutationa (može se reverzibilno oksidirati i reducirati). Osim što sudjeluje u uklanjanju

8

Uvod 9

slobodnih radikala, glutation može konjugirati ksenobiotike te na taj način potpomaže njihovo

uklanjanje. Zbog visoke stanične koncentracije te uloge u održavanju redoks stanja stanice,

glutation je jedan od najvažnijih antioksidansa posebice u animalnim stanicama. Naime u

biljnim stanicama, askorbat je kvantitativno dominantan antioksidans.

Glutation ima vrlo važnu ulogu i u toleranciji biljaka na teške metale i njihovoj

kompartmentalizaciji u vakuolu (Zhu i sur., 1999.; Zeng i sur., 2009.). Naime, GSH je

prekursor fitohelatina, peptida s općom strukturom [(γ-Glu-Cys)n-Gly (n ≥ 2) koji na sebe

vežu metale i „odvoze“ ih u vakuolu. Metali se vežu na –SH helirajuću grupu cisteina i

nastaju kompleksi čime je sprječena slobodna cirkulacija metala u citosolu.

Reducirani glutation je najzastupljeniji neproteinski tiol u biljnoj stanici i čini preko

90 % sadržaja neproteinskih tiola, dok se ostatak od 10 % odnosi na ostale tiolne spojeve

niske molekularne mase kao što su cistein, metionin, fitohelatini, metalotioneini, defenzini i

sl. (Zenk, 1996.; Mulier i sur., 1998.). Spoj 5,5-ditio-bis-nitrobenzojeva kiselina (DTNB) koji

služi kao glavni reagens u metodi za dokazivanje neproteinskih tiola primijenjenoj u ovom

radu vezuje se ne samo na –SH skupinu reduciranog glutationa, već i na one cistena glutamil

cisteina i drugih neproteinskih tiola, no zna se da većina detektiranih sulfhidrilnih grupa

potječe od GSH (Liszewska i sur., 2001.).

9

Cilj istraživanja 10

2. CILJ ISTRAŽIVANJA

Cilj ovog rada bio je procijeniti učinke nanočestica srebra u rasponu koncentracija 0,1-

5 mgL-1 na vodenu leću (Lemna minor L.).

Učinak nanočestica srebra pratila sam putem:

• Lemna-testa (test inhibicije rasta) pri čemu je stopa rasta biljaka izražena na temelju

dva pokazatelja (broj listića, masa svježe tvari) praćenih tijekom sedam dana,

• sadržaja klorofila a i b, te ukupnih karotenoida,

• stupnja lipidne proksidacije u vodenoj leći,

• sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći,

• promjene u aktivnosti antioksidacijskih enzima katalaze, askorbat peroksidaze i

superoksid dismutaze

10

Materijali i metode 11

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Vodena leća (Lemna minor L.)

Vodene leće spadaju u porodicu Lemnaceae koja obuhvaća četiri roda: Lemna,

Spirodela, Wolffia i Wolffiella. Ova porodica je obično na margini botaničkih zanimljivosti jer

spadaja u najjednostavnije i najmanje cvjetnice. No usprkos sitnoj i jednostavnoj građi vodena

leća je bitna slatkovodna vrsta. Porodica Lemnaceae razmnožava se vegetativno, što

osigurava genetičku homogenost organizama, a njihov brz rast (30-40 h za novu biljku) te

relativno jeftin i jednostavan način održavanja u kulturi čini ovu porodicu pogodnim

laboratorijskim subjektom u istraživanjima fotoperioda, morfogeneze lista, toksikološkog

učinka raznih tvari, utjecaja UV zračenja, oštećenja na biljkama uzrokovana ozonom i sl.

Najčešće se rabe vrste: Lemna minor, Lemna gibba, Spirodela polyrrhiza i Wolffia arrhiza. U

ovom radu korištena je Lemna minor (Les i sur., 2002.)

Vodene leće u prirodi žive na staništima koja imaju pH vrijednost prirodne vode u

rasponu od 3,5 do 10,5 (Landolt, 1986.). Optimalna pH vrijednost ovisi o mnogim

čimbenicima, npr. je li izvor dušika u obliku amonijaka ili nitrata te o stupnju raspoloživosti

mikroelemenata, što osim njihove koncentracije u mediju, ovisi i o nazočnosti helatnih tvari

poput EDTA i citrata, no obično iznosi 6,5-7,8. Temperaturni optimum za većinu vrsta iz

porodice Lemnaceae je između 20 i 30°C, a ovisi o intenzitetu svjetlosti i sastavu podloge

(osobito o sadržaju šećera). Temperaturni minimum za ovu vrstu je između 4 i 18°C a

maksimum između 30 i 32°C (Hillman, 1961.).

Vodena leća je nezahtjevna biljka kojoj odgovara mirna voda pa je zato u prirodi

najčešće susrećemo u jezerima, barama i mirnijim potocima. Rasprostranjena je po cijelom

svijetu do nadmorske visine od 2 000 m. Obično ima 3-5 listića koji u promjeru imaju 2-3 mm

i plutaju na površini vode, a iz listića izravno raste i korjenčić. Listići su najčešće simetrično

raspoređeni i eliptičnog oblika. Imaju glatku površinu i jarke zelene su boje (slika 1).

11


Slika 1. Vodena leća (Lemna minor L.) (http://delta-intkey.com/angio/www/lemnacea.htm, 21.11.2014)

3.2. Kultura vodene leće (Lemna minor L.) u uvjetima in vitro

Lemna minor je sakupljena u Botaničkom vrtu Prirodoslovno–matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu. Prilikom uvođenja vodene leće u kulturu in vitro 1995. godine biljke

su sterilizirane etanolom i živinim kloridom postupkom po Kranjčiću i Devidéu (1980) i dalje

uzgajane u akseničnim uvjetima. Za dugotrajnu kultivaciju vodene leće korištena je

modificirana Pirson-Seidel (PS) hranjiva podloga (Pirson i Seidel 1950), a za eksperimentalnu

analizu hranjiva podloga po Steinbergu (1946) koje su sterilizirane autoklaviranjem pri

temperaturi od 120 ˚C i tlaku od 0,15 MPa u trajanju od 20 minuta. Sastav hranjivih podloga

prikazan je u Tablici 1. Biljke sam na modificiranoj Pirson-Seidel podlozi uzgajala u uvjetima

dugog dana (16 sati osvjetljenja i 8 sati tame) na temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih

fluorescentnih svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.

Prije izvođenja pokusa, biljke sam radi bolje adaptacije (predkultivacija) presadila na

Steinbergovu podlogu i tijekom dva tjedna uzgajala u uvjetima kontinuiranog osvjetljenja na

temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih fluorescentnih svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.

Za izvođenje pokusa, pojedinačne zdrave kolonije s 10 listića (praćenje rasta -

Erlenmeyerove tikvice od 100 mL sa po 60 mL hranjive podloge) ili veći broj kolonija

12


(određivanje biokemijskih pokazatelja - Erlenmeyerove tikvice od 300 mL sa po 130 mL

hranjive podloge) presadila sam na hranjive podloge po Steinbergu koje su sadržavale nano

čestice srebra promjera manjeg od 100 nm (Sigma-Aldrich) u koncentracijama 0; 0,1; 0,5; 1;

2 i 5 mg L-1. Tijekom jednotjedne kultivacije za Lemna-test, biljke su također uzgajane u

uvjetima kontinuiranog osvjetljenja na temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih fluorescentnih

svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.

Uzorke biljnog tkiva za određivanje sadržaja srebra i biokemijskih pokazatelja uzimala

sam iz svih tikvica nakon tjedan dana pokusa.

3.3. Lemna-test i biokemijski pokazatelji u vodenoj leći

3.3.1. Lemna-test (ISO 20079) - stopa rasta vodene leće

Rast biljaka pratila sam određivanjem broja frondova tj. listića i mase svježe tvari nakon

tjedan dana izlaganja nano česticama srebra. Pri tome sam brojila svaki pa i najmanji listić

vidljiv golim okom. Dobivene podatke uvrštavala sam u slijedeći izraz:

Tablica 1. Sastav hranjivih podloga po Pirsonu i Seidelu (1950) i Steinbergu (1946).

MAKROELEMENTI mg/L mmol/L MAKROELEMENTI mg/L mmol/LKNO3 400 3,95 KNO3 350 3,46

KH2PO4 200 1,47 KH2PO4 90 0,66K2HPO4 12,6 0,072

MgSO4 x 7H2O 300 1,21 MgSO4 x 7H2O 100 0,41CaCl2 x 2H2O 804 5,46 Ca(NO3)2 x 4H2O 295 1,25

MIKROELEMENTI mg/L mmol/L MIKROELEMENTI mg/L mmol/LMnCl2 x 4H2O 300 1,5 MnCl2 x 4H2O 180 0,91

H3BO3 500 8,1 H3BO3 120 1,94Na2 – EDTA x 2H2O 1860 4,99 Na2 – EDTA x 2H2O 1500 4,03

željezni citrat 5000 20 FeCl3 x 6H2O 760 2,81Na2MoO4 x 2H2O 44 0,18

ZnSO4 x 7H2O 180 0,63ORGANSKI DODACI g/L mmol/L

saharoza 10 29,2asparagin 0,1 0,66

Pirson i Seidel Steinberg

13


= t1-t2ln x t1 - ln x t2

x t1 – vrijednost promatranog parametra u vremenu t1 (dani) x t2 – vrijednost promatranog parametra u vremenu t2 (dani) t2-t1 – vremenski period između dana uzimanja uzorka i početnog dana

Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost stope rasta broja biljaka ili mase svježe

tvari u pet Erlenmeyerovih tikvica ± standardna devijacija.

3.3.2. Određivanje sadržaja srebra u vodenoj leći i hranjivim podlogama

3.3.2.1. Priprema uzoraka za mjerenje tehnikom ICP-OES

Uzorci hranjivih podloga su uzimani prije i poslije nasađivanja biljaka, a prije samog

mjerenja su zakiseljeni. Uzorke vodene leće uzela sam nakon tjedan dana pokusa i osušila do

konstantne mase na 80 0C tijekom 24h. Svaki uzorak vodene leće (između 50 i 90 mg)

razorila sam metodom mokre digestije u smjesi 10 mL koncentrirane dušične kiseline

(Kemika) i 1 mL vodikovog peroksida (Kemika) u mikrovalnom sustavu za digestiju i

ekstrakciju otapalima CEM Mars Xpress, nakon čega sam ekstrakt kvantitativno prenesla u

odmjernu tikvicu od 50 mL, te je nadopunila do oznake s 1% (v/v) dušičnom kiselinom.

Parametri digestije podešeni na mikrovalnom sustavu bili su:

digestija uzorka koncentriranom dušičnom kiselinom kroz 5 minuta na 70 0C, 5 minuta

na 130 0C, 4 minute na 150 0C

nakon dodatka uzorku 1 mL vodikovog peroksida digestija 5 minuta na 85 0C, 4

minute na 130 0C

3.3.2.2. Određivanje sadržaja metala tehnikom ICP-OES

Određivanje sadržaja metala u uzorcima hranjivih podloga i vodene leće izvela sam

tehnikom optičke emisijske spektroskopije uz induktivno spregnutu plazmu (ICP-OES) na

instrumentu Thermo Elektron IRIS Intrepid II XSP prema normi HRN EN ISO 11885:2010.

Provela sam eksternu kalibraciju standardnim otopinama koncentracija 0, 0,05, 0,5 i 5 mg L-1.

Stopa rasta

14


Uzorak se u plazmu injektira u obliku aerosola u uski prolaz unutar cirkularne struje

plazme argona pri čemu argon služi i kao nosač uzorka. Ovakav način unosa osigurava optički

vrlo tanak izvor emisije, te kemijski inertnu atmosferu. Atomizacija elemenata u uzorku

postiže se na temperaturama od 5500 do 8000 K. Ovako visoke temperature osim što

minimaliziraju kemijske interakcije u uzorku dodatno ioniziraju argon koji je prethodno

preveden u plazmu strujanjem kroz radiofrekvencijsko polje.

Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost dvije replike.

Tehničke specifikacije:

RF snaga: 1150 W

Protok plina u raspršivaču: 25,0 PSI

Protok plina za uzorak: 1,0 L min.-1

Protok uzorka: 2,40 mL min.-1

Prikupljanje podataka: kompjutorski program TEVA

Broj mjerenja: 5 mjerenja po uzorku

Uvođenje uzoraka: peristaltička pumpa

Skraćenice:

ICP-OES = induktivno spregnuta plazma-optička emisijska spektrometrija (eng. Inductively

Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry)

ISO = Međunarodna organizacija za standardizaciju (eng. The International

Organisation for Standardisation)

TEVA = Thermo Electron Validated Analysis

XSP = Extra Stability Platform

3.3.3. Određivanje sadržaja pigmenata u vodenoj leći

Sadržaj pigmenata odredila sam spektrofotometrijski (UV/VIS spektrofotmetar

Specord, Analytik Jena). Uzorke svježeg tkiva (30 mg) ekstrahirala sam u 80%-tnom hladnom

acetonu (1,5 mL) i centrifugirala (5000 g / 10 min) u rotoru 12154H visokookretajne

centrifuge (Sigma 3K18) pri temperaturi +4 oC. Nakon toga sam mjerila i očitavala

apsorbancije za svaki uzorak na tri valne duljine: 663, 646 i 470 nm (Arnon, 1949.). Sadržaj

fotosintetskih pigmenata određen je prema Lichtenthaleru (1987).

15


Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija i

izrazila u odnosu na kontrolu.

3.3.4. Određivanje sadržaja malondialdehida u vodenoj leći

Kako bih odredila sadržaj malondialdehida (MDA) krajnjeg produkta lipidne

peroksidacije, pomiješala sam 200 µL uzorka s 800 µL reakcijske smjese (0,25%

tiobarbiturna kiselina otopljena u 10%-tnoj trikloroctenoj kiselini). Kao slijepu probu koristila

sam reakcijsku smjesu. Uzorke i slijepu probu prelila sam u staklene semimikroepruvete te

sam ih zagrijavala u sušioniku 30 min na 95 oC. Zatim sam uzorke naglo ohladila na ledu te

centrifugirala 10 min na 10 000 g. Nakon toga očitavala sam apsorbancije uzoraka na 532 te

na 600 nm zbog korekcije na nespecifično zamućenje (Heath i Packer, 1968.). Tijekom

zagrijavanja reakcijske smjese niske pH vrijednosti dolazi do raspadanja lipidnih peroksida

nastalih kao posljedica stresa pri čemu nastaje malondialdehid. Jedna molekula MDA reagira

s dvije molekule TBA, a time se stvara crvenkasti kromogen kojemu se mjeri apsorbancija.

Koncentracija lipidnih peroksida izražena je kao MDA u jedinicama nmol/g sv. t uz

ekstinkcijski koeficijent ε532 = 155 mM-1cm-1.

Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.

3.3.5. Određivanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći

Uzorci vodene leće mase 250 mg homogenizirani su u 1,0 mL 6,67% sulfosalicilne

kiseline te centrifugirani 10 min na 13 000 g u rotoru 12154H visokookretajne centrifuge

(Sigma 3K18) pri temperaturi +4 ºC. S ciljem određivanja sadržaja neproteinskih tiola, 900

μL Ellmanovog reagensa (120 mM Na-fosfatni pufer pH 7,5 koji sadrži 5mM EDTA i 0,6

mM 5,5-ditio-bis-nitrobenzojevu kiselinu (DTNB)) su pomiješani sa 100 μL supernatanta.

Kao slijepa proba korišten je alikvot istog uzorka (100 μL) pomiješan s 900 μL 120 mM Na-

fosfatnog pufera pH 7,5 koji sadrži 5mM EDTA. Kao korekciju za apsorbanciju reakcijske

smjese bez supernatanta korišteno je 100 μL 6,67% sulfosalicilne kiseline pomiješano s 900

μL Ellmanovog reagensa. Pripremljeni uzorci su inkubirani 15 min na sobnoj temperaturi.

Nakon inkubacije je slijedilo mjerenje sadržaja neproteinskih tiola uz reducirani glutation kao

standard. Sadržaj neproteinskih tiola koji se temelji na reakciji tiolnih skupina s DTNB,

određen je spektrofotometrijskim mjerenjem otopljenih uzoraka na valnoj duljini od 412 nm

16


(Ellman, 1959.). Količina nastalih tiola izražena je u nmol po gramu svježe tvari koristeći

ekstinkcijski koeficijent ε412 = 14,53 mM-1cm-1. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost

pet replika ± standardna devijacija i izraženi u odnosu na kontrolu.

3.3.6. Ekstrakcija topivih proteina i aktivnost antioksidacijskih enzima u vodenoj leći

Nakon tjedan dana pokusa, uzorke vodene leće (po 150 mg) homogenizirala sam u 50

mM kalij fosfatnom puferu (pH 7,0) uz dodatak 0,1 mM EDTA i netopivog

polivinilpolipirolidona te zatim centrifugirala (25000 g / 30 minuta) u rotoru 12154H

visokookretajne centrifuge (Sigma 3K18) pri temperaturi +4 ºC. Dio dobivenog supernatanta

iskorišten je za određivanje koncentracije proteina metodom Bradforda (1976), a drugi dio za

određivanje aktivnosti enzima. Bradfordova metoda temelji se na mjerenju apsorbancije

smjese proteinskog ekstrakta i reagensa pri valnoj duljini 595 nm. Koncentracija proteina u

pojedinim uzorcima određena je očitavanjem baždarne krivulje dobivene mjerenjem

apsorbancije otopina serumskog albumina iz goveda poznatih koncentracija (od 0,1 do 0,8

mg/mL).

Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) određivala sam spektrofotometrijski prema

metodi Giannopolitisa i Riesa (1977). Reakcijska otopina je sadržavala 50 mM kalij fosfatni

pufer (pH 7,8), 13 mM metionin, 75 mM nitrotetrazolijum plavila (NBT), 0,1 mM EDTA, 2

μM riboflavin te ekstrakcijski pufer ili enzimsku otopinu. Na 910 µL reakcijske otopine

dodala sam 80 µL ekstrakcijskog pufera (kontrola), dok je proba sadržavala isti volumen

enzimske otopine koja je dobivena miješanjem pufera i određenih volumena originalnih

enzimskih ekstrakata (30, 50 i 70 µL). Riboflavin sam dodala u reakcijsku smjesu neposredno

prije mjerenja. Uzorke sam promiješala i stavila ispod izvora svjetlosti (15 W) u zamračenom

prostoru. Reakcija se pokreće uključivanjem svjetla, te se nakon 10 min mjerenja svjetlo

ugasi. NBT se reducira u prisutnosti superoksidnih radikala u netopivi plavo obojeni formazan

koji pokazuje apsorpcijski maksimum na valnoj duljini od 560 nm.

Postotak inhibicije se mjeri prema sljedećoj jednadžbi:

% inhibicije = (uzorak A560 – kontrola A560) / kontrola A560

Jedna jedinica aktivnosti SOD-a izražava se kao ona količina enzima koja uzrokuje 50

% inhibicije redukcije NBT-a pri 560 nm u prisutnosti riboflavina na svjetlu.

17


Reakcijska otopina za katalazu (KAT) sadržavala je 50 mM kalij fosfatnog pufera (pH

7), 10 mM H2O2 (Aebi, 1984.) i uzorak (30 µL supernatanta vodene leće) te sam mjerila pad

apsorbancije (zbog razgradnje vodikovog peroksida) svakih 10 sekundi tijekom 2 minute pri

valnoj duljini od 240 nm. Aktivnost KAT izrazila sam kao količinu potrošenog H2O2 u µmolu

po minuti (jedna jedinica, 1 U) po miligramu proteina (U/mg proteina), a izračunala sam je uz

korištenje odgovarajućeg ekstinkcijskog koeficijenta (ε240= 40 mM-1cm-1). Rezultate sam

prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.

Reakcijska otopina za određivanje aktivnosti askorbat peroksidaze (APOD) sadržavala

je 50 mM kalij fosfatnog pufera (pH7), 0,2 mM askorbinske kiseline, 0,1 mM EDTA,12 mM

H2O2 (Nakano i Asada, 1981.) i supernatant (120 μL). Vodikov peroksid (10 μL) dodavala

sam u reakcijsku smjesu neposredno prije mjerenja te sam pratila pad apsorbancije zbog

oksidacije askorbinske kiseline svaku sekundu tijekom 15 sekundi. Aktivnost APOD

izračunala sam uz odgovarajući ekstinkcijski koeficijent (ε 290 = 2,8 mM-1cm-1). Rezultate sam

prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.

3.4. Statistička obrada podataka

Svaki brojčani podatak prikazan grafikonom ili tablicom aritmetička je sredina

određenog broja replika. Usporedba kontrole i tretmana (pojedinačno i međusobno) provela

sam testom "Duncan’s New Multiple Range Test" za svaki pojedini dan (Duncan, 1955.).

Statistički značajnim smatrala sam rezultate koji su se razlikovali na razini p ≤ 0,05. Pri

statističkoj obradi podataka koristila sam računalni program STATISTICA 10.0 (Stat Soft

Inc., SAD).

18

Rezultati 19

4. REZULTATI

4.1. Stopa rasta vodene leće

Na slici 2. prikazana je stopa rasta biljaka izražena po dva parametra, broju listića i

masi svježe tvari, praćenih tijekom sedam dana.

Neovisno o koncentraciji, nanočestice srebra (n Ag) su, u usporedbi s kontrolnim

biljkama, statistički značajno inhibirale stopu rasta biljaka izraženu po broju listića pri čemu

je inhibicija rasta bila proporcionalna sa povećanjem koncentracije n Ag. Koncentracija n Ag

od 5 mg L-1 je uzrokovala gotovo potpunu inhibiciju stope rasta izraženu po broju listića.

Nanočestice srebra su u svim koncentracijama izazvale i statistički značajno smanjenje

stope rasta vodene leće izražene po masi svježe tvari (slika 2). Najniža koncentracija nano

srebra smanjila je stopu rasta mase svježe tvari za 22%, a najviša koncentracija za više od

70% u usporedbi s kontrolom.

Slika 2. Stopa rasta broja listića i mase svježe tvari vodene leće uzgajane tijekom tjedan dana na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag

Stop

a ra

sta

broj listića svježa masa

a

b

c

d

e

f

A

B

C

D

E

F

19

Rezultati 20

4.2. Sadržaj srebra u vodenoj leći

Većina vrsta roda Lemna posjeduje iznimnu sposobnost i potencijal za akumulaciju

teških metala iz vodenog okoliša. Sadržaj srebra u testnim podlogama prvog i sedmog dana

pokusa kao i nakupljanje tog metala u vodenoj leći izmjerena je ICP-OES metodom.

Sadržaj srebra u vodenoj leći pokazao je linearan porast s povećanjem koncentracije n

Ag u podlogama (Tablica 2). Sadržaj srebra u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji

nanočestica srebra bio je 52 puta veći u odnosu na kontrolu, dok je u onim izloženim

koncentracijama nanočestica srebra višim od 0,5 mg L-1 taj sadržaj bio oko 180 puta veći u

usporedbi s kontrolnim biljkama.

Tablica 2. Sadržaj srebra u testnim podlogama i u vodenoj leći izloženoj rastućim koncentracijama nano Ag (0,1 - 5 mg L-1) ili podlozi bez njegovog dodatka (K).

Ag - biljke (µg g-1)tretman 1.dan 7.dan 7.dan

K 27,4 4,16 4,42

n Ag 0,1 192 16,2 219

n Ag 0,5 617 25,8 429

n Ag 1 993 126 801

n Ag 2 1399 234 815

n Ag 5 1993 353 779

Ag - podloga (µg L-1)

20

Rezultati 21

4.3. Sadržaj pigmenata

4.3.1. Sadržaj klorofila

Sadržaj klorofila a u vodenoj leći izloženoj najnižoj koncentraciji nanočestica srebra u

periodu od sedam dana bilo je sličan sadržaju tog pigmenta u kontrolnim biljkama. Pri svim

ostalim koncentracijama n Ag zamijećeno je statistički značajno smanjenje sadržaja klorofila

a u odnosu na kontrolne biljke, a najniži sadržaj klorofila a zabilježen je očekivano pri

najvećoj koncentraciji 5 mg L-1 (slika 3).

Sadržaj klorofila b također se, izuzev pri koncentraciji 0,1 mg L-1 n Ag, smanjivao s

porastom koncentracije n Ag, ali promjene u sadržaju tog pigmenta nisu bile tako izražene u

usporedbi s promjenama sadržaja klorofila a. Najveće smanjenje klorofila b (38% u odnosu

na kontrolu) može se primijetiti pri najvišoj koncentraciji n Ag (slika 3).

Slika 3. Sadržaj klorofila a i b (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nano česticasrebra u koncentracijama: 0,1 i Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 i Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 i Ag (1 mg L-1 Ag), 2 i Ag (2 mg L-1 Ag), 5 i Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Sadr

žaj k

loro

fila

klorofil a klorofil ba a

b

c c

d

A AAB

BC C C

21

Rezultati 22

4.3.2. Sadržaj karotenoida

U slučaju karotenoida, pomoćnih pigmenata iz skupine terpena, uočena je vrlo slična

situacija kao i kod klorofila a i b odnosno utvrđeno je smanjenje sadržaja karotenoida u

vodenoj leći izloženoj nanočesticama srebra u koncentracijama višim od 0,1 mg L-1 n Ag.

Najviša koncentracija n Ag upotrijebljena u ovom istraživanju izazvala je i najveće smanjenje

tih zaštitnih pigmenata u odnosu na kontrolu (slika 4) .

Slika 4. Sadržaj karotenoida (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35


Sadr

žaj k

arot

enoi

da

a a

bbc c

d

22

Rezultati 23

4.4. Sadržaj malondialdehida

Stupanj lipidne peroksidacije, kao jednog od pokazatelja oksidacijskog stresa u

biljaka, određuje se mjerenjem sadržaja malondialdehida, koji je jedan od produkata tog

procesa. Na slici 5 vidljiv je znatan porast sadržaja malondialdehida u vodenoj leći tretiranoj

koncentracijama nanočestica srebra 0,1 - 5 mg L-1 u odnosu na kontrolni uzorak. Taj je porast

najizraženiji u biljkama izloženim najvećoj koncentraciji n Ag (preko dva i pol puta veći u

odnosu na kontrolne biljke).

Slika 5. Sadržaj malondialdehida (nmol / g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1

Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1

Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

5

10

15

20

25


Sadr

žaj m

alon

dial

dehi

da

c

bb

b

a

a

23

Rezultati 24

4.5. Sadržaj neproteinskih tiola

Na Slici 6. prikazan je sadržaj neproteinskih tiola koji su u biljnoj stanici najviše

zastupljeni u obliku reduciranog glutationa.

Sadržaj neproteinskih tiola u vodenoj leći uzgojenoj na podlogama s dodatkom

nanočestica srebra bio je statistički značajno povećan u odnosu na kontrolne vrijednosti pri

koncentracijama većim od 0,1 mg L-1.

Slika 6. Sadržaj neproteinskih tiola (μmol / g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1



0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5


Sadr

žaj n

epro

tein

skih

tiol

a

c

c

b

a a a

24

Rezultati 25

4.6. Sadržaj ukupnih proteina

Dvije najniže koncentracije n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nisu uzrokovale statistički značajno

smanjenje sadržaja ukupnih proteina u usporedbi sa kontrolom (slika 7). Sadržaj proteina u

vodenoj leći izloženoj koncentracijama nAg većim od 0,5 mg L-1 statistički se značajno

smanjio u usporedbi s kontrolom (najveće smanjenje sadržaja ukupnih proteina iznosilo je

33% u odnosu na kontrolne biljke).

Slika 7. Sadržaj ukupnih proteina (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

1

2

3

4

5

6


Sadr

žaj u

kupn

ih p

rote

ina

aa

ab

b b

25

Rezultati 26

4.7. Aktivnost antioksidacijskih enzima

4.7.1. Aktivnost superoksid dismutaze

Superoksid dismutaza katalizira razgradnju superoksidnih radikala u vodikov peroksid

i kisik. Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji n

Ag nije bila statistički značajno povišena u odnosu na listiće kontrolnih biljaka (slika 8).

Statistički značajno povećanje aktivnosti tog enzima zamijećeno je pri koncentracijama većim

od 0,1 mg L-1, a najveći porast aktivnosti (porast od 38% u odnosu na kontrolu) utvrđen je pri

koncentraciji n Ag od 2 mg L-1 srebra.

Slika 8. Aktivnost superoksid dismutaze (U / mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1



0

5

10

15

20

25

30


Akt

ivno

st s

uper

oksi

d di

smut

aze

c c

b ba

b

26

Rezultati 27

4.7.2. Aktivnost askorbat peroksidaze

Najniža koncentracija n Ag kao i koncentracija n Ag od 2 mg L-1 nisu bitno utjecale na

aktivnost askorbat peroksidaze u vodenoj leći dok su koncentracije n Ag od 0,2 i 1 mg L-1

izazvale statistički značajno povećanje aktivnosti askorbat peroksidaze u usporedbi s

kontrolom. Najviša koncentracija nanočestica srebra značajno je inhibirala aktivnost tog

antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolne vrijednosti (slika 9).

Slika 9. Aktivnost askorbat peroksidaze (U / mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1



0

1

2

3

4

5

6


Akt

ivno

st a

skor

bat p

erok

sida

ze

cbc

ab

a

bc

d

27

Rezultati 28

4.7.3. Aktivnost katalaze

Jedan od enzimskih mehanizama antioksidacijskog sustava koji sudjeluje u razgradnji

vodikovog peroksida je i enzim katalaza. Aktivnost katalaze u vodenoj leći tretiranoj nižim

koncentracijama n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nije bila statistički značajno povećana u odnosu na

kontrolne biljke. S druge strane koncentracije nano srebra više od 0,5 mg L-1 uzrokovale su

značajnu inhibiciju aktivnosti tog antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolu (slika 10).

Slika 10. Aktivnost katalaze (µmol / min mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2


Akt

ivno

st k

atal

aze

a

a a

b

bc c

28

Rasprava 29

5. RASPRAVA

5.1. Učinak nanočestica srebra na rast i funkcionalnost fotosinteze vodene leće

Nanočestice srebra upotrijebljene u ovom radu nepovoljno su djelovale na rast i razvoj

vodene leće te su uzrokovale oksidacijski stres. Istraživan je utjecaj nanočestica srebra

promjera manjeg od 100 nm u koncentracijama od 0,1 do 5 mg L-1 na rast vodene leće, sadržaj

fotosintetskih pigmenata, malondialdehida, neproteinskih tiola te na aktivnost

antioksidacijskih enzima. Nakon sedam dana pokusa, najstariji listići pokazivali su znakove

kloroze što je jedan od vidljivih simptoma stresa na metaboličke procese u biljci (Bonnet i

sur. 2000.). Nanočestice srebra su pri višim koncentracijama izazvale inhibiciju stope rasta

biljaka za čak i više od 50% u odnosu na kontrolne vrijednosti. Te rezultate potvrđuje

istraživanja Jesus i sur. (2013.) gdje se stopa rasta vodene leće smanjila nakon izlaganja

nanočesticama srebra, s tim da je učinak bio izraženiji s povećanjem koncentracije ili vremena

izloženosti.

Zanimljivo je istraživanje Krishnaraj i sur. (2012.) koji su proučavali utjecaj srebra u

ionskom i nano obliku na klijavost biljke Bacopa monnieri. Utvrđeno je da nanočestice srebra

u koncentracijama od 10 i 100 μg L-1 te 10 i 100 mg L-1 nisu utjecale na klijavost dok je

tretman s AgNO3 u koncentraciji od 10 mg L-1 usporio, a u deset puta većoj koncentraciji

potpuno inhibirao klijanje. Nanočestice srebra u koncentraciji od 0,1 mg L-1 uzrokovale su

značajno smanjenje stope rasta broja listića u biljnoj vrsti Lemna gibba nakon tjedan dana

pokusa (Oukarroum i sur., 2013.). I u mom su radu utvrđeni slični rezultati jer je stopa rasta

vodene leće izražene po masi svježe tvari i po broju listića također bila znatno smanjena pri

koncentraciji od 0,1 mg L-1. Najviša koncentracija n Ag od 5 mg L-1 smanjila je stopu rasta

mase svježe tvari za više od 70%, a stopu rasta broja listića gotovo potpuno u usporedbi s

kontrolom. Inhibicija rasta vodene leće (broja listića i mase suhe tvari) tretirane s n Ag

promjera 5-20 nm ustanovljena je i u istraživanju Űçüncü i sur. (2014.) pri čemu je utvrđeno

da je najveća inhibicija rasta nastupila pri koncentraciji od 32 μg L-1 (58% smanjenja). U

istraživanju Gubbins i sur. (2011.) zabilježeno je smanjenje broja listića vodene leće izložene

tijekom sedam dana nanočesticama srebra (promjera manjeg od 100 nm) u koncentraciji od

160 μg L-1, no s ionskim srebrom smanjenje rasta bilo je značajno već pri koncentraciji od 5

μg L-1.

29

Rasprava 30

Woo-Mi i sur. (2012.) su proučavali bioakumulaciju nanočestica srebra promjera 5-25

nm te njihov utjecaj na rast mungo graha (Vigna radiata) i sirka (Sorghum bicolor). Sadržaj

nanočestica u biljnom tkivu se povećao s povećanjem koncentracije srebra u agaru, a rast se

proporcionalno smanjivao; rast klijanaca graha i sirka izloženih koncentraciji n Ag od 40 mg

L-1 iznosio je 20 odnosno 47% rasta kontrolnih biljaka. U ovom je radu sadržaj srebra u

biljkama dosegao maksimum pri koncentraciji od 2 mg L-1 a pri tome je sadržaj srebra u

vodenoj leći bio 184 puta veći u usporedbi sa sadržajem srebra u kontrolnim biljkama.

Primjetno smanjenje rasta vodene leće može biti uzrokovano smanjenjem

koncentracije fotosintetskih pigmenata, a time i fotosintetske sposobnosti vodene leće. Wang

(1990.) je ustvrdio da redukcija sadržaja fotosintetskih pigmenata može biti puno bolji

pokazatelj toksičnosti od stope rasta biljaka.

U radu Dewez i Oukarroum (2012.) učinak nano čestica srebra na fotokemijske

reakcije fotosinteze istraživan je pomoću testnog organizma - zelene alge Chlamydomonas

reinhardtii. Alge su izložene nanočesticama srebra u koncentraciji od 1, 5 i 10 μmol L-1 u

uvjetima svijetla i tame tijekom 6 sati. Kad su alge bile izložene nanočesticama srebra u

koncentracijama od 5 i 10 μmol L-1 dobiveni su rezultati koji pokazuju strukturalne promjene

reakcijskog centra fotosistema II i inhibiciju u prijenosu elektrona pri čemu je učinak bio veći

kod biljaka izloženih svjetlu. Pod tim uvjetima, nije došlo do aktiviranja fotozaštitnih

mehanizama kojim bi se riješio višak svjetlosne energije apsorbirane od strane antena

fotosistema II. Najveće pogoršanje strukturnog i funkcionalnog integriteta fotosistema II

opaženo je u stanicama algi izloženih 10 μmol L-1 n Ag tijekom 6 sati u uvjetima svjetlosti

(Dewez i Oukarroum, 2012.).

Istraživanje Mazumdar (2014) pokazuje značajno smanjenje sadržaja klorofila u vrsti

Brassica campestris izloženoj 0,5 i 1 mg L-1 n Ag u odnosu na kontrolu. Vrsta Vigna radiata

pokazala se nešto tolerantnija prema nanočesticama srebra od B. campestris jer je u toj vrsti

značajno smanjenje klorofila zabilježeno tek pri koncentraciji n Ag od 1 mg L-1 u odnosu na

kontrolu. U ovom je istraživanju utvrđeno da je vodena leća (kao i B. campestris) osjetljivija

na nanočestice srebra od mungo graha jer je sadržaj klorofila a u vodenoj leći bio znatno

smanjen pri koncentracijama n Ag većim od 0,1 mg L-1 (slika 3). U slučaju karotenoida,

pomoćnih pigmenata iz skupine terpena, uočena je vrlo slična situacija kao i kod klorofila,

odnosno utvrđeno je smanjenje sadržaja karotenoida u vodenoj leći izloženoj nano česticama

srebra u koncentracijama višim od 0,1 mg L-1 nanočestica srebra (slika 4). U vrsti Landoltia

punctata koja je tretirana nanočesticama bakrovog oksida (CuO) zabilježeno je značajno

30

Rasprava 31

smanjenje klorofila pri koncentraciji od 1 mg L-1, dok pri koncentraciji od 0,2 mg L-1 nisu

zabilježene takve promjene (Shi i sur. 2011.).

5.2 Učinak nano čestica srebra na pokazatelje oksidacijskog stresa u vodenoj leći

Izlaganje toksičnim koncentracijama metala često uzrokuje nakupljanje reaktivnih

oblika kisika, povišenu razinu lipidne peroksidacije i promjenu aktivnosti antioksidacijskih

enzima. U drugom dijelu istraživanja sam kao pokazatelje oksidacijskog stresa određivala

sadržaj malondialdehida i neproteinskih tiola, te aktivnost antioksidacijskih enzima katalaze,

askorbat peroksidaze i superoksid dismutaze.

U istraživanju Oukarroum i sur. (2013.) utvrđeno je značajno povećanje

unutarstanične koncentracije reaktivnih oblika kisika (ROS) u vodenoj leći Lemna gibba

izloženoj koncentracijama nanočestica srebra od 1 i 10 mg L-1. Također je utvrđena pozitivna

korelacija između oksidacijskog stresa i akumulacije nanočestica srebra u biljnim stanicama,

te oksidacijskog stresa i povećanja koncentracije nanočestica u podlozi. Rezultati istraživanja

upućuju na zaključak da suspenzija nanočestica srebra predstavlja potencijalni izvor

toksičnosti za vrstu L. gibba.

Peroksidacija lipidne membrane predstavlja jedan od najštetnijih učinaka

oksidacijskog stresa uzrokovan metalima (Bueno i Piqueres, 2002.). Stupanj lipidne

peroksidacije određuje se mjerenjem sadržaja malondialdehida, koji je jedan od krajnjih

produkata tog procesa. U ovom istraživanju je vidljiv znatan porast sadržaja malondialdehida

u vodenoj leći tretiranoj nanočesticama srebra (slika 5) u odnosu na kontrolni uzorak. Taj je

porast najizraženiji u biljkama izloženim koncentracijama nanočestica srebra od 5 mg L-1 i bio

je čak dva i pol puta veći u odnosu na kontrolne biljke. Ti rezultati također pokazuju da je u

biljkama izloženim n Ag došlo do oksidacijskog stresa jer je poznato da je direktna posljedica

povećanog stvaranja ROS i lipidna peroksidacija odnosno oštećenje lipidnih biomembrana.

Isti su rezultati utvrđeni i u istraživanju Glavaš Ljubimir i sur. (2012.).

Različiti stresni čimbenici djeluju na metaboličke procese ograničavajući rast i razvoj

biljaka. Prvi odgovor biljke je smanjenje normalne metaboličke aktivnosti, a time i sadržaja

proteina. Stoga, nizak sadržaj proteina predstavlja jasan pokazatelj stresa biljaka. Međutim,

sadržaj proteina može biti i povišen uslijed aktivacije različitih procesa u biljkama koji

uključuju sintezu proteina de novo, osmotsku regulaciju, antioksidacijsku obranu i druge

procese (Bonjoch i Tamayo, 2001.). U ovom istraživanju, nanočestice srebra u najnižim

primijenjenim koncentracijama (0,1 i 0,5 mg L-1) nisu uzrokovale statistički značajno

31

Rasprava 32

smanjenje sadržaja ukupnih proteina u usporedbi s kontrolom (slika 7). Sadržaj proteina u

vodenoj leći izloženoj koncentracijama srebra većim od 0,5 mg L-1 statistički se značajno

smanjio u usporedbi s kontrolom (najveće smanjenje sadržaja ukupnih proteina iznosilo je

33% u odnosu na kontrolne biljke).

Zbog visoke stanične koncentracije te uloge u održavanju redoks stanja stanice,

glutation je jedan od najvažnijih antioksidansa posebice u animalnim stanicama. Glutation

ima vrlo važnu ulogu i u toleranciji biljaka na teške metale i njihovoj kompartmentalizaciji u

vakuolu (Zhu i sur., 1999.; Zeng i sur., 2009.). Naime, GSH je prekursor fitohelatina, peptida

s općom strukturom [(γ-Glu-Cys)n-Gly (n ≥ 2) koji na sebe vežu metale i „odvoze“ ih u

vakuolu. Metali se vežu na –SH helirajuću grupu cisteina i nastaju kompleksi čime je

sprječena slobodna cirkulacija metala u citosolu. Dixit i sur. (2001.) su istraživali utjecaj

kadmija na grašak te su zaključili da je došlo do smanjenja razine GSH-a zbog njegovog

korištenja kao reducirajućeg supstrata u sintezi askorbata te tako i u zaštiti staničnih

membrana od lipidne peroksidacije. U ovom je radu sadržaj neproteinskih tiola, koji ukazuje

na sadržaj reduciranog glutationa, u vodenoj leći uzgojenoj na podlogama s dodatkom

nanočestica srebra bio statistički značajno povećan u odnosu na kontrolne vrijednosti pri

koncentracijama većim od 0,1 mg L-1 (slika 6).

U mom su istraživanju nanočestica srebra izazvale i promjene u aktivnostima

antioksidacijskih enzima u vodenoj leći – katalaze (CAT), askorbat peroksidaze (APOD) i

superoksid dismutaze (SOD). Bitnu ulogu u biljci ima katalaza koja neutralizira vodikov

peroksid čime zapravo utječe na redoks balans tijekom oksidacijskog stresa (Bowler i sur.

1992.). Iako je katalaza prisutna samo u peroksisomima, ima nezamjenjivu ulogu u razgradnji

visokih koncentracija ROS-a u stresnim uvjetima (Gupta i sur. 2009.). U ovom istraživanju

aktivnost katalaze u vodenoj leći tretiranoj nižim koncentracijama n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nije

bila statistički značajno povećana u odnosu na kontrolne biljke. S druge strane koncentracije

nano srebra veće od 0,5 mg L-1 uzrokovale su značajnu inhibiciju aktivnosti tog

antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolu (slika 10). Song i sur. (2012.) su utvrdili

povećanu aktivnost katalaze i superoksid dismutaze u vodenoj leći izloženoj koncentracijama

nanočestica TiO2 nižim od 200 mg L-1 dok su veće koncentracije nanočestica uzrokovale

inhibiciju aktivnosti tih enzima. Jesus i sur. (2013.) primjetili su da različite veličine

nanočestica srebra drugačije utječu na aktivnost katalaze u biljci Lemna minor. Prilikom

tretiranja vodene leće nanočesticama srebra od 10 nm došlo je do povećane aktivnosti

katalaze iako je do statistički značajnog povećanja došlo samo pri najvišoj koncentraciji (0,32

mg L-1). Nanočestice srebra od 80 nm su pri koncentraciji od 0,02 mg L-1 uzrokovale lagano

32

Rasprava 33

smanjenje aktivnosti katalaze, pri koncentraciji od 0,05 aktivnost tog enzima je porasla, ali je i

dalje bila niža od aktivnosti katalaze u kontrolnim biljkama.

Askorbat peroksidaza, koja je visoko specifična tj. gotovo isključivo koristi askorbat u

razgradnji H2O2, pod utjecajem nižih koncentracija nanočestica srebra pokazala je porast

aktivnosti a pri najvišoj koncentraciji (5 mg L-1) i znatno smanjenje aktivnosti u usporedbi s

kontrolom (slika 9). U radu Hatami i sur. (2013.) procijenjen je učinak nanočestica srebra i

skladištenja u tamnom prostoru na sorte pelargonija 'Blue Wonder' i 'Antuna'. Aktivnost

askorbat peroksidaze (APOD) i gvajakol peroksidaze (POD) u pelargonijama tretiranim s 20-

60 mg cm-3 n Ag (nanočestice srebra primijenjene su folijarno) tijekom pet dana bila je

znatno povećana u odnosu na kontrolne biljke.

Superoksid dismutaza katalizira razgradnju superoksidnih radikala u vodikov peroksid

i kisik. Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji

nanočestica srebra nije bila statistički značajno povišena u odnosu na listiće kontrolnih biljaka

(slika 8). Statistički značajno povećanje aktivnosti tog enzima zamijećeno je pri

koncentracijama većim od 0,1 mg L-1, a najveći porast aktivnosti (porast od 38% u odnosu na

kontrolu) utvrđen je pri koncentraciji od 2 mg L-1 nanočestica srebra. U biljnoj vrsti Spirodela

polyrhiza tretiranoj nanočesticama srebra veličine 6 i 20 nm u koncentraciji od 10 mg L-1

aktivnost SOD i CAT te sadržaj GSH i MDA se nisu bitno razlikovali u usporedbi s

vrijednostima tih pokazatelja u kontrolnim biljkama (Jiang i sur., 2014.). S druge strane n Ag

u koncentracijama nižim od 10 mg L-1 značajno su povećali aktivnost svih mjerenih enzima

(SOD, CAT i POD) te glutationa ali usporedno s tim i povećanje ROS.

Na osnovu dobivenih rezultata može se zaključiti da su nanočestice srebra u

istraživanim koncentracijama negativno utjecale na rast vodene leće te su uzrokovale

okisdacijski stres iako su istovremeno potaknuti i obrambeni mehanizmi biljke.

33

Zaključak 34

6. ZAKLJUČAK

Na temelju dobivenih rezultata može se zaključiti da su nanočestice srebra toksične za

vodenu leću te da je u mehanizam njihove toksičnosti uključen oksidacijski stres jer su:

• uzrokovale smanjenje stope rasta broja listića i mase svježe tvari u vodenoj leći

• dovele do smanjenja sadržaja klorofila a i b, karotenoida u vodenoj leći

• povećale stupanj lipidne peroksidacije u vodenoj leći

• uzrokovale povećanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći

• uzrokovale promjenu aktivnosti antioksidacijskih enzima (superoksid dismutaze,

askorbat peroksidaze i katalaze) u vodenoj leći

34

Literatura 35

7. LITERATURA

Aebi H., 1984. Catalase in vitro. Methods in Enzymology 105, 121-126. Arnon D.I., 1949. Copper enzymes in isolated chloroplast: polypheoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24, 1-15. Arora A, Sairam RK, Srivastava GC (2002) Oxidative stress and antioxidative system in plants. Curr Sci India 82: 1227-1238 Asada K., 1992. Ascorbate peroxidase – a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants. Physiologia Plantarum 55, 235-241. Begović L., 2013. Anatomski, fiziološki i molekularni biljezi lignifikacije u razvoju stabiljke jarog ječma (Hordelum vulgare L.). Doktorska disertacija: Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera, Sveučilište u Dubrovniku, Institut Ruđer Bošković, Sveučilišni poslijediplomski interdisciplinarni doktorski studij Molekularne bioznanosti. Bharadwaj Punita S., 2012. Silver or silver nanoparticle a safety or a risk. Journal of environmental research and development., 7(1A) 5, 452-456. Bonjoch N.-P., Tamayo P.-R., 2001. Protein content quantification by Bradford method U: Reigosa Roger, M. J. (ur) Handbook of Plant Ecophysiology Techniques. Kluwer Academic Publisher, Nizozemska, 283-295. Bonnet M., Camares O., Veisseire P., 2000. Effect of zinc and influence of Acremonium lolii on growth parameters, chlorophyll a fluorescence and antioxidant enzyme activities of ryegrass (Lolium perenne L. cv Apollo). Journal of Experimental Botany 51, 945-953. Bowler C., Van Montagu M., Inze D., 1992. Superoxide-dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43, 83-116. Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Analytical Biochmistry 72, 248-254. Bueno P., Piqueres A., 2002. Effect of transition metals on stress, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in tobacco cell cultures. Plant Growth Regulation 36, 161-167. Cassells A.C., Curry R.F., 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers. Plant, Cell Tissue and Organ Culture 64, 145-157. Chen X., Schluesener H.J., 2008. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicology Letters 176,1-12.

35

Literatura 36

Dewez D., Oukarraoum A., 2012. Silver nanoparticles toxicity effect on photosystem II photochemistry of the green alga Chlamydomonas reinhardtii treated in light and dark conditions. Toxicological and environmental chemistry 162, 1536-1546. Dixit, V., V. Pandey, Shyam, R., 2001. Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea. Journal of Experimental Botany 52, 1101-1109. Duncan D.B., 1955. Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11, 1-42. Ellman G.L., 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemestry and Biophysics 82, 70-77.

Giannopolitis C. N., Ries S. K., 1977. Superoxide dismutase. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology 59, 309-314. Gill SS, Tuteja N (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol Bioch 48: 909-930 Glavaš Ljubimir K., Radić Brkanac S., Cvjetko P., Vujčić V., Ljubimir S., Pevalek-Kozlina B., 2012. Toxicity of silver nanoparticles in Duckweed (Lemna minor L.). International Conference-Plant Growth, Nutrition & Environment Interactions, Austrija, Beč. Gubbins E.J., Batty L.C., Lead J.R., 2011. Phytotoxicity of silver nanoparticles to Lemna minor L. Environmental Pollution 159, 1551-1559. Gupta D.K., Nicoloso F.T., Schetinger M.R.C., Rossato L.V., Pereira L.B., Castro, G.Y., Srivastava S., Tripathi R.D., 2009. Antioxidant defense mechanism in hydroponically grown Zea mays seedlings under moderate lead stress. Journal of Hazardous Materials 172, 479-484. Hatami M., Ghorbanpour M., 2013. Effect of nanosilver on physiological performance of Pelargonium plants exposed to dark stoge. Journal of Horticultural Research 21(1), 15-20. Heath R.L., Packer L., 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts.I- Kinetics and Stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemestry and Biophysics 125, 189- 198. Hillman W.-S., 1961. The Lemnaceae or duckweeds. Botanical Review 27, 221-287.

Hiraga S., Sasaki K., Ito H., Ohashi Y., Matsui H., 2001. A large family of class III peroxidases. Plant and Cell Physiology 42, 462-468.

Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M.,Geiss K.T. , Schlager J.J., 2005. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Toxicology in vitro. 19(1) 9, 975-983. Jesus F., Aguiar S., Ferreira M., Oliveira R., Pereira S., Nogueira Antonio J.A., 2013. Long-term effects of silver nanoparticles in Lemna minor: the influence of nanoparticles size. 8th International Conference on the Envionmental Effects of Nanoparticles and Nanomaterials, Aix-en-Provence, France, Abstract book.

36

Literatura 37

Jiang H.-S., Qiu X.-N., Li G.-B., Li W., Yin L.-Y., 2014. Silver nanoparticles induced accumulation of reactive oxygen species and alteration of antioxidant systems in the aquatic plant Spirodela polyrhiza. Environmental Toxicology and Chemistry 33(6), 1398-405. Krajnčić B., Devidé Z., 1980. Report on photoperiodie response in Lemnaceae from Slovenia. Ber. Geobot. Inst. ETH, Stiftung Rübel, Zürich, 47, 75-86. Krishanaraj C., Jagan E.G., Ramachandran R., Abirami S.M., Mohan N., Kalaichelvan P.T., 2012. Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri (Linn.) Wettst. plant growth metabolism. Process Biochemistry 47, 651-658. Landolt E, 1986. The family of Lemnaceae - a monografic study. Veröffentlichungen des Geobotanischen Institutes der Edig. tech. Hochschule, Stiftung Rübel. Zürich. 71. Heft. Les H.D., Crawford J.D., Landolt E., Gabel D.J., Kimball T.R., 2002. Systematic Botany 27(2), 221-240. Lichtennthalter H.K., 1987. Chlorophylls and caroteniods- pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148, 350-382. Liszewska F., Błaszczyk A., Sirko A., 2001. Modification of non-protein thiols contents in transgenic tobacco plants producing bacterial enzymes of cysteine biosynthesis pathway. Acta Biochimica Polonica 48, 647-656. Mazumdar H., 2014. The impact of silver nanoparticles on plant biomass and chlorophyll content. International Journal of Engineering and Science 4(7), 12-20. Mulier B., Rahman I., Watchorn T., Donaldson K., MacNee W., Jeffery P.-K., 1998. Hydrogen peroxide-induced epithelial injury: the protective role of intracellular nonprotein thiols (NPSH). European Respiratory Journal 11, 384-391. Nair R., Varghese S.H., Nair B.G., Maekawa T., Yoshida Y., Kumar D.S., 2010. Nanoparticulate material delivery to plants. Plant Science 179, 154-163. Nakano Y., Asada K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate- specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology 22, 867-880. Noctor G., Foyer C.H., 1998. Ascorbate and glutatione: keeping active oxygen under control. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 49, 249-279. Oukarraoum A., Barhoumi L., Pirastru L., Dewez D.,2013. Silver nanoparticle toxicity effect on growth and cellular viability of the aquatic plant Lemna gibba. Environmental Toxicology and Chemistry 32(4):902-907. Pand S., 2006. Environmental degradation due to the accumulation of perticulates. Journal of Environmental Research and Development, 1(1) 4: 22-25. Pevalek-Kozlina B., 2003. Fiziologija bilja, Profil International, Zagreb.

37

http://www.researchgate.net/journal/1552-8618_Environmental_Toxicology_and_Chemistry



Literatura 38

Pirson A., Seidel F., 1950. Zell- und stoffwechselphysiologishe Untersuchungen an der Wurzel von Lemna minor unter besonderer Berücksichtigung von Kalium- und Kalziummangel. Planta 38, 431-473. Rogić T., Šimac M., 2009. Utjecaj solnog i osmotskog stresa na kaktus Mammillaria gracilis Pfeiff. u kulturi in vitro. Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet – Biološki odsjek rad izrađen u svrhu prijeve za natječaj za dodjelu Rektorove nagrade u akademskoj godini 2009/2010. Sarvajeet S.G., Narendra T., 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48, 909-930. Savolainen K., Alenius H., Norppa H., Pylkkänen L., Tuomi T., Kasper G., 2010. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies-A review. Toxicololgy 269: 92-104. Shi J., Abid A.D., Kennedy I.M., Hristova K.R., Silk K.W., 2011.To duckweeds (Landoltia punctata), nanoparticulate copper oxide is more inhibitory than the soluble copper in the bulk solution. Environmental Pollution 159(5), 1277-1282. Song G., Gao Y., Wu H., Zhang C., Ma H., 2012. Physiological effect of anatase TiO2 nanoparticles on Lemna minor. Environmental Toxicology and Chemistry 31(9), 2147-2152. Šmuc T., 2009. Kiselo-bazna svojstva Mn(III) meso-tetrakis((N-butil)piridin-2-il) porfirina u vodenom mediju. Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet – rad izrađen u svrhu prijeve za natječaj za dodjelu Rektorove nagrade u akademskoj godini 2008/2009. Štefan L., Tepešić T., Zavidić T., Urukalo M., Tota D., Domitrović R., 2007. Lipidna peroksidacija – uzroci i posljedice. Medicina. 10, 84-93. Steinberg R., 1946. Mineral requirenment of Lemna minor. Plant Physiology 21, 42-48. Űçüncü E., Őzkan A.D., Kurşungőz C., Űlger E., Őlmez T.T., Tekinay T., Ortaç B., Tunca E., 2014. Effect of laser ablated silver nanoparticles on Lemna minor. Chemosphere 108, 251-257. Vranova E., Inzé D., Breusegem F., 2002. Signal transduction during oxidative stress. Journal of Experimetal Botany 53, 1227-1236. Wang W., 1990. Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research 52, 7-22. Wang, F-Z., Wang, Q-B., Kwon, Suk-Yoon, Kwak, S-S., Su, W-A., 2005. Enhanced drought tolerance of transgenic rice plants expressing a pea manganese superoxid dismutase. Journal of Plant Physiology 162: 456-472. Woo-Mi L., Jin II K., Youn-Joo A.,2012. Effect of silver nanoparticles in crop plants Phaseolus radiatus and Sorghum bicolor: media effect on phytotoxicity. Chemosphere 86, 491-499.

38

http://www.researchgate.net/journal/1873-6424_Environmental_Pollution

Literatura 39

Zeng X., Ma L.-Q., Qiu R., Tang Y., 2009. Responses of non-protein thiols to Cd exposure in Cd hyperaccumulator Arabis paniculata Franch. Environmental and Experimental Botany 66: 242-248. Zenk M.-H., 1996. Heavy metal detoxification in higher plants – a review. Gene 179: 21-30. Zhu Y.-L., Pilon-Smits E.-A.-H., Tarun A.-S., Weber S.-U., Jouanin L., Terry N., 1999. Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressing γ-glutamylcysteine synthetase. Plant Physiology 121: 1169-1177.

http://delta-intkey.com/angio/www/lemnacea.htm, 21.11.2014

39

http://delta-intkey.com/angio/www/lemnacea.htm

ŽIVOTOPIS 40

ŽIVOTOPIS

Eda Puntarić

OSOBNI PODACI:

Ime i prezime: Eda Puntarić

Datum i mjesto rođenja: 26.11.1990., Zagreb

Adresa: Zagrebačka 22a, 10 313 Graberje Ivanićko

Telefon: 01/2820-068

Mobitel: 098/1940-319

E-mail: [email protected]

Državljanstvo: Hrvatsko

OBRAZOVANJE:

1997.-2005. Osnovna škola „Josipa Badalića“, Graberje Ivanićko

2005.-2009. Srednja škola „Ivan Švear“, Ivanić Grad; smjer: opća

gimnazija

2009.-2012. Prirodoslovno - matematiči fakultet, Biološki odsjek,

smjer: Znanosti o okolišu – preddiplomski studij

(sveučilišna prvostupnica struke Znanosti o okolišu)

2012.- Prirodoslovno - matematiči fakultet, Biološki odsjek,

smjer: Znanosti o okolišu – diplomski studij

Zimski semestar 2013/2014 Demonstrator za izvođenje 45h praktikuma iz kolegija

„Osnove fiziologije bilja“

OSTALO:

- sudjelovanje na Smotri Sveučilišta 2011., 2012.

- sudjelovanje na manifestaciji „Noć biologije“ ( 2010., 2011., 2012., 2013.,2014.)

40

eda puntarić utjecaj nanočestica srebra na vodenu lećudigre.pmf.unizg.hr/3978/1/eda.pdflijekova,...

Documents