Ectomycorrhizae  and  forest  biogeochemistry:    

The  role  of  ectomycorrhizal  communities    

in  forests  impacted  by  global  change  

by

Nicholas Paul Rosenstock

A dissertation submitted in partial satisfaction of the

requirements for the degree of

Doctor of Philosophy

in

Environmental Science, Policy and Management

in the

Graduate Division

of the

University of California, Berkeley

Committee in charge:

Professor Thomas D. Bruns, Chair Professor John W. Taylor Professor Ron Amundson

Fall 2010

1    

 Abstract  

 Ectomycorrhizae  and  forest  biogeochemistry:  

 The  role  of  ectomycorrhizal  communities  

 in  forests  impacted  by  global  change  

by

Nicholas Paul Rosenstock

Doctor of Philosophy in Environmental Science, Policy and Management

University of California, Berkeley

Professor Thomas D Bruns, Chair    

Ectomycorrhizal  communities  may  play  a  major  role  in  preventing  decreases  in  forest  productivity  associated  with  the  depletion  of  nutrients  caused  by  anthropogenic  nitrogen  and  in  facilitating  increased  productivity  in  response  to  elevated  atmospheric  CO2  concentrations.  In  my  doctoral  research  I  attempted  to  shed  some  light  on  the  following  question:  As  nutrient  demand  by  forest  trees  is  altered  by  human  induced  global  change  how  will  the  functioning  of  ectomycorrhizal  communities  respond?    

In  chapter  1,  I  present  the  results  of  a  study  of  the  effects  of  nitrogen  fertilization  on  ectomycorrhizal  communities  in  an  Eastern  US  hardwood  forest.  I  found  the  ectomycorrhizal  communities  of  the  organic  and  mineral  horizon  to  be  quite  distinct,  and  that  high,  but  not  moderate  levels  of  nitrogen  fertilization  altered  the  ectomycorrhizal  community  composition  and  decreased  ectomycorrhizal  species  richness.  I  also  found  that  ectomycorrhizal  colonization  intensity  increased  in  the  mineral  soil,  and  when  considered  in  conjunction  with  other  studies  conducted  in  the  same  research  forest,  this  may  indicate  that  the  ectomycorrrhizal  community  is  shifting  in  accordance  with  the  shifting  nutrient  demands  of  the  forest.  In  Chapter  2,  I  attempted  to  elucidate  the  role  of  soil  heterogeneity  in  shaping  fungal  community  composition  in  the  mineral  soil.  Depth  and  soil  carbon  content  were  consistently  correlated  with  fungal  community  composition.  The  parent  material  from  which  the  overlying  soil  is  derived  and  soil  calcium  content  may  be  important  in  determining  fungal  community  composition  but  our  sampling  scheme  did  not  allow  us  to  isolate  these  chemical  factors  from  the  potential  influence  of  geographic  location  on  fungal  community.  In  chapter  3,  I  present  a  literature  review  that  endeavored  to  determine  whether  there  is  potential  for  ectomycorrhizal  communities  or  individuals  to  alter  their  mineral  weathering  capabilities  and  nutrient  provision  to  host  plants  in  response  to  altered  nutrient  demand  from  their  host  plants.  Knowledge  of  the  mechanisms  that  control  belowground  carbon  allocation  by  plants  in  response  to  nutrient  

2    

demand  is  limited,  but  there  is  a  potential  for  plants  to  respond  to  increased  demand  of  phosphorous  and  potassium  by  allocating  more  carbon  to  the  fungal  symbionts  most  adept  at  providing  these  nutrients.  Future  studies  on  ectomycorrhizal  weathering  should  explicitly  test  the  role  of  host  nutrient  demand  in  stimulating  fungal  weathering.  In  chapter  4,  I  investigated  the  role  of  plants,  ectomycorrhizae,  and  low  molecular  weight  organic  acids  in  stimulating  mineral  weathering,  as  well  as  the  potential  for  elevated  carbon  dioxide  to  affect  biotic  weathering.  We  found  that  plants,  but  not  their  associated  ectomycorrhizae,  stimulated  weathering.  Elevated  CO2  did  not  affect  weathering  rates.  The  lack  of  an  effect  of  ectomycorrhizal  colonization  may  have  been  due  to  low  levels  of  mycorrhizal  colonization.  The  biotic  weathering  observed  in  this  study  was  driven  by  the  uptake  of  nutrient  cations,  and  not  by  substrate  acidification  or  root  exudation.  My  doctoral  research  suggests  that  ectomycorrhizae  may  play  an  important  role  in  mineral  nutrient  provision.              

i    

 Table  of  contents    Acknowledgments………………………………………………………………..…………...…………………………iii    Introduction…………………………………………………………………………..………….…………………………iv      Chapter  1:  Long-­‐term  additions  of  nitrogen  have  altered..……………………………………….……..1  ectomycorrhizal  community  composition  and  abundance  in  a  temperate  deciduous  forest.      

Abstract…………………………………………………………………………….……………………1  Introduction…………………………………………………………………..………………….……2  Methods………………………………………………………………………………..…………..……4  Results…………………………………………………………………………………………….……..7  Discussion…………………………………………………………………………………….………14  Conclusion…………………………………………………………………………………….………19  References  cited…………………………………………...……………………………….………20  

   

Chapter  2:  Linking  small  scale  soil  chemical  variability  ………………………………………………..27  to  fungal  niche  preference    

Abstract……………………………………………………………………….……………..…..….…27  Introduction…………………………………………………………………………………….……28  Methods…………………………………………………………………………………..……….…...29  Results…………………………………………………………………………………….………....…31  Discussion………………………………………………………………….……………………...….38  Conclusion………………………………………………………………………………….…………42  References  cited………………………………………………………………………….…...……43  

   

 Chapter  3:  Can  ectomycorrhizal  weathering  activity  ………………………………..…………………..46  respond  to  host  nutrient  demands?    

Abstract…………………………………………………………………….…………………..…...…46  Introduction…………………………………………………………………………………..…...…47  Relevant  aspects  of  root  physiology………………………………..….……………...…...47  Evidence  from  field  and  microcosm  studies……………………….….…………...…...50  Conclusion………………………………………………………………………………….…………55  References  cited…………………………………………….…………………………….……..…56  

   

ii    

Table  of  contents  (continued)    Chapter  4:  The  role  of  ectomycorrhizae,  organic  acids,…………………………………………………61  and  Pinus  sylvestris  seedlings  in  mineral  weathering:    nutrient  uptake  increases  weathering  rates.    

Abstract…………………………………………………………………….…………………….……61  Introduction…………………………………………………………………………………….……62  Methods…………………………………………………………………………………..……………64  Results…………………………………………………………………………………….……………68  Discussion………………………………………………………………….…………………………75  Conclusion……………………………………………………………………………………….……82  References  cited…………………………………………………………………………...….……83  

                                               

iii    

Acknowledgements:       I  cannot  overstate  the  role  that  my  late  father  Robert  Rosenstock  (1935-­‐2004)  has  had  in  forming  the  man  that  I  am  today,  and  contributing  to  the  modest  accomplishments  I  have  achieved.  He  always  encouraged  my  curiosity  and,  by  example,  inspired  me  to  pursue  a  career  path  that  is  inspiring  to  me  and  valuable  to  society.     I  owe  a  great  deal  of  gratitude  to  all  of  the  teachers  and  professors  I  have  had  who  have  encouraged  my  inquisitive  (albeit,  at  times,  overeager)  nature.  In  particular,  Dr.  Wood,  my  high  school  chemistry  teacher,  showed  me  the  joy  and  fulfillment  that  a  curious  mind  can  find  in  science.  My  undergraduate  forest  ecology  professor,  Tim  Fahey’s  statement  in  reference  to  the  evolution  of  the  mycorrhizal  symbiosis  that  “the  fungi  got  smart  enough  to  grow  trees”,  as  well  as  his  biogeochemistry  lectures  likely  laid  the  foundation  for  this  thesis.  At  Berkeley,  professor  Garrison  Sposito  reaffirmed  the  belief  that  I  could  learn  and  understand  anything  I  put  my  mind  to,  with  many  of  his  office  hours  required,  and  that  one  could  be  successful  in  science  without  sacrificing  an  interest  in  the  humanities.     The  friends  that  I  made  during  my  doctoral  studies,  were  a  great  help  to  my  mental  health,  which  otherwise  may  have  suffered  (more)  from  thousands  of  DNA  extractions  and  millions  of  pipette  depressions.  Particular  debts  of  gratitude  are  due  to  Adriana,  for  her  friendship  and  support,  Russell,  for  showing  me  there  are  always  new  friends  to  be  made  (and  for  his  home  stretch  efforts  in  the  submission  of  this  document),  and  Ashley,  for  distracting  me  to  no  end  from  my  research,  and  energizing  me  to  complete  it.     The  great  northern  nation  of  Sweden,  its  citizens  (particularly  Anna,  Patrick,  Niklas,  and  Elisabet),  and  immigrants  (Martin,  Raphaelle,  Dragos,  Jonas,  Linda,  Inga)  are  all  due  some  credit  (and  bear  some  responsibility)  for  my  progress  in  the  field  of  ecology.     I  have  been  lucky  in  many  ways  in  my  life.  Perhaps  my  greatest  good  fortune  thus  far  was  to  have  landed  in  the  Bruns  lab  at  Berkeley.  Tom  Bruns  has  been  a  good  friend  and  a  great  advisor  and  mentor.  I  don’t  due  well  in  overly  formal  settings,  and  there  is  nothing  overly  (or  even  moderately)  formal  about  the  rapport  Tom  maintains  with  his  students.  His  general  policy  of  being  always  available  for  questions,  his  encouragement  to  pursue  my  research  passions  (not  his),  his  sense  of  humor,  his  compassion,  and  his  attempts  to  improve  my  “very  long,  convoluted  (sort  of  Germanic)”  writing  style  have  all  been  instrumental  in  my  doctoral  studies.     Lastly,  I  think  I  should  thank  the  Forest  Service  for  not  hiring  me  in  the  Summer  of  2003,  and  the  Bush  administration,  for  its  insidious  attempts  to  systematically  underfund  all  benevolent,  and  potentially  regulatory,  government  institutions.  Had  I  gone  down  my  first-­‐choice  career  path  after  Cornell,  there  is  no  telling  where  I  would  be  right  now,  but  it  wouldn’t  be  here.            

iv    

Introduction    Man’s  emissions  of  carbon  dioxide  and  nitrogen  are  impacting  large  portions  of  the  Earth’s  forests.  The  implications  of  these  impacts  for  forest  productivity  and  soil  carbon  pools  remain  largely  unknown.  In  this  era  of  greenhouse  gas  induced  climate  change  understanding  the  trajectory  of  global  trends  in  forest  productivity  and  soil  carbon  storage  is  more  important  than  ever.  Ectomycorrhizal  fungi  play  a  major  role  in  many  of  the  processes  that  govern  how  forests  will  respond  to  global  change.  My  PhD  thesis  attempted  to  shed  light  on  one  of  the  most  important  questions  facing  forest  ecology  today:  As  nutrient  demands  by  forest  trees  is  altered  by  human  induced  global  change,  how  will  the  functioning  of  ectomycorrhizal  communities  respond?  In  the  proceeding  introductory  pages  I  will  give  some  background  information  about  ectomycorrhizal  fungi  and  the  effects  of  anthropogenic  nitrogen  deposition  and  elevated  atmospheric  CO2  levels  on  forests  and  ectomycorrhizal  communities.  I  will  then  discuss  how  my  PhD  research  has  contributed  to  a  greater  understanding  of  how  forests  will  be  affected  by  the  next  century  of  human  alteration  of  the  global  carbon  and  nitrogen  cycles.  

Ectomycorrhizal  fungi  are  important  to  forest  health.  The  majority  of  land  plants  associate  with  some  fungi  in  mycorrhizal  symbiosis  (Smith  and  Read,  2008).  A  mycorrhiza  is  a  symbiotic  union  between  a  fungus  and  a  plant  root,  and,  while  the  role  of  this  symbiosis  is  complex  and  variable,  nearly  all  mycorrhizae  share  a  common  trait  of  being  a  mutualistic  exchange  of  plant  derived  carbon  for  fungus  supplied  nutrients.  Ectomycorrhizae  are  one  of  a  number  of  mycorrhizal  types.  Ectomycorrhizae  are  structurally  distinct  in  that  the  fungus  forms  a  sheath  around  the  root  tips,  and  sends  hyphae  (small  hair  like  threads  of  fungal  tissue)  into  the  root,  but  does  not  penetrate  the  plant  cell  walls.  This  type  of  mycorrhiza,  ectomycorrhizae,  associates  with  a  relatively  small  portion  of  all  plant  species,  perhaps  only  about  3%,  but  this  3%  represents  the  majority  of  trees  of  the  temperate  and  boreal  forests  (particularly  the  plant  families  Fagaceae  and  Pinaceae),  so,  in  terms  of  land  area,  the  majority  of  the  earth’s  forests  are  dependant  on  ectomycorrhizal  fungi  (Smith  and  Read,  2008).  Ectomycorrhizae  have  been  shown  to  improve  their  host  plant’s  resistance  to  drought  (Muhsin  and  Zwiazek,  2002),  pathogens  (Buscot  et  al.,  1992),  and  phytotoxic  concentrations  of  heavy  metals  (Smith  and  Read,  2008),  but  it  is  their  ability  to  provide  nutrients  to  their  hosts  that  is  generally  considered  their  most  growth  promoting  effect.  This  enhanced  nutrient  uptake  is  a  result  of  ectomycorrhizal  fungi’s  ability  to  greatly  increase  the  amount  of  soil  the  plants  can  be  in  contact  with  through  their  extensive  mycelial  networks  as  well  as  their  ability  to  solubilize  and  take  up  nutrients  from  pools  not  available  to  plant  roots.  The  majority  of  research  on  growth  promotion  by  ectomycorrhizal  fungi  has  focused  on  their  ability  to  provide  nitrogen  to  their  host  plants.  Ectomycorrhizae  can  provide  up  to  80%  of  a  plant’s  nitrogen  demand  (Hobbie  and  Colpaert,  2003).  However,  ectomycorrhizae  have  also  been  shown  to  provide  their  host  plants  with  significant  amounts  of  the  mineral  derived  nutrients  calcium  (Jentschke  et  al.,  2001),  potassium  (van  Scholl  et  al.,  2006),  magnesium  (Jentschke  et  al.,  2000),  and  phosphorous  (Ekblad  et  al.,  1996).  Studies  have  shown  that  ectomycorrhizal  fungi  may  also  play  a  role  in  the  weathering  of  soil  minerals,  enhancing  mineral  nutrient  uptake  from  these  otherwise  highly  recalcitrant  nutrient  pools  (Landeweert  et  al.,  2001).  Ectomycorrhizal  communities  are  species  rich,  with  well  over  a  

v    

hundred  ECM  species  having  been  documented  in  monodominant  forests  (Parrent  and  Vilgalys,  2007;  Taylor  et  al,  2010),  and  dozens  or  more  on  individual  trees  (Bruns,  1995).  Our  knowledge  of  the  respective  ecological  niches  of  ECM  fungi  is  poor,  but  there  is  ample  evidence  that  suggests  discreet,  non-­‐overlapping  niches  of  habitat  preference  (Rosling  et  al.,  2003,  Dickie  et  al.,  2002)  and  nutrient  acquisition  (van  Scholl  et  al.,  2006;  Abuzinadah  and  Read,  1986)  exist  for  some  species.    

As  atmospheric  CO2  concentrations  rise,  forest  growth  and  tree’s  nutrient  demands  may  increase.  The  Earth’s  atmospheric  concentrations  of  CO2  are  increasing  due  to  fossil  fuel  combustion,  agriculture,  and  deforestation,  and  are  predicted  to  continue  to  rise,  even  if  we  arrest  the  increasing  rate  of  anthropogenic  CO2  emissions.  A  number  of  studies  have  shown  that  plants  grow  faster  and  fix  more  CO2  when  CO2  concentrations  are  increased  above  ambient  levels  (Ainsworth  and  Long,  2005).  This  increased  growth  however,  is  dependant  on  increased  nutrient  uptake  to  support  increased  standing  plant  biomass  (Pinkard  et  al.,  2010)  There  is  evidence  that  forests  are  responding  to  this  increased  nutrient  demand  caused  by  CO2-­‐stimulated-­‐growth-­‐enhancement  by  increasing  root  growth  and  developing  a  deeper  distribution  of  roots  (Iversen,  2010).  

Anthropogenic  nitrogen  pollution  threatens  to  alter  the  productivity  and  carbon  storage  of  temperate  and  boreal  forests.  Anthropogenic  nitrogen  pollution  (ANP)  from  energy  generation,  transport,  and  agriculture  has  more  than  doubled  the  inputs  of  nitrogen  to  terrestrial  ecosystems  (Vitousek  et  al.,  1997).  Emissions  of  the  other  major  component  of  acid  rain,  sulfur,  were  successfully  reduced  in  the  early  1990’s,  and  public  attention  to  acid  rain  has  since  diminished  greatly.  ANP  however,  has  either  remained  steady  or  increased  somewhat  in  the  developed  world,  and  has  risen  sharply,  and  is  predicted  to  rise  even  more  sharply  in  the  21st  century  in  the  developing  world  (Galloway  et  al.,  2004).  Nitrogen  put  into  the  atmosphere  by  transport  and  energy  generation  returns  to  earth  as  HNO3  and  can  fall  as  wet  or  dry  deposition  many  hundreds  of  miles  from  pollution  sources  (Driscoll  et  al.,  2003).  Soil  nitrogen  status  is,  for  temperate  and  boreal  forests,  the  dominant  edaphic  factor  controlling  forest  productivity  and  shaping  species  composition  (Cleland  and  Harpole,  2010).  Anthropogenic  nitrogen  pollution  (ANP)  has  facilitated  invasive  species  establishment  in  many  forests  of  the  temperate  and  boreal  zone  and  contributed  to  widespread  species  loss  (Cleland  and  Harpole,  2010).  There  is  ample  evidence  that  moderate  levels  of  ANP  may  significantly  increase  the  net  primary  productivity  of  temperate  forests  (Pregitzer  et  al.,  2008;  Janssens  et  al.,  2010).  Beyond  a  certain  amount  of  accumulated  ANP  forest  productivity  may  drop  sharply  as  a  result  of  soil  acidification  and  excess  N  inputs  leaching  out  other  essential  nutrients,  which  then  become  limiting  to  forest  productivity.  This  shift  from  nitrogen  limitation  to  limitation  or  co-­‐limitation  by  phosphorous  (Gradowski  and  Thomas,  2006),  potassium  (Gleeson  and  Good,  2003),  or  calcium  (Long  et  al.,  2009)  due  to  prolonged  ANP  has  already  been  observed  in  a  number  of  forests  in  Eastern  North  America.    Thus,  the  continued  productivity  of  forests  sustaining  heavy  nitrogen  deposition  will  become  dependant  on  the  uptake  of  these  mineral  derived  nutrients.  Mineral  weathering  increases  the  supply  of  these  nutrients  and  neutralizes  the  acidifying  effects  of  nitrogen  deposition.  Increased  nitrogen  availability  decreases  belowground  carbon  allocation  (Ekblad  et  al.,  1996;  Ericsson,  1995).  Decreased  belowground  carbon  allocation  equates  to  decreased  inputs  of  carbon  into  deep  soil;  carbon  inputs  which  may  lead  to  longer-­‐term  

vi    

soil  carbon  retention  than  aboveground  litter  inputs  (Gill  and  Burke,  2002).  This  decreased  belowground  carbon  allocation  also  has  profound  effects  on  mycorrhizal  relations.  

Understanding  how  nitrogen  deposition  and  elevated  atmospheric  CO2  concentrations  will  affect  forest  productivity  and  soil  carbon  storage  is  essential  to  predicting  how  future  anthropogenic  emissions  of  carbon  will  affect  the  Earth’s  climate.  At  present,  an  amount  of  carbon  equivalent  to  600  %  of  our  annual  CO2  emissions  is  taken  up  by  the  planet’s  terrestrial  biota  each  year,  the  majority  in  forests  (Lal,  2008).  Even  small  increases  in  forest  productivity  could  be  a  major  negative  feedback  to  greenhouse  gas-­‐induced  climate  change.  There  is  five  times  as  much  carbon  stored  in  soils  as  there  is  in  living  plant  biomass,  a  change  of  just  1  %  in  soil  carbon  pools  is  equal  to  3  years  of  anthropogenic  carbon  emissions  (Lal,  2008).  There  is  a  wide  variety  of  effects  of  anthropogenic  emissions  of  N  and  C  that  may  affect  these  huge  stocks  of  soil  carbon,  with  the  net  effect,  increase  or  decrease,  very  much  unclear.    

Ectomycorrhizal  communities  may  play  a  major  role  in  determining  how  forest  productivity  and  soil  carbon  stocks  are  affected  by  anthropogenic  carbon  and  nitrogen  emissions.  Elevated  CO2  has  been  found  to  alter  ectomycorrhizal  community  composition  (Parrent  and  Vilgalys,  2007)  and  increase  mycorrhizal  colonization  (Alberton  et  al.,  2005).  Anthropogenic  nitrogen  pollution  has  been  found  to  alter  ectomycorrhizal  community  composition  (Wallenda  and  Kottke,  1998  and  references  therein),  decrease  ECM  diversity  (Lilleskov  et  al.,  2002)  and  decrease  colonization  intensity  (ECM  biomass  per  unit  root  biomass)  (Treseder  et  al.,  2004).  The  potential  loss  of  ECM  species  from  nitrogen  deposition  reduces  forest  biodiversity  and  may  represent  a  reduction  in  forests’  resiliency  to  future  environmental  change.  ECM  represent  a  very  large  sink  for  fixed  carbon;  studies  have  found  more  than  60%  of  recent  carbon  assimilation  (Rosling  et  al  2004)  and  net  primary  production  (Godbold  et  al.,  2006)  may  be  allocated  to  ectomycorrhizal  symbionts,  though  most  estimates  are  closer  to  15%  (Hobbie,  2006).  Ectomycorrhizal  biomass  may  be  much  more  recalcitrant  than  fine  root  biomass  (Langley  et  al.,  2006).  Reductions  in  C  allocation  to  ECM  may  significantly  reduce  soil  C  storage  and  serve  as  a  positive  feedback  to  global  change.  The  reductions  in  carbon  allocation  to  ectomycorrhizae  observed  under  nitrogen  limitation  may  continue  as  more  N  deposition  occurs  or  may  level  off  as  other  nutrients  become  limiting  to  forest  growth.  The  increase  in  belowground  carbon  allocation  observed  with  elevated  CO2  may  continue  as  global  CO2  levels  increase,  or  may  level  off  or  reverse  if  plants  become  sufficiently  nutrient  limited  that  carbon  fixation  rates  are  reduced.     If  ectomycorrhizal  community  shifts  observed  under  elevated  CO2  and  nitrogen  inputs  represent  a  shift  towards  ectomycorrhizal  species  that  are  better  able  to  provide  the  nutrients  most  limiting  to  plant  growth,  then  forests  may  likely  adapt  to  their  shifting  nutrient  demands  and  continue  to  increase  in  productivity  in  response  to  increasing  CO2  levels  and  nitrogen  deposition.  If,  on  the  other  hand,  these  shifts  in  community  composition,  and  reductions  in  mycorrhizal  colonization  reflect  temperate  and  boreal  forests’  adaptation  to  limitation  by  nitrogen  and  only  nitrogen,  then  increasing  amounts  of  forest  may  experience  reduced  productivity  in  response  to  continued  nitrogen  deposition  and  the  fertilization  effect  from  CO2  enrichment  will  likely  decrease  as  forests  become  more  severely  nutrient  limited.  My  dissertation  attempts  to  shed  light  on  which  

vii    

of  these  two  scenarios  is  likely  to  unfold  over  the  coming  decades  of  continued  anthropogenic  global  change.  

In  chapter  one,  I  investigated  the  effects  of  nitrogen  addition  on  ectomycorrhizal  community  composition  and  colonization  in  a  deciduous  forest.  Very  high  levels  of  nitrogen  fertilization  significantly  changed  ectomycorrhizal  community  composition,  decreased  ectomycorrhizal  diversity,  and  shifted  the  ectomycorrhizal  distribution  more  towards  the  mineral  soil.  These  results  suggest  that  the  ectomycorrhizal  community  may  be  shifting  to  meet  the  changing  nutrient  demands  of  the  forest  and  outline  a  potential  mechanism  for  increased  soil  carbon  storage  under  anthropogenic  nitrogen  deposition.  Based  on  the  high  fungal  diversity  found  in  the  mineral  soil,  and  the  fact  that  the  ectomycorrhizal  abundance  in  the  mineral  soil  increased  in  response  to  nitrogen  deposition  I  decided  to  investigate  how  the  heterogeneous  distribution  of  nutrients  in  mineral  soil  determines  fungal  species  distribution.  In  chapter  two,  I  tried  to  assess  which  soil  properties  determine  fungal  species  distribution.  Our  sampling  design  prevented  us  from  assessing  the  role  of  some  of  the  chemical  properties  examined,  but  carbon  content  and  depth  emerged  as  the  most  influential  soil  properties  determining  fungal  community  composition.  Calcium  content  also  appeared  to  be  important  in  determining  fungal  community  composition.    

While  pure  culture  studies  have  shown  that  ectomycorrhizal  fungi  vary  in  their  ability  to  stimulate  mineral  weathering  and  take  up  mineral  nutrients,  the  observed  species  shifts  in  ectomycorrhizal  communities  can  only  reflect  shifting  nutrient  demands  from  host  plants  if  plants  can  allocate  carbon  to  the  mycorrhizal  fungi  that  are  providing  the  most  mineral  nutrients.  In  Chapter  3,  I  present  a  literature  review  on  the  current  state  of  knowledge  on  how  plant  nutrient  demand  drives  fungal  weathering.  Within  the  plant  physiology  literature  there  is  evidence  that  plants  may  be  able  to  respond  to  phosphorous  and  potassium  limitation  with  increased  carbon  allocation  to  mycorrhizal  fungi  providing  those  nutrients.  Magnesium  limitation  reduces  belowground  carbon  allocation,  and  the  effects  of  calcium  limitation  on  carbon  allocation  are  unclear.  In  studies  of  ectomycorrhizal  weathering  there  is  a  distinct  lack  of  explicit  testing  of  the  role  of  host  nutrient  status  in  driving  fungal  weathering.  I  conclude  by  making  a  number  of  recommendations  for  how  future  studies  can  address  this  important  question.  For  the  fourth  chapter  of  this  dissertation  I  investigated  how  elevated  CO2  affects  plant  growth,  biotic  weathering,  and  organic  acid  exudation,  as  well  as  the  roles  of  plants,  their  ectomycorrhizal  symbionts,  and  organic  acids  in  stimulating  mineral  weathering.  Elevated  CO2  increased  plant  growth  but  did  not  increase  mineral  weathering.  Pine  seedlings  but  not  ectomycorrhizae  significantly  increased  mineral  weathering,  though  there  was  some  indication  that  one  of  the  two  ectomycorrhizal  species  examined,  Piloderma  fallax,  may  have  stimulated  mineral  weathering.  These  results  do  not  support  the  hypothesis  that  increased  nutrient  demand  by  plants,  caused  by  increased  CO2  availability,  will  stimulate  weathering,  though  our  system’s  departures  from  forest  soil  conditions  hamper  our  ability  to  directly  relate  our  results  to  processes  in  forested  ecosystems.    

In  my  doctoral  research  I  set  out  to  determine  whether  the  ecological,  chemical,  and  physiological  nature  of  the  ectomycorrhizal  symbiosis  will  allow  for  ectomycorrhizal  communities  to  shift  their  functioning  in  accordance  with  the  changing  nutrient  demands  

viii    

of  forests  experiencing  global  change.  My  research  indicates  that  ectomycorrhizal  communities  may  shift  to  accommodate  the  shifting  nutrient  demands  of  forest  undergoing  sustained  heavy  nitrogen  deposition,  but  failed  to  find  an  effect  of  elevated  CO2  on  mycorrhizal  fungi  or  biotic  weathering.  I  also  identified  a  number  of  ways  in  which  future  studies  could  address  these  questions  in  a  more  targeted,  verifiable  manner.              References  Cited      Abuzinadah  RA,  Finlay  RD,  Read  D.  1986.  The  role  of  proteins  in  the  nitrogen  nutrition  of  ectomycorrhizal  plants.  II  Utilization  of  proteins  by  mycorrhizal    plants  of  Pinus  contorta.  New  Phytologist  103:  495-­‐506.    Ainsworth  EA,  Long  SP.  2005.  What  have  we  learned  from  15  years  of  free-­‐air  CO2  enrichment  (FACE)?  A  meta-­‐analytic  review  of  the  responses  of  photosynthesis,  canopy  properties  and  plant  production  to  rising  CO2.  New  Phytologist  165:  351–372.    Alberton  O,  Kuyper  TW,    Gorissen  A.  2005.  Taking  mycocentrism  seriously:  mycorrhizal  fungal  and  plant  responses  to  elevated  CO2.  New  Phytologist  167:859-­‐868.    Bruns  TD.  1995.  Thoughts  on  the  processes  that  maintain  local  species-­‐diversity  of  ectomycorrhizal  fungi.  Plant  and  Soil  170:  63-­‐73.    Buscot  F,  Weber  G,  Oberwinkler  F.  1992.  Interactions  between  Cylindricarpon-­destructans  and  ectomycorrhizas  of  Picea  abies  with  Laccaris  laccata  and  Paxillus  involutus.  Trees-­‐Structure  and  Function  6:83-­‐90.    Cleland  EE,  Harpole  WS.  2010.  Nitrogen  enrichment  and  plant  communities.  Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences  1195:46  -­‐61.    Dickie  IA,  Xu  B,  Koide  RT.  2002.  Vertical  niche  differentiation  of  ectomycorrhizal  hyphae  in  soil  as  shown  by  T-­‐RFLP  analysis.  New  Phytologist  156:  527–535.    Driscoll  CT,  Whitall  D,  Aber  J,  Boyer  E,  Castro  M,  Cronan  C,  Goodale  C,  Groffman  P,    Hopkinson  C,  Lambert  K,  Lawrence  G,  Ollinger  S.  2003.  Nitrogen  pollution  in  the  northeastern  United  States:  sources,  effects,  and  management  options.  Bioscience  53:  357–  374.    

ix    

Ekblad  A,  Wallander  H,  Carlsson  R,  Huss-­‐Danell  K.  1995.  Fungal  biomass  in  roots  and  extraradical  mycelium  in  relation  to  macronutrients  and  plant  biomass  of  ectomycorrhizal  Pinus  sylvestris  and  Alnus  incana.  New  Phytologist  131:443-­‐451.    Ericsson  T.  1995.  Growth  and  shoot:  root  ratio  of  seedlings  in  relation  to  nutrient  availability.  Plant  and  Soil  168-­‐169:205-­‐214.    Galloway  JN,  Dentener  FJ,  Capone  DG,  Boyer  EW,  Howarth  RW,  Seitzinger  SP,  Asner  GP,  Cleveland  CC,  Green  PA,  Holland  EA,  Karl  DM,  Michaels  AF,  Porter  JH,  Townsend  AR,  Vorosmarty  CJ.  2004.  Nitrogen  cycles:  past,  present,  and  future.  Biogeochemistry  70:153-­‐226.    Gill  RA,  Burke  IC.  2002.  Influence  of  soil  depth  on  the  decomposition  of  Bouteloua  gracilis  roots  in  the  shortgrass  steppe.  Plant  and  Soil  241:  233–242.    Gleeson  SK,  Good  RE.  2003.  Root  allocation  and  multiple  nutrient  limitation  in  the  New  Jersey  Pinelands.  Ecology  Letters  6:  220–227.    Godbold  DL,  Hoosebeek  MR,  Lukac  M,  Cotrufo  MF,  Janssens  IA,  Ceulemans  R,  Polle  A,  Velthorst  EJ,  Scarascia-­‐Mugnozza  G,  De  Angelis  P,  Miglietta  F,  Peressotti  A.  2006.  Mycorrhizal  hyphal  turnover  as  a  dominant  process  for  carbon  input  into  soil  organic  matter.  Plant  and  Soil  281:15-­‐24.    Gradowski  T,  Thomas  SC.  2006.  Phosphorus  limitation  of  sugar  maple  growth  in  central  Ontario.  Forest  Ecology  and  Management  226:104–109.    Hobbie  EA.  2006.  Carbon  allocation  to  ectomycorrhizal  fungi  correlates  with  belowground  allocation  in  culture  studies.  Ecology  87:563-­‐569.    Hobbie  EA,  Colpaert  JV.  2003.  Nitrogen  availability  and  colonization  by  mycorrhizal  fungi  correlate  with  nitrogen  isotope  patterns  in  plants.  New  Phytologist  157:115-­‐126.      Iversen  CM.  2010.  Digging  deeper:  fine-­‐root  responses  to  rising  atmospheric  CO2  concentration  in  forested  ecosystems.  New  Phytologist  186:  346–357.    Janssens  IA,  Dieleman  W,  Luyssaert  S,  Subke  JA,  Reichstein  M,  Ceulemans  R,  Ciais  P,  Dolman  AJ,  Grace  J,  Matteucci  G,  Papale  D,  Piao  SL,  Schulze  ED,  Tang  J,  Law  BE.  2010.  Reduction  of  forest  soil  respiration  in  response  to  nitrogen  deposition.  Nature  Geoscience  3:315-­‐322.    Jentschke  G,  Brandes  B,  Kuhn  AJ,  Schröder  WH,  Becker  JS,  Godbold  DL.  2000.  The  mycorrhizal  fungus  Paxillus  involutus  transports  magnesium  to  Norway  spruce  seedlings.  Evidence  from  stable  isotope  labeling.  Plant  and  Soil  220:243–246.    Jentschke  G,  Godbold  DL,  Brandes  B.  2001.  Nitrogen  limitation  in  mycorrhizal  Norway  

x    

spruce  (Picea  abies)  seedlings  induced  mycelial  foraging  for  ammonium:  implications  for  Ca  and  Mg  uptake.  Plant  and  Soil  234:109–117.    Lal  R.  2008.  Sequestration  of  atmospheric  CO2  in  global  carbon  pools.  Energy  and  Environmental  Science  1:  86–100.    Landeweert  R,  Hoffland  E,  Finlay  RD,  Kuyper  TW,  van  Breemen  N,  2001.  Linking  plants  to  rocks:  ectomycorrhizal  fungi  mobilize  nutrients  from  minerals.  Trends  in  Ecology  and  Evolution  16:  248-­‐254.          Langley  JA,  Chapman  SK,  Hungate  BA.  2006.  Ectomycorrhizal  colonization  slows  root  decomposition:  the  post-­‐mortem  fungal  legacy.  Ecology  Letters  9:  955–959.    Lilleskov  EA,  Fahey  TJ,  Horton  TR,  Lovett  GM.  2002.  Below-­‐ground  ectomycorrhizal  fungal  community  change  over  a   nitrogen  deposition  gradient  in  Alaska.  Ecology  83:104-­‐115.    Long  RP,  Horsley  SB,  Hallett  RA.  2009.  Sugar  Maple  growth  in  relation  to  nutrition  and  stress  in  the  northeastern  United  States.  Ecological  Applications  19:1454-­‐1466.    Muhsin  TM,  Zwiazek  JJ.  2002.  Ectomycorrhizas  increase  apoplastic  water  transport  and  root  hydraulic  conductivity  in  Ulmus  americana  seedlings.  New  Phytologist  153:153-­‐158.    Parrent  JL,  Vilgalys  R.  2007.  Biomass  and  compositional  responses  of  ectomycorrhizal  fungal  hyphae  to  elevated  CO2  and  nitrogen  fertilization.  New  Phytologist  176:  164–174.    Pinkard  EA,  Beadle  CL,  Mendham  DS,  Carter  J,  Glen  M.  2010.  Determining  photosynthetic  responses  of  forest  species  to  elevated  [CO2]:  Alternatives  to  FACE.  Forest  Ecology  and  Management  260:1251–1261.    Pregitzer  K  S,  Burton  AJ,  Zak  DR,  Talhelm  AF.  2008.  Simulated  chronic  nitrogen  deposition  increases  carbon  storage  in  northern  temperate  forests.  Global  Change  Biology  14:142–153.    Rosling  A,  Lindahl  BD,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2004.  Mycelial  growth  and  substrate  acidification  of  ectomycorrhizal  fungi  in  response  to  different  minerals.  FEMS  Microbiology  Ecology  47:31-­‐37.    Rosling  A,  Landeweert  R,  Lindahl  BD,  Larsson  KH,  Kuyper  TW,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2003.  Vertical  distribution  of  ectomycorrhizal  fungal  taxa  in  a  podzol  soil  profile  New  Phytologist  159:  775–783.    Smith  SE,  Read  DJ.  2008.  Mycorrhizal  Symbiosis:  3rd  Edition.  London:  Academic  Press.  787  p.    

xi    

Taylor  DL,  Herriott  IC,  Stone  KE,  McFarland  JW,  Booth  MG,  Leigh  MB.  2010.  Structure  and  resilience  of  fungal  communities  in  Alaskan  boreal  forest  soils.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  40:  1288–1301.    Treseder  KK.  2004.  A  meta-­‐analysis  of  mycorrhizal  responses  to  nitrogen,  phosphorus,  and  atmospheric  CO2  in  field  studies.  New  Phytologist  164:347-­‐355.    van  Scholl  L,  Smits  MM,  Hoffland  E.  2006.  Ectomycorrhizal  weathering  of  the  soil  minerals  muscovite  and  hornblende.  New  Phytologist  171:805-­‐814.    Vitousek  PM,  Aber  JD,  Howarth  RW,  Likens  GE,  Matson  PA,  Schindler  DW,  Schlesinger  WH,  Tilman  DG.  1997.  Human  alterations  of  the  global  nitrogen  cycle:  Sources  and  Consequences.  Ecological  Applications  7:737–750.      Wallenda  T,  Kottke  I.  1998.  Nitrogen  depositon  and  ectomycorrhizas.  New  Phytologist  139:169-­‐18

1    

 Chapter  1  

 Long-­‐term  additions  of  nitrogen  have  altered  ectomycorrhizal  community  composition  and  abundance  in  a  temperate  deciduous  forest.        Abstract  

Studies  have  found  that  prolonged  additions  of  nitrogen  to  temperate  forests  have  profound  effects  on  the  ectomycorrhizal  community  composition.  Most  studies  note  decreased  diversity  and  altered  community  composition,  and  some  have  found  decreased  ectomycorrhizal  abundance.  Few  of  these  studies  have  been  performed  in  deciduous  forests  and  only  one  has  looked  at  the  effects  of  nitrogen  addition  on  the  ectomycorrhizal  community  in  different  soil  layers.  We  sampled  the  ectomycorrhizal  community  in  a  mixed  species  oak-­‐dominated  deciduous  forest  at  the  Harvard  Forest  Long-­‐Term  Ecological  Research  Chronic  Nitrogen  Enrichment  site  in  the  Northeast  US.  These  plots  have  undergone  18  years  of  NH4NO3  additions  at  high  (150  kg  N/ha/  yr)  and  low  (50  kg  N/ha/  yr)  levels.  We  used  soil  cores  to  sample  the  ECM  community  in  the  organic  and  mineral  horizons  in  the  control,  low  N,  and  high  N  plots.  Individual  root  tips  were  sequenced  with  Sanger  sequencing.  First  and  second  order  roots  were  collected  for  ectomycorrhizal  abundance  measurements.    

A  total  of  1806  ectomycorrhizal  root-­‐tips  were  sequenced  to  yield  495  ectomycorrhizal  sequences  representing  65  ectomycorrhizal  fungal  species  (based  on  97%  sequence  similarity  in  the  ITS  region).  Ectomycorrhizal  community  composition  was  significantly  different  and  diversity  significantly  lower  in  the  high  N  treatment.  Neither  diversity  nor  community  composition  were  significantly  different  between  the  low  N  and  control  treatments.  The  ectomycorrhizal  communities  were  significantly  different  in  the  organic  and  mineral  soil  and  diversity  was  higher  in  the  mineral  soil.  Ectomycorrhizal  abundance  was  not  significantly  different  between  any  horizons  or  N  addition  levels  except  for  the  high  N  mineral  horizon,  which  had  significantly  higher  ectomycorrhizal  abundance.  We  could  not  detect  an  interactive  effect  of  nitrogen  and  horizon  on  community  composition.  While  certain  species  exhibited  clear  nitrophillic  (Lactarius  quietus,  Russula  atropurpurea,  Amanita  sp.  1,  Lactarius  sp.  1)  or  nitrophobic  (Cenococcum  geophilum,  Tomentella  sp.  1,  Russula  sp.  1,  Tricholoma  aff.  sejunctum)  reactions  to  nitrogen  addition,  these  affinities  do  not  seem  to  be  generalizable  to  genus  or  family.  Distinct  horizon  preferences  were  found  for  species,  genera,  and  families.  We  suggest  that  our  results  indicate  a  possible  adaptation  to  increased  nutrient  demand  for  phosphorous  and/or  base  cations.        

2    

Introduction  Anthropogenic  nitrogen  pollution  is  a  global  problem  that  threatens  the  ecological  

integrity  of  many  terrestrial  and  aquatic  ecosystems.  Anthropogenic  nitrogen  pollution  (ANP)  from  energy  generation,  transport,  and  agriculture  has  more  than  doubled  the  inputs  of  nitrogen  to  terrestrial  ecosystems  (Vitousek  et  al.,  1997).  Emissions  of  the  other  major  component  of  acid  rain,  sulfur,  were  successfully  reduced  in  the  early  1990’s  and  public  attention  to  acid  rain  has  since  diminished  greatly.  Anthropogenic  nitrogen  pollution  however,  has  either  remained  steady  or  increased  somewhat  in  the  developed  world,  and  has  risen  sharply,  and  is  predicted  to  rise  even  more  sharply  in  the  21st  century  in  the  developing  world  (Galloway  et  al.,  2004).  Nitrogen  pollution  from  agriculture  either  leaches  into  streams,  lakes,  and  groundwater  as  nitrate  or  volatilizes  off  of  fields  and  manure  deposits  to  return  to  the  earth  in  the  form  of  ammonium.  Nitrogen  put  into  the  atmosphere  by  transport  and  energy  generation  returns  to  earth  as  HNO3  and  can  fall  as  wet  or  dry  deposition  many  hundreds  of  miles  from  pollution  sources.  As  a  result  of  both  these  processes,  but  primarily  due  to  the  more  far  reaching  HNO3  (Driscoll  et  al.,  2003),  large  forested  regions  are  receiving  inputs  of  HNO3  that  threaten  to  dramatically  alter  their  ecology  and  species  composition  (Gilliam_2006),  and,  when  prolonged  severe  deposition  occurs,  reduce  their  productivity  (Fenn  et  al,  2006).         Ectomycorrhizal  fungi  are  essential  to  forest  health  and  are  particularly  important  to  the  nitrogen  nutrition  of  temperate  and  boreal  forests.  They  form  intimate  associations  with  tree  roots,  providing  the  roots  with  nutrients  and  receiving  fixed  carbon  from  their  plant  hosts.  Ectomycorrhizae  form  symbiosis  with  less  than  3%  of  the  world’s  plant  species  but  with  many  of  the  dominant  trees  of  temperate  and  boreal  forests,  particularly  the  plant  families  Pinaceae  and  Fagaceae,  (Smith  and  Read,  2008).  Ectomycorrhizal  communities  are  species  rich,  with  well  over  a  hundred  ECM  species  having  been  documented  in  monodominant  forests  (Parrent  and  Vilgalys,  2007;  Taylor  et  al,  2010),  and  dozens  or  more  on  individual  trees  (Bruns,  1995).  Ecomycorrhizae  have  been  shown  to  transfer  significant  amounts  of  P  (Ekblad  et  al.,  1996),  Mg  (Jentschke  et  al.,  2000),  Ca  (Jentschke  et  al.,  2001),  and  K  (van  Scholl  et  al.,  2006)  to  their  plant  hosts,  but  their  provision  of  nitrogen  is  generally  considered  their  primary  contribution  to  plant  health.    Studies  have  shown  that  ECM  may  provide  up  to  80%  of  a  host  plant’s  total  N  uptake  (Hobbie  and  Colpaert,  2003).  The  extraradical  mycelia  of  ECM  greatly  increase  the  volume  of  soil  that  roots  can  exploit  (Smith  and  Read,  2008).  Through  the  use  of  a  diverse  suite  of  enzymes  ECM  may  be  able  to  solubilize  and  take  up  nitrogen  from  organic  N  pools  that  roots  cannot  utilize  (Abuzinadah  and  Read,  1986).  

Anthropogenic  nitrogen  pollution  threatens  to  alter  the  productivity  and  carbon  storage  of  temperate  and  boreal  forests.  Soil  nitrogen  status  is,  for  temperate  and  boreal  forests,  the  dominant  edaphic  factor  controlling  forest  productivity  and  shaping  species  composition  (Cleland  and  Harpole,  2010).  Anthropogenic  nitrogen  pollution  (ANP)  has  facilitated  invasive  species  establishment  in  many  forests  of  the  temperate  and  boreal  zone,  and  contributed  to  widespread  species  loss  (Gilliam_2006;  Cleland  and  Harpole,  2010).  There  is  ample  evidence  that  moderate  levels  of  ANP  may  significantly  increase  the  net  primary  productivity  of  temperate  forests  (Pregitzer  et  al.,  2008;  Janssens  et  al.,  2010).  Beyond  a  certain  amount  of  accumulated  ANP  forest  productivity  may  drop  sharply.  This  is  the  core  of  the  “nitrogen  saturation  hypothesis”  developed  by  Aber  et  al.  

3    

(1998),  and  it  is  used  by  many  as  a  theoretical  framework  to  understand  the  ecological  processes  at  work  over  the  course  of  prolonged  periods  of  ANP  (Fenn  et  al.,  1998;  Fenn  et  al.,  2006;  Vadeboncoeur,  2010).  According  to  the  Nitrogen  Saturation  Hypothesis,  the  tipping  point  and  proceeding  drop  in  forest  productivity  is  a  result  of  soil  acidification,  and  excess  N  inputs  leaching  out  other  essential  nutrients,  which  then  become  limiting.  This  shift  from  nitrogen  limitation  to  limitation  or  co-­‐limitation  by  phosphorous  (Gradowski  and  Thomas,  2006),  potassium  (Gleeson  and  Good,  2003),  or  calcium  (Long  et  al.,  2009;  Baribault  et  al.,  2010)  due  to  prolonged  ANP  has  already  been  observed  in  a  number  of  forests  in  Eastern  North  America.    Increased  nitrogen  availability  decreases  belowground  carbon  allocation  (Ekblad  et  al.,  1996;  Ericsson,  1995;  Magill,  2004).  Decreased  belowground  carbon  allocation  involves  decreased  inputs  of  carbon  into  deep  soil;  carbon  inputs  which  may  lead  to  longer-­‐term  soil  carbon  retention  than  aboveground  litter  (Gill  and  Burke,  2002).  This  decreased  belowground  carbon  allocation  also  has  profound  effects  on  mycorrhizal  relations.     Anthropogenic  nitrogen  pollution  has  been  shown  in  fertilization  and  deposition  gradient  studies  to  have  large  impacts  on  ectomycorrhizal  communities.    N  fertilization  and  deposition  is  commonly  associated  with  a  shift  in  ECM  species  composition  with  some  species  increasing  in  abundance  while  others  disappear  under  high  N  fertilization  or  deposition  (Wallenda  and  Kottke,  1998  and  references  therein;  Avis  et  al.,  2008;  Lucas  and  Caspar,  2008).  Many  studies  have  also  observed  a  decrease  in  both  ECM  diversity  (Lilleskov  et  al.,  2002;  Avis  et  al.,  2008;  Lucas  and  Caspar,  2008)  and  colonization  intensity  (ECM  biomass  per  unit  root  biomass)  (Treseder  et  al.,  2004;  Wölllecke  et  al.,  1999)  with  nitrogen  additions.  

  The  effects  of  ANP  on  ectomycorrhizal  communities  may  have  serious  negative  implications  for  ecosystem  integrity.  Our  knowledge  of  the  respective  ecological  niches  of  ECM  fungi  is  poor,  but  there  is  ample  evidence  that  suggests  discreet,  non-­‐overlapping  niches  of  habitat  preference  (Rosling  et  al.,  2003,  Dickie  et  al.,  2002)  and  nutrient  acquisition  (van  Scholl  et  al.,  2006;  Abuzinadah  and  Read,  1996)  exist  for  some  species.  The  potential  loss  of  ECM  species  from  nitrogen  deposition  reduces  forest  biodiversity  and  may  represent  a  reduction  in  forests’  resiliency  to  future  environmental  change.  ECM  represent  a  very  large  sink  for  fixed  carbon;  studies  have  found  more  than  60%  of  recent  carbon  assimilation  (Rosling  et  al  2004)  and  net  primary  production  (Godbold  et  al.,  2006)  may  be  allocated  to  ectomycorrhizal  symbionts,  though  most  estimates  are  closer  to  15%  (Hobbie,  2006).  Ectomycorrhizal  biomass  may  be  much  more  recalcitrant  than  fine  root  biomass  (Langley  et  al.,  2006).  Reductions  in  C  allocation  to  ECM  may  significantly  reduce  soil  C  storage  and  serve  as  a  positive  feedback  to  global  change.     The  great  majority  of  studies  on  nitrogen  fertilization  and  ECM  have  been  conducted  in  conifer  stands  and  have  focused  on  the  organic  horizon,  yet  there  is  evidence  that  forests  dominated  by  broad-­‐leafed  angiosperms  may  react  differently  than  coniferous  gymnosperms  to  ANP  (Aber  et  al.,  1998;  Fenn  et  al.,  1998).  Very  few  studies  examining  the  effects  of  ANP  on  ECM  communities  or  even  on  ECM  communities  for  any  purpose  have  looked  at  the  ECM  community  in  the  mineral  soil.  Over  half  of  all  ECM  biomass  may  be  in  the  mineral  soil  (Rosling  et  al.,  2003;  Scattolin  et  al,  2008)  and  ECM  

4    

community  composition  varies  significantly  with  soil  horizon  (Dicke  et  al.,  2002;  Rosling  et  al.,  2003).  

To  examine  the  effect  of  N  enrichment  in  broad-­‐leaved  forests  and  in  mineral  and  organic  horizons  we  investigated  the  ECM  community  in  a  mixed  broad-­‐leaved  forest  at  the  Harvard  Forest  Chronic  N  Enrichment  research  site.  This  National  Science  Foundation-­‐sponsored  Long  Term  Ecological  Research  facility  is  the  longest  running  nitrogen  fertilization  study  in  the  US.      Methods  Study  Site  The  study  was  conducted  in  the  hardwood  stand  at  the  Harvard  Forest  Chronic  Nitrogen  Enrichment  site.  This  is  a  National  Science  Foundation  sponsored  Long-­‐Term-­‐Ecological  -­‐Research  study  that  commenced  in  1988  to  investigate  the  effects  of  nitrogen  addition  on  forests.  The  Harvard  Forest  is  located  in  central  Massachusetts  (42o30’N,  72o10’W).  Mean  monthly  temperatures  range  from  19oC  in  July  to  -­‐12oC  in  January.  Average  annual  precipitation  is  112  cm  and  is  distributed  evenly  throughout  the  year.  Atmospheric  nitrogen  deposition  is  approximately  8  kg/ha/yr.  The  hardwood  stand  is  dominated  by  red  (Quercus  rubra)  and  black  oak  (Quercus  velutina)  (approximately  50%)  with  lesser  amounts  of  black  birch  (Betula  lenta),  red  maple  (Acer  rubra),  american  beech  (Fagus  gransifolia)  and  white  birch  (Betula  alba),  and  is  approximately  60-­‐100  years  old.  The  soils  are  stony  to  sandy  loams  classified  as  Typic  Dystrochrepts.  More  detail  about  the  soils,  climate,  and  stand  history  can  be  obtained  from  Magill  et  al.  (2004).  

In  1988,  Three  30m  X  30m  plots  were  established,  which  were  each  further  divided  into  36  5m  X  5m  subplots.  Since  1988,  the  low  N  and  high  N  plots  have  received  50  kg  N/ha/yr  and  150  kg  N/ha/yr,  respectively,  divided  evenly  amongst  6  applications  at  4  week  intervals  by  backpack  sprayer  from  May  through  September.  The  interior  16  subplots  are  used  for  analysis,  and  the  perimeter  20  subplots  are  not.  More  detail  about  the  nitrogen  addition  treatment  can  be  obtained  from  Magill  et  al.  (2004).      Sample  collection  and  processing  Ectomycorrhizal  sampling  was  performed  in  July,  2005.  We  randomly  selected  4  5m  X  5m  subplots  from  the  interior  16  subplots.  We  used  30cm  (depth)  X  2.5cm  (interior  diameter)  PVC  pipe  to  collect  soil  cores.  We  sampled  4  subplots  from  each  of  the  control,  low  N  addition,  and  high  N  addition  hardwood  plots  (3  plots,  12  subplots  total).  Six  cores  were  taken  from  each  subplot.  Each  core  was  processed  on  the  same  day  it  was  collected  from  the  forest.  Because  sampling  was  conducted  over  the  course  of  a  month  during  which  time  rooting  dynamics  may  change,  sample  collection  was  divided  evenly  between  different  subplots  and  nitrogen  treatments  over  time.  

Each  core  was  divided  into  organic  and  mineral  soil.  There  was  typically  a  distinct  border  between  the  organic  horizon  and  mineral  horizon,  and  to  prevent  any  cross-­‐contamination  0.5-­‐2  cm  of  soil  at  the  interface  between  the  cores  was  not  kept.  While  the  depth  of  the  organic  horizon  varied  somewhat,  the  organic  horizon  was  generally  around  5  cm  thick,  and  the  mineral  horizon  we  sampled  25cm.  After  each  core  was  divided,  each  portion  of  the  core  was  washed  over  a  2mm  sieve  with  distilled  water.  Fine  roots  were  

5    

then  collected  and  put  into  a  petri  dish  filled  with  water  for  ectomycorrhizal  root  tip  sampling  and  quantification.  

Roots  were  examined  under  a  dissecting  microscope  and  roots  that  were  not  turgid  or  that  appeared  senescent  were  removed,  as  were  any  roots  that  were  higher  than  second  branching  order.  Any  roots  that  appeared  to  be  red  maple  were  also  removed.    Red  maple  associates  with  arbuscular  mycorrhizal  fungi,  not  the  ectomycorrhizal  fungi  that  this  study  focused  on.  Fortunately,  red  maple  roots  are  quite  morphologically  distinct  as  they  have  a  much  lighter  color  and  a  unique  beaded  morphology  that  makes  them  easy  to  distinguish  form  the  ectomycorrhizal  roots.  The  live,  ectomycorrhizal  fine  roots  from  each  core  were  placed  in  a  water-­‐filled  petri  dish  for  community  characterization  and  quantification.  A  subset  of  all  samples  (3  cores  /subplot)  was  examined  for  percentage  root  length  colonized  before  they  were  assessed  for  community  composition.  Petri  dishes  (10cm  diameter)  were  placed  over  a  piece  of  transparency  paper  with  a  black  grid.  The  dish  was  illuminated  from  underneath  and  the  roots  were  examined  under  a  dissection  microscope  at  low  magnification.  Each  line  of  the  grid  was  followed  visually  and  every  intersection  with  a  root  was  recorded  as  either  mycorrhizal  if  the  grid  intersected  the  root  at  an  ectomycorrhizal  root  tip  or  non-­‐mycorrhizal  if  the  grid  intersected  the  root  at  a  point  on  the  root  that  was  not  an  ectomycorrhiza.  If  the  grid  crossed  a  coralloid  cluster  of  mycorrhizae  each  discrete  intersection  of  the  line  with  a  seprate  branchlet  of  the  cluster  was  counted.  All  gridlines,  vertical  and  horizontal  were  counted  for  each  dish  (20  lines  in  all)  and  then  the  grid  was  rotated,  the  roots  were  mixed  and  the  count  was  done  again.  For  each  sample  5  counts  were  done,  and  the  percentage  root  length  colonized  (%  RLC)  for  each  sample  was  calculated  as  the  average  amount  of  total  mycorrhizal  intersections/divided  by  the  average  amount  of  total  root  intersections.    

Either  following  quantification,  or  immediately  after  washing  and  sorting,  14  root  tips  were  randomly  selected  from  each  horizon  from  each  core  (+1  sample  control  with  no  root  tip)  and  placed  in  300uL  2X  CTAB  buffer  (100mM  Tris-­‐HCl(pH  8.0),  1.4  M  NaCl,  20mM  EDTA,  2%  CTAB,  0.2%  β-­‐mercapto-­‐ethanol)  and  immediately  frozen  for  later  extraction  and  sequencing.  In  all,  2,160  ectomycorrhizal  samples  were  collected  [3  Plots  X  4  Subplots  X  6  cores  X  2  horizons  X  15  tips  (14  +  1  control)  =  2160  tips  collected].    Molecular  analysis  DNA  from  root  tips  was  extracted  by  chloroform/isopropanol/ethanol  precipitation  as  per  Gardes  and  Bruns  (1993).  The  ITS  region  was  selected  for  sequencing,  and  PCR  amplification  was  done  with  the  primer  pair  ITS  1F  (Gardes  and  Bruns  1993)  and  ITS  4  (White  et  al.,  1990).  The  ITS  region  is  the  most  commonly  sequenced  region  for  fungal  identification  and  has  a  large  database  of  vouchered  sequences.  Its  high  variability  makes  it  a  suitable  region  for  species  identification  (Horton  and  Bruns,  2001).    PCR  products  were  treated  with  ExoSAP  IT  (USB  Corp,  Cleveland,  OH,  USA)  to  remove  primers  and  inhibitory  salts.  PCR  amlicons  were  sequence  directly  without  cloning  using  ABI  Big  Dye  version  3.1  (Applied  Biosystems,  Foster  City,  CA,  USA)  and  pre  sequencing  cleanup  was  performed  with  the  ABI  recommended  ethanol/EDTA  precipitation.  Single  pass  sequencing  was  conducted  on  an  ABI  3100  16  capilary  Sanger-­‐sequencing  machine.  Sequences  were  analyzed  using  Sequencher  4.2  (Gene  Codes  Corp.,  Ann  Arbor,  MI,  USA).  Sequences  were  edited  to  remove  priming  sites  and  poor  quality  portions  of  the  

6    

sequences  at  the  3’  and  5’  ends.  Only  sequences  with  at  least  200  clear  distinct  base  pairs  were  used.  Many  were  disqualified  due  to  apparent  contamination  or  co-­‐occurrence  of  other  fungal  PCR-­‐product.  Acceptable  sequences  were  identified  by  comparison  with  the  sequence  database  at  the  National  Center  for  Bioscience  Informatics  (NCBI)  using  the  basic  local  alignment  search  tool  (BLAST)  to  identify  rough  phylogenetic  identity.  Sequences  were  then  grouped  according  to  these  approximate  phylogenetic  groupings  (typically  family)  and  clustered  using  Sequencher  4.2  with  a  minimum  overlap  of  50%  and  minimum  sequence  identity  of  97%.  High  quality  sequences  (long  sequences,  no  unclear  peaks)  were  then  selected  from  clusters  for  BLASTing  against  the  NCBI  database  again.  When  matches  at  97%  or  higher  were  found,  the  best  match  to  a  vouchered  sporocarp  sequence  was  used  as  the  taxa  name.  In  many  cases  no  match  at  97%  or  higher  for  a  vouchered  sporocarp  was  found  and  we  felt  that  we  could  only  reliably  identify  the  genus  of  these  taxa.  These  taxa  are  called  “genus”  sp.  “#”  (ex.  Russula  sp.  2).    Statistical  analysis  Diversity  was  assessed  using  the  chao1  estimate,  species  accumulation  curves  generated  by  analytical  rarefaction,  the  Shannon  index,  and  Simpson’s  index.  Rarefaction  analysis  was  performed  using  Analytic  Rarefaction  (Hunt  Mountain  Software,  2009.  Analytic  Rarefaction,  version  2.0).  The  Shannon  diversity  index  was  calculated  as  

 -­‐  ∑  pi  ln  (  pi  )  .      

The  Simpson  diversity  index  was  calculated  as  1  /    (∑  pi2)    

 Species  evenness  was  calculated  as  

 H  /  log(S)  .    Here  pi  is  the  proportion  of  total  number  of  species  made  up  of  the  ith  species,  H  is  the  shannon  index,  and  S  is  the  total  number  of  observed  species.     The  similarities  between  communities  were  assessed  with  ordination  methods  using  the  statistical  software  PC-­‐ORD  (MjM  Software  Design,  version  5.0,  Glene-­‐  den  Beach,  OR,  USA).  For  ordination,  each  community  consisted  of  all  successfully  identified  ectomycorrhizal  sequences  from  the  6  cores  taken  for  a  specific  horizon  in  a  specific  subplot  (24  communities  total).  The  communities  were  compared  across  nitrogen  treatments  (n  =  8/N  treatment)  or  between  soil  horizons  (n=  12  /  horizon).  Mantel  tests  were  independently  conducted  to  assess  whether  the  communities  in  different  horizons  or  nitrogen  treatments  were  significantly  different.  Differences  were  visualized  using  non-­‐parametric-­‐multi-­‐dimensional  scaling  (NMS).  NMS  is  a  suitable  method  for  comparing  complex  microbial  communities  because  it  does  not  assume  a  normalized  distribution  of  species  or  equivalent  variance  between  communities  (Clarke,  1993).  For  NMS  ordination  an  initial  run  was  performed  using  the  “medium  thoroughness”  default  settings  to  identify  the  optimum  dimensionality  of  the  ordination.  After  that,  the  ordination  was  performed  again  (Sorenson’s/Bray-­‐Curtis  distance  measure,  400  maximum  iterations,  0.00001  instability  criterion,  recommended  dimensionality,  100  real  runs  and  200  randomized  trials).  To  account  for  unequal  amounts  of  root  tips  between  

7    

communities,  the  abundance  of  each  taxa  in  each  sample  was  divided  by  the  total  number  of  root  tips  in  that  sample  such  that  the  total  abundance  of  all  taxa  within  each  sample  equaled  1.  Only  the  45  most  abundant  taxa  (3  or  more  root  tips  found)  were  used  for  community  analysis.       The  effect  of  horizon  and  nitrogen  treatment  on  the  abundance  of  the  25  most  common  taxa  was  assessed  using  a  two  way  ANOVA  followed  by  post-­‐hoc  comparisons  using  the  student’s  t-­‐test  (for  horizon)  or  Tukey’s  HSD  test  (nitrogen  treatment).  The  effect  of  horizon  and  nitrogen  treatment  on  groups  of  taxa  (genera,  families,  orders)  was  assessed  for  monophyletic  groups  that  had  at  least  3  species,  each  of  which  occurring  on  at  least  3  (out  of  12)  subplots.  For  such  groups  of  species  the  standardized  species’  abundances  (as  detailed  for  ordination  methods)  were  used  with  the  additional  standardization  step  of  equalizing  the  total  abundance  of  each  species,  so  that  the  total  abundance  of  each  species  was  set  to  equal  1;  this  was  done  so  that  one  very  abundant  species  did  not  bias  the  whole  genus  or  family.  All  ANOVA  were  done  with  JMP  v5.0.1  (SAS  Institute  Inc.,  Cary,  NC,  USA).  

 Results  Out  of  1800  ectomycorrhizal  root  tips  extracted,  we  obtained  495  (243  organic,  252  mineral  horizon)  ectomycorrhizal  sequences  of  sufficient  quality  to  use  in  our  analysis.  A  small  number  (36)  of  readable  sequences  were  members  of  the  Heliotiales  or  other  known  saprobe  groups  and  were  not  used  in  analysis.  The  majority  of  DNA  extracts  that  failed  to  yield  useable  sequences  did  so  due  to  multiple  fungi  being  present  in  the  DNA  extract.  The  number  of  useable  sequences  amounted  to  13-­‐30  sequences  per  subplotXhorizon  (n  =  24),  31-­‐55  per  subplot  (n  =  12),  and  59-­‐102  per  plotXhorizon  (n  =  6).  Examining  the  overall  species  accumulation  curve  (figure  1)  it  appears  that  we  sampled  adequately  to  capture  the  overall  diversity;  the  chao1  estimator  of  total  diversity  is  67.25  +/-­‐  1.75  (S.D.).  When  the  community  from  each  plotXhorizon  combination  is  examined  separately,  the  species  accumulation  curves  do  not  plateau,  and  the  chao1  estimators  of  diversity  vary  between  26.3  and  58.2  (figure  2).  

8    

Figure  1:  Rank  abundace  plot  (bars,  axis  left  and  below)  and  species  accumulation  curve  (line,  axis  above  and  right)  for  total  ectomycorrhizal  community  across  all  three  nitrogen  treatments  and  both  horizons.  495  sequences  grouped  into  65  species.  Error  bars  on  species  accumulation  curve  are  variance.      

 

 Figure  2:  Species  accumulation  curves  for  each  horizon  of  each  nitrogen  treatment.  Vertical  bars  are  the  variance  associated  with  each  estimate.  Numbers  to  the  right  of  each  line  are  the  chao1  estimates  of  total  diversity.          

9    

Response  to  Nitrogen   Horizon  Preference  Taxa  name   #  of  tips   #  of  subplots  (out  of  12)  

  P  value     P  value  

1. Cenococcum geophilum 62 12   -­‐  high   0.02   No  pref  2. Lactarius quietus var. incanus 53 11   +  high   0.011   org   0.082  3. Russula atropurpurea 44 11   +  high   0.011   No  pref  4. Tomentella sp. 1 27 9   -­‐  high   0.02   No  pref  5. Lactarius camphoratus 21 8 No  effect   min   0.0374  6. Lactarius imperceptus 19 7   +  low   0.013   org   0.013  7. Amanita sp.1 18 4   +  high   0.009   min   0.088  8. Russula sp. 1 16 6   -­‐  high   0.05   No  pref  9. Russula sp. 10 15 8 No  effect   No  pref  10. Russula sp. 7 12 6 No  effect   org   0.024  11. Russula sp. 2 11 7 No  effect   org   0.083  12. Tricholoma aff. sejunctum 10 6   -­‐  high   0.033   min   0.07  13. Inocybe sp. 1 9 3   +  low   0.049   No  pref  14. Lactarius deceptivus 8 5 No  effect   org   0.021  15. Thelephoraceae sp. 1 7 4 No  effect   No  pref  16. Lactarius sp. 1 7 4   +  high   0.037   org   0.059  17. Lactarius theiogalus 7 4   +  low   0.04   org   0.037  18. Cortinarius flexipes 6 2   +  control   0.02   No  pref  19. Ascomycetous ecto 6 4 No  effect   min   0.079  20. Basidiomycetous ecto 6 6   +  low   0.087   min   0.0042  21. Clavulina castaneipes 6 2 No  effect   No  pref  22. Clavulinaceae sp. 1 6 4 No  effect   min   0.065  23. Piloderma sp. 1 6 4   +  control   0.077   No  pref  24. Amanita flavoconia 5 4 No  effect   No  pref  25. Byssocorticium atrovirens 5 4 No  effect   min   0.048  Table  1:  List  of  25  most  common  species  observed  across  all  three  nitrogen  treatments  and  both  horizons.    Number  of  tips  =  number  of  root  tips  observed  for  that  species.  Number  of  subplots  =  number  of  subplots  in  which  at  least  one  tip  was  collected  and  successfully  sequenced  for  that  species.    Responses  to  nitrogen:  +  control  =  significantly  reduced  abundance  in  both  low  N  and  high  N  plots,    -­‐  high  =  significantly  lower  abundance  in  high  N  plots  only,  +  high  =  significantly  greater  abundance  in  high  N  plots  ,    =  significantly  greater  abundance  in  low  N  plots.      

Ectomycorrhizal  Community  Composition  The  495  ectomycorrhizal  sequences  were  grouped  into  65  OTU’s,  which  we  will  henceforth  refer  to  as  species.  They  varied  in  abundance  from  62  tips  (Cenococcum  geophilum)  to  a  number  of  species  for  which  only  one  tip  was  found.    The  rank  abundance  curve  for  the  ECM  community  has  the  shape  of  a  typical  soil  microbial  community  (figure  1)  with  a  few  abundant  species  and  many  rare  species.  The  5  most  abundant  species  account  for  42%  of  all  tips.  The  most  abundant  genera  were  Lactarius,  Russula,  Cenococcum,  Thelephora/tomentella,  and  Amanita,  which  comprised  23.2%,  22.6%,  12.5%,  8.2%,  and  6.9%  of  the  total  number  of  tips  sampled,  respectively.  A  complete  list  of  species,  and  their  affinity  for  nitrogen  treatment  and  horizon  (top  25  species)  is  detailed  in  tables  1  and  2.  Four  nitrophilic  (significantly  increased  abundance  in  N-­‐fertilized  plots)  and  5  nitrophobic  (significantly  decreased  abundance  in  N-­‐fertilized  plots)  species  could  be  identified  amongst  the  most  abundant  species,  as  well  as  three  species  that  had  significantly  higher  abundance  in  the  low  N  treatment  (table  1).  Four  of  the  most  abundant  species  exhibit  a  clear  preference  for  the  organic  horizon,  and  3  for  the  mineral  horizon.  There  does  not  appear  to  be  any  interaction  between  horizon  preference  and  reaction  to  nitrogen  fertilization  but  the  number  of  suitable  candidate  species  was  too  low  to  allow  significance  testing.  When  we  scale  up  and  look  at  species  groups  at  either  

10    

the  genus,  family,  or  order  level  we  see  that  the  Agaricales  (mineral),  Russulaeae  (organic),  and  Calvulinaceae  (mineral)  exhibit  strong  preference  for  horizon,  while  only  the  Clavulinaceae  has  a  consistent  reaction  to  nitrogen  fertilization  (nitrophobic)  (table  3).      

Taxa  name   #  of  tips   #  of  subplots  (out  of  12)  

26. Inocybe sp. 2 5 3 27. Coltricia cinnamomea 5 2 28. Tomentella sp. 2 4 4 29. Scleroderma citrinum 4 3 30. Sebacinaceae sp. 1 4 4 31. Clavulinaceae sp. 3 4 2 32. Inocybe sp. 4 4 2 33. Tricholoma saponaceum 3 3 34. Uncultured ectomycorrhiza (Piloderma) 3 2 35. Cortinarius sp. 2 3 2 36. Laccaria ochropurpurea 3 1 37. Sebacinaceae sp. 2 3 2 38. Russula sp. 6 3 2 39. Russula sp. 8 3 1 40. Amanita cf. subphalloides 3 2 41. Amanita sp. 5 3 2 42. Tomentella sublilacina 3 2 43. Sebacina epigaea 3 2 44. Tricholoma sp. 1 3 2 45. Scleroderma citrinum 3 1 46. Sebacinaceae sp. 3 2 1 47. Inocybe sp. 3 2 2 48. Inocybe sp. 5 2 2 49. Sebacinaceae sp. 4 2 1 50. Clavulinaceae sp. 2 2 1 51. Laccaria sp. 1 2 2 52. Russula sp. 3 2 2 53. Russula sp. 4 2 2 54. Russula sp. 5 2 1 55. Russula sp. 9 2 2 56. Entoloma sinuatum 2 2 57. Amanita sp. 4 2 2 58. Cortinarius sp. 1 2 2 59. Amanita sp. 2 2 2 60. Tricholoma sp. 2 1 1 61. Melanogaster sp. 1 1 1 62. Cortinarius illitus 1 1 63. Tricholoma sp. 3 1 1 64. Amanita sp. 3 1 1 65. Hydnum repandum 1 1 Table  2:  List  of  40  least  common  species  observed  across  all  three  nitrogen  treatments  and  both  horizons.    Number  of  tips  =  number  of  root  tips  observed  for  that  species.  Number  of  subplots  =  number  of  subplots  in  which  at  least  one  tip  was  collected  and  successfully  sequenced  for  that  species            

 

11    

Response  to  Nitrogen  

Horizon  Preference  

Taxa  name   #  of  tips  

#  of  OTU’s  

  P  value     P  value  Order: Agaricales 76 13 No  effect   min   0.0002   Family: Tricholomataceae 19 4 No  effect   min   0.006   Genus: Inocybe 18 3 No  effect   min   0.018   Genus: Amanita 29 4 No  effect   No  pref  Family: Russulaceae 213 11 No  effect   org   0.0001   Genus: Russula 98 5 No  effect   org   0.0011   Genus: Lactarius 115 6 No  effect   org   0.0001  Family: Thelephoraceae 41 4 No  effect   No  pref  Family: Atheliaceae 14 3   +  control   0.09   No  pref  Family: Clavulinaceae 16 3   -­‐  high   0.027   min   0.013  Table  3:  Effects  of  nitrogen  treatment  and  preference  for  horizon  of  higher  phylogenetic  groups.    Number  of  tips  =  number  of  root  tips  observed  for  that  group.  Number  of  OTU’s  =  number  of  taxa  included  in  that  group.  Responses  to  nitrogen:  +  control  =  significantly  lower  abundance  in  low  N  and  high  N  plots,    -­‐  high  =  significantly  lower  abundance  in  high  N  plots.    Note  Agaricales  includes  the  Tricholomataceae,  Incocybe,  and  Amanita;  Russulaceae  includes  the  genera  Russula  and  Lactarius.  

   

The  three  dimensional  non-­‐parametric  multi-­‐dimensional  scaling  (MDS)  plot  (figure  3)  explained  83%  of  the  variation  between  the  ectomycorrhizal  communities  (axis  1,  30.1%;  Axis  2,  37.7%;  axis  3,  15.1%).  The  final  stress  in  the  3  dimensional  solution  was  12.36  (p  <  0.02).  The  MDS  plot  illustrates  that  the  communities  of  the  mineral  and  organic  horizons  are  distinct  (Axis  2),  and  that  the  high  N  treatment  ECM  community  is  distinct  from  the  communities  in  the  control  and  low  N  plots  (Axis  1).    Mantel  tests  for  both  nitrogen  treatment  and  horizon  indicate  that  both  factors  are  important  in  shaping  community  composition  (p=0.001,  r=0.348).    

   

12    

   Figure  3:  NMDS  plot  of  ectomycorrhizal  community  composition  as  affected  by  nitrogen  treatment  and  horizon.  Each  point  represents  all  tips  collected  from  one  horizon  in  one  subplot  in  a  particular  nitrogen  treatment  (n=24).  Hollow  symbols  are  organic  horizon,  filled  symbols  are  mineral.  Squares  are  high  N,  triangles  low  N,  and  circles  control.  Ordination  represents  axis  1  and  2  of  a  three  dimensional  ordination  with  a  final  stress  of  12.67  (p  <  0.02).      Ectomycorrhizal  Diversity  Richness,  as  measured  by  observed  #  of  species,  chao1  estimator,  and  diversity  as  measured  by  shannon’s  or  simpson’s  index,  were  significantly  lower  in  the  high  N  plot  than  in  either  the  low  N  plot  or  the  control  plot  (table  3).  Diversity  was  not  appreciably  different  between  the  control  and  the  low  N  plot  (table  3).  Thirty-­‐four  species  were  found  in  the  organic  soil,  and  57  were  found  in  the  mineral  soil.  By  all  diversity  metrics  employed  (table  3)  the  mineral  soil  was  more  species  rich  than  the  organic  horizon  within  each  nitrogen  treatment  (figure  2).  The  overall  chao1  estimated  for  the  organic  and  mineral  soil  were  58    +/-­‐11.8  (S.D.)  and  70  +/-­‐2.0  (S.D.)  respectively,  and  the  Shannon  diversity  index:  2.87  and  3.55,  respectively.                  

13    

Plot/Horizon   Control  Organic  

Control  Mineral  

Low  N  Organic  

Low  N  Mineral  

High  N  Organic  

High  N  Mineral  

#  of  species   22   34   25   30   14   20  Shannon  index   2.57   3.27   2.76   3.02   1.91   2.45  

Simpson  index  (1/D)   9.5   21.4   11.4   14.7   4.1   7.7  Evenness   0.83   0.93   0.86   0.89   0.72   0.82  

Total  species/  treatment  (%  shared  min/org)  

46  (24%  shared)  

43  (28%  shared)  

27  (26%  shared)  

Chao1  estimator  (+/-­‐  S.D.)   78.8  (+/-­‐  9.5)   84.3  (+/-­‐  21.3)   39.5  (+/-­‐  3.2)  

Shannon  index   3.32   3.29   2.56  Simpson  index  1/D   18.9   17.8   8.0  

Evenness   0.87   0.87   0.78  Table  3:  Effects  of  nitrogen  treatment  and  horizon  on  various  diversity  metrics.          Ectomycorrhizal  Colonization  Intensity  The  percentage  of  root  length  colonized  (%RLC)  was  quite  consistent  between  treatments  (23.4-­‐26.6%),  except  for  the  high  N  mineral  horizon,  which  had  significantly  higher  %RLC  (33.6%,  p  <  0.001)(figure  4)      

 Figure  4:    Ectomycorrhizal  colonization  intensity  measured  as  percent  root  length  colonized.  Error  bars  are  standard  error.  Bars  with  a  different  letter  next  to  them  are  significantly  different  (p  <  0.001).        

           

14    

Discussion  Many  studies  have  demonstrated  that  high  levels  of  nitrogen  addition  significantly  impact  ectomycorrhizal  communities,  though  very  few  of  them  have  looked  at  deciduous  stands,  and  none  of  those  have  looked  at  the  mineral  and  organic  horizons  separately.  In  this  study,  we  found  that  high  levels  of  nitrogen  fertilization  (150  kg/ha/yr)  have  significantly  altered  the  ectomycorrhizal  community  in  the  Harvard  Forest  NSF  LTER  Chronic  N  Enrichment  study.  There  is  no  evidence  that  the  community  composition,  diversity,  or  colonization  intensity  have  been  appreciably  affected  by  “low”  levels  of  nitrogen  fertilization  (50  kg/ha/yr).    We  had  a  very  low  sequencing  success  rate  (<30%)  and  this  appeared  to  be  due  to  contamination  of  many  samples  by  saprotrophic  other  fungal  infection.  Our  sampling  was  done  in  mid  summer,  and  this  may  be  a  time  of  high  root  turnover.  The  levels  of  nitrogen  fertilization  applied  in  this  study  termed  “high”  and  “low”  would  be  considered  “extremely  high”  and  “very  high”  in  natural  settings.  The  highest  rates  of  nitrogen  deposition  in  the  eastern  US  are  generally  below  20  kg  N/ha/yr  (Driscoll  et  al.,  2003),  and  many  forests  considered  to  be  exhibiting  nitrogen  saturation  associated  decline  are  below  15  kg  N/ha/yr  (Fenn  et  al.,  2006).  The  high  and  low  levels  of  fertilization  employed  here  are  20  and  6  fold  higher  than  the  atmospheric  deposition  levels  in  this  part  of  the  northeast  (Magill  et  al.,  2004).  Because  there  was  no  evidence  of  an  interactive  effect  of  nitrogen  treatment  and  horizon  with  regards  to  community  composition,  we  will  first  discuss  our  findings  in  the  context  of  nitrogen  addition  experiments  and  then  discuss  the  implications  of  our  findings  on  horizon  preference.  There  is  some  evidence  that  deciduous  forests  may  respond  differently  to  nitrogen  deposition  than  coniferous  forests  (Aber  et  al.,  1998;  Fenn  et  al.,  1998),  so,  when  possible,  we  will  focus  on  studies  done  in  deciduous  forests.  We  will  also  not  discuss  studies  that  focus  exclusively  on  ectomycorrhizal  sporocarp  (mushrooms)  inventories.  Sporocarp  inventories  formed  the  majority  of  early  studies  on  the  effects  of  acid  deposition  on  ectomycorrhizal  communities,  and  could  be  considered  the  canary  in  the  coal  mine  that  has  spurred  2  decades  of  research  following  the  seminal  work  by  Arnolds  (1991).  However,  there  is  ample  evidence  that  sporocarp  abundance  may  not  be  reflective  of  mycorrhizal  abundance  (Gardes  and  Bruns,  1996;  Koren  and  Nylund,  1997;  Wallenda  and  Kottke,  1998).  We  will  address  the  results  of  our  colonization  intensity  measurements  in  the  context  of  rooting  distribution,  ecosystem  biogeochemistry  and  ecosystem  responses  to  nitrogen  deposition.    Effects  of  Nitrogen  on  Ectomycorrhizal  Community  Composition  Our  findings  of  a  significant  shift  in  ectomycorrhizal  species  composition  are  generally  in  agreement  with  other  investigations  on  the  effects  of  N  deposition  on  ectomycorrhizal  commmmunities.  Avis  et  al.  (2003,  2008)  and  Lucas  and  Casper  (2008)  found  that  nitrogen  fertilization  significantly  impacted  ECM  community  composition  in  oak  forests  of  the  eastern  US,  as  have  numerous  studies  in  coniferous  forests  (see  review  by  Wallenda  and  Kottke,  1998,  and  regional  study  by  Cox  et  al.,  2010).  Our  results  stand  apart  from  those  of  Avis  et  al.  (2008)  and  Lucas  and  Casper  (2008)  in  that  they  observed  significant  effects  on  N  fertilization  on  ECM  community  composition  at  N  fertilization  levels  between  20  and  35  kg/ha/yr  and  in  as  little  as  two  years,  while  we  found  no  significant  effects  of  18  years  of  50  kg/ha/yr  of  N  fertilization  on  ectomycorrhizal  community  composition.  

15    

Avis  et  al.  (2003)  also  failed  to  find  a  significant  community  change  after  18  years  of  fertilization  at  54  kg/ha/yr.  The  majority  of  N  addition  studies  on  coniferous  plots  have  found  a  significant  impact  of  30-­‐50  kg  N/ha/yr  on  ECM  community  composition  (Lilleskov  et  al.  2002;  Cox  et  al.,  2010,  Wallenda  and  Kottke,  1998),  though  Ishida  and  Nordin  (2010)  failed  to  find  an  effect  of  12  years  of  50  kg  N/ha/yr  on  ECM  community  composition  in  a  spruce  forest.  Wallenda  and  Kottke  (1998)  identified  a  general  threshold  for  20-­‐30  kg  N/ha/yr  before  marked  changes  in  the  ECM  community  composition  are  likely  to  be  observed,  although  they  caution  that  forest-­‐specific  factors  may  change  this  threshold  a  great  deal  in  either  direction,  and  at  the  time  of  their  review,  there  were  no  studies  on  the  effects  of  N  addition  on  ECM  communities  in  deciduous  forests.  

Our  findings  of  a  marked  reduction  in  ECM  diversity  with  high  N  fertilization  are  also  in  line  with  the  findings  of  Avis  et  al  (2008),  and  Lucas  and  Casper  (2008),  which  found  significantly  reduced  ECM  diversity  in  their  high  N  treatments,  though  again,  they  noted  significant  decreases  in  ECM  diversity  at  levels  comparable  to  our  “low”  N  treatment,  while  we  did  not.  Avis  et  al.  (2003)  failed  to  find  a  significant  effect  of  N  addition  (at  levels  comparable  to  our  High  N  treatment)  on  ECM  diversity.    Looking  at  studies  in  coniferous  forests,  a  reduction  in  ECM  diversity  with  N  addition  seems  to  be  the  general  finding  (Lilleskov  et  al.  2002;  Cox  et  al.,  2010;  Carfae  et  al.,  2006,  Wallenda  and  Kottke,  1998),  but  studies  have  also  found  no  reduction  in  ECM  diversity  in  forests  fertilized  with  moderate  (Ishida  and  Nordin,  2010;  Jonsson  et  al.,  2000)  or  very  high  levels  of  N  addition  (Kåren  and  Nylund,  1997).    

We  could  clearly  identify  certain  species  to  be  nitrophilic  or  nitrophobic  but  we  could  not  make  such  characterizations  for  any  higher-­‐level  phylogenetic  groups  other  than  the  Clavulinaceae.  We  found  that  the  Clavulinaceae  were  generally  nitrophobic  and  this  is  in  agreement  with  the  findings  of  Avis  et  al.  (2008).  Among  our  5  most  abundant  Lactarius  species,  one  (L.  quietus,  the  second  most  abundant  species  overall)  was  nitrophilic,  two  were  more  common  in  the  low  nitrogen  treatment,  and  nitrogen  had  no  effect  on  the  abundance  of  the  other  two.  Lactarius  quietus  was  also  quite  abundant  in  Avis  et  al.’s  (2008)  study  on  oak,  but  they  found  no  consistent  reaction  to  nitrogen  fertilization.  In  their  study  across  a  depositional  gradient  in  an  Alaskan  spruce  forest  Lilleskov  et  al.  (2002)  found  Lactarius  theiogalus  to  be  dramatically  nitrophilic,  shifting  from  7%  to  69%  of  all  root  tips  from  the  low  to  high  end  of  their  nitrogen  gradient;  we  found  L.  theiogalus  to  be  mildy  nitrophilic,  occurring  in  greatest  abundance  in  the  low  N  treatment.  Cox  et  al.’s  (2010)  study  across  european  Picea  abies  forests  identified  the  genera  Lactarius  and  Thelepohra/Tomentella  to  be  nitrophilic.  We  found  our  only  common  Tomentella  species  to  be  nitrophobic.  Our  most  abundant  species  was  Cenococcum  geophilum,  and  it  was  termed  nitrophobic  due  to  its  sharply  reduced  abundance  in  the  high  N  treatment.  Avis  et  al.  (2008)  found  Cenococcum  abundance  across  N  treatments  variable,  with  one  TRFLP  type  being  nitrophilic  and  another  nitrophobic.  Lucas  and  Casper  (2008)  found  Cenoccocum  geophilum  abundance  increased  on  oak  roots  in  response  to  nitrogen  fertilization  (fertilization  levels  below  our  low  N  treatment  levels).  Avolio  et  al.  (2009)  looked  at  ECM  community  composition  on  pine  and  oak  seedlings  in  response  to  nitrate  fertilization  and  found  that  Cenococcum  abundance  increased  markedly  in  response  to  N  fertilization  on  oaks,  and  decreased  markedly  in  response  to  N  fertilization  on  pines.  Cenococcum  geophilum  is  widely  thought  to  be  a  

16    

cryptic  species  complex  (Douhan  et  al.,  2007),  and  we  examined  the  possibility  that  we  had  sub-­‐taxa  within  C.  geophilum  that  might  have  a  distinct  affinity  for  nitrogen  or  horizon.  Clustering  our  C.  geophilum  sequences  at  different  %  similarities  did  yield  different  clusters,  but  did  not  divide  this  large  group  according  to  any  horizon  or  nitrogen  affinity.  This  inability  to  define  Cenococcum’s  niche  is  not  uncommon;  in  a  2007  commentary,  Dickie  (2007)  identified  Cenococcum  as  “one  notable  exception  to  the  rule  of  niche  differentiation”.    

 Role  of  horizon  is  shaping  ectomycorrhizal  community  composition  The  ECM  communities  in  the  organic  and  mineral  soil  were  quite  distinct,  both  across  all  treatments  and  within  a  given  nitrogen  treatment.  Our  findings  of  different  ECM  communities  in  the  mineral  and  organic  horizon  is  common  to  other  studies  which  have  examined  the  ECM  communities  in  organic  and  mineral  soil  separately  (Rosling  et  al.,  2003;  Dickie  et  al.,  2002;  Scattolin  et  al,  2008,  Tedersoo  et  al.,  2003),  though  to  date  few  studies  (<10)  have  done  so.  We  found  evidence  of  increased  diversity  in  the  mineral  soil.  Rosling  et  al.  (2003)  found  higher  diversity  in  the  mineral  soil,  while  Dickie  et  al.  (2002)  found  lower  diversity  in  the  mineral  soil,  and  Scattolin  et  al.  (2008)  found  moderately  (though  not  significantly)  increased  diversity  of  ECM  species  in  the  mineral  soil.  All  three  of  these  studies  were  done  in  coniferous  forests.       Certain  species  in  our  study  exhibited  clear  preferences  for  one  horizon  or  another,  and  these  trends  were  also  applicable  to  higher  phylogenetic  classifications.  In  particular  the  Russulaceae  exhibited  a  preference  for  the  organic  horizon  while  members  of  the  genus  Inocybe,  the  order  Agaricales,  and  the  families  Tricholomataceae  and  Clavulinaceae  were  significantly  more  abundant  in  the  mineral  soil.  In  contrast  to  our  findings,  Baier  et  al.(2006)  and  Scattolin  et  al.(2008)  found  that  Lactarius  and  Russula  were  generally  more  abundant  in  the  mineral  soil,  though  they  found  individual  species  within  both  genera  that  were  more  abundant  in  the  organic  soil;  both  studies  were  done  in  high  elevation  coniferous  forests.  Tedersoo  et  al.  (2003)  found,  as  we  did,  that  the  Agaricales  exhibited  strong  preference  for  mineral  soil,  though  they  also  found  the  Clavulinaceae  to  be  significantly  more  abundant  in  the  organic  horizon,  in  contrast  to  our  findings.  In  general,  our  data  suggests  greater  specialization  in  the  mineral  horizon  than  in  the  organic  horizon.  Of  the  65  species  we  found,  31  were  found  only  in  the  mineral  soil,  while  only  eight  were  found  exclusively  in  the  organic  horizon.  Rosling  et  al.  (2003)  also  found  a  higher  proportion  of  species  occurring  exclusively  in  mineral  soil.    Mycorrhizal  colonization  intensity  and  ecosystem  responses  to  nitrogen  deposition  

Across  all  treatments,  the  ectomycorrhizal  colonization  intensity  (%RLC)  was  very  similar  between  the  mineral  and  organic  horizon,  and  this  stands  in  some  contrast  to  the  published  literature.  Very  few  studies  have  exhaustively  sampled  the  ectomycorrhizal  community  in  the  mineral  soil  (our  sampling  only  considered  the  top  25  cm  in  the  mineral  soil),  but  those  that  have,  have  found  as  many,  if  not  more,  ECM  (total  biomass)  in  the  mineral  soil  as  in  the  organic  soil  (Rosling  et  al.,  2003;  Scattolin  et  al.,  2008).  More  studies  have  sampled  the  upper  layers  of  the  mineral  soil,  and  ECM  colonization  intensity,  measured  as  either  percent  root  length  colonized  (%RLC)  or  percentage  of  fine  root  tips  that  are  mycorrhizal,  is  generally  lower  in  the  mineral  soil  (Rosling  et  al,  2003,  Baier  et  al,  

17    

2006,  Jonsson  et  al.,  2000).      However,  Scattolin  et  al.  (2008)  found  that  the  A  and  B  horizons  in  a  montane  spruce  forest  in  Italy  had  significantly  higher  mycorrhizal  colonization  intensity  than  the  organic  soil,  so  our  finding  of  equal  (control  and  low  N)  or  slightly  elevated  (high  N)  colonization  intensity  in  the  mineral  soil  is  not  unprecedented.  Magill  et  al.  (2004)  assessed  the  fine  root  biomass  in  the  same  plots  we  did  two  years  before  we  sampled  these  stands.  They  found  that  between  55%  and  62%  of  all  fine  roots  were  found  in  the  mineral  soil,  though  they  only  sampled  the  top  20cm  of  mineral  soil.  Thus,  our  findings  of  equivalent  or  higher  colonization  intensity  in  the  mineral  soil  can  be  interpreted  as  equivalent  or  higher  mycorrhizal  biomass  in  the  mineral  soil.      

Nitrogen  addition  had  no  effect  on  the  colonization  intensity  in  the  low  N  treatment  or  in  the  organic  horizon  of  the  high  N  treatment,  and  increased  the  percentage  root  length  colonized  (%RLC)  in  the  mineral  soil  in  the  high  N  treatment.    According  to  Magill  et  al.  (2004),  the  fine  root  biomass  in  the  organic  horizon  in  these  same  stands  is  25%  and  27%  lower  in  the  low  and  high  N  treatments,  respectively.  Fine  root  biomass  in  the  top  20  cm  of  the  mineral  horizon  has  not  been  significantly  affected  by  nitrogen  treatment,  thus  the  percentage  of  fine  roots  found  in  the  mineral  horizon  increased  marginally  from  55%  to  62%  with  nitrogen  addition  (Magill  et  al.,  2004).    We  can  thus  infer  that  there  is  a  significantly  higher  fraction  of  total  ectomycorrhizae  in  the  mineral  soil  (69%  of  total  in  high  N  vs.  51.4%  of  total  in  control)  in  the  high  N  treatment.  There  is  considerable  variation  in  the  literature  in  reported  responses  of  ECM  colonization  and  fine  root  biomass  to  nitrogen  addition.  The  consensus  seems  to  be  that  nitrogen  addition  decreases  both,  but  the  large  number  of  reports  finding  the  opposite  suggests  that  characteristics  of  the  individual  forest  being  examined  may  be  important  to  consider.    In  a  meta-­‐analysis  of  6  studies  conducted  in  14  forest  stands,  Treseder  et  al.  (2004)  found  a  moderate  (though  significant)  decrease  in  %RLC  of  5.8%  with  nitrogen  fertilization,  but  also  noted  that  the  responses  to  N  were  very  heterogeneous.  In  a  meta-­‐analysis  of  boreal  forests’  responses  to  nitrogen  addition,  Cudlin  et  al.  (2007)  found  a  not  significant  decrease  of  10%  in  percent  mycorrhizal  colonization.  Carfrae  at  al.  (2006)  and  Koren  and  Nylund  (1997)  found  significantly  increases  in  %RLC  with  nitrogen  fertilization.  Wöllecke  et  al.  (1999)  noted  a  sharp  decrease  in  %  RLC  with  nitrogen  fertilization,  but  this  was  much  more  pronounced  for  the  organic  horizon  than  the  mineral  horizon,  also  indicating  increased  fraction  of  total  mycorrhizal  activity  in  the  mineral  soil  under  nitrogen  addition.  To  the  authors’  knowledge  no  published  studies  have  examined  the  effects  of  nitrogen  on  ECM  colonization  intensity  in  deciduous  forests.  The  literature  on  the  effects  of  nitrogen  on  rooting  activity  is  no  more  consistent.  While,  many  micro-­‐  and  mesocosm  studies  have  demonstrated  a  decreased  ratio  of  root  biomass  to  shoot  biomass  with  increased  N  availability  (Ekblad  et  al.,  1996;  Ericsson,  1995;  Marschner,  1995  and  references  therein),  and  the  mechanisms  for  this  are  well  understood  (Walch-­‐Liu  et  al.,  2005),  the  effect  is  generally  driven  by  increases  in  aboveground  biomass  and  the  effects  of  nitrogen  fertilization  on  belowground  biomass  in  forests  vary  considerably.  Cudlin  et  al.  (2007)  found  an  increase  in  root  biomass  of  10%  in  their  meta-­‐analysis  of  22  forest  studies,  while  Ostonen  et  al.  (2007)  found  a  20%  decrease  in  specific  root  length  in  a  meta-­‐analysis  of  54  studies,  both  of  these  studies  reported  such  high  variation  in  responses  to  N  that  neither  trend  was  significant.  

18    

The  altered  mycorrhizal  colonization  we  observed  in  the  high  N  plot  may  be  an  adaptation  to  limitation  or  co-­‐limitation  by  phosphorous  or  base-­‐cations.  Many  studies  have  shown  that  anthropogenic  nitrogen  deposition  is  altering  the  nutrient  status  of  eastern  forests  from  nitrogen  limitation  to  co-­‐limition  or  limitation  by  phosphorous  or  base  cations  (Aber  et  al.,  2003;  Fenn  et  al.,  2006;  Long  et  al.,  2008).  Minocha  et  al.  (2000)  measured  the  foliar  and  soil  contents  of  base  cations  and  phosphorous  in  the  same  plots  we  did  5  years  before  we  sampled  them,  and  found  significantly  reduced  amounts  of  Ca,  Mg,  K,  and  P  in  the  organic  horizon  in  the  high  N  plots  at  Harvard  Forest,  while  the  mineral  soil  amounts  were  not  affected.    Currie  et  al.  (1999)  studied  the  same  plots  and  demonstrated  that  loss  of  cations  was  due  to  downward  leaching  of  these  important  nutrients  due  to  nitrogen  addition.  Minocha  et  al.  (2000)  also  showed  significantly  reduced  foliar  concentrations  of  calcium  and  foliar  Mg:N  ratio.  In  light  of  the  findings  of  Minocha  et  al.  (2000)  and  Magill  et  al.  (2004)  we  suggest  that  the  increased  ectomycorrhizal  colonization  we  observed  in  the  mineral  soil  of  the  high  N  plot  in  conjunction  with  a  deeper  rooting  distribution  may  be  a  response  to  greater  demand  for  mineral  derived  nutrients.  The  two  species  that  we  found  to  increase  in  the  mineral  soil  of  the  high  N  sites  were  Amanita  sp.  1,  which  was  significantly  more  abundant,  and  Russula  atropurpurea,  which  showed  a  substantial  but  non-­‐significant  increase.  One  way  to  examine  whether  shifting  nutrient  demand  on  the  part  of  the  host  trees  is  driving  the  observed  changes  in  species  composition  and  distribution  would  be  to  examine  whether  these  species  have  enhanced  ability  to  take  up  and  translocate  phosphorous  or  base  cations.  A  split  chamber  mesocosm  similar  to  that  employed  by  Jentschke  et  al.  (2000)  would  be  ideal  to  address  such  questions.     The  effects  of  nitrogen  addition  on  root  and  mycorrhizal  distribution  must  be  considered  in  models  of  how  soil  carbon  stocks  will  respond  to  nitrogen  deposition.  There  is  evidence  that  soil  carbon  storage  increases  in  response  to  elevated  nitrogen  deposition  (Pregitzer  et  al.,  2008;  meta-­‐analysis  by  Janssens  et  al.,  2010),  and  some  studies  ascribe  this  to  reduced  decomposition,  not  increased  litter  inputs  (Waldrop  et  al.,  2004,  Zak  et  al.,  2008).  In  a  recent  meta-­‐analysis  Nave  et  al.  (2009)  found  that  nitrogen  addition  had  no  effect  on  carbon  storage  in  organic  horizons  but  significantly  increased  carbon  stocks  in  the  mineral  soil  by  12%.    Few  studies  have  exhaustively  sampled  how  rooting  distribution  responds  to  nitrogen  addition.    There  is,  however,  increasing  evidence  that  CO2  enrichment  causes  deeper  rooting  distribution  among  forest  trees  in  response  to  greater  nutrient  demand  (Norby  et  al.,  2004;  review  by  Iversen,  2010).  Studies  investigating  the  role  of  depth  on  root  turnover  and  decomposition  are  limited  but  there  is  evidence  that  root  decomposition  is  significantly  slower  at  greater  depth  (Gill  and  Burke,  2002).  Ectomycorrhizal  roots  decompose  significantly  more  slowly  and  contribute  more  carbon  to  recalcitrant  carbon  pools  with  much  slower  turnover  rates  than  nonmycorrhizal  fine  roots  (Langley  et  al.,  2006;  Fann  and  Guo,  2010).  The  results  of  our  experiment  and  Magill  et  al.  (2004)  have  demonstrated  increased  mycorrhization  and  proportionally  more  rooting  in  the  mineral  soil  in  response  to  N  addition.  This  study  is  the  first  to  address  how  ectomycorrhizal  abundance  and  distribution  in  deciduous  forests  is  affected  by  nitrogen  deposition,  and  one  of  the  first  in  any  forest  to  combine  information  on  how  colonization  intensity  responds  to  nitrogen  addition  with  concurrent  examination  of  root  biomass  responses.  If  our  finding  that  the  amount  of  ectomycorrhizal  biomass  in  the  mineral  soil  

19    

increases  in  response  to  nitrogen  deposition  is  representative  of  other  forests,  then  this  should  be  considered  in  models  that  predict  how  soil  carbon  stores  may  respond  to  anthropogenic  nitrogen  deposition.          Conclusions  Eighteen  years  of  heavy  nitrogen  fertilization  have  significantly  impacted  the  ectomycorrhizal  community  at  Harvard  Forest.  The  community  composition  has  shifted,  diversity  has  decreased  and  the  total  mycorrhizal  activity  has  shifted  significantly  towards  the  mineral  soil.  The  low  nitrogen  treatment,  though  six  times  higher  than  ambient  deposition,  does  not  appear  to  have  changed  the  ectomycorrhizal  community  appreciably.  Our  study  only  sampled  roots  to  a  depth  of  25  cm,  while  many  studies  fail  to  sample  the  mineral  soil  at  all.  Future  studies  of  ectomycorrhizal  communities  or  ecosystem  responses  to  nitrogen  addition  should  take  care  to  address  rooting  and  mycorrhizal  processes  in  the  mineral  soil.                                                              

20    

References  Cited    Aber  JD,  McDowell  W,  Nadelhoffer  K,  Magill  A,  Berntson  G,  Kamakea  M,  McNulty  S,  Currie  W,  Rustad  L,  Fernandez  I.  1998.  Nitrogen  Saturation  in  Temperate  Forest  Ecosystems:  Hypotheses  revisited.  BioScience  48:921-­‐934.    Aber  JD,  Goodale  CL,  Ollinger  SV,  Smith  ML,  Magill  A,  Martin  ME,  Hallett  RA,  Stoddard  JL.  2003.  Is  Nitrogen  Deposition  Altering  the  Nitrogen  Status  of  Northeastern  Forests?  BioScience  53:375-­‐389.    Abuzinadah  RA,  Finlay  RD,  Read  D.  1986.  The  role  of  proteins  in  the  nitrogen  nutrition  of  ectomycorrhizal  plants.  II  Utilization  of  proteins  by  mycorrhizal    plants  of  Pinus  contorta.  New  Phytologist  103:  495-­‐506.    Avis  PG,  McLaughlin  DJ,  Dentinger  BC,  Reich  PB.  2003.  Long-­‐term  increase  in    nitrogen  supply  alters  above-­‐  and  below-­‐ground  ectomycorrhizal  communities  and  increases  the  dominance  of  Russula    spp.  in  a  temperate  oak  savanna.  New  Phytologist  160:239-­‐253.    Avis  PG,  Mueller  GM,  Lussenhop  J.  2008.  Ectomycorrhizal  fungal  communities  in  two  North  American  oak  forests  respond  to  nitrogen  addition.  New  Phytologist  179:  472–483.    Avolio  ML,  Tuininga  AR,  Lewis  JD,  Marchese  M.  2009.  Ectomycorrhizal  responses  to  organic  and  inorganic  nitrogen  sources  when  associating  with  two  host  species.  Mycological  Research  113:897–907.    Baier  R,  Ingenhaag  J,  Blaschke  H,  Göttlein  A,  Agerer  R.  2006.  Vertical  distribution  of  an  ectomycorrhizal  community  in  upper  soil  horizons  of  a  young  Norway  spruce  (Picea  abies  [L.]  Karst.)  stand  of  the  Bavarian  Limestone  Alps.  Mycorrhiza  16:  197–206.    Baribault  TW,  Kobe  RK,  Rothstein  DE.  2010.Soil  calcium,  nitrogen,  and  water  are  correlated  with  aboveground  net  primary  production  in  northern  hardwood  forests.  Forest  Ecology  and  Management  260:723–733.    Bowden  RD,  Davidson  E,  Savage  K,  Arabia  C,  Steudler  P.  2004.  Chronic  nitrogen  additions  reduce  total  soil  respiration  and  microbial  respiration  in  temperate  forest  soils  at  the  Harvard  Forest.  Forest  Ecology  and  Management  196:43–56.    Bruns  TD.  1995.  Thoughts  on  the  processes  that  maintain  local  species-­‐diversity  of  ectomycorrhizal  fungi.  Plant  and  Soil  170:  63-­‐73.    Carfrae  JA,  Skene  KR,  Sheppard  LJ,  Ingleby  K,  Crossley  A.  2006.  Effects  of  nitrogen  with  and  without  acidified  sulphur  on  an  ectomycorrhizal  community  in  a  Sitka  spruce  (Picea  sitchensis  Bong.  Carr)  forest.  Environmental  Pollution  141:  131-­‐138.      

21    

Clarke  KR.  1993.  Non-­‐parametric  multivariate  analyses  of  changes  in  community  structure.  Australian  Journal  of  Ecology  18:117–143.    Cleland  EE,  Harpole  WS.  2010.  Nitrogen  enrichment  and  plant  communities.  Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences  1195:46  -­‐61.    Cox  F,  Barsoum  N,  Lilleskov  EA,  Bidartondo  MI.  2010.  Nitrogen  availability  is  a  primary  determinant  of  conifer  mycorrhizas  across  complex  environmental  gradients.  Ecology  Letters  13:1103–1113.    Cudlin  P,  Kieliszewska-­‐Rokicka  B,  Rudawska  M,  Grebenc  T,  Alberton    O,  Lehto  T,  Bakker  MR,  Børja  I,  Konopka  B,  Leski  T,  Kraigher  H,  Kuyper  TW.  2007.  Recent  advances  in  woody  root  research:  Fine-­‐roots  and  ectomycorrhizas  as  indicators  of  environmental  change.  Plant  Biosystems  141:406–425.    Currie  WS,  Aber  JD,  Driscoll  CT.  1999.  Leaching  of  nutrient  cations  from  the  forest  floor:  effects  of  nitrogen  saturation  in  two  long-­‐term  manipulations.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  29:609–620.    Dickie  IA,  Xu  B,  Koide  RT.  2002.  Vertical  niche  differentiation  of  ectomycorrhizal  hyphae  in  soil  as  shown  by  T-­‐RFLP  analysis.  New  Phytologist  156:  527–535.    Dickie  IA.  2007.  Host  preference,  niches  and  fungal  diversity.  New  Phytologist  174:  230–233.    Driscoll  CT,  Whitall  D,  Aber  J,  Boyer  E,  Castro  M,  Cronan  C,  Goodale  C,  Groffman  P,    Hopkinson  C,  Lambert  K,  Lawrence  G,  Ollinger  S.  2003.  Nitrogen  pollution  in  the  northeastern  United  States:  sources,  effects,  and  management  options.  Bioscience  53:  357–  374.    Douhan  GW,  Huryn  KL,  Douhan  LI.  2007.  Significant  diversity  and  potential  problems  associated  with  inferring  population  structure  within  the  Cenococcum  geophilum  species  complex.  Mycologia,  99:812–819.      Ekblad  A,  Wallander  H,  Carlsson  R,  Huss-­‐Danell  K.  1995.  Fungal  biomass  in  roots  and  extraradical  mycelium  in  relation  to  macronutrients  and  plant  biomass  of  ectomycorrhizal  Pinus  sylvestris  and  Alnus  incana.  New  Phytologist  131:443-­‐451.    Ericsson  T.  1995.  Growth  and  shoot:  root  ratio  of  seedlings  in  relation  to  nutrient  availability.  Plant  and  Soil  168-­‐169:205-­‐214.    Fan  P,  Guo  D.  2010.  Slow  decomposition  of  lower  order  roots:  a  key  mechanism  of  root  carbon  and  nutrient  retention  in  the  soil.  Oecologia  163:509–515.      

22    

Fenn  ME,  Poth,  MA,  Aber  JD,  Baron  JS,  Bormann  BT,  Johnson  DW,  Lemly  D,  McNulty  SG,  Ryan  DF,  Stottlemeyer  R.  1998.  Nitrogen  excess  in  North  American  ecosystems:  predisposing  factors,  ecosystem  responses,  and  management  strategies.  Ecological  Applications,  8:706–733.    Fenn  ME,  Huntington  TG,  McLaughlin  SB,  Eager  C,  Gomez  A,  Cook  RB.  2006.  Status  of  Soil  Acidification  in  North  America.  Journal  of  Forest  Science  52:3-­‐13.    Galloway  JN,  Dentener  FJ,  Capone  DG,  Boyer  EW,  Howarth  RW,  Seitzinger  SP,  Asner  GP,  Cleveland  CC,  Green  PA,  Holland  EA,  Karl  DM,  Michaels  AF,  Porter  JH,  Townsend  AR,  Vorosmarty  CJ.  2004.  Nitrogen  cycles:  past,  present,  and  future.  Biogeochemistry  70:153-­‐226.    Gardes  M,  Bruns  TD.  1993.  ITS  primers  with  enhanced  specificity  for  basidiomycetes  -­‐  application  to  the  identification  of  mycorrhizae  and  rusts.  Molecular  Ecology  2:113-­‐118.    Gardes  M,  Bruns  TD.  1996.  Community  structure  of  ectomycorrhizal  fungi  in  a  Pinus  muricata  forest:  Above-­‐  and  below-­‐ground  views.  Canadian  Journal  of  Botany  74:1572-­‐1583.    Gardes  M  &  Bruns  T  (1996b)  ITS-­‐RFLP  matching  for  the  identification  of  fungi.  Methods  in  Molecular  Biology,  Species  Diagnostic  Protocols:  PCR  and  Other  Nucleic  Acid  Methods  (Gardes  M  &  Bruns  T,  eds),  pp.  177–186.  Humana  Press  Inc.,  Totowa.    Gill  RA,  Burke  IC.  2002.  Influence  of  soil  depth  on  the  decomposition  of  Bouteloua  gracilis  roots  in  the  shortgrass  steppe.  Plant  and  Soil  241:  233–242.    Gilliam  FS.  2006.  Response  of  the  herbaceous  layer  of  forest  ecosystems  to  excess  nitrogen  deposition.  Journal  of  Ecology  94:1176–1191.    Gleeson  SK,  Good  RE.  2003.  Root  allocation  and  multiple  nutrient  limitation  in  the  New  Jersey  Pinelands.  Ecology  Letters  6:  220–227.    Godbold  DL,  Hoosebeek  MR,  Lukac  M,  Cotrufo  MF,  Janssens  IA,  Ceulemans  R,  Polle  A,  Velthorst  EJ,  Scarascia-­‐Mugnozza  G,  De  Angelis  P,  Miglietta  F,  Peressotti  A.  2006.  Mycorrhizal  hyphal  turnover  as  a  dominant  process  for  carbon  input  into  soil  organic  matter.  Plant  and  Soil  281:15-­‐24.    Gradowski  T,  Thomas  SC.  2006.  Phosphorus  limitation  of  sugar  maple  growth  in  central  Ontario.  Forest  Ecology  and  Management  226:104–109.    Hobbie  EA,  Colpaert  JV.  2003.  Nitrogen  availability  and  colonization  by  mycorrhizal  fungi  correlate  with  nitrogen  isotope  patterns  in  plants.  New  Phytologist  157:115-­‐126.      

23    

Hobbie  EA.  2006.  Carbon  allocation  to  ectomycorrhizal  fungi  correlates  with  belowground  allocation  in  culture  studies.  Ecology  87:563-­‐569.      Iversen  CM.  2010.  Digging  deeper:  fine-­‐root  responses  to  rising  atmospheric  CO2  concentration  in  forested  ecosystems.  New  Phytologist  186:  346–357.    Janssens  IA,  Dieleman  W,  Luyssaert  S,  Subke  JA,  Reichstein  M,  Ceulemans  R,  Ciais  P,  Dolman  AJ,  Grace  J,  Matteucci  G,  Papale  D,  Piao  SL,  Schulze  ED,  Tang  J,  Law  BE.  2010.  Reduction  of  forest  soil  respiration  in  response  to  nitrogen  deposition.  Nature  Geoscience  3:315-­‐322.    Jentschke  G,  Brandes  B,  Kuhn  AJ,  Schröder  WH,  Becker  JS,  Godbold  DL.  2000.  The  mycorrhizal  fungus  Paxillus  involutus  transports  magnesium  to  Norway  spruce  seedlings.  Evidence  from  stable  isotope  labeling.  Plant  and  Soil  220:243–246.    Jentschke  G,  Godbold  DL,  Brandes  B.  2001.  Nitrogen  limitation  in  mycorrhizal  Norway  spruce  (Picea  abies)  seedlings  induced  mycelial  foraging  for  ammonium:  implications  for  Ca  and  Mg  uptake.  Plant  and  Soil  234:109–117.    Jonssona  L,  Dahlberg  A,  Brandrud  TE.  2000.  Spatiotemporal  distribution  of  an  ectomycorrhizal  community  in  an  oligotrophic  Swedish  Picea  abies  forest  subjected  to  experimental  nitrogen  addition:  above-­‐  and  below-­‐ground  views.  Forest  Ecology  and  Management  132:143-­‐156.    Kåren  O,  Nylund  JE.  1997.  Effects  of  ammonium  sulphate  on  the  -­‐community  structure  and  biomass  of  ectomycorrhizal  fungi  in  a  Norway  spruce  stand  in  southwestern  Sweden.  Canadian  Journal  of  Botany  75:  1628-­‐1642.    Langley  JA,  Chapman  SK,  Hungate  BA.  2006.  Ectomycorrhizal  colonization  slows  root  decomposition:  the  post-­‐mortem  fungal  legacy.  Ecology  Letters  9:  955–959.    Lilleskov  EA,  Wargo  PM,  Vogt  KA,  Vogt  DJ.  2008.  Mycorrhizal  fungal  community  relationship  to  root  nitrogen  concentration  over  a  regional  atmospheric  nitrogen  deposition  gradient  in  the  northeastern  USA.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  38:  1260-­‐1266.    Lilleskov  EA,  Fahey  TJ,  Horton  TR,  Lovett  GM.  2002.  Below-­‐ground  ectomycorrhizal  fungal  community  change  over  a   nitrogen  deposition  gradient  in  Alaska.  Ecology  83:104-­‐115.    Long  RP,  Horsley  SB,  Hallett  RA.  2009.  Sugar  Maple  growth  in  relation  to  nutrition  and  stress  in  the  northeastern  United  States.  Ecological  Applications  19:1454-­‐1466.        

24    

Lucas  RW,  Casper  BB.  2008.  Ectomycorrhizal  community  and  extracellular  enzyme  activity  following  simulated  atmospheric  N  deposition.  Soil  Biology  &  Biochemistry  40:1662–1669.    Magill  AH,  Aber  JD,  Currie  WS,  Nadelhoffer  KJ,  Martin  ME,  McDowell  WH,  Melillo  JM,  Steudler  P.  2004.  Ecosystem  response  to  15  years  of  chronic  nitrogen  additions  at  the  Harvard  Forest  LTER,  Massachusetts,  USA.  Forest  Ecology  and  Management  196:7–28.    Marschner  H.  1995.  Mineral  nutrition  of  higher  plants.  Academic  Press.  London.    Minocha  R,  Long  S,  Magill  A,  Aber  JD,  McDowell  WH.  2000.  Foliar  free  polyamine  and  inorganic  ion  content  in  relation  to  soil  and  soil  solution  chemistry  in  two  fertilized  forest  stands  at  the  Harvard  Forest,  Massachusetts.  Plant  Soil  222:119–137.    Nave  LE,  Vance  ED,  Swanston  CW,  Curtis  PS.  2009.  Impacts  of  elevated  N  inputs  on  north  temperate  forest  soil  C  storage,  C/N,  and  net  N-­‐mineralization.  Geoderma  153:231–240.    Ostonon  I,  Puttsepp  Ü,  Biel  C,  Alberton  O,  Bakker  MR,  Löhmus  K,  Majdi  H,  Metcalfe  D,  Olsthoorn  AFM,  Pronk  A,  Vanguelova  E,  Weih  M,  Brunner  I.  2007.  Recent  advances  in  woody  root  research:  Specific  root  length  as  an  indicator  of  environmental  change.  Plant  Biosystems  141:426-­‐442.    Parrent  JL,  Vilgalys  R.  2007.  Biomass  and  compositional  responses  of  ectomycorrhizal  fungal  hyphae  to  elevated  CO2  and  nitrogen  fertilization.  New  Phytologist  176:  164–174.    Pregitzer  K  S,  Burton  AJ,  Zak  DR,  Talhelm  AF.  2008.  Simulated  chronic  nitrogen  deposition  increases  carbon  storage  in  northern  temperate  forests.  Global  Change  Biology  14:142–153.    Rosling  A,  Lindahl  BD,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2004.  Mycelial  growth  and  substrate  acidification  of  ectomycorrhizal  fungi  in  response  to  different  minerals.  FEMS  Microbiology  Ecology  47:31-­‐37.    Rosling  A,  Landeweert  R,  Lindahl  BD,  Larsson  KH,  Kuyper  TW,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2003.  Vertical  distribution  of  ectomycorrhizal  fungal  taxa  in  a  podzol  soil  profile  New  Phytologist  159:  775–783.    Scattolin  L,  Montecchio  L,  Mosca  E,  Agerer  R.  2008.  Vertical  distribution  of  the  ectomycorrhizal  community  in  the  top  soil  of  Norway  spruce  stands.  European  Journal  of  Forest  Research  127:347–357.    Smith  SE,  Read  DJ.  2008.  Mycorrhizal  Symbiosis:  3rd  Edition.  London:  Academic  Press.  787  p.      

25    

Sun  Y,    Gu  JC,    Zhuang  HF,  Wang  ZQ.  2010.  Effects  of  ectomycorrhizal  colonization  and  nitrogen  fertilization  on  morphology  of  root  tips  in  a  Larix  gmelinii  plantation  in  northeastern  China.  Ecological  Research  25:  295–302.    Taylor  DL,  Herriott  IC,  Stone  KE,  McFarland  JW,  Booth  MG,  Leigh  MB.  2010.  Structure  and  resilience  of  fungal  communities  in  Alaskan  boreal  forest  soils.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  40:  1288–1301.    Tedersoo  L,  Koljalg  U,  Hallenberg  N,  Larsson  KH.  2003.  Fine  scale  distribution  of  ectomycorrhizal  fungi  and  roots  across  substrate  layers  including  coarse  woody  debris  in  a  mixed  forest.  New  Phytologist  159:  153-­‐165.    Treseder  KK.  2004.  A  meta-­‐analysis  of  mycorrhizal  responses  to  nitrogen,  phosphorus,  and  atmospheric  CO2  in  field  studies.  New  Phytologist  164:347-­‐355.    Treseder  KK,  Turner  KM,  Mack  MC.  2007.  Mycorrhizal  responses  to  nitrogen  fertilization  in  boreal  ecosystems:  potential  consequences  for  soil  carbon  storage  Global  Change  Biology  13:78–88.    Vadeboncoeur  MA.  2010.  Meta-­‐analysis  of  fertilization  experiments  indicates  multiple  limiting  nutrients  in  northeastern  deciduous  forests.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  40:  1766–1780.      van  Scholl  L,  Smits  MM,  Hoffland  E.  2006.  Ectomycorrhizal  weathering  of  the  soil  minerals  muscovite  and  hornblende.  New  Phytologist  171:805-­‐814.    Vitousek  PM,  Aber  JD,  Howarth  RW,  Likens  GE,  Matson  PA,  Schindler  DW,  Schlesinger  WH,  Tilman  DG.  1997.  Human  alterations  of  the  global  nitrogen  cycle:  Sources  and  Consequences.  Ecological  Applications  7:737–750.      Walch-­‐Liu  P,  Filleur  S,  Gan  YB.  2005.  Signaling  mechanisms  integrating  root  and  shoot  responses  to  changes  in  the  nitrogen  supply.  Photosynthesis  Research  83:  239-­‐250.    Waldrop  MP,  Zak  DR,  Sinsabaugh  RL,  Gallo  M,  Lauber  C.  2004.  Nitrogen  deposition  modifies  soil  carbon  storage  through  changes  in  microbial  enzyme  activity.  Ecological  Applications,  14:1172–1177.    Wallenda  T,  Kottke  I.  1998.  Nitrogen  depositon  and  ectomycorrhizas.  New  Phytologist  139:169-­‐187.    White  TJ,  Bruns  TD,  Lee  SB,  Taylor  JW.  1990.  Amplification  and  direct  sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA  genes  for  phylogenetics.  In:  Innis  MA,  Gelfand  DH,  Sninsky  JJ,  White  TJ.  PCR  Protocols-­‐  a  Guide  to  Methods  and  Applications.  New  York,  Academic  Press.  p315-­‐322.    

26    

Wölllecke  J,  Münzenberger  B,  Hüttl  RF.  1999.  Some  effects  of  N  on  ectomycorrhizal  diversity  of  scots  pine  (Pinus  sylvestris  L.)  in  Northeastern  Germany.  Water,  Air,  and  Soil  Pollution  116:  135-­‐140.    Zak  DR,  Holmes  WE,  Burton  AJ,  Pregitzer  KS,  Talhelm  AF.  2008.  Simulated  atmospheric  NO3  deposition  increases  soil  organic  matter  by  slowing  decomposition.  Ecological  Applications,  18:2016–2027.                        

27    

Chapter 2 Linking small scale soil chemical variability to fungal niche preference Abstract Soil heterogeneity is often proposed to be an important contributing factor to fungal diversity. Significant evidence exists to suggest that, at least on the scale of horizon-to-horizon variation, consistent shifts in fungal (including just ectomycorrhizal) community can be found to correlate with soil chemical variables. However, significant diversity is found within a given soil horizon, suggesting that if soil chemical factors and niche heterogeneity are driving fungal diversity then a smaller scale of sampling is necessary. We looked at a large number (150) of small (<5g) soil samples taken from a bishop pine forest at Point Reyes National Seashore in northern California. Six 1 X 1 m pits were dug in soils formed from two parent materials (three granitic, three sandstone). Three 70 cm vertical transects were drawn across each soil profile and eight samples were taken per vertical transect. Plant community and stand history were both constant between pits and sites. For each sample %C, %N, pH, and BaCl2-exchangeable Na, Ca, K, and Mg were measured. The fungal community within each sample was characterized using terminal restriction fragment length polymorphism. When all samples from both parent materials are examined together Ca, Mg, pH, and Na stand out as the dominant factors potentially shaping fungal community. However, the variance in fungal community and these soil chemical variables co-correlate with parent material so we cannot isolate the effects of soil chemistry from other site-specific factors. When pits are examined individually depth, %C, and, to a lesser extent, Ca stand out as soil factors strongly correlated with fungal community composition. Other associations between soil chemical factors and fungal community were found (K, pH, %N, Mg), but our sampling design did not allow us to separate the potential influence of geographic location from the influence of these soil parameters. To our knowledge this is the first study which links soil chemical variability to fungal community composition on a scale relevant to individual hyphae.                        

28    

Introduction  Fungal  communities  in  forests  are  remarkably  diverse.  Recent  advances  in  molecular  techniques  have  allowed  the  identification  of  hundreds  of  fungal  taxa  in  small  volumes  of  forest  soil  (Lim  et  al.,  2010;  Buee  et  al.,  2009).  This  tremendous  diversity  has  been  observed  for  both  the  saprotrophic  and  ectomycorrhizal  components  of  the  fungal  community.  Fungal  community  composition  and  diversity  is  altered  by  elevated  CO2  (Parrent  and  Vilgalys,  2007)  and  anthropogenic  nitrogen  deposition  (Wallenda  and  Kottke,  1998  and  references  therein).  Lilleskov  et  al.  (2002a)  and  Parrent  and  Vilgalys  (2007)  suggested  that  these  shifts  in  community  composition  might  be  a  result  of  changing  nutrient  dynamics  within  the  soil.  An  understanding  of  what  soil  factors  control  fungal  community  composition  is  necessary  to  understand  the  implications  of  global  change-­‐induced  shifts  in  fungal  communities.  

We  do  not  have  a  clear  understanding  of  what  factors  control  fungal  community  composition  and  maintain  fungal  diversity.  Studies  have  demonstrated  that  different  soil  horizons  in  forest  soils  have  distinct  fungal  communities  (Rosling  et  al.,  2003;  Dickie  et  al.,  2002;  Lindahl  et  al.,  2007),  but  this  scale  of  examination  is  too  coarse  to  explain  the  observed  diversity  in  fungal  communities  and  may  not  capture  variations  in  soil  chemistry  relevant  to  individual  genets.  Many  studies  have  found  discreet  niches  in  resource  use  among  both  ectomycorrhizal  (Lilleskov  et  al.,  2002b;  Abuzinadah  and  Read,  1986)  and  fungal  saprotrophic  (McQuire  et  al.,  2010;  Gleeson  et  al.,  2005)  communities.  The  majority  of  these  studies  have  been  done  with  either  labeled  substrate  addition  or  in  vitro  pure  culture  studies.  In  their  reviews  on  the  factors  shaping  fungal  diversity  in  forest  soil,  Taylor  (2002)  and  Bruns  (1995)  both  identified  small-­‐scale  (finer  scale  than  horizon)  variation  in  soil  chemistry  as  a  potentially  important  factor  shaping  fungal  community  composition  and  called  for  studies  to  address  the  effects  of  soil  heterogeneity  on  fungal  species  distributions.  

No  studies  have  investigated  the  role  of  small-­‐scale  variation  in  soil  chemistry  in  structuring  fungal  communities  in  forest  soils.  A  few  studies  have  examined  the  role  of  soil  chemistry  in  structuring  fungal  communities  in  grassland  soils  (Moore  et  al.,  2010,  Allison  et  al.,  2007;  Fierer  et  al.,  2003).  They  found  depth  and  carbon  content  to  be  the  soil  parameters  most  strongly  associated  with  fungal  community  composition  These  studies,  however,  have  all  used  large  composite  soil  samples  (>0.5  l),  and  have  thus  likely  obscured  the  role  of  soil  heterogeneity  in  structuring  fungal  communities,  focusing  instead  on  broad,  depth-­‐related  trends.  

We  took  a  large  number  of  small  mineral  soil  samples  across  a  range  of  depths  in  a  pine  forest  to  elucidate  the  role  of  soil  chemistry  in  determining  fungal  community  composition.  We  used  a  PCR-­‐based  community  fingerprinting  method  in  conjunction  with  a  novel  sequential  chemical  analysis  procedure  to  maximize  the  amount  of  soil  chemical  information  from  each  sample  while  minimizing  the  size  of  the  sample  required.  In  doing  so,  we  hoped  to  capture  the  heterogeneous  distribution  of  elements  in  the  soil  at  a  scale  relevant  to  fungal  hyphae.          

29    

Methods  Study  site  Point  Reyes  National  Seashore  is  located  in  west  Marin  County,  California  (38  °04N  by  122  °50W),  approximately  60  km  north  of  San  Francisco.  It  has  a  mixture  of  vegetation  types  but  the  areas  we  sampled  were  dominated  Bishop  Pine  (Pinus  muricata)  forest.  It  has  a  Mediterranean  climate  characterized  by  a  warm  dry  summer  and  a  cool  wet  winter.  Approximately  80%  of  annual  rainfall  (80-­‐160cm  per  year)  falls  between  November  and  March.  Average  air  temperatures  range  between  11oC  and  14oC,  and  average  summer  temperatures  are  around  18oC.    In  October  1995,  a  major  stand-­‐replacing  wildfire  occurred  that  burned  approximately  5000  ha  of  the  park.  

Our  two  study  sites  were  located  in  even-­‐aged  13  year-­‐old  Bishop  pine  forests  derived  from  the  1995  fire.  One  site  (38.085N,  122.865W)  was  on  soils  derived  from  Silurean  granite.  The  granitic  soil  is  an  inceptisol  in  the  soil  series  Sheridan  variant.  It  is  classified  as  a  coarse-­‐loamy,  mixed,  isomesic  ustic  dystrocrept.  This  site  is  located  at  approximately  350  m  above  sea  level  and  is  3.5  km  east  of  the  Pacific  Ocean.  The  other  site  (38.043N,  122.873W)  was  on  soils  derived  from  greywacke  sandstone.  The  sandstone  soil  is  an  alfisol  in  the  soil  series  Tomales.  It  is  classified  as  a  fine,  mixed,  mesic  ultic  paleustalf.  This  site  is  located  at  approximately  150  m  a.s.l.  and  is  1.5  km  east  of  the  Pacific  ocean.  The  two  study  sites  are  approximately  2  km  from  each  other.    Sampling  We  conducted  our  sampling  in  mid-­‐November  of  2007,  approximately  one  month  after  the  start  of  the  Fall  rains.  On  each  study  site  (granitic  and  sandstone)  we  dug  three  pits  within  50  meters  of  each  other.  Each  pit  was  approximately  1  m  wide  and  1  m  deep.    On  one  wall  of  each  pit  we  cut  a  straight  vertical  profile,  and  used  a  brush  to  remove  any  cross  contamination  from  different  depths  that  may  have  occurred  while  digging.  On  each  profile  we  made  three  vertical  transects.  Each  transect  was  a  line  drawn  from  the  soil  surface  straight  down  to  a  depth  of  75  cm.  The  three  vertical  transects  within  each  pit  were  10  cm  apart.  We  sampled  from  5  cm  beneath  the  organic  mineral  horizon  interface  to  a  depth  of  70  cm.  We  sampled  each  vertical  transect  at  depths  of  5cm,  10cm,  15cm,  20cm,  30cm,  40cm,  50cm,  and  60cm,  and  for  each  pit  we  took  one  sample  at  70cm.  Sampling  was  performed  with  a  small  circular  scoop  (a  mellon  baller).  We  removed  one  scoop  (~1-­‐2  cm3)  from  the  exposed  soil  face  for  each  sample  and  placed  it  in  a  small  sealable  plastic  bag.  In  between  samples,  the  scoop  was  cleaned  with  ethanol.  Samples  were  immediately  put  in  a  cooler  with  ice  and  stored  at  4oC  until  processed.    Molecular  Analysis  Within  2  days  of  sampling,  samples  were  homogenized  and  a  0.5  g  subsample  was  taken  for  DNA  extraction.  DNA  was  extracted  from  soil  using  the  PowerSoil  DNA  Isolation  Kit  (Mo  Bio  Laboratories  Inc.,  Carlsbad,  CA)  as  per  manufacturer’s  instructions.  DNA  was  then  diluted  1:25  for  PCR  amplification  with  fluorescent  primers.    PCR  was  conducted  in  50  µl  reaction  volumes  with  the  primers  ITS1-­‐F  (Gardes  &  Bruns,  1993)  and  ITS4  (White  et  al.,  1990)  using  the  cycling  parameters  detailed  in  Gardes  and  Bruns  (1993)  with  the  following  modifications:  two  microliters  molecular-­‐grade  bovine  serum  albumin  (20mg/ml)  was  added  to  each  reaction  to  improve  PCR  efficiency,  and  primers  were  

30    

labeled  with  WellRED  fluorescent  dyes;  ITS-­‐1F  primer  was  labeled  with  D4-­‐PA  and  ITS4  with  D3-­‐PA  (Proligo,  Boulder,  CO,  USA).  Three  5  µl  aliquots  from  each  PCR  product  were  separately  digested  with  the  restriction  enzymes  AluI  (Amersham  Biosciences,  Freiburg,  Germany),  CfoI  (Promega,  Madison,  Wisconsin,  USA),  and  TaqI  (Fermentas,  Glen  Burnie,  Maryland,  USA),  according  to  the  manufacturer’s  instructions.    The  terminal  restriction  fragment  length  polymorphism  (here  after  TRFLP)  patterns  were  analyzed  with  a  Beckman  Coulter  CEQ  8000  Genetic  Analysis  System,  using  the  CEQ  DNA  Size  Standard  Kit-­‐600.    TRFLP  results  were  screened  for  quality  and  only  samples  with  clear  distinct  peaks  (>5000  intensity  units;  max  threshold  150,000)  for  each  fluorescent  primer  were  included.  Excessive  “pullup”  (a  high  intensity  peak  causes  the  occurrence  of  a  spurious  high  intensity  peak  of  the  other  fluorescent  dye  1-­‐3  bp  longer,  and  slightly  lower  in  amplitude)  was  grounds  for  excluding  samples,  as  was  excessive  stuttering  (a  series  of  peaks,  each  1-­‐2  bp  longer  than  the  last  with  decreasing  amplitude).  Only  samples  with  clear,  high  quality  TRFLP  profiles  for  each  of  the  three  restriction  enzymes  were  included  in  the  final  analysis.    Soil  Chemical  Analysis  After  subsampling  for  DNA  extraction  the  remaining  soil  (~4g)  was  divided  into  2  portions.  One  portion  was  dried  at  60oC  for  3  days  in  an  oven,  and  the  other  was  used  for  pH  and  exchangeable  cation  contents.  Before  drying,  the  soil  was  weighed  moist,  and  then  weighed  again  after  drying  to  calculate  the  moisture  content.  After  weighing  the  portion  intended  for  pH  and  exchangeable  cation  analysis,  it  was  immersed  in  a  solution  of  0.1M  BaCl2,  [1:5  soil  mass  (g):  solution  volume  (ml)]  and  pH  was  measured,  after  which  another  10ml  0.1M  BaCl2  was  added  for  cation  exchange  measurement.  BaCl2/soil  slurries  were  shaken  overnight,  centrifuged  at  5000g  at  4oC  for  15  minutes,  and  the  supernatant  solution  was  carefully  removed  to  avoid  collecting  any  soil  particles  with  the  solution.  The  supernatant  soil  solution  was  then  measured  for  elemental  content  on  a  Perkin-­‐Elmer  atomic  optical  emission  inductively  coupled  plasma  emission  spectrometer  (AOE-­‐ICP).  A  set  of  four  standards  was  established  based  on  preliminary  analysis  of  elemental  concentrations.  In  addition  to  hourly  rerunning  of  standards,  duplicates  and  an  internal  scandium  standard  were  run  to  ensure  an  accuracy  of  elemental  contents  to  +/-­‐  1%.    The  calibration  blank  was  an  aliquot  of  the  same  0.1M  BaCl2  solution  used  for  extraction.  We  used  BaCl2  as  our  cation  extractant,  as  opposed  to  the  more  commonly  used  ammonium  acetate,  in  order  to  allow  pH  measurement  from  the  same  sample,  and  reduce  the  required  sample  size.    Dried  soil  was  pulverized  in  a  ball  mill  and  analyzed  for  carbon  and  nitrogen  content  on  a  combustion  elemental  analyzer.  Exchangeable  cation  contents  are  reported  as  µmol  per  gram  soil,  and  carbon  and  nitrogen  contents  as  %C  and  %N  by  weight.    Statistical  Analysis  Correlations  between  soil  chemical  data  were  assessed  by  one-­‐way  ANOVA  using  JMP  software  version  5.01a  (SAS  Institute,  Inc.,  Cary,  NC,  USA).    Differences  between  fungal  communities  and  associations  between  fungal  community  composition  and  soil  chemistry  were  assessed  with  the  statistical  software  PC-­‐ORD  (MjM  Software  Design,  version  5.0,  Gleneden  Beach,  OR,  USA).    Communities  were  examined  at  different  scales;  individual  pit,  

31    

all  3  pits  on  a  parent  material,  and  all  6  pits  together.  All  TRFLP  peak  data  was  treated  as  presence/absence  for  each  enzyme/primer/fragment  length  combination.  At  each  community  scale  examined,  the  TRFLP  profiles  were  reorganized,  and  peaks  that  occurred  in  less  than  10%  of  all  samples  or  more  than  75%  were  not  considered.  Community  differences  were  visualized  using  nonparametric  multidimensional  scaling  (NMS).  NMS  is  a  suitable  method  for  comparing  complex  microbial  community  data  because  it  does  not  assume  a  normalized  distribution  of  species  or  equivalent  variance  between  communities  (Clarke,  1993).  For  NMS  ordination  an  initial  run  was  performed  using  the  “medium  thoroughness”  default  settings  to  identify  the  optimum  dimensionality  of  the  ordination.  After  that,  the  ordination  was  performed  again  (Sorenson’s/Bray-­‐Curtis  distance  measure,  400  maximum  iterations,  0.00001  instability  criterion,  recommended  dimensionality,  100  real  runs  and  200  randomized  trials).  For  NMS  ordination  vectors  are  displayed  in  ordination  plots  to  indicate  the  strength  of  association  between  soil  chemical  data  and  community  composition,  however  these  vectors  only  indicate  relative  explanatory  power  of  the  different  soil  chemical  variables  and  do  not  test  for  statistically  significant  associations.  Mantel  tests  were  independently  conducted  to  assess  the  strength  of  association  between  the  different  soil  chemical  variables  and  fungal  community  composition  (Mantel,  1967).  Mantel  tests  were  performed  using  the  default  parameters  associated  with  the  “randomization”  method  with  5000  iterations,  and  the  Mantel  test  statistic  “r”  is  reported  as  a  measure  of  effect  size  (McCune  and  Grace,  2002).  We  examined  the  relationship  between  fungal  community  and  each  individual  soil  parameter  (parent  material,  pit,  pH,  %C,  %N,  Ca,  Mg,  K,  Na)  All  soil  parameters  were  combined  into  a  distance  matrix  using  NMS  ordination  which  was  then  also  examined  for  its  relationship  to  fungal  community  using  the  Mantel  test.  This  combined  relationship  (not  including  pit  or  parent  material)  will  be  referred  to  as  “aggregate  soil  chemistry”.    Results  Across  all  6  pits  on  both  parent  materials  we  obtained  115  TRFLP  profiles  that  met  our  quality  criteria  out  of  149  soil  samples  (55  sandstone,  60  granite;  16-­‐23  samples/pit).  A  total  of  34  were  excluded  because  of  excessive  “pull-­‐up”,  excessive  stuttering  of  peaks,  or  failing  to  obtain  peaks  above  a  minimum  intensity  threshold  for  each  primer/enzyme  pair.  Our  final  data  set  had  186  peak  sizes  in  total  for  the  6  restriction  enzyme/primer  pairs.  

We  did  not  measure  the  total  contents  of  calcium,  magnesium,  sodium,  or  potassium,  so,  for  brevity,  all  data  for  BaCl2-­‐exchangeable  Ca,  BaCl2-­‐exchangeable  Mg,  BaCl2-­‐exchangeable  Na,  and  BaCl2-­‐exchangeable  K  will  be  referred  to  as  Ca,  Mg,  Na,  and  K,  respectively.    Data  for  the  seven  chemical  parameters  measured  (pH,  %C,  %N,  Ca,  Mg,  Na,  and  K)  are  presented  in  figure  1  (contents  and  co-­‐correlation  of  all  seven  parameters  across  all  six  pits  and  both  parent  materials),  figure  3  (carbon,  magnesium,  and  calcium  contents  as  well  as  co-­‐correlation  of  all  seven  parameters  from  the  three  pits  overlying  granitic  parent  material),  and  figure  5  (carbon,  magnesium,  and  sodium  contents  as  well  as  co-­‐correlation  of  all  seven  parameters  from  the  three  pits  overlying  granitic  parent  material  ).  In  general,  and  particularly  for  Ca,  Mg,  Na,  and  pH,  there  was  more  variation  in  chemical  parameters  between  soils  on  different  parent  materials  than  within  the  all  soil  samples  on  one  parent  material  (figure  1).  For  each  parent  materials  there  was  more  

32    

variation  with  depth  than  between  pits,  but  Na  (sandstone),  Ca  (granite),  Mg  (granite)  and  carbon  (granite)  also  varied  considerably  between  pits.    Many  chemical  parameters  were  strongly  co-­‐correlated  (figure  1).  We  only  sampled  the  mineral  soil,  and  there  was  very  limited  visual  indication  of  distinct  horizons  within  the  mineral  soil.  According  to  national  soil  surveys,  the  pits  on  granitic  parent  material  should  have  been  entirely  in  the  A  horizon,  and  the  sandstone  pits  would  have  included  the  upper  10  cm  of  B  horizon  (USDA  NRCS,  http://casoilresource.lawr.ucdavis.edu).  

 

 Figure  1:  Soil  chemistry  data  for  all  6  pits  on  both  parent  materials.  A:Mg,  B:Ca,  C:pH,  D:Na,  E:  percent  carbon  (by  weight),  F:  percent  nitrogen  (by  weight),  G:K,  H:  correlation  coefficient  for  soil  chemical  variables  (n=150).  For  figures  A-­‐G  each  point  is  the  average  across  all  samples  from  one  depth  from  one  parent  material  (n=9)  and  horizontal  error  bars  are  =  two  standard  deviations.  For  figure  H  r2  correlations  significant  at  p<0.05  are  marked  with  an  *,  p  <  0.01  are  in  bold,  and  p  <0.001  are  in  bold  and  larger  font.    

33    

 Non-­‐parametric  multidimensional  scaling  was  performed  for  each  pit,  each  parent  

material,  and  for  all  samples  combined  (figures  2,4,6).    The  final  statistics  for  each  ordination  are  presented  in  table  1.  In  most  cases  a  three  dimensional  solution  was  optimal,  and  for  all  NMS  plots  the  dominant  three  axis  explained  54  –  85%  of  the  total  variation.  Final  stress  ranged  from  9.4  to  22.3  and  was  proportional  to  the  number  of  samples  examined.    Fungal  Community  Across  Sandstone  and  Granitic  Soils  Examining  the  NMDS  plot  (figure  2),  a  very  clear  division  of  the  fungal  community  according  to  parent  material  is  apparent.  All  7  chemical  factors  examined  (pH,  %C,  %N,  Ca,  Mg,  Na,  and  K)  are  significantly  associated  with  community  composition  according  to  the  Mantel  tests  (Mantel’s  “r”  >  0.068,  p  <  0.02).  Soil  chemistry  is  also  strongly  associated  with  fungal  community  when  the  soil  all  7  soil  chemical  parameters  are  aggregated  into  one  “total  soil  chemistry”  parameter  (Mantel’s  “r”  =  0.311,  p  <  0.0002).  However,  all  7  soil  chemical  factors  co-­‐vary  quite  strongly  with  parent  material  (figure  1).  The  four  chemical  factors  that  have  the  strongest  association  with  fungal  community  composition  are  Mg,  Na,  Ca,  and  pH  (figure  2;  Mantel’s  “r”  >  0.2,  p  <  0.0002),  and  these  are  the  four  chemical  factors  that  most  distinguish  the  soils  on  the  two  parent  materials  (figure  1).    Additionally,  these  4  chemical  factors  are  all  very  strongly  co-­‐correlated  (r2  >0.3,  p  <  0.001).  Overall,  parent  material  is  such  a  dominant  factor  shaping  the  community,  and  chemistry  varies  so  much  with  parent  material,  that  we  can’t  determine  which  chemical  factors  are  most  influential  upon  fungal  community  composition  when  we  look  across  both  parent  materials.            

34    

 Figure  2:  NMS  plot  of  all  samples  (n=115)  and  results  of  Mantel  tests  for  each  soil  chemical  parameter  as  well  as  parent  material.    Vectors  in  ordination  represent  soil  chemical  variables  that  had  a  strong  correlation  with  the  primary  axis    (r2  >0.2),  and  vector  length  is  proportional  the  strength  of  correlation.  (see  table  1  for  final  NMS  statistics)  

 Fungal  Community  on  Granite  On  granite,  the  three  pits  have  distinct  communities,  as  revealed  by  the  NMDS  plot  and  Mantel  test  (figure  4).  Pit  2  separates  more  strongly  from  pits  1  and  3,  primarily  along  axis  2  of  the  NMDS  plot  (35.1  %  of  total  variation),  and  %C  is  strongly  associated  with  this  axis.  Pit  3  separates  from  pits  1  and  2  along  axis  1,  and  Mg  and  Ca  are  strongly  associated  with  this  axis.  Across  the  three  granite  pits  nearly  all  chemical  variables  are  significantly  associated  with  fungal  community  composition.  The  factors  most  strongly  associated  with  fungal  community  composition  are  pit,  Ca,  aggregated  soil  chemistry,  Mg,  depth,  %  C,  and  pH  (figure  4).  Pit  is  clearly  the  dominant  factors  shaping  the  fungal  community  composition  across  the  three  soil  pits  on  granitic  parent  material.  The  two  chemical  factors  most  strongly  associated  with  fungal  community  composition  across  the  three  pits,  Ca  and  Mg,  separate  very  strongly  by  pit.  Pit  3,  which  separated  from  the  other  pits  along  axis  1,  has  markedly  lower  calcium  and  magnesium  contents  (figure  3).  The  only  pit  within  which  Ca  or  Mg  were  significantly  associated  with  community  composition  was  Ca  in  pit  3.  pH  is  significantly  associated  with  community  composition  across  the  three  pits,  but  it  is  strongly  correlated  with  both  carbon  (r2  =0.242,  p  <  0.001)  and  depth  (r2  =0.322,  p  <  0.001)  (figure  3).  The  only  pit  within  which  the  pH  is  significantly  associated  with  the  fungal  community  is  pit  3,  and  this  pit  is  also  the  one  in  which  pH  is  most  strongly  associated  with  depth  (r2,:  pH  with  depth,  pit  3:  0.64;  pit  1:  0.255;  pit  2:  0.264).  The  significant  association  of  nitrogen  with  fungal  community  in  pit  1  can  also  be  explained  by  more  consistency  with  depth  in  plot  1:  (r2:  N  with  depth:  overall:  0.245;  pit  1:  0.635  ;  pit  2:  0.224  ;  pit  3:  0.192).    Across  all  three  plots  carbon  is  strongly  associated  with  axis  2  (35.1  

35    

%  of  total  variation),  and  this  axis  also  separates  the  fungal  community  on  plot  2  from  plots  1  and  3.  While  %  C  changes  more  with  depth  and  parent  material  than  it  does  with  pit  (figures  1,3,5),  pit  2  does  have  a  measurably  higher  carbon  content  throughout  its  depth  than  pits  1  and  3  (figure  3).  Carbon  content  and  depth  are  strongly  associated  with  fungal  community  composition  across  all  three  plots  and  within  each  plot  (figure  4).  Within  each  plot  %C  and  depth  are  associated  with  the  same  NMS  axis  (figure  4).  Across  all  3  granite  pits,  %C  and  depth  are  very  strongly  correlated  with  one  another  (r2  =  0.625,  p  <  0.001),  and  we  cannot  resolve  which  is  more  strongly  associated  with  fungal  community  composition.    

ordination

number of

samples

dimensionality of final solution

% variation explained by 3

dimensions final

stress final

instability

number of

iterations all samples 119 3 53.80% 22.26 0.0008 143

all sandstone 55 3 69% 17.4 0.00001 149 sand pit 1 20 3 79.10% 11.77 0.00001 104 sand pit 2 18 3 70.90% 13.54 0.00001 135 sand pit 3 17 3 76.70% 12.62 0.00001 107 all granite 60 3 64.80% 18.8 0.00009 103

granite pit 1 16 4 81.90% 9.42 0.00009 99 granite pit 2 21 4 71.60% 14.19 0.00009 195 granite pit 3 23 4 79% 0.00001 156 Table  1:  Ordination  results  and  statistics      

 Figure  3:  Magnesium  (top  left),  calcium  (top  right),  and  percent  carbon  content  (bottom  left)  for  all  3  pits  on  granitic  parent  material.  Correlation  coefficient  (bottom  right)  for  soil  chemical  variables  (n=60);  correlation  significant  at  p<0.05  are  marked  with  an  *,  p  <  0.01  are  in  bold,  and  p  <0.001  are  in  bold  and  larger  font.  

36    

Figure  4:  NMS  plots  of  all  granite  samples  (top  left,  n=60)  and  the  samples  within  pit  1  (top  right,  n=16),  pit  2  (bottom  left,  n=21),  and  pit  3  (bottom  right,  n=23)  on  granite  derived  soils  and  results  of  Mantel  tests  for  each  soil  chemical  parameter.    Vectors  in  ordinations  represent  soil  chemical  variables  that  had  a  strong  correlation  with  the  primary  axis    (r2  >0.2),  and  vector  length  is  proportional  the  strength  of  correlation  (within  each  ordination,  not  between  ordinations)(see  table  1  for  final  NMS  statistics).      Fungal  Community  on  Sandstone  On  sandstone,  the  three  pits  have  distinct  communities,  as  revealed  by  the  NMDS  plot  and  Mantel  test  (figure  6).  Pit  6,  in  particular,  separates  strongly  from  pits  4  and  5,  primarily  along  axis  1  of  the  NMDS  plot  (34.1  %  of  total  variation),  and  the  soil  chemical  variables  Na  (very  strongly)  and  Ca  (less  strongly)  are  associated  with  this  axis  (figure  6).  Across  the  three  sandstone  pits  the  factors  most  strongly  associated  with  fungal  community  composition  are  pit,  Na,  aggregated  soil  chemistry,  %  C,  and  calcium,  with  a  weak,  marginally  significant  association  with  depth  (figure  6).  Pit  is  clearly  the  dominant  factor  shaping  the  fungal  community.  Sodium  is  very  strongly  associated  with  fungal  community  when  all  three  pits  are  examined  together,  but  this  seems  to  be  entirely  explained  by  pit  6  (figure  6),  and  when  we  examine  the  soil  chemistry  data  (figure  5)  for  Na  on  sandstone  we  see  that  pit  6  had  markedly  higher  Na  throughout,  so  we  cannot  separate  the  effect  of  

37    

Na  from  the  effect  of  pit  location  on  fungal  community.  When  we  look  at  each  pit  individually,  depth  is  significantly  associated  with  fungal  community  composition  on  two  of  the  three  pits  (pit  4:“r”  =0.169,  p  <  0.034;  pit  6:“r”  =  0.165,  p  <  0.045),  while  %C  (pit  4:“r”  =0.233,  p  <  0.037;  pit  6:“r”  =  0.155,  p  <  0.1)  and  Ca  (pit  4:“r”  =0.165,  p  <  0.1;  pit  6:“r”  =  0.279,  p  <  0.007)  are  both  significantly  associated  with  fungal  community  composition  on  one  of  the  three  pits,  and  marginally  associated  with  fungal  community  composition  on  another  (figure  6).  Across  all  3  sandstone  pits,  %C,  Ca,  and  depth  are  very  strongly  co-­‐correlated  (r2  >0.39,  p  <  0.001),  and,  we  cannot  resolve  which  of  the  three  soil  factors  is  more  strongly  associated  with  fungal  community  composition.    

 Figure  5:  Calcium  (top  left),  percent  carbon  (top  right),  and  sodium  content  (bottom  left)  for  all  3  pits  on  sandstone  parent  material.  Correlation  coefficient  (bottom  right)  for  soil  chemical  variables  (n=55);  correlation  significant  at  p<0.05  are  marked  with  an  *,  p  <  0.01  are  in  bold,  and  p  <0.001  are  in  bold  and  larger  font.  

           

38    

 Figure  6:  NMS  plots  of  all  sandstone  samples  (top  left,  n=55)  and  the  samples  within  pit  1  (top  right,  n=20),  pit  2  (bottom  left,  n=18),  and  pit  3  (bottom  right,  n=17)  on  sandstone  derived  soils  and  results  of  Mantel  tests  for  each  soil  chemical  parameter.    Vectors  in  ordinations  represent  soil  chemical  variables  that  had  a  strong  correlation  with  the  primary  axis    (r2  >0.2),  and  vector  length  is  proportional  the  strength  of  correlation  (within  each  ordination,  not  between  ordinations)(see  table  1  for  final  NMS  statistics).  

   Discussion  What  Part  of  the  Fungal  Community  are  we  Sampling?  This  study  was  originally  intended  to  investigate  the  effects  of  soil  chemistry  on  ectomycorrhizal  fungal  community  composition.  This  is  why  we  did  not  sample  the  organic  horizon  or  the  uppermost  mineral  soil,  where  we  assumed  saprotrophic  fungi  would  dominate  the  fungal  community.  While  the  relative  ratio  of  ectomycorrhizal  fungi  to  saprotrophic  fungi  is  much  higher  in  the  mineral  soil  (Lindahl  et  al.,  2007),  there  are  likely  to  be  many  saprotrophic  fungi  in  the  mineral  soil,  and  we  had  planned  to  eliminate  these  from  our  dataset  by  using  a  database  of  known  ectomycorrhizal  fungi.  We  attempted  to  use  an  extensive  collection  of  ectomycorrhizal  sporocarps  in  conjunction  with  cloning  and  sequencing  to  build  a  reference  database  of  known  TRFLP  types,  similar  to  the  method  used  by  Dickie  et  al.  (2002).  We  had  many  problems  assembling  this  database  so  we  had  to  restrict  our  analysis  to  a  “fingerprint”  of  the  total  fungal  community.    We  did,  however,  assemble  6  clone  libraries  from  a  total  of  36  of  our  samples  

39    

(evenly  distributed  across  parent  material,  pit  and  depth).  Of  118  sequenced  clones,  56%  were  attributed  to  being  of  ectomycorrhizal  origin,  belonging  to  22  operational  taxonomic  units  (OTU’s),  and  44%  were  either  known  or  suspected  saprotrophic  fungi,  belonging  to  24  OTU’s.  Clones  were  picked  after  examination  by  gel  electrophoresis  in  order  to  maximize  taxonomic  coverage  of  our  sequencing  so  clone  abundance  cannot  be  taken  as  an  accurate  indication  of  relative  distribution.  However,  since  there  were  more  OTU’s  of  putatively  saprotrophic  fungi,  and  more  clones  of  ectomycorrhizal  origin,  it  seems  reasonable  to  conclude  that  at  least  half  of  our  TRFLP  peaks  profiles  are  of  ectomycorrhizal  fungi.  However,  given  the  significant  amount  of  saprotrophic  diversity  observed,  we  do  not  know  whether  the  observed  shifts  in  fungal  community  composition  are  due  to  shifts  in  saprotrophic  community  or  ectomycorrhizal  community,  and  this  has  significant  implications  for  the  interpretation  of  our  results.    Role  of  Parent  Material  in  Fungal  Community  Composition  Parent  material  was  the  dominant  factor  shaping  fungal  community  across  the  6  soil  pits.  Soils  formed  from  different  parent  materials  can  be  expected  to  vary  in  many  respects  as  a  result  of  the  mineral  from  which  they  formed  (Shaw,  1930;  Jenny,  1994)  Across  both  parent  materials  all  soil  chemical  characteristics  we  examined  varied  significantly  with  parent  material,  and  the  soil  chemical  factors  that  varied  most  with  parent  material  were  the  most  strongly  associated  with  fungal  community  composition.  Given  that  carbon  was  strongly  associated  with  fungal  community  composition  at  the  pit  scale  but  very  weakly  across  both  parent  materials,  it  is  clear  that  location  or  parent  material  exerts  a  strong  influence  on  fungal  community  composition,  but  we  cannot  assess  the  relative  importance  of  any  particular  chemical  factor  in  determining  fungal  community  composition  at  this  broad  scale.         When  examining  the  effect  of  parent  material,  we  cannot  separate  the  effects  of  chemistry  from  the  role  of  geographic  location  in  shaping  fungal  community.  Rainfall  and  sea  salt  inputs  may  contribute  to  the  different  communities  observed  on  the  different  parent  materials.  The  elevation  of  the  sandstone  plots  is  approximately  150  meters  lower  than  the  granite  plots,  and  the  sandstone  plots  are  located  approximately  2km  closer  to  the  sea  (~1.5  km  vs.  ~3.5  km).  As  a  result  of  these  geographic  factors,  the  annual  rainfall  is  approximately  10%  higher,  and  one  can  assume  that  any  ocean  derived  salt  inputs  from  precipitation  significantly  higher  at  the  sandstone  plots.  Sea  salt  inputs  have  been  shown  to  significantly  lower  soil  pH  (Lydersen  and  Henriksen,  1995)  and  this  may  explain  the  lower  pH  of  the  soils  formed  on  sandstone.  The  higher  precipitation  inputs  may  be  expected  to  have  significant  effects  on  the  fungal  community  of  these  seasonally  dry  soils,  though  at  the  time  of  our  sampling  we  were  1  month  into  the  wet  season,  and  we  did  not  detect  any  significant  difference  in  soil  moisture  between  the  different  soils  (data  not  shown).      

 Role  of  Soil  Chemistry  in  Fungal  Community  Composition  On  each  parent  material,  carbon  content  and  depth  stand  out  as  the  dominant  variables  that  correlate  with  fungal  community  composition.  Magnesium  and  calcium  are  strongly  associated  with  fungal  community  composition,  but  Ca  and  Mg  also  correlate  strongly  with  pit.  Calcium  is  significantly  associated  with  fungal  community  composition  in  one  pit  

40    

on  each  parent  material  including  pit  3  on  the  granite  derived  soil.  This  pit  also  has  the  lowest  calcium  content  of  all  pits.    Overall  though,  the  lack  of  a  consistent  effect  of  calcium,  nor  any  significant  effect  of  magnesium  on  fungal  community  at  the  pit  scale,  in  conjunction  with  their  tendency  to  vary  considerably  between  pits  suggests  that  Mg  and  Ca  contents  may  be  proxies  for  pit  location  and  not  significant  factors  in  shaping  fungal  community  composition.  Sodium  is  strongly  associated  with  fungal  community  composition  on  soils  formed  from  sandstone,  but  Na  is  not  a  macronutrient  for  plants,  and  it  is  more  abundant  in  soils  formed  from  sandstone  parent  material.  Given  that  it  forms  less  than  5%  of  extractable  cations  (Mg  and  Ca  form  >80  %)  it  seems  unlikely  that  Na  is  driving  fungal  community  composition.  Pit  6  on  sandstone,  had  a  significantly  different  fungal  community  than  pits  4  and  5  and  markedly  higher  sodium  content.  While  it  did  not  appear  to  have  a  more  ocean-­‐facing  aspect  than  the  other  pits  (<50  meters  apart,  all  in  closed  canopy  forest  with  similar  slope  and  aspect),  it  is  possible  that  the  higher  exchangeable  Na  from  this  pit  is  a  marker  of  significantly  higher  sea  salt  effects.  However,  we  would  expect  a  lower  pH  and  lower  contents  of  non-­‐marine  base  cations  (K,  Ca,  Mg)  to  be  associated  with  markedly  higher  sea  salt  inputs,  and  we  did  not  observe  this.    

The  strong  association  between  fungal  community  and  carbon  content  suggests  that  the  differences  we  observed  in  the  fungal  community  may  be  primarily  driven  by  shifts  in  the  saprotrophic  fungal  community.  While  carbon  correlates  with  nitrogen,  pH  and  base  cations  across  all  soil  samples,  it  consistently  stands  out  as  the  dominant  factor  shaping  community  composition.  There  is  evidence  that  ectomycorrhizal  fungi  can  obtain  energy  from  soil  carbon  (Cullings  et  al.,  2008,  Courty  et  al.,  2007),  but  saprotrophic  activity  by  ectomycorrhizal  fungi  appears  to  only  be  significant  when  carbon  allocation  by  the  host  plant  is  cut-­‐off  (drought,  girdling,  defoliation)  (Baldrian  et  al.,  2009),  and  we  sampled  the  fungal  community  during  the  period  of  maximum  carbon  allocation  to  roots.  Given  that  these  forests  are  considered  to  be  nitrogen-­‐limited,  and  there  was  considerable  range  of  nitrogen  content  observed,  we  would  expect  nitrogen  to  be  an  important  determinant  of  fungal  community  composition  if  the  observed  changes  in  the  fungal  community  were  driven  by  shifts  in  the  distribution  and  abundance  of  ectomycorrhizal  fungi.  Nitrogen  was  only  associated  with  fungal  community  composition  in  two  pits,  and  only  marginally  significantly  (p  <  0.06,  p  <0.1).  The  carbon  to  nitrogen  ratio  (C:N)  was  9.5  across  all  soils  (did  not  vary  markedly  with  depth,  or  parent  material,  data  not  shown);  this  is  well  below  the  fungal  biomass  C:N  ratio  (Wallander  et  al.,  2003),  indicating  that  the  saprotrophic  fungal  community  is  limited  by  carbon  availability.  The  lack  of  a  strong  effect  of  nitrogen  or  potassium  (the  most-­‐commonly  growth  limiting  cation  in  temperate  forests)  on  fungal  community  composition  and  the  low  soil  C:N  suggest  that  the  relationship  between  soil  carbon  and  fungal  community  is  driven  by  shifts  in  the  saprotrophic  fungal  community.    

Our  finding  that  carbon  content  was  very  strongly  associated  with  fungal  community  composition  is  not  in  agreement  with  other  studies  in  forests,  though  no  studies  have  examined  the  effects  of  mineral  soil  carbon  distribution  on  fungal  community  composition  in  forests.    Lauber  et  al.  (2008)  and  Kasel  et  al.  (2008)  both  compared  fungal  communities  across  multiple  forest  types  and  failed  to  find  an  effect  of  soil  carbon  content  on  fungal  community.  However,  both  studies  took  large  (>1  liter)  soil  samples  that  included  the  litter  layer,  organic  horizon  and  only  the  top  few  cm  (<8)  of  

41    

mineral  soil,  and  any  carbon  effects  were  thus  dominated  by  the  thickness  of  the  organic  horizon  and  litter  layer.    These  are,  to  the  author’s  knowledge,  the  only  studies  that  have  investigated  the  role  of  soil  carbon  in  determining  fungal  community  composition  in  forest  soils.  A  number  of  studies  have  investigated  the  effect  of  soil  carbon  content  in  the  mineral  soil  on  microbial  community  composition  in  grasslands,  and  carbon  content  is  consistently  found  to  be  the  chemical  factor  most  strongly  correlated  with  fungal  community  composition  (Moore  et  al.,  2010,  Allison  et  al.,  2007;  Fierer  et  al.,  2003).    

To  the  author’s  knowledge,  the  only  studies  investigating  depth  effects  on  fungal  community  composition  in  forests  have  done  so  by  comparing  the  ectomycorrhizal  community  on  root  tips  between  soil  horizons.  These  studies  consistently  find  a  strong  effect  of  horizon  on  ectomycorrhizal  fungal  community  composition  (Rosling  et  al.,  2003;  Dickie  et  al.,  2002;  Scattolin  et  al.,  2008).  A  number  of  studies  have  found  a  strong  association  between  total  fungal  community  composition  and  depth  in  grassland  soils.  Robinson  et  al.  (2009)  used  nearly  identical  TRFLP  fingerprinting  methods  to  ours  to  determine  the  effect  of  depth  on  the  fungal  community  composition  in  a  grassland  soil  approximately  5  km  from  our  study  site.  They  sampled  2  depths  (1.5  cm,  14.5cm)  and  found  that  across  a  wide  range  of  spatial  scales  the  TRFLP  profiles  of  the  fungal  community  were  more  similar  between  different  cores  taken  from  the  same  depth  (25  cm  to  96m  apart)  than  between  the  two  depths  of  an  individual  soil  core  (13cm  apart).    Moore  et  al.  (2010),  Allison  et  al.  (2007),  and  Fierer  et  al.  (2003)  found  that,  though  very  strongly  associated  with  carbon,  depth  was  an  even  stronger  determinant  of  fungal  community  than  carbon  alone.    Allison  et  al.  (2007)  and  Moore  et  al.  (2010)  both  suggest  that  carbon  is  the  most  important  depth-­‐related  factor  in  determining  fungal  community  composition,  but  also  indicate  that  calcium  availability  may  be  an  important  component  of  the  association  of  microbial  community  composition  with  depth.  Rooting  distribution,  and  the  associated  exudation  of  labile  carbon  may  also  exert  a  controlling  effect  on  fungal  community  composition  in  forest  soils  (Brant  et  al.,  2006),  and  this  may  be  another  depth-­‐related  factor  controlling  fungal  community  composition.      Methodological  Considerations  There  are  limitations  associated  with  using  terminal  restriction  fragment  length  polymorphism  as  a  community  “fingerprinting”  method  (see  review  by  Avis  et  al.,  2006).  Differences  in  peak  profiles  can  be  caused  by  incomplete  restriction  digest.  Multiple  OTU’s  may  yield  the  same  peak  profile,  and  individual  taxa  may  yield  multiple  restriction  profiles.  Compiling  a  database  of  peak  profiles  from  known  fungal  species  will  reduce  the  deleterious  effects  of  these  potential  sources  of  error  in  TRFLP  methods.  However,  TRFLP  fingerprinting  methods  are  reproducible  (Thies  et  al.,  2007;  Edel  Hermann  et  al.,  2004),  and  widely  used.  Our  methods  were  internally  consistent,  and  our  results  were  sufficiently  strong  and  our  sampling  sufficiently  intensive  that  we  do  not  believe  that  these  possible  sources  of  error  caused  spurious  correlations.  One  limitation  of  any  community  profiling  method  that  we  have  already  addressed  is  that  it  cannot  be  used  to  isolate  polyphyletic  groups,  such  as  ectomycorrhizal  fungi.  A  limitation  of  any  molecular  method  involving  DNA  extraction  from  soil  is  that  we  cannot  separate  the  potential  contributions  of  fungal  spores  from  that  of  fungal  hyphae  (our  target)  to  our  peak  profiles,  but  we  find  that  only  very  high  levels  of  spores  can  be  detected  (Bruns,  pers.  observ.).    

42    

Our  sampling  strategy  was  flawed  in  its  spatial  design  due  to  incorrect  assumptions  about  the  soil  chemical  variability  we  would  encounter.    We  were  unable  to  determine  the  relative  importance  of  geographic  location  or  certain  soil  chemical  factors  strongly  associated  with  fungal  community  in  shaping  fungal  community  composition.  We  anticipated  more  variation  in  soil  chemical  variables  within  pits  and  less  between  pits  or  parent  materials.  We  designed  our  sampling  strategy  to  maximize  soil  chemical  variability,  but  we  did  so  underestimating  how  much  soil  chemistry  would  vary  with  distance.  We  assumed  that  autocorrelation  of  fungal  community  with  distance  would  drop  so  rapidly  that  pit  separated  by  more  than  5  meters  should  be  independent.  (Lilleskov  et  al.,  2004),  but  given  that  we  cannot  separate  the  effects  of  distance  from  the  effects  of  parent  material,  magnesium,  nitrogen,  sodium,  pH,  or  calcium  on  fungal  community  composition,  this  may  not  be  true  at  the  scale  we  have  sampled.    Calcium,  though,  does  appear  to  be  more  strongly  associated  with  fungal  community  than  location  alone  could  explain.  Phosphorous  is  an  important  nutrient,  and  we  neglected  to  include  it  in  our  soil  chemical  analysis  because  we  did  not  think  we  would  have  enough  material  left  over  from  our  very  small  soil  samples  after  analyzing  the  seven  parameters  we  analyzed  to  perform  phosphorous  analysis.  In  actuality,  we  had  extra  material  and  likely  could  have  both  collected  smaller  samples  (potentially  increasing  soil  chemical  variability)  and  performed  phosphorous  analysis.      Conclusion  In  the  mineral  soil  of  Pinus  muricata  forests  at  Point  Reyes  National  Seashore  soil  carbon  and  depth  have  a  very  strong  influence  on  fungal  community  composition.  Parent  material  and  calcium  content  also  appear  to  exert  considerable  influence  on  fungal  community  composition  but  our  sampling  scheme  did  not  allow  us  to  eliminate  location  or  distance  as  a  possible  cause  for  their  apparent  influence  on  fungal  community  composition.  This  study  has  demonstrated  the  potential  of  a  novel  approach  to  elucidating  the  role  of  very  small-­‐scale  variation  in  soil  chemistry  in  shaping  microbial  communities.  In  future  studies,  sampling  schemes  should  be  designed  with  consideration  for  the  spatial  scale  of  soil  chemical  variation  inherent  to  the  study  area.                          

43    

References  Cited    Abuzinadah  RA,  Read  DJ.  1986.  The  role  of  proteins  in  the  nitrogen  nutrition  of  ectomycorrhizal  plants.  I.  Utilization  of  peptides  and  proteins  by  ectomycorrhizal  fungi.  New  Phytologist  103:481-­‐493.    Albrecht  R,  Perissol  C,  Ruaudel  F,  Le  Petit  J,  Terrom  G.  2010.  Functional  changes  in  culturable  microbial  communities  during  a  co-­‐composting  process:  Carbon  source  utilization  and  co-­‐metabolism.  Waste  Management  30:764-­‐770.    Allison  VJ,  Yermakov  Z,    Miller  RM,  Jastrow  JD,  Matamala  R.  2007.  Using  landscape  and  depth  gradients  to  decouple  the  impact  of  correlated  environmental  variables  on  soil  microbial  community  composition.  Soil  Biology  &  Biochemistry  39:  505–516.    Baldrian  P.  2009.  Ectomycorrhizal  fungi  and  their  enzymes  in  soils:  is  there  enough  evidence  for  their  role  as  facultative  soil  saprotrophs?  Oecologia  161:657–660.    Brant  JB,  Myrold  DD,  Sulzman  EW.  2006.  Root  controls  on  soil  microbial  community  structure  in  forest  soils.  Oecogia:148:  650-­‐659  .    Buee  M,  Reich  M,  Murat  C,  Morin  E,  Nilsson  RH,  Uroz  S,  Martin  F.  2009.  454  Pyrosequencing  analyses  of  forest  soils  reveal  an  unexpectedly  high  fungal  diversity  New  Phytologist  184:  449-­‐456.          Clarke  KR.  1993.  Non-­‐parametric  multivariate  analyses  of  changes  in  community  structure.  Australian  Journal  of  Ecology  18:117–143.    Cullings  K,  Ishkhanova  G,  Henson  J.  2008.  Defoliation  effects  on  enzyme  activities  of  the  ectomycorrhizal  fungus  Suillus  granulatus  in  a  Pinus  contorta  (lodgepole  pine)  stand  in  Yellowstone  National  Park.  Oecologia  158:77–83    Courty  PE,  Breda  N,  Garbaye  J.  2007.  Relation  between  oak  tree  phenology  and  the  secretion  of  organic  matter  degrading  enzymes  by  Lactarius  quietus  ectomycorrhizas  before  and  during  bud  break.  Soil  Biology  and  Biogeochemistry  7:  1655-­‐1633.    Dickie  IA,  Xu  B,  Koide  RT.  2002.  Vertical  niche  differentiation  of  ectomycorrhizal  hyphae  in  soil  as  shown  by  T-­‐RFLP  analysis.  New  Phytologist  156:  527–535.    Dickie  IA,  Richardson  SJ,  Wiser  SK.  2009.  Ectomycorrhizal  fungal  communities  and  soil  chemistry  in  harvested  and  unharvested  temperate  Nothofagus  rainforests.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  39:1069-­‐1079.    Edel-­‐Hermann  V,  Dreumont  C,  Perez-­‐Piqueres  A,    Steinberg  C.  2004.  Terminal  restriction  fragment  length  polymorphism  analysis  of  ribosomal  RNA  genes  to  assess  changes  in  fungal  community  structure  in  soils.  FEMS  Microbiology  Ecology  47:397-­‐404.    

44    

Fierer  N,    Schimel    JP,  Holden  PA.  2003.  Variations  in  microbial  community  composition  through  two  soil  depth  profiles  Soil  Biology  &  Biochemistry  35:  167–176.    Gardes  M,  Bruns  TD.  1993.  ITS  primers  with  enhanced  specificity  for  basidiomycetes  -­‐  application  to  the  identification  of  mycorrhizae  and  rusts.  Molecular  Ecology  2:113-­‐118.    Gleeson  DB.  Clipson  N,  Melville  K,  Gadd  GM,  McDermott  FP.  2005.  Characterization  of  fungal  community  structure  on  a  weathered  pegmatitic  granite.  Microbial  ecology  50:360-­‐368.    Jenny  H,  Amundson.  1994.  Factors  of  soil  formation:  A  System  of  Quantitative  Pedology.  Dover  Publications,  New  York.  Foreword  by  Amundson  R,  reprint  of  original  work:  Factors  of  soil  formation  :  a  system  of  quantitative  pedology  by  Jenny  H.  1941.New  York:  McGraw-­‐Hill.    Kasel  S,  Bennett  LT,  Tibbits  J.  2008.  Land  use  influences  soil  fungal  community  composition  across  central  Victoria,  south-­‐eastern  Australia.  Soil  Biology  &  Biochemistry  40:1724–1732.    Lilleskov  EA,  Fahey  TJ,  Horton  TR,  Lovett  GM.  2002a.  Below-­‐ground  ectomycorrhizal  fungal  community  change  over  a  nitrogen  deposition  gradient  in  Alaska.  Ecology  83:104-­‐115.    Lilleskov  EA,  Hobbie  EA,  Fahey  TJ.  2002b.  Ectomycorrhizal  fungal  taxa  differing  in  response  to  nitrogen  deposition  also  differ  in  pure  culture  organic  nitrogen  use  and  natural  abundance  of  nitrogen  isotopes.  New  Phytologist  154:  219–231.    Lim  YW,  Kim  BK,  Kim  C,  Jung  HS,  Kim  BS,  Lee  JH,  Chun  J.  2010.  Assessment  of  soil  fungal  communities  using  pyrosequencing.  The  Journal  of  Microbiology  48:284-­‐289.    Lindahl  BD,  Ihrmark  K,  Boberg  J,  Trumbore  SE,  Högberg  P,    Stenlid  J,  Finlay  RD.  2007.  Spatial  separation  of  litter  decomposition  and  mycorrhizal  nitrogen  uptake  in  a  boreal  forest.  New  Phytologist  173:  611–620.      Lydersen  E,  Henriksen  A.  1995.  Seasalt  effects  on  the  acid  neutralizing  capacity  of  streamwaters  in  Southern  Norway.  Nordic  Hydrology  26:369-­‐388.    Mantel,  N.  1967.  The  detection  of  disease  clustering  and  generalized  regression  approach.  Cancer  Research  27,  209-­‐220.    McCune,  B.,  Grace,  J.B.,  2002.  Analysis  of  Ecological  Communities.  MjM  Software  Design,  Gleneden  Beach,  Oregon,  USA.      McGuire  KL,  Bent  E,  Borneman  J,  Majumder  A,  Allison  SD,  Treseder  KK.  2010.  Functional  diversity  in  resource  use  by  fungi.  Ecology  91:  2324-­‐2332.    

45    

 Moore  J,  Macalady  JL,  Schulz  MS,  White  AF,  Brantley  SL.  2010.  Shifting  microbial  community  structure  across  a  marine  terrace  grassland  chronosequence,  Santa  Cruz,  California.  Soil  Biology  &  Biochemistry  42:21–31.    Parrent  JL,  Vilgalys  R.  2007.  Biomass  and  compositional  responses  of  ectomycorrhizal  fungal  hyphae  to  elevated  CO2  and  nitrogen  fertilization.  New  Phytologist  176:  164–174.    Robinsona  CH,  Szaro  TM,  Izzo  AD,  Anderson  IC,    Parkin  PI,  Bruns  TD.  2009.  Spatial  distribution  of  fungal  communities  in  a  coastal  grassland  soil.  Soil  Biology  &  Biochemistry  41:  414–416.    Rosling  A,  Landeweert  R,  Lindahl  BD,  Larsson  KH,  Kuyper  TW,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2003.  Vertical  distribution  of  ectomycorrhizal  fungal  taxa  in  a  podzol  soil  profile  New  Phytologist  159:  775–783.      Scattolin  L,  Montecchio  L,  Mosca  E,  Agerer  R.  2008.  Vertical  distribution  of  the  ectomycorrhizal  community  in  the  top  soil  of  Norway  spruce  stands.  European  Journal  of  Forest  Research  127:347–357.    Shaw  CF.  1930.  Potent  factors  in  soil  formation  Source:  Ecology  11:  239  -­‐245    Taylor,  AFS.  2002.    Fungal  diversity  in  ectomycorrhizal  communities:  sampling  effort  and  species  detection.    Plant  and  Soil  244:  19–28.    Thies  JE.  2007.Soil  Microbial  Community  Analysis  using  Terminal  Restriction  Fragment  Length  Polymorphisms.  Soil  Science  Society  of  America  Journal  71:  579-­‐591.    Wallander  H,  Nilsson  LO,  Hagerberg  D,  Rosengren  U.  2003.    Direct  estimates  of  C:N  ratios  of  ectomycorrhizal  mycelia  collected  from  Norway  spruce  forest  soils.  Soil  Biology  &  Biochemistry  35:997–999.    Wallenda  T,  Kottke  I.  1998.  Nitrogen  depositon  and  ectomycorrhizas.  New  Phytologist  139:169-­‐187.    White  TJ,  Bruns  TD,  Lee  SB,  Taylor  JW.  1990.  Amplification  and  direct  sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA  genes  for  phylogenetics.  In:  Innis  MA,  Gelfand  DH,  Sninsky  JJ,  White  TJ.  PCR  Protocols-­‐  a  Guide  to  Methods  and  Applications.  New  York,  Academic  Press.  p315-­‐322.            

46    

Chapter  3    Can  ectomycorrhizal  weathering  activity  respond  to  host  nutrient  demands?    Abstract  Ectomycorrhizal  fungi  may  make  a  significant  contribution  to  mineral  weathering  in  temperate  and  boreal  forests.  It  is  important  to  know  how  this  weathering  activity  will  be  affected  by  changing  nutrient  demands  of  forests  affected  by  global  change  and  nitrogen  deposition.  This  review  looks  at  how  belowground  carbon  allocation  in  plants  is  affected  by  nutrient  demand  and  at  a  number  of  experiments  that  have  examined  ectomycorrhizal  weathering  activity.  Plant  physiology  literature  indicates  that  plants  can  respond  to  phosphorus  limitation  by  allocating  more  carbon  belowground  and  increasing  root  branching  in  areas  of  high  P  availability.    Increasing  expression  and  upregulation  of  phosphorus  and  potassium  uptake  transporters  has  been  observed  under  P-­‐  and  K-­‐  limitation,  respectively.  There  is  evidence  for  a  negative  feedback  between  magnesium-­‐  and  potassium-­‐  deficiency  and  belowground  carbon  allocation.  There  are  very  few  ectomycorrhizal  weathering  experiments  that  explicitly  test  how  weathering  activity  responds  to  nutrient  demand.  Field  studies  suggest  that  hyphal  colonization  of  readily  available  P  sources  does  increase  with  increased  P  demand  of  the  host.  In  microcosm  studies  there  is  indirect  evidence  that  weathering  activity  may  increase  in  response  to  P,  K,  or  Mg  demand.  Recommendations  are  made  for  how  future  ectomycorrhizal  research  can  better  address  this  question.  More  research  on  how  plants  sense  and  respond  to  nutrient  limitation,  as  well  as  genomic  data  from  gymnosperms  would  also  aid  our  understanding  of  this  important  aspect  of  forest  ecology.                              

47    

Introduction  Ectomycorrhizae  are  considered  to  be  weathering  agents  in  temperate  and  boreal  ecosysytems  (see  reviews  by  van  Scholl  et  al.,  2008;  Hoffland  et  al.,  2004;  Landeweert  et  al.,  2001;  van  Breeman  et  al.,  2000  and  other  articles  in  this  issue).  There  is  considerable  debate  about  the  significance  of  this  biotic  component  of  weathering.  Understanding  and  quantifying  the  ectomycorrhizal  contribution  to  mineral  weathering  may  be  particularly  important  to  forest  managers  attempting  to  minimize  time  between  stand  harvest  without  depleting  mineral  nutrient  levels  in  the  soil  and  to  policy  makers  determining  critical  loads  of  atmospheric  pollutants.    

Ectomycorrhizal  fungal  communities  are  dynamic,  composed  of  many  species,  with  somewhat  discreet  ecological  niches.  Nitrogen  deposition  (Avis  et  al.,  2008;  Lilleskov  et  al.,  2002)  and  increasing  CO2  levels  (Parrent  and  Vilgalys,  2007)  have  been  observed  to  cause  a  shift  in  the  community  composition  of  ectomycorrhizal  fungi  (ECM)  in  a  given  forest.  While  it  is  unclear  what  causes  these  changes,  it  has  been  suggested  that  trees  may  be  selecting  for  ECM  species  that  best  satisfy  the  host  plant’s  altered  nutrient  demand  (Lilleskov  et  al.,  2002;  Treseder,  2004).    It  is  important  to  know  how  ectomycorrrhizal  weathering  rates  will  respond  to  changing  nutrient  status  of  forests  to  determine  what  measures  must  be  taken  to  guarantee  forest  health  as  humans  continue  to  alter  the  global  carbon  and  nitrogen  cycles.  This  review  examines  what  is  known  about  how  weathering  activity  of  ectomycorrhizal  fungi  (both  communities  and  individual  species)  responds  to  nutrient  demand.  First,  attention  is  given  to  our  understanding  of  how  host  plant  nutrient  demand  is  sensed  by  the  plant  and  communicated  to  the  roots,  then  research  on  ectomycorrhizal  weathering  is  discussed  with  recommendations  for  further  studies.  For  the  purposes  of  this  review  we  will  focus  on  nutrient  demand  of  P,  K,  Mg,  and  Ca,  although  S  and  sometimes  Fe  are  also  important  nutrients  to  consider  in  regards  to  weathering  activity.  Ectomycorrhizal  weathering  activity  will  be  defined  as  any  activity  on  the  part  of  the  fungus  that  increases  the  rates  of  element  release  from  mineral  surfaces,  such  as  proton  exudation,  organic  acid  exudation,  or  element  removal  from  the  mineral  surface.    Relevant  aspects  of  root  physiology    When  considering  how  ectomycorrhizal  weathering  rates  may  respond  to  host  plant  nutrient  demand  two  important  questions  stand  out:  ♦ Is  nutrient  demand  of  the  aboveground  portions  of  the  host  plant  communicated  to  

the  roots?  And  if  so,  how?  ♦ How  can  ectomycorrhizae  respond  to  host  nutrient  demand?  

The  first  question  addresses  belowground  carbon  allocation  and  root  growth  of  the  plant,  and  the  focus  is  almost  entirely  on  the  plant,  whereas  the  second  question  incorporates  plant  physiology,  fungal  physiology  and  community  ecology  and  the  primary  focus  is  the  root  apoplast-­‐fungal  interface.        Plant  responses  to  nutrient  demand  is  a  broad  subject;  what  follows  is  a  concise  review  of  aspects  of  plant  nutrient  sensing  and  root  physiology  relevant  to  the  central  question  of  whether  ectomycorrhizal  weathering  can  respond  to  plant-­‐host  demand  for  P,  K,  Mg,  and  Ca.  There  are  three  (overlapping)  mechanisms  by  which  a  plant  can  increase  nutrient  uptake  by  its  roots.  

48    

♦ Increased  C  allocation  belowground    ♦ Increased  C  allocation  to-­‐  and/or  root  branching  in-­‐  a  particular  part  of  the  root  

system  ♦ Increased  expression  or  upregulation  of  nutrient  transporters.  

The  first  is  sometimes  called  “systemic”  control  and  the  second  and  third  “localized”,  implying  that  belowground  allocation  is  controlled  by  overall  plant  nutrient  status  while  localized  root  branching/proliferation  and  transporter  expression  and  regulation  are  controlled  by  the  roots,  but  there  is  ample  evidence  that  the  “localized”  characters  may  also  be  systemically  controlled  (Ford  and  Lorenzo,  2001).      

Nearly  all  of  the  research  done  to  date  on  plant  nutrient  status  sensing  and  regulation  of  nutrient  acquisition  has  been  done  on  model  organisms  or  crop  plants,  all  of  which  are  angiosperms  (as  opposed  to  gymnosperms  which  comprise  the  majority  of  temperate  and  boreal  forest  cover),  and  nearly  all  of  which  form  arbuscular  mycorrhizae    (as  opposed  to  ectomycorrhizae  which  are  the  primary  focus  of  this  article).  However,  in  the  limited  number  of  cases  where  ECM  forming  host  plants  are  examined  their  reactions  to  nutrient  limitation  seem  qualitatively  similar.    

Phosphorus  deficiency  inhibits  the  growth  of  new  plant  tissues,  particularly  aboveground  shoots  and  leaves  (Radin  and  Eidenbock,  1984),  leading  to  a  buildup  of  sugars  and  starches  in  leaves  which  in  turn  causes  increased  phloem  loading  of  sugars,  and  C  transport  to  the  roots  (Cakmak  et  al.,  1994a;  Cakmak  et  al.,  1994b;  Qiu  and  Israel,  1992).  Increased  P  demand  has  been  found  in  a  number  of  studies  (including  the  EM  associate  Betula  pendula)  to  cause  increased  belowground  carbon  allocation  and  increased  root:  shoot  ratios  (Andrews  et  al.,  1999;  Cakmak  et  al.,  1994a;  Ericsson  et  al.,  1995;  Hermans  et  al.,  2006).  Increased  root  growth  and  branching  is  generally  found  in  patches  of  high  P  availability  when  plants  are  P-­‐limited  (Robinson,  1994;  Drew  et  al.,  1975;  Lopez-­‐Bucio  et  al.,  2003).  Numerous  studies  have  found  increased  expression  and  up  regulation  of  high-­‐affinity  P  transporters  in  the  roots  of  phosphorous  deficient  plants  covering  a  wide  range  of  species  (see  refs.  in  Wang  et  al.,  2006).  

Potassium  deficiency  causes  a  buildup  of  carbohydrates  in  the  leaf,  but  also  inhibits  phloem  loading  of  carbohydrates  (Hermans  et  al.,  2006).  Andrews  et  al.  (1999)  found  either  no  effect  (Pisum  sativum,  Phaseolus  vulgaris)  or  a  marginal  increase  in  root:shoot  with  increasing  K  limitation  (Triticum  aestivum).  In  general,  however,  K  deficiency  has  been  found  to  decrease  belowground  carbon  allocation  and  root:shoot  (including  on  ECM  associate  Betula  pendula)  (Cakmak  et  al.,  1994;  Ericsson  and  Kahr,  1993;  Ericsson,  1995).  Numerous  studies  find  plants  (including  ECM  gymnosperm  associate  Picea  stitchensis)  unable  to  respond  to  local  concentration  gradients  of  potassium  by  enhanced  growth  or  branching  in  areas  of  elevated  K  availability  (Gile  and  Carrero,  1917;  Drew,  1975;  Philipson  and  Coutts,  1977;  Ashley  et  al.,  2006).  A  number  of  studies  have  found  high  affinity  root  K  transporters  are  up-­‐regulated  in  response  to  K  deprivation  (see  refs  in  review  by  Wang  et  al.,  2006).  

Mg  deficiency  causes  a  sharp  inhibition  of  sugar  loading  into  the  phloem,  and  this  is  generally  found  to  result  in  a  sharp  decrease  in  belowground  carbon  allocation  in  a  wide  range  of  plants  (including  both  gymnosperm  and  angiosperm  ECM  associates),  even  at  only  moderate  levels  of  Mg  deficiency  (Ericsson,  1995:  Ericsson  and  Kahr,  1995;  Cakmak  and  Kirby,  2008;  Andrews,  1999).  Ericsson  and  Kahr  (1995)  also  observed  that  

49    

ectomycorrhizal  development  was  strongly  suppressed  in  Mg-­‐limited  spruce  seedlings.  Indirect  evidence  suggests  that  plant  root  systems  are  not  able  to  alter  root  growth  patterns  to  take  advantage  of  localized  patches  of  high  Mg  availability.  There  is  very  little  data  available  on  root  Mg  transporters  (Wang  et  al.  2006).  

Ca  deficiency  generally  inhibits  the  formation  of  new  tissues.  This  may  cause  an  increase  in  leaf  soluble  carbohydrate  concentrations  and  result  in  increased  root:shoot  and  belowground  C  allocation.  A  slight  increase  in  root:  shoot  with  decreasing  plant  Ca  concentrations  has  been  observed  in  a  number  of  studies  (Lopez-­‐Lefebre  et  al.,  2001;  Ingestad  and  Lund,  1986),  but  this  increase  is  always  marginal  and  the  increased  root:shoot  likely  reflects  growth  inhibition  of  aboveground  apical  meristems  and  not  an  increase  in  belowground  C  allocation.  The  majority  of  calcium  is  thought  to  enter  the  plant  with  bulk  flow  of  evapotransporation  via  the  apoplastic  pathway  in  parts  of  the  root  that  lack  a  casparian  band,  but  it  is  also  known  that  there  are  symplastic  pathways.  Little  is  known  about  the  relative  importance  of  the  apoplastic  and  symplastic  pathways  in  Ca  uptake  (White  and  Broadley,  2003).  The  author  could  not  find  any  data  on  whether  roots  are  able  to  increase  branching  in  patches  of  localized  Ca  abundance.  Overall,  our  understanding  of  how  plants  sense  and  respond  to  nutrient  status  is  

severely  limited.  The  development  of-­‐  and  subsequent  research  upon-­‐  nitrate  reductase  mutants  of  tobacco  plants  greatly  advanced  out  understanding  of  nitrogen  responsiveness  in  plants,  but  no  such  milestones  have  been  achieved  for  P,  K,  Mg,  or  Ca.  As  a  result  we  have  very  little  idea  about  the  mechanisms  of  plant  nutrient  status  sensing  for  these  important  nutrients.  More  research  is  needed  in  this  fundamental  area  of  plant  physiology  for  mycorrhizal  ecologists  to  gain  an  understanding  of  how  mycorrhizae  may  respond  to  shifting  host  nutrient  demand  in  ecosystems  undergoing  continued  acid  deposition  and/or  global  change.    Nonetheless,  the  research  performed  to  date  does  provide  the  field  of  mycorrhizal  ecology  with  some  useful  information  in  predicting  how  ECM  communities  may  respond  to  host  nutrient  demand:    ♦ Belowground  allocation  increases  in  response  to  increased  host  P  demand,  is  not  

significantly  affected  by  plant  Ca  status,  and  is  reduced  significantly  by  K  and  Mg  deficiency.    

♦ Plants  can  respond  to  localized  patches  of  P  by  increased  root  branching.  ♦ Plants  can  either  increase  expression  of  or  upregulate  existing  root  nutrient  

transporters  to  increase  uptake  of  K  and  P  in  response  to  deficiency.    Increased  carbon  allocation  belowground  necessarily  correlates  with  increased  carbon  allocation  to  ectomycorrhizae  (Hobbie,  2006)  and  thus,  it  follows  logically,  to  increased  weathering  activity  by  ectomycorrhizal  fungi.  Roots  that  can  preferentially  grow  and/or  branch  in  localized  areas  of  high  nutrient  availability  will  favor  the  ectomycorrhizal  species  which  are  providing  the  largest  amounts  of  this  nutrient,  because  by  ramifying  in  those  areas  they  allow  those  fungal  species  the  opportunity  to  colonize  a  larger  root  area.  It  is  unclear  if  increased  expression  and  up-­‐regulation  of  high  affinity  transporters  is  possible  under  the  ectomycorrhizal  mantle.  If  so,  one  would  assume  this  greater  sink  strength  on  the  part  of  plant  root  would  increase  nutrient  loss  from  the  fungus,  and  thus  increase  nutrient  transport  in  ECM  rhizomorphs.  However,  it  remains  poorly  understood  

50    

how  fungi  exude  non-­‐N  nutrients  into  the  fungal-­‐plant  interface.  A  better  understanding  of  this  mechanism  is  necessary  to  understand  how  increased  expression  of  nutrient  transporters  in  plant  roots  will  affect  ectomycorrhizal  activity.    

It  is  generally  assumed  that  there  is  a  tit-­‐for-­‐tat  relationship  between  the  ectomycorrhizal  fungus  and  the  plant  host.  The  former  providing  nutrients  in  exchange  for  carbon  from  the  latter.  Much  research  has  gone  into  developing  a  mechanistic  understanding  of  how  this  arrangement  might  be  structured  at  the  fungus-­‐root  interface,  nearly  all  of  it  focusing  on  nitrogen  as  the  fungal  exchange  currency.  Nehls  et  al.  (2007)  suggest  that  carbon  provision  by  the  fungus  may  be  dependant  on  plant  phosphorylation  of  hexose  uptake  transporters.  This  mechanism  would  allow  the  host  plant  to  very  quickly  control  carbon  loss  to  the  fungus  as  a  function  of  nutrient  provision  from  the  ectomycorrhizal  fungus.  If  these  phsophorylation  sites  are  controlled  by  the  supply  of  nutrients  other  than  N,  such  as  P,  K,  Mg,  or  Ca,  then  this  could  be  a  key  point  of  communication  between  host  nutrient  demand  and  fungal  nutrient  acquisition.      Evidence  from  field  and  microcosm  studies  Field  studies  A  variety  of  microcosm  and  field  experiments  have  been  conducted  to  examine  how  host  plant  nutrient  status  affects  the  weathering  activity  of  ectomycorrhizal  fungi.  There  are  tradeoffs  associated  with  each  scale  of  experimentation.  Field  studies  take  into  account  the  full  range  of  biotic  and  abiotic  interactions  which  govern  nutrient  demand  and  mycorrhizal  activity.  In  field  studies,  plants  generally  grow  under  realistic  nutrient  regimes,  and  in  the  presence  of  dynamic,  complex  microbial  communities.  However,  it  may  be  very  difficult  to  isolate  nutrient  deficiency  as  a  single  treatment  in  field  studies.  Fertilization  treatments  are  one  method  for  examining  the  effects  of  nutrient  demand  on  weathering  activity;  using  existing  productivity  gradients  is  another.  Fertilization  may,  however,  cause  other,  undesirable  effects  such  as  increased  pH,  and  it  may  take  many  years  for  the  system  to  fully  react  to  the  altered  nutrient  status.  Natural  productivity  gradients  may  vary  with  regards  to  a  number  of  factors  other  than  the  desired  nutrient  availability.  Both  of  these  methods  have  been  employed  in  a  limited  number  of  field  studies  to  look  at  how  nutrient  availability  and  host  plant  nutrient  status  affect  ectomycorrhizal  weathering  activity  in  situ.      

While  it  is  not  possible  to  quantify  ectomycorrhizal  weathering  activity  in  the  field  on  an  ecosystem  scale,  a  number  of  qualitative  measures  can  be  employed  to  compare  weathering  activity  either  between  different  nutrient  regimes  or  between  different  minerals.  One  such  measure  involves  the  use  of  in-­‐growth  bags.  Small  mesh  bags  are  filled  with  either  quartz  sand  alone  or  sand  amended  with  a  particular  mineral  of  interest.  The  mesh  is  of  a  size  that  allows  hyphae  but  not  roots  to  penetrate  the  bags.    Studies  by  Wallander  et  al.  (2001),  Parrent  and  Vilgalys  (2007),  and  Kjoller  (2006)  have  indicated  that  the  great  majority  of  hyphae  found  in  these  bags  are  ectomycorrhizal  fungi.  By  quantifying  the  fungal  biomass  and  mineral  dissolution  in  bags  one  can  make  inferences  about  the  relative  ectomycorrhizal  weathering  activity  in  a  given  soil.    One  important  weakness  of  this  method  is  that  it  discriminates  against  the  broad  range  of  ectomycorrhizal  fungi  that  do  not  produce  abundant  extraradical  hyphae.  

51    

Hagerberg  et  al.  (2003)  examined  ectomycorrhizal  hyphal  colonization  of  mesh  bags  filled  with  sand,  or  sand  amended  with  either  a  mineral  P  source    (apatite)  or  a  mineral  K  source  (biotite)  in  a  variety  of  Picea  abies  forests  in  southern  Sweden  encompassing  a  range  of  P  and  K  availabilities.  Apatite  amended  bags  always  had  greater  mycorrhizal  colonization  than  pure  sand  bags,  but  in  forests  considered  to  be  P-­‐limited  (spruce  needle  P  content  below  sufficiency  levels)  there  was  significantly  greater  difference  in  colonization  between  apatite-­‐amended  and  pure  sand  bags.  No  such  response  was  found  for  forest  K  status  and  biotite  colonization,  although  colonization  of  biotite  amended  bags  was  overall  significantly  higher  than  purely  sand  filled  bags.    Wallander  et  al.  (2008)  revisited  this  study,  also  using  southern  Swedish  P.  abies  stands  of  varying  P  status,  but  they  focused  on  P  and  added  a  fertilization  treatment.  Again,  they  found  a  significantly  greater  difference  in  colonization  between  apatite-­‐amended  and  pure  sand  bags  when  P  levels  were  growth  limiting,  but  when  P  levels  were  increased  by  fertilization  there  was  no  increase  in  mycelial  colonization  of  apatite  amended  bags  as  compared  to  pure  quartz  sand  filled  bags.  Taken  together  these  studies  suggest  that  ectomycorrhizal  colonization  of  readily  weatherable  minerals,  though  not  necessarily  actual  weathering,  can  respond  to  forest  phosphorous  status.    

In  another  mesh  bag  study,  Wallander  et  al.  (2003)  looked  at  mycelial  colonization  of  quartz  filled  mesh  bags,  some  of  which  were  amended  with  wood  ash  (a  rich  source  of  relatively  mobile  Ca,  K,  Fe,  Mg)  or  apatite.  The  study  employed  particle  induced  X-­‐ray  emission  spectra  to  assess  the  elemental  content  of  specific  rhizomorphs  which  were  also  molecularly  identified  to  fungal  species.  Wood  ash-­‐amended  bags  had  significantly  more  mycelia  than  either  sand  filled  or  apatite-­‐amended  bags.  Paxillus  involutus,  by  far  the  most  utilized  ECM  in  weathering  experiments  and  the  one  generally  shown  to  have  the  highest  oxalic  acid  production  in  microcosm  studies  (Wallander  and  Wickman,  1999;  van  Scholl,  2005;  van  Scholl,  2006)  was  not  found  on  any  root  tips  near  the  mesh  bags,  but  it  was  by  a  large  margin  the  most  common  ITS  phylotype  found  in  the  mesh  bags.  Suillus  granulatus  hyphae  consistently  contained  more  K  than  other  species  and  generally  had  Ca-­‐oxalate  encrustations  on  its  rizomorphs,  while  P.  involutus  consistently  had  higher  Ca  content  than  any  other  species.  Some  trends  were  also  found  for  Fe  and  P  contents  and  other  ECM  species.  These  results  suggest  there  may  be  some  consistent  trends  that  can  be  used  to  place  certain  ectomycorrhizal  species  in  distinct  biogeochemical  niches.  However,  elevated  levels  of  mineral  elements  do  not  necessarily  indicate  increased  weathering  activity  of  minerals  containing  those  elements.  On  the  contrary,  elevated  levels  of  a  given  element  could  indicate  that  this  fungus  passes  less  of  this  elelement  on  to  its  host  plant.    

Another  potentially  useful  method  for  examining  weathering  activity  of  ectomycorrhizal  fungi  is  to  look  at  the  density  of  hyphal  tunneling  in  mineral  grains.    Jongmans  et  al.  (1997)  first  proposed  that  regular  channels  often  found  in  minerals  might  be  fungal  in  origin.  While  no  “smoking  gun”  has  to  date  been  devised  to  demonstrate  that  these  tunnels  are  irrefutably  caused  by  ectomycorrhizal  fungi,  a  number  of  studies  offer  circumstantial  evidence  (Jongmans  et  al,  1997;  Hofland  et  al,  2004;  Hoffland  et  al,  2002).    Looking  at  a  topographic  fertility  gradient  in  a  northern  Swedish  boreal  forest,  Hoffland  et  al.  (2003)  found  that  the  density  of  tunnels  of  putative  ectomycorrhizal  origin  had  a  strong  positive  correlation  with  ectomycorrhizal  tip  density  and  a  strong  negative  one  with  soil  fertility.  Assuming  that  tunneling  can  be  taken  as  an  indicator  for  overall  

52    

weathering  activity  (despite  the  relatively  small  contribution  tunneling  makes  to  overall  mineral  weathering  (Smits  et  al.,  2005)),  it  remains  unclear  whether  the  greater  weathering  activity  in  the  lower  fertility  sites  is  due  to  lower  pH,  greater  nutrient  demand  on  the  part  of  the  host,  or  greater  ectomycorrhizal  colonization.  Hoffland  et  al.  (2002)  assessed  tunneling  activity  across  a  northern  Sweden  podzol  sequence  and  found  that  the  occurrence  of  tunnels  in  feldspar  grains  coincided  with  the  disapearence  of  easily  weatherable  cation  sources  such  as  biotite.  Taken  together,  these  tunnel  studies  imply  a  correlative,  but  not  a  causative,  link  between  weathering  activity  by  ectomycorrhizal  fungi  and  host  nutrient  demand.  

Wilson  at  al.  (2008)  used  magnetic  separation  to  segregate  readily  weatherable  cation  sources  such  as  biotite  and  orthopyroxene  from  more  cation  poor  K  feldpars.  They  then  used  a  variety  of  molecular  and  microscopic  methods  to  asses  the  density  of  microbial  colonization  and  weathering  state  of  these  minerals.  They  found  significantly  more  mycelial  (primarily  ectomycorrhizal)  colonization  of  readily  weatherable  cation  sources  such  as  biotite  and  orthopyroxene  than  on  more  cation-­‐poor  K  feldpars,  but  noticed  only  slightly  increased  weathering  of  the  biotite  compared  to  the  feldspar  minerals.  

In  the  aforementioned  field  studies,  there  is  evidence  that  ectomycorrhizal  fungi  may  increase  mineral  foraging  and  colonization  in  response  to  increased  demand  for  phosphorus.  There  is  also  evidence  that  weathered  tunnels  (a  likely  indicator  of  fungal  weathering  activity)  coincide  with  increased  demand  for  mineral  elements  other  than  phosphorus  and  that  ectomycorrhizal  hyphae  can  preferentially  colonize  mineral  fragments  which  are  good  sources  of  mineral  nutrients  other  than  phosphorus.  However,  there  is  no  direct  evidence  in  field  studies  that  foraging  for  and  weathering  of  K,  Mg,  or  Ca  sources  by  ECM  can  respond  to  demand  for  these  nutrients.  There  are  many  reports  in  the  literature  of  forest  ecosystems  dominated  by  ectomycorrhizal  hosts  which,  possibly  due  to  anthropogenic  acid  deposition,  are  now  limited  by  base  cation  availability  and  not  nitrogen  or  phosphorus.  The  mesh  bag  approach  employed  by  Wallander  and  others  in  Swedish  forests  may  be  a  good  method  for  examining  how  the  mycorrhizal  role  in  nutrient  acquisition  has  changed  with  the  changing  nutrient  status  of  these  forests.  Especially  good  sites  to  use  this  approach  would  be  the  sharp  N  depositional  gradients  near  industrial  or  agricultural  sites.    Pot  and  microcosm  studies  Microcosm  studies  allow  weathering  to  be  quantified  and  can  focus  on  the  weathering  of  a  single  mineral  or  any  desired  mineral  mix.    Microcosms  can  be  used  to  examine  the  weathering  potential  of  individual  ectomycorrhizal  species  and  can  be  employed  to  isolate  the  weathering  activity  of  the  ectomycorrhizal  fungus  from  that  of  the  plant  root.  Microcosm  studies  also  allow  the  researcher  to  isolate  the  effects  of  the  availability  of  just  one  nutrient  on  weathering  activity.  In  relatively  sterile  microcosm  experiment  it  is  also  much  easier  to  assay  for  readily  decomposable  weathering  agents,  particularly  low-­‐molecular-­‐weight  organic  acids  (LMWOA),  and  examine  how  LMWOA  production  affects  weathering  rates.  In  soils,  measured  bulk-­‐solution  LMWOA  concentrations  are  generally  too  low  to  significantly  enhance  mineral  weathering  due  to  their  rapid  degradation  by  soil  microbiota.  However  in  semi-­‐sterile  microcosms  and  at  the  fungus-­‐mineral  interface  in  

53    

natural  soils,  LMWOA  concentrations  may  be  high  enough  to  greatly  enhance  weathering  rates  via  proton-­‐promoted  and  ligand-­‐promoted  dissolution.  (van  Hees  et  al.  2005;  Banfield  et  al.,  1999)  

Van  Scholl  et  al.  (2006)  looked  at  how  organic  acid  production  was  influenced  by  nutrient  deficiency  of  Mg,  N,  P,  and  K.  Decreasing  P  or  N  increased  organic  acid  production,  while  reducing  Mg  or  K  either  had  no  effect  or  slightly  decreased  overall  LMWOA,  although  reducing  Mg  did  increase  oxalate  production  in  some  treatments.  There  were  also  significant  differences  between  individual  fungal  species  organic  acid  exudation  profiles  and  how  they  reacted  to  different  nutrient  deficiencies.    

Paris  et  al.  (1995,  1996a,  1996b)  conducted  a  series  of  studies  examining  how  weathering  activity  of  ectomycorrhizal  fungi  in  azenic  culture  is  affected  by  nutrient  availability.  They  found  that  Ca  (Paris  et  al.,  1995),  K,  and  Mg  (Paris  et  al.,  1996a)  had  no  effect  of  weathering  activity  when  one  element  was  deficient,  however  when  Mg  and  K  were  simultaneously  deficient  both  phlogopite  weathering  (Paris  et  al.,  1996a)  and  oxalic  acid  production  (Paris  et  al.,  1996b)  increased.  

In  order  to  test  whether  weathering  activity  can  respond  to  nutrient  demand  there  must  be  a  nutrient-­‐sufficient  treatment  and  a  nutrient-­‐deficient  treatment,  both  with  added  minerals.  The  great  majority  of  microcosm  studies  investigating  ectomycorrhizal  weathering  fail  to  have  both  a  nutrient-­‐deficient  and  a  nutrient-­‐sufficient  treatment.  Only  the  work  by  van  Scholl  et  al.  (2005)  and  Paris  et  al.  (1995,  1996a,  1996b),    explicitly  tested  whether  weathering  activity  can  respond  to  nutrient  demand.  From  these  studies  it  does  appear  that  there  is  potential  for  the  ectomycorrhizal  fungus  alone,  or  the  ectomycorrhizal  seedling  to  respond  to  deficiencies  in  P,  Mg,  or  K  by  enhancing  weathering  activity,  however  the  study  by  van  scholl  et  al.  (2005)  had  no  added  minerals  and  thus  doesn’t  actually  measure  weathering,  and  the  studies  by  Paris  et  al.  (1995,  1996a)  are  azenic  pure  culture  studies.  More  studies  are  clearly  needed  to  address  this  specific  question.      

If  the  ectomycorrhizal  fungus  is  also  below  its  optimal  level  for  a  particular  nutrient,  then  increases  in  weathering  or  nutrient  uptake  observed  by  ectomycorrhizae  in  a  –nutrient  treatment  are  not  necessarily  a  reaction  to  host  plant  nutrient  demand.  Increased  weathering  may  be  a  reaction  to  ectomycorrhizal  nutrient  demand  only.  Having  separate  mycorrhizal  and  rooting  compartments  would  help  to  resolve  this  question  as  would  an  additional  treatment  in  which  the  growth  medium  is  kept  very  nutrient  poor  but  the  plant  is  foliarly  fertilized.  The  two-­‐compartment  system  used  in  Jentschke  et  al.  (2001)  would  be  a  very  effective  way  to  segregate  the  ecomycorrhizal  nutrient  demand  from  plant  nutrient  supply.  

While  they  do  not  explicitly  test  whether  weathering  activity  can  respond  to  changing  nutrient  status,  a  number  of  other  studies  can  offer  insight  into  the  study  of  ectomycorrhizal  weathering  and  some  discussion  of  them  is  warranted  in  this  review.  Ectomycorhizae  have  been  found  to  increase  weathering  in  a  number  of  microcosm  studies  (Ochs  et  al.,  1993;  van  Hees  et  al.,  2004;  van  Scholl  et  al.,  2006;  Wallander  et  al.,  2000),  while  others  have  not  found  any  increase  in  weathering  with  ectomycorrhizal  colonization  (Balogh-­‐Brunstad  et  al.,  2008;  Wallander  et  al.,  1999).    Many  of  these  studies  find  increased  weathering  with  one  ectomycorrhizal  species  but  not  another  or  with  one  nutrient  treatment  or  mineral  type  but  not  another.  Generally,  studies  that  deny  P  or  K  

54    

and  add  a  weatherable  P  or  K  source  such  as  apatite  or  biotite  do  find  increased  weathering  with  ectomycorrhizal  colonization.  The  same  cannot  be  said  for  Mg;  no  study  has  yet  looked  at  how  weathering  by  ectomycorrhizal  plants  is  affected  by  Ca  status.  The  proposed  weathering  mechanism  varies  from  one  study  to  another  and  even  from  fungus  to  fungus.  Wallander  (2000)  found  that  all  3  ECM  strains  tested  increased  weathering  rates  above  the  non-­‐mycorrhizal  (NM)  control,  but  the  mechanism  of  increased  weathering  was  different  for  each  strain:    decreasing  solution  pH  (proton-­‐promoted  dissolution),  oxalic  acid  prodution  (ligand-­‐promoted  dissolution)  and  greater  P  uptake  (removing  transport  limitation  to  weathering).  The  most  commonly  proposed  mechanism  for  ectomycorrhizal  enhancement  of  mineral  weathering  is  greater  nutrient  uptake  and  transport  away  from  the  mineral  surface  (van  Scholl  et  al.,  2006;  Wallander.  2000;  van  Hees  et  al.,  2004).    

Organic  acid  production  by  seedlings  is  generally  found  to  be  altered,  though  not  necessarily  increased,  by  ectomycorrhizal  colonization.  Organic  acid  exudation  does  not  respond  in  a  consistent  way  to  nutrient  demand  or  to  the  presence  of  certain  minerals,  nor  is  it  generalizable  across  different  ectomycorrhizal  species.  When  one  LMWOA  is  linked  to  increased  weathering  rates  it  is  most  commonly  oxalic  acid.  Oxalic  acid  is  produced  in  particularly  large  quantities  by  P.  involutus,  which  also  happens  to  be  the  most  commonly  used  ectomycorrhizal  species  in  weathering  experiments.    Ochs  et  al.  (1993)  found  that  there  were  strong  weathering  agents  in  the  root  exudates  of  H.  crustiliniforme,  present  in  very  low  concentrations  (µM)  which  were  likely  not  LMWOA’s.  

The  work  of  Calvaruso  et  al.  (2006)  and  Uroz  et  al.  (2007)  give  convincing  evidence  for  a  key  role  that  bacteria  may  play  in  ectomycorrhizal  weathering.  They  found  that  bacteria  isolated  from  the  symbiotic  mantle  of  ectomycorrhizosphere  of  oak  mycorrhizas  have  significantly  higher  weathering  capacity  than  phylogenetically  closely  related  bacteria  isolated  from  the  adjacent  bulk  soil  (Uroz  et  al.,  2007).  Calvaruso  et  al.  (2007)  demonstrated  that  one  of  these  bacteria  has  the  potential  to  enhance  nonmycorrhizal  seedling  growth  by  alleviating  Mg  and  K  limitation  by  stimulating  biotite  weathering.  These  results  strongly  suggest  that  further  research  into  the  field  of  mycorrhizal  helper  bacteria  and  ectomycorrhizal  weathering  is  warranted.  It  also  suggests  that  some  of  the  highly  reductionist  experiments  with  either  no  bacteria  or  a  much  simplified  bacterial  community  may  fail  to  account  for  a  key  mechanism  of  ectomycorrhizal  weathering.  

Often  the  rooting  area  in  pot  or  microcosm  studies  is  quite  small  such  that  the  roots  are  far  more  densely  packed  than  they  would  be  in  a  natural  setting.  As  a  result,  the  ectomycorrhizosphere  is  no  larger  than  the  rhizosphere  in  nonmycorrhizal  treatments.  This  eliminates  one  of  the  major  proposed  advantages  of  mycorrhizal  colonization,  and  possibly  a  key  mechanism  by  which  ectomycorrhizae  may  confer  a  greater  weathering  ability  on  root  systems:  greater  mineral  surface  contact  and  uptake  of  weathering  products  directly  from  mineral  surfaces.    The  majority  of  microcosm  experiments  employ  an  artificial  rooting  medium  (such  as  semi-­‐sterile  peat,  or  sterile  quartz  sand)  and/or  an  inorganic  nutrient  solution,  both  of  which  may  be  a  poor  recreation  of  the  nutrient  environment  of  field  settings.  Nutrient  starvation  may  be  achieved  when  minor  nutrient  limitation,  more  representative  of  field  conditions,  is  desired.  Most  microcosm  studies  also  have  either  no  or  a  highly  simplified  bacterial  community,  which  may  significantly  

55    

alter  weathering  dynamics  from  natural  settings.  Another  key  drawback  of  microcosm  studies  is  that  the  carbon  and  nutrient  exchange  dynamics  of  isolated  seedlings  in  a  laboratory  may  bear  little  resemblance  to  that  of  seedlings  or  mature  trees  in  the  field.  In  field  settings  hyphal  networks  may  allow  seedlings  to  avoid  some  of  the  initial  carbon  investment  involved  in  establishing  mycorrhizal  colonization.  Mature  ectomycorrhizal  trees  are  generally  considered  to  be  dependent  on  ectomycorrhizal  communities  for  survival,  while  seedlings  in  the  lab  often  experience  growth  reductions  in  response  to  mycorrhizal  colonization  and  uncolonized  seedlings  can  be  far  larger  and  more  vigorous.  The  following  recommendations  will  improve  our  ability  to  relate  the  results  of  weathering  experiments  in  pots  or  microcosms  to  field  processes:  ♦ Experiments  must  have  both  a  +nutrient  and  –nutrient  experiment.  ♦ If  weathering  activity  is  to  be  attributed  to  feedback  from  plant  demand,  some  

segregation  of  plant  and  fungal  nutrient  demand  is  necessary.  ♦ Pots  should  be  big  enough  so  that  root  systems  do  not  completely  fill  potting  

medium.  ♦ Weathering  agents  other  than  LMWOA  should  be  assayed  for.  ♦ A  variety  of  mycorrhizal  species  should  be  used.    ♦ When  possible  a  diverse  community  of  soil  bacteria  should  be  used.  ♦ Pilot  studies  should  be  done  to  ensure  that  nutrients  are  limiting  but  not  deficient.  ♦ When  possible,  larger,  older  seedlings  (1-­‐2  yr.  old  instead  of  2-­‐6  mo.)  should  be  used.  

 Conclusion  There  is  limited  evidence  in  the  literature  that  ectomycorrhizal  fungi  can  respond  to  increased  nutrient  demand  with  an  increase  in  weathering  activity,  particularly  with  regards  to  phosphorous  and  potassium.  Most  studies  however  fail  to  properly  isolate  nutrient  demand  as  a  single  factor,  and  no  studies  isolate  fungal  nutrient  demand  from  plant  nutrient  demand.  More  research  is  needed  to  address  the  important  question  of  how  ectomycorrhizal  communities  will  buffer  changes  in  soil  nutrient  regimes  caused  by  human  activities.  In  the  field,  mesh  bag  studies  in  a  variety  of  affected  forests  and  nutrient  gradients  will  improve  our  understanding  of  how  weathering  may  respond  to  nutrient  demand.  In  microcosm  studies,  experiments  should  be  designed  to  better  capture  the  range  of  ecological  interactions  present  in  natural  systems,  and  more  controls  are  needed  to  attribute  altered  weathering  activity  to  host  plant  nutrient  demand.  

An  impressive  amount  of  research  has  been  devoted  to  how  plant  root  physiology  is  affected  by  nutrient  demand,  but  we  still  lack  a  clear  mechanistic  understanding  for  how  plants  sense  and  respond  to  nutrient  demand.  What  little  we  do  know  is  based  on  angiosperm  herbs,  not  the  gymnosperm  trees  for  which  we  may  wish  to  interpret  the  results.  Gymnosperm  genomes  are  enormous  and  thus  none  of  them  have  been  sequenced  to  date,  as  more  plant  genomes  are  sequenced  we  can  expect  our  understanding  of  plant  nutrient  sensing  to  increase.            

56    

References  cited    Andrews  M,  Sprent  JI,  Raven  JA,  Eady  PE,  1999.  Relationships  between  shoot  to  root  ratio,  growth  and  leaf  soluble  protein  concentration  of  Pisum  Sativum,  Phaseolus  vulgaris  and  Triticum  aestivum  under  different  nutrient  deficiencies.  Plant,  Cell  and  Environment  22:  949-­‐958      Ashley  MK,  Grant  M,  Grabov  A,  2006.  Plant  responses  to  potassium  deficiencies:  a  role  for  potassium  transport  proteins.  Journal  of  Experimental  Botany  57:  425-­‐436.    Avis  PG,  Mueller  GM,  Lussenhop  J,  2008.  Ectomycorrhizal  fungal  communities  in  two  North  American  oak  forests  respond  to  nitrogen  addition.  New  Phytologist  179:  472-­‐473.    

Balogh-­‐Brunstad  Z,  Keller  CK,  Gill  RA,  Stevens  F,  Bormann  BT,  Li  CY,  2008.  The  effect  of  bacteria  and  fungi  on  chemical  weathering  and  chemical  denudation  fluxes  in  pine  growth  experiments.  Biogeochemistry  88:  153-­‐167.    Banfield  JF,  Barker  WB,  Welch  SA,  Taunton  A,  1999.  Biological  impact  on  mineral  dissolution:  Application  of  the  lichen  model  to  understanding  mineral  weathering  in  the  rhizosphere.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  96:  3404-­‐3411.    Calvaruso  C,  Turpault  MP,  Frey-­‐Klett  P,  2006.  Root-­‐associated  bacteria  contribute  to  mineral  weathering  and  to  mineral  nutrition  in  trees:  a  budgeting  analysis.  Applied  and  Environmental  Microbiology  72:  1258-­‐1266.    Cakmak  I,  Hengler  C,  Marschner  H,  1994.  Partitioning  of  shoot  and  root  dry  matter  and  carbohydrates  in  bean  plants  suffering  from  phosphorous,  potassium,  and  magnesium  deficiency.  Journal  of  Experimental  Botany  45:  1245-­‐1250.    Cakmak  I,  Hengler  C,  Marschner  H,  1994.  Changes  in  phloem  export  of  sucrose  in  leaves  in  response  to  phosphorus,  potassium  and  magnesium  deficiency  in  bean  plants.  Journal  of  Experimental  Botany  45:  1251-­‐1257.    Cakmak  I,  Kirby  EA,  2008.  Role  of  magnesium  in  carbon  partitioning  and  alleviating  photooxidative  damage.  Physiologia  Plantarum  133:  692-­‐704.    Drew  MC,  1975.  Comparison  of  the  effects  of  a  localized  supply  of  phosphate,  nitrate,  ammonium  and  potassium  on  the  growth  of  the  seminal  root  system,  and  the  shoot,  in  barley.  New  Phytologist  75:  479-­‐490.    Drew  MC,  Saker  LR,  1978.  Nutrient  supply  and  the  growth  of  the  seminal  root  system  in  barley.  III.  Compensatory  increases  in  growth  of  lateral  roots  ,  and  in  rates  of  phosphate  uptake,  in  response  to  a  localized  supply  of  phosphate.  Journal  of  Experimental  Botany  29:  435-­‐451.      

57    

Ericsson  T,  1995.  Growth  and  shoot:  root  ratio  of  seedlings  in  relation  to  nutrient  availability.  Plant  and  Soil  168-­169:  205-­‐214.    Ericsson  T,  Kahr  M,  1993.  Growth  and  nutrition  of  birch  seedlings  in  relation  to  potassium  supply  rate.  Trees  7:  78-­‐85.    Ericsson  T,  Kahr  M,  1995.  Growth  and  nutrition  of  birch  seedlings  at  varied  addition  rates  of  magnesium.  Tree  Physiology  15:  85-­‐93.    Forde  B.  and  Lorenzo  H,  2001.  The  nutritional  control  of  root  development.  Plant  and  Soil  232:  51-­‐68.    Gile  PL,  and  Carrero  JO,  1917.  Absorption  of  nutrients  as  affected  by  the  number  of  roots  supplied  with  the  nutrient.  Journal  of  Agricultural  Research  9:  73-­‐95.    Hagerberg  D,  Thelin  G,  Wallander  H,  2003.  The  production  of  ectomycorrhizal  mycelium  in  forests:  Relation  between  forest  nutrient  status  and  local  mineral  sources.  Plant  and  Soil  252:  279-­‐290.    Hermans  C,  Hammond  JP,  White  PJ,  Verbruggen  N,  2006.  How  do  plants  respond  to  nutrient  shortage  by  biomass  allocation?  TRENDS  in  Plant  Science  11:  610-­‐617.    Hoffland  E,  Kuyper  TW,  Wallander  H,  Plassard  C,  Gorbushina  AA,  Haselwandter  K,  Holmstrom  S,  Landeweert  R,  Lundstrom  US,  Rosling  A,  Sen  R,  Smits  MM,  van  Hees  PA,  van  Breemen  N,  2004.  The  role  of  fungi  in  weathering.  Frontiers  in  Ecology  and  the  Environment  2:  258-­‐264.          Hoffland  E,  Giesler  R,  Jongmans  AG,  van  Breemen  N,  2002.  Increasing  feldspar  tunneling  by  fungi  across  a  north  Sweden  podzol  chronosequence.  Ecosystems  5:11-­‐22.    Hoffland  E,  Giesler  R,  Jongmans  AG,  van  Breemen  N,  2003.  Feldspar  tunneling  by  fungi  along  Natural  Productivity  Gradients.  Ecosystems  6:  139-­‐146.    Hobbie  E,  2006.  Carbon  allocation  to  ectomycorrhizal  fungi  correlates  with  belowground  allocation  in  culture  studies.  Ecology  87:  563-­‐569.    Ingestad  T,  Lund  AB,  1986.  Theory  and  techniques  for  steady  state  mineral  nutrition  and  growth  of  plants.  Scandanavian  Journal  of  Forest  Research  1:  439-­‐453.    Jentschke  G,  Brandes  B,  Kuhn  AJ,  Schroder  WH,  Godbold  DL,  2001.  Interdependence  of  phosphorous,  nitrogen,  potassium  and  magnesium  translocation  by  the  ectomycorrhizal  fungus  Paxillus  involutus.  New  Phytologist  149:  327-­‐337.        

58    

Jongmans  AG,  Van  Breemen  N,  Lundstrom  US,  Van  Hees  PAW,  Finlay  RD,  Srinivasan  M,  Unestam  T,  Giesler  R,  Melkerud  PA,  Olsson  M,  1997.  Rock-­‐eating  fungi.  Nature  389:  682–683.    Jordan-­‐Meille  L,  Pellerin  S,  2008.  Shoot  and  root  growth  of  hydroponic  maize  (Zea  mays  L.)  as  influenced  by  K  deficiency.  Plant  and  Soil  304:  157-­‐168.    Kjoller  R,  2006.  Disproportionate  abundance  between  ectomycorrhizal  root  tips  and  their  associated  mycelia.  FEMS  Microbiology  Ecology  58:  214-­‐224.    Landeweert  R,  Hoffland  E,  Finlay  RD,  Kuyper  TW,  van  Breemen  N,  2001.  Linking  plants  to  rocks:  ectomycorrhizal  fungi  mobilize  nutrients  from  minerals.  Trends  in  Ecology  and  Evolution  16:  248-­‐254.          Lilleskov  EA,  Fahey  TJ,  Horton  TR,  Lovett  GM,  2002.  Belowground  ectomycorrhizal  fungal  community  change  over  a  nitrogen  deposition  gradient  in  Alaska.  Ecology  83:  104-­‐115.      Lopez-­‐Lefebre  LR,  Rivero  RM,  Garcia  PC,  Sanchez  E,  Ruiz  JM,  Romero  L,  2001.  Effect  of  calcium  on  mineral  nutrient  uptake  and  growth  of  tobacco.  Journal  of  the  Science  of  Food  and  Agriculture  81:  1334-­‐1338.    Nehls  U,  Grunze  N,  Willmannn  M,  Reich  M,  Kuster  H,  2007.  Sugar  for  my  honey:  Carbohydrate  partitioning  in  ectomycorrhizal  symbiosis.  Phytochemistry  68:  82-­‐91.    Nehls  U,  2008.  Mastering  ectomycorrhizal  symbiosis:  the  impact  of  carbohydrates.  Journal  of  Experimental  Botany  59:  1097-­‐1108.    Ochs  M,  Brunner  I,  Stumm  M,  Cosovic  B,  1993.  Effects  of  Root  Exudates  and  Humic  Substances  on  Weathering  Kinetics.  Water,  Air  and  Soil,  Pollution.  68:  213-­‐229.    Paris  F,  Bonnaud  P,  Ranger  J,  Robert  M,  Lapeyrie  F,  1995.  Weathering  of  ammonium  or  calcium  saturated  2:1  phyllosilicates  by  ectomycorrhizal  fungi  in  vitro.  Soil    Biology  and  Biochemistry  27:  1237-­‐1244.    Paris  F,  Bonnaud  P,  Ranger  J,  Lapeyrie  F,  1996.  In  vitro  weathering  of  phlogopite  by  ectomycorrhizal  fungi.  I  Effect  of  K+  and  Mg2+  deficiency  on  phyllosilicate  evolution.  Plant  and  Soil  177:  191-­‐201.    Paris  F,  Botton  B,  Lapeyrie  F,  1996.  In  vitro  weathering  of  phlogopite  by  ectomycorrhizal  fungi.  II  Effect  of  K+  and  Mg2+  deficiency  on  accumulation  of  oxalate  and  H+.  Plant  and  Soil  179:  141-­‐150.    Parrent  JL,  Vilgalys  R,  2007.  Biomass  and  compositional  response  of  ectomycorrhizal  fungal  hyphae  to  elevated  CO2  and  nitrogen  fertilization.  New  Phytologist  176:  164-­‐174.    

59    

Philipson  JJ,  Coutts  MP,  1977.  The  influence  of  mineral  nutrition  on  the  root  development  of  trees.  II.  The  effect  of  specific  nutrient  elements  on  the  growth  of  individual  roots  of  Sitka  spruce.  Journal  of  Experimental  Botany  28:  864-­‐871.    Qiu  J,  Isreal  DW,  1992.  Diurnal  starch  accumulation  and  utilization  in  phosphorus  deficient  soybean  plants.  Plant  Physiology  47:  404-­‐408.    Radin  JW,  Eidenbock  MP,  1984.  Hydraulic  conductance  as  a  factor  limiting  leaf  expansion  of  phosphorous-­‐deficient  cotton  plants.  Plant  Physiology  88:  725-­‐730.    Robinson  D,  1994.  The  responses  of  plants  to  non-­‐uniform  supplies  of  nutrients.  New  Phytologist  127:  635-­‐674.    Rosling  A,  Lindahl  B,  Finlay  R,  2004.  Carbon  allocation  to  ectomycorrhizal  roots  and  mycelium  colonizing  different  mineral  substrates.  New  Phytologist  162:  795-­‐802.    Smits  MM,  Hoffland  E,  Jongmans  AG,  van  Breemen  N,  2005.  Contribution  of  mineral  tunneling  to  total  feldspar  weathering.  Geoderma  125:  59-­‐69.    Treseder  K.K.  2004.    A  meta-­‐analysis  of  mycorrhizal  responses  to  nitrogen,  phosphorus,  and  atmospheric  CO2  in  field  studies.  New  Phytologist  164:  347-­‐355.    Uroz  S,  Calvaruso  C,  Turpaul  MP,  Pierrat  JC,  Mustin  C,  Frey-­‐Klett  P,  2007.  Effect  of  the  mycorrhizosphere  on  the  genotypic  and  metabolic  diversity  of  the  bacterial  communities  involved  in  mineral  weathering  in  a  forest  soil.  Applied  and  Environmental  Microbiology  73:  3019-­‐3027.    van  Breemen  N,  Finlay  R,  Lundstrom  U,  Jongmans  AG,  Giesler  R,  Olsson  M,  2000.  Mycorrhizal  weathering:  A  true  case  of  mineral  plant  nutrition?  Biogeochemistry  49:  53-­‐67.        van  Hees  PAW,  Jones  DL,  Jentschke  G,  Godbold  DL,  2004.  Mobilization  of  aluminum,  iron  and  silicon  by  Picea  abies  and  ectomycorrhizas  in  a  forest  soil.  European  Journal  of  Soil  Science  55:  101-­‐111.    Van  Hees  PAW,  Jones  DL,  Jentschke  G,  Godbold  DL,  2005.  Organic  acid  concentrations  in  soil  solution:  effects  of  young  coniferous  trees  and  ectomycorrhizal  fungi.  Soil  Biology  and  Biogeochemistry  37:  771-­‐776.    Van  Scholl  L,  Smits  MM,  and  Hoffland  E,  2006.  Ectomycorrhizal  weathering  of  the  soil  minerals  muscovite  and  hornblende.    New  Phytologist  171:  805-­‐814.    Van  Scholl  L,  Hoffland  E,  van  Breemen  N,  2006.  Organic  anion  exudation  by  ectomycorrhizal  fungi  and  Pinus  sylvestris  in  response  to  nutrient  deficiency.  New  Phytologist  170:  153-­‐163.  

60    

 Van  Scholl  L,  Kuyper  TW,  Smits  MM,  Landeweert  R,  Hoffland  E,  van  Breemen  N,  2008.  Rock-­‐eating  mycorrhizas:  their  role  in  plant  nutrition  and  biogeochemical  cycles.  Plant  and  Soil  303:  35-­‐47.      Wallander  H,  Thelin  G,  2008.  The  stimulating  effect  of  apatite  on  ectomycorrhizal  growth  diminishes  after  PK  fertilization.  Soil  Biology  and  Biochemistry  40:  2517-­‐2522.    Wallander  H,  Mahmood  S,  Hagerberg  D,  Johansson  L,  Pallon  J,  2003.    Elemental  composition  of  ectomycorrhizal  mycelia  identified  by  PCR-­‐RFLP  analysis  and  grown  in  contact  with  apatite  or  wood  ash  in  forest  soil.  FEMS  Microbial  Ecology  44:  57-­‐65.    Wallander  H,  2000.  Uptake  of  P  from  apatite  by  Pinus  sylvestris  seedlings  colonized  by  different  ectomycorrhizal  fungi.  Plant  and  Soil  218:  249-­‐256.    Wallander  H,  Johansson  E,  Pallon  J,  2002.  PIXE  analysis  to  estimate  the  elemental  composition  of  ectomycorrhizal  rhizomorphs  grown  in  contact  with  different  minerals  in  Forest  soil.  FEMS  Microbiology  Ecology  39:  147-­‐156.    Wallander  H,  Wickman  T,  1999.  Biotite  and  microcline  as  potassium  sources  in  ectomycorrhizal  and  non-­‐mycorrhizal  Pinus  sylvestris  seedlings.  Mycorrhiza  9:25-­‐32.    Wallander  H,  Nilsson  LO,  Hagerberg  D,  Baath  E,  2001.  Estimation  of  the  biomass  and  seasonal  growth  of  external  mycelium  of  ectomycorrhizal  fungi  in  the  field.  New  Phytologist  151:  753-­‐760.    Wang  H,  Inukai  Y,  Yamauchi  A,  2006.  Root  development  and  nutrient  uptake.  Critical  Reviews  in  Plant  Sciences.  25:  279-­‐301.    White  PJ,  Broadley  MR,  2003.  Calcium  in  plants.  Annals  of  Botany  92:  487-­‐511.    Wilson  MJ,  Certini  G,  Campbell  CD,  Anderson  IA,  Hiller  S,  2008.  Does  the  preferential  microbial  colonization  of  ferromagnesian  minerals  affect  mineral  weathering  in  soil.  Naturwissenschaften  95:  851-­‐858.                              

61    

Chapter  4    The  role  of  ectomycorrhizae,  organic  acids,  and  Pinus  sylvestris  seedlings  in  mineral  weathering:  nutrient  uptake  increases  weathering  rates.    ABSTRACT  Calculating  the  weathering  rates  in  forest  soils  is  critically  important  to  forest  managers,  air  quality  policy,  and  models  of  forest  productivity.    Understanding  biotic  weathering,  the  relative  contributions  from  bacteria,  plants  and  fungi,  and  the  influence  of  elevated  CO2  on  biotic  weathering  is  essential  to  constraining  weathering  estimates.  We  employed  a  column  mesocosm  system  to  look  at  the  effects  of  elevated  CO2  and  Pinus  sylvestris  seedlings,  with  or  without  the  ectomycorrhizal  fungi  Piloderma  fallax  and  Suillus  variegatus  on  rhizosphere  soil  solution  concentrations  of  low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOA)  and  weathering  of  primary  minerals.  Seedlings  significantly  increased  mineral  weathering.  Elevated  CO2  increased  plant  growth  but  had  no  effect  on  weathering.  Ectomycorrrhizae  demonstrated  some  ability  to  increase  weathering,  particularly  P.  fallax,  but  did  not  significantly  increase  overall  weathering  rates.  LMWOA  production  was  strongly  correlated  with  seedling  biomass  but  not  with  weathering  rates.  Our  results  indicate  that  nutrient  uptake  is  the  primary  mechanism  of  biotic  enhancement  to  weathering.  Biotic  uptake  of  nutrients  and  water  reduces  transport  limitation  to  weathering,  and  it  is  this  process,  not  proton-­‐  or  ligand-­‐promotion,  that  is  the  primary  mechanism  by  which  biota  enhanced  mineral  weathering.  While  this  system  departs  from  conditions  in  forest  soils  in  a  number  of  ways,  these  results  are  in  line  with  weathering  studies  done  at  the  ecosystem,  mesocosm,  and  microcosm  scale.                                  

62    

INTRODUCTION  Calculating  the  weathering  rates  in  forest  soils  is  critically  important  to  forest  managers,  air  quality  policy,  and  models  of  forest  productivity.  Any  removal  of  timber  from  a  forest  represents  a  removal  of  mineral  nutrients;  understanding  how  quickly  those  nutrients  are  replenished  by  atmospheric  deposition  or  mineral  weathering  is  a  key  component  of  a  sustainable  harvesting  cycle  (Duschesne  and  Houle,  2006;  Sverdrup  et  al.,  2006;  Akselsson  et  al.,  2007).  Mineral  weathering  rates  determine  a  soil’s  buffering  capacity  and  are  the  single  most  important  properties  determining  an  ecosystem’s  ability  to  buffer  the  effects  of  acidifying  pollutants  (McDonnell  et  al.,  2010;  Hodson  and  Langan,  1999;  Whitlfield  et  al.,  2006).  Mineral  weathering  rates  in  soils  are  also  the  single  most  poorly  constrained  component  of  models  designed  to  calculate  acceptable  airborne  pollutant  loads  of  nitrogen  and  sulfur  deposition  from  power  generation,  transport,  and  agriculture  (Shindo  et  al.,  1995;  McDonnell  et  al.,  2010;  Li  and  McNulty,  2007).  Accurate  estimates  of  net  primary  productivity  of  forests  over  the  course  of  the  next  century  are  critically  important  to  global  carbon  models.  Forest  productivity  is  predicted  to  increase  due  to  elevated  CO2  (Lindner  et  al.,  2010;  Ainsworth  and  Long,  2005).  The  extent  of  this  negative  feedback  to  elevated  CO2  levels  is  largely  dependant  on  forest  trees’  ability  to  meet  their  increased  carbon  availability  and  water  use  efficiency  with  increased  nutrient  uptake  (Pinkard  et  al.,  2010;  Norby  et  al.,  1999).  As  the  effects  of  anthropogenic  nitrogen  deposition  continue  to  accumulate,  large  areas  of  forest  are  limited  by  base  cation  availability  (Naples  and  Fisk,  2010;  Baribault  et  al.,  2010),  which  is  a  function  of  mineral  dissolution.  In  coniferous  trees,  elevated  CO2  has  been  shown  to  increase  the  ratio  of  root  to  shoot  biomass  (root:shoot)  (Alberton  et  al.,  2007;  Janssens  et  al.,  2005)  and  allocation  to  mycorrhizal  symbionts  (Fransson  et  al.,  2007;  Compant  et  al.,  2010).  To  understand  how  forest  productivity  and  forest  carbon  stocks  will  be  affected  by  global  change  we  must  first  understand  whether  increased  carbon  allocation  to  nutrient  uptake  organs  actually  results  in  increased  nutrient  uptake  and  whether  this  increased  carbon  allocation  is  a  result  of  increased  nutrient  demand.  

Most  forest  trees  of  the  temperate  and  boreal  biomes  are  dependant  on  ectomycorrhizae  for  their  survival  (Smith  and  Read,  2008).  Ectomycorrhizal  fungi  (EMF)  are  symbionts  that  form  an  intimate  association  with  the  fine  roots  of  trees  and  some  woody  shrubs.  Increased  nutrient  uptake  is  generally  considered  to  be  the  most  beneficial  effect  of  EMF  on  forest  trees  (Smith  and  Read,  2008),  though  EMF  have  also  been  shown  to  increase  water  uptake  (Muhsin  and  Zwiazek,  2002),  provide  resistance  to  aluminum  and  other  toxic  metals  (Smith  and  Read,  2008),  and  increase  pathogen  resistance  (Buscot  et  al.,  1992).  EMF  take  up  nitrogen  from  the  soil  and  provide  their  host  plant  significant  amounts  of  it;  up  to  80  %  of  total  plant  N  uptake  is  from  EMF  (Hobbie  and  Colpaert  2003).  They  also  take  up  P,  Ca,  Mg,  and  K  from  the  soil  and  provide  their  host  plant  significant  amounts  of  these  nutrients  (Hatch,  1937,  Smith  and  Read,  2008,  Jentschke  et  al.  2001).    In  return  for  this  key  role  in  plant  nutrition  the  host  plant  transfers  significant  amounts  of  fixed  carbon  to  their  EMF.    A  recent  review  by  Hobbie  (2006)  suggests  an  average  of  approximately  15%  of  total  fixed  carbon  is  allocated  to  ectomycorrhizae,  but  studies  have  found  more  than  60%  of  recent  carbon  assimilation  (Rosling  et  al  2004)  and  net  primary  production  (Godbold  et  al.,  2006)  may  be  allocated  to  EMF.  

63    

In  addition  to  their  instrumental  role  in  tree  nutrition  EMF  are  believed  to  be  instrumental  in  forest  biogeochemistry.  They  have  a  strong  effect  on  processes  that  govern  soil  carbon  residence  time  (Gadgil  and  Gadgil,  1971;  Entry  et  al.,  1991;  Talbot  et  al.,  2008)  and  have  been  the  subject  of  much  interest  over  the  last  15  years  of  biogeochemistry  research  due  to  their  ability  to  stimulate  mineral  weathering.  A  Web  of  Science  citation  search  finds  that  since  1995,  74  articles  (including  7  reviews)  have  been  generated  on  the  topic  of  ectomycorrhizal  weathering.  Many  have  found  that  EMF  do  stimulate  weathering,  and  the  proposed  mechanisms  include  acidification  (Balogh-­‐Brunstad  et  al.,  2008;  Rosling  et  al.,  2004),  nutrient  uptake  (Wallander,  2000,  van  Hees  et  al.,  2004),  production  of  siderophores  (Ochs  et  al.,  1993;  Watteau  and  Berthelin,  1994),  and  production  of  low  molecular  weigh  organic  acids  (Paris  et  al.,  1996,  van  Scholl  et  al.  2006a).      

Numerous  studies  point  to  a  significant  biotic  contribution  to  mineral  weathering  in  forest  soils  from  prokaryotic  (Uroz  et  al.,  2009),  fungal  saprotrophic  (Rosling  et  al,  2007),  mycorrhizal  (Wallander,  2000),  and  plant  (Drever,  1994)  components  of  the  biota.  The  relative  importance  of  these  different  groups  in  mineral  weathering  as  well  as  the  effects  of  elevated  CO2  on  biotic  weathering  remain  poorly  understood.  

Low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOA)  are  actively  exuded  by  biota  in  response  to  nutrient  demand  (van  Scholl  et  al.,  2006b;  Paris  et  al.,  1996)  and  have  been  proposed  to  be  key  drivers  of  biotic  weathering  (van  Hees  at  al.,  2002;  Stillings  et  al.,  1996).  Work  by  Fransson  &  Johansson  (2009),  and  Johansson  et  al.  (2010)  suggests  that  LMWOA  production  by  both  plants  and  EMF  may  increase  in  response  to  elevated  CO2,  either  as  a  result  of  source  sink  relationships  within  the  plant  caused  by  increased  carbon  fixation  or  as  an  active  response  to  increased  nutrient  demand.  Assessing  the  relative  contributions  of  these  microbial  and  plant  components  of  forest  biota  to  LMWOA  production,  the  effects  of  CO2  on  LMWOA  production,  and  the  effects  of  these  LMWOA  production  levels  on  mineral  weathering  rates  are  necessary  elements  for  a  better  understanding  of  the  importance  of  biotic  weathering.  

Previous  work  by  van  Hees  et  al.  (2006a,  2006b)  demonstrated  a  slight  increase  in  weathering  rates  and  organic  acid  production  in  mesocosms  with  pine  seedlings  compared  to  those  without  seedlings  but  limited  effects  of  ectomycorrhizae  on  weathering  rates  or  organic  acid  production.  In  that  study  pine  growth  responded  poorly  to  EMF  due  to  low  nutrient  levels,  EMF  did  not  persist  in  one  of  the  treatments,  and  overall  weathering  was  very  low  because  a  highly  weathered  substrate  was  used  which  was  likely  well  coated  with  resistant  secondary  mineral  coatings.    

Here  we  focus  on  the  role  of  LMWOA’s  in  biological  weathering  by  using  a  column  microcosm  system  to  elucidate  the  role  of  Scots  pine  seedlings,  their  associated  EMF  and  the  effects  of  elevated  CO2  on  weathering  rates.  In  contrast  to  earlier  work  that  used  a  similar  system  (van  Hees  et  al.,  2006a,  2006b)  we  have  increased  nutrient  levels,  used  a  rooting  substrate  derived  from  primary  minerals,    used  different  fungal  symbionts,  and  incorporated  an  elevated  CO2  treatment.        

64    

METHODS  Plant,  mycorrhizal,  and  bacterial  preculture  Seeds  of  Pinus  sylvestris  were  surface  sterilized  for  30  min  in  33  %  H2O2,  rinsed  in  sterilized  water  and  sown  in  sterile,  autoclaved  water  agar  (1.6  %)  for  6-­‐8  weeks  for  germination  (300  µmol  m-­‐2  s-­‐1  PPFD;  16H  light  at  18°C,  8  hours  dark  at  15°C).    

Ectomycorrhizal  and  non-­‐ectomycorrhizal  seedlings  were  prepared  in  petri  dishes  of  peat:vermiculite:Modified  Melin-­‐Norkrans  media  (1:4:2  v:v:v)  as  detailed  in  Fransson  and  Johansson  (2009).  The  ectomycorrhizal  fungal  species  Suillus  variegatus  (Sw.:Fr.)  O.  Kuntze  (isolate  code  UP597,  GenBank  accession  no.  EF493256)  and  Piloderma  fallax  (Liberta)  Stalpers  (UP113,  DQ179125),  growing  on  half  strength  Modified  Melin-­‐Norkrans  media  (Marx,  1969)  were  used  for  EMF  inoculum.  After  12  weeks  seedlings  were  removed  from  petri  dishes  and  planted  in  10  cm  X  10  cm  X  10  cm  pots  filled  with  a  1:10  sterilized,  autoclaved  peat:quartz  sand  mixture.    These  pots  were  grown  under  the  same  environmental  conditions  as  detailed  for  seed  germination  for  6  months  and  watered  3  times  weekly  with  ~  20  ml  of  nutrient  solution.  The  composition  of  this  nutrient  solution  was  600  µmol  NH4NO3,  140  µmol  K2HP04,  150  µmol  Ca(NO3)  2,  80  µmol  K2SO4,  15  µmol  H3BO3,  0.3  µmol  Na2MoO4,    0.3  µmol  ZnSO4,    0.3  µmol  CuSO4,    50  µmol  Mg(NO3)2.    

In  order  to  incorporate  bacterial–ectomycorrhizal  interactions  which  may  be  important  to  mineral  weathering  (Uroz  et  al.,  2007;  2009)  we  inoculated  each  column  with  a  fungus  free  bacterial  suspension.  This  was  obtained  in  April  2008  from  E  horizon  soil  and  humus  collected  from  a  local  Pinus  sylvestris  boreal  forest  (59.785N,  17.683E,  Lunsen  forest,  Uppsala,  Sweden).  The  collected  soil  was  subjected  to  sequential  centrifugation  in  winogradsky  salt  solution  (Faegri  et  al.  1977),  followed  by  nicodenz  extraction  at  ultra  high  speed  (Courtois  et  al.  2001).  The  resulting  bacterial  suspension  was  tested  for  the  presence  of  culturable  fungi  by  plating  on  potato  dextrose  agar,  which  yielded  no  observable  fungal  colonies.  The  bacterial  suspension  was  used  for  inoculation  within  2  days  of  extraction  and  was  stored  at  4-­‐8°C  in  the  meanwhile.  

 Soil  column  system  and  growth  conditions  A  sand  culture  system  nearly  identical  to  that  of  van  Hees  et  al.  (2006a)  was  employed  with  opaque  plexiglas  tubes  (diameter=  4  cm,  height  =  30  cm)  serving  as  vertical  growth  columns.    Each  column  was  filled  with  405  grams  (dry  weight)  of  a  mineral  mix  (which  mimicked  the  e-­‐horizon  of  a  local  boreal  forest  soil)  comprised  of  50%  quartz  sand,  28%  oligioclase,  18%  microcline,  1.8%  hornblende,  0.9%  vermiculite,  and  0.9%  biotite.  The  quartz  sand  was  acid  washed  (10%  HCl  w/v)  overnight  and  washed  with  DI  water  until  the  solution  pH  was  >6  before  being  mixed  with  the  other  ground  minerals.  The  complete  mix  was  approximately  40%  silt  size  class  (>71uM,  <100um)  and  60%  sand  size  class  (>100um,  <500uM).  The  tubes  were  drained  by  applying  suction  at  the  base  of  the  columns  with  a  ceramic  lysimeter  cup  (655X01,  Soil  Moisture  Corp.,  Santa  Barbara,  CA)  and  column  leachate  was  collected  in  opaque  250-­‐ml  glass  bottles.  When  tested  before  planting,  this  drainage  system  maintained  the  mineral  mix  at  a  moisture  content  of  5±2%.  Rhizon  SMS-­‐MOM  suction  lysimeter  samplers  (0.3cm  diameter,  3  cm  length;  Rhizosphere  Research  Products,  Wageningen)  were  inserted  horizontally  10  cm  below  the  soil  surface  

65    

for  the  purpose  of  extracting  rhizosphere  soil  solution  to  measure  LMWOA  production.  The  columns  were  maintained  at  20  ±  0.5°C  during  the  “daytime”  and  14-­‐16°C  

during  the  “nighttime”  by  the  use  of  plexiglass  chambers  placed  over  the  column  system  with  peltier  coolers  used  to  regulate  temperature.  CO2  levels  were  maintained  at  330-­‐380  ppm  (ambient)  and  700-­‐750  ppm  (elevated)  under  each  chamber.  Light  was  supplied  by  a  high-­‐pressure  sodium  lamp  with  an  intensity  of  300  PPFD  at  the  seedling  tops  (16h  photoperiod).  The  columns  were  watered  3  times  a  week  with  24-­‐36  ml  (volumes  increased  over  the  course  of  the  experiment)  nutrient  solution  (72-­‐108  ml  column-­‐1  week-­‐1).  The  watering  solution  contained  33  µmol  (NH4)  2HPO4,  407  µmol  NH4NO3,  27.5  µmol  K2HP04,  55  µmol  Ca(NO3)  2,  27.5  µmol  K2SO4,  5.5  µmol  H3BO3,  1  µmol  FeCl3,  0.1  µmol  Na2MoO4,    0.1  µmol  ZnSO4,    0.1  µmol  CuSO4,    55  µmol  Mg(NO3)2.    The  pH  was  adjusted  to  5.0.  The  molar  ratio  of  N/K/P  was  100:10:6,  which  is  comparable  to  the  optimal  nutrient  use  efficiency  values  for  conifers  of  100:15:6,  as  determined  by  Ingestad  (1979),  except  it  is  slightly  depauperate  in  K.  After  addition  of  the  mineral  mixture  to  each  column  the  columns  were  allowed  to  equilibrate  with  the  nutrient  solution  for  three  weeks.  In  April  2008,  one  seedling  was  planted  in  each  column  (except  for  8  non-­‐planted  controls).  At  this  time  2  seedlings  of  each  colonization  treatment  were  dried  for  future  analysis.    Black  plastic  beads  (diameter  =  0.8  cm)  were  placed  on  top  of  the  soil  after  planting  to  prevent  the  growth  of  algae.  One  week  after  planting,  each  column  was  inoculated  with  5  ml  of  the  fungus-­‐free  bacterial  inoculum  described  above.    Experimental  Overview  Treatments  were  factorial  with  +/-­‐seedlings,  +/-­‐  EMF  (2  species),  and  +/-­‐CO2  (there  was  no  treatment  with  ectomycorrhizae  without  seedlings).  N=4  for  the  nonmycorrhizal  and  nonplanted  treatments,  and  5  for  the  EMF  treatments;  in  total  there  were  36  columns,  28  of  which  were  planted.  The  experiment  was  run  for  9  months.  Organic  acid  and  phosphate  concentrations  were  measured  in  rhizosphere  soil  solution,  and  elemental  concentrations  and  pH  were  measured  in  column  leachate  collected  during  the  experiment.  Upon  harvest,  the  cation  exchange  capacity  (CEC)  of  the  mineral  mix  pre  and  post  9  months  of  growth,  the  weight  and  elemental  contents  of  seedlings,  and  the  chitin  contents  of  the  roots,  and  mineral  mix  were  assessed.  This  information  was  used  to  construct  whole  column  nutrient  budgets.      Sampling  during  experiment  Rhizosphere  soil  solution  was  extracted  for  low  molecular  weight  organic  acid  (LMWOA)  analysis  by  applying  suction  for  up  to  3h  with  a  50-­‐ml  plastic  syringe  to  lysimeter  samplers.  LMWOA  samples  were  collected  five  times  from  each  column  at  5,  6,  7,  8,  and  9  months  post  planting,  with  sample  volumes  ranging  from  2  to  12  ml.  Sampling  was  performed  24–36  h  after  watering,  and  immediately  frozen  at  -­‐20oC  for  later  analysis.       Column  leachate  was  sampled  every  3-­‐4  weeks.  Total  volume  in  each  bottle  was  measured  and  2  duplicate  15  ml  aliquots  from  each  bottle  were  sampled  and  frozen  for  future  elemental  analysis.  Leachate  was  sampled  a  total  of  11  times  for  each  column.        

66    

 Harvest  and  sample  analysis  Upon  harvest  seedlings  were  removed  from  the  mineral  mix,  and  all  possible  adhering  mineral  particles  were  shaken/brushed  off  the  roots  under  dry  conditions.  The  last  few  remaining  adhering  mineral  particles  were  washed  off  the  roots  with  distilled  water.  Each  seedling  was  separated  into  roots,  stem,  and  needles  and  dried  at  60oC  for  24  -­‐72  hours  until  no  more  mass  loss  was  noted,  and  we  then  measured  dry  weights  (DW).  The  plant  DW  is  the  sum  of  the  three  compartments  and  the  root:shoot  was  calculated  as  root  DW  /  (stem  DW  +  needles  DW).  Seedlings  sampled  before  planting  into  columns  were  given  the  same  treatment.  

The  mineral  mix  from  the  columns  was  separated  into  three  fractions:  bottom,  top,  and  rhizosphere.  The  bottom  fraction  consisted  of  the  portion  of  the  column  below  the  extent  of  lowest  roots  in  that  column  (the  roots  extended  between  30%  and  70%  down  the  30  cm  height  of  the  columns,  so  the  relative  ratio  of  top:bottom  is  variable),  the  rhizosphere  fraction  consisted  of  all  of  the  soil  which  remained  adhering  to  the  roots  when  the  roots  were  gently  removed  from  the  columns,  and  the  top  fraction  was  the  remainder.  Each  fraction  was  weighed  moist  and  a  subsample  of  approximately  50  grams  (moist  weight)  was  collected  and  dried  at  60°C  for  24-­‐72  h  until  no  further  mass  loss  was  noted.  Additional  smaller  subsamples  were  freeze-­‐dried  for  chitin  analysis.     Low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOAs)  were  determined  by  capillary  electrophoresis  by  the  method  of  Dahlen  et  al.  (2000).  Briefly,  LMWOA’s  were  analyzed  on  an  Agilent  3DCE  capillary  electrophoresis  system  (Agilent  technologies,  Santa  Clara).  The  concentrations  of  12  different  LMWOA’s  were  analyzed:  acetate,  butyrate,  citrate,  formate,  fumarate,  lactate,  malate,  malonate,  oxalate,  proprionate,  succinate,  and  shikimate,  as  well  as  phosphate.  To  determine  oxalate  and  citrate,  EDTA  (final  concentration  250  mM  at  pH  9)  was  added  in  a  separate  run  to  eliminate  interference  from  Al  and  Fe  ions.  LMWOA  data  is  presented  in  µmol/L  solution  collected  from  rhizosphere  lysimeters  and  as  µmol/L/gram  plant  DW.  

Acid  digestion  of  plant  material  was  undertaken  following  the  procedure  of  Zarcinas  et  al.  (1987)  as  follows:  0.1  gram  of  each  seedling  component  (needles,  stems,  and  roots,  all  pre-­‐ground  on  a  wiley  mill)  was  separately  digested  at  room  temperature  overnight  in  2  ml  concentrated  HNO3  (10N),  heated  up  to  and  refluxed  at  130oC  with  a  funnel  lid  for  5-­‐7  hours  and  subsequently  diluted  with  12-­‐15  ml  deionized  water.  

Exchangeable  ions  were  measured  for  each  of  the  three  post-­‐harvest  mineral  fractions  for  each  sample  as  well  as  for  9  replicates  of  the  pre-­‐experimental  mineral  mix.    Extractions  were  performed  in  a  1:10  (m:V)  mineral  mix:1M  NH4AOc  suspension  by  shaking  for  5  hours  at  100  rpm  at  room  temperature.  The  supernatant  was  separated  by  centrifugation  (3000g)  and  filtered  through  a  pre-­‐washed  0.45  µm  Na-­‐Acetate  filter  syringe.  Before  cation  exchange,  the  pre-­‐experimental  mineral  mix  was  equilibrated  with  the  experimental  nutrient  solution  3  separate  times  for  12  hours  each  (solution  was  exchanged  between  each  rinse)  to  mimic  the  period  that  the  columns  were  allowed  to  equilibrate  for  three  weeks  before  planting.  

Plant  digests,  CEC  extracts,  and  column  leachate  were  all  analyzed  for  elemental  contents  of  Al,  Ca,  Fe,  K,  Mg,  Mn,  Na,  P,  S,  and  Si  on  a  Perkin-­‐Elmer  atomic  optical  emission  

67    

inductively  coupled  plasma  emission  spectrometer  (AOE-­‐ICP).  A  set  of  four  standards  was  established  based  on  preliminary  analysis  for  each  sample  type.  In  addition  to  hourly  rerunning  of  standards,  duplicates  and  an  internal  scandium  standard  were  run  to  ensure  an  accuracy  of  elemental  contents  to  +/-­‐  1%.  Elemental  loss  (µmol)  though  column  leachate  was  calculated  from  the  leachate  concentration  and  the  total  volume  of  leachate.       Plant  roots  and  growth  substrate  were  assayed  for  chitin  content  post  harvest  to  assess  fungal  biomass.  Chitin  was  extracted  and  analyzed  by  HPLC  at  the  Department  of  Forest  Ecology  &  Management,  SLU  (Sweden),  according  to  the  method  in  Ekblad  and  Näsholm  (1996).  Chitin  concentration  of  each  column  fraction  (top,  rhizosphere,  bottom,  and  roots)  was  multiplied  by  the  mass  of  that  fraction  and  these  sums  were  added  to  obtain  total  chitin  content  per  column.  Significant  quantities  of  chitin  were  not  found  in  any  of  the  bottom  fraction  samples.  To  relate  fungal  biomass  to  plant  biomass  the  total  chitin  content  (root  +  rhizosphere  +  mineral  mix)  was  divided  by  the  total  plant  biomass  in  each  column.    Construction  of  weathering  budgets  Elemental  concentrations  obtained  from  ICP  analysis  were  used  to  back-­‐calculate:  1.  Change  (final  –  initial)  in  NH4AOc-­‐exchangeable  elements  (ΔCEC);  2.  Final  elemental  content  in  plants  –  pre-­‐experimental  plant  contents  (seedling  uptake,  Su);  3.  elemental  drainage  (total  leachate,  Lt).  All  values  were  computed  in  micromoles  and  total  weathering  (Wt)  was  represented  by  the  following  equation.    Wt  =  ΔCEC  +  Su  +  Lt  -­‐  nutrients  added    Statistical  analysis  Except  where  explicitly  stated  all  data  are  presented  as  the  mean  per  column.  LMWOA  and  chitin  were  also  presented  as  mean  per  column  per  unit  seedling  mass.  In  this  experiment  we  investigate  2  different  independent  variables:  CO2  (ambient  and  elevated)  and  seedling  treatment  (non-­‐planted,  non-­‐mycorrhizal,  P.  fallax,  S.  variegatus).  If  significant  interaction  effects  were  found  they  were  indicated.  Otherwise,  when  looking  at  the  effects  of  seedling  treatment  (non-­‐planted,  non-­‐mycorrhizal,  P.  fallax,  S.  variegatus)  the  two  CO2  treatments  were  combined  (ambient  and  elevated).  When  looking  at  the  effects  of  CO2  the  different  seedling  treatments  (non-­‐mycorrhizal,  P.  fallax,  S.  variegatus)  were  combined.  When  looking  at  the  effect  of  CO2  on  any  growth  or  weathering  parameters,  only  planted  columns  were  considered.  Statistical  analysis  was  performed  using  JMP  software  version  5.01a  (SAS  Institute,  Inc.,  Cary,  NC,  USA).  Two-­‐way  ANOVA  was  used  to  determine  treatment  and  interaction  effects.  Significant  differences  between  CO2  treatments  were  assessed  with  a  student  T  test,  and  significant  differences  between  ectomycorrhizal  treatments  with  Tukey’s  HSD  test,  using  a  one-­‐way  ANOVA.          

68    

RESULTS  Seedling  Growth  Elevated  CO2  significantly  increased  the  biomass  of  seedlings  (p  <  0.04),  but  had  no  significant  effect  on  root:shoot.    Mycorrhizal  treatment  had  no  significant  effect  on  growth  or  root:shoot    (table  1).  There  was  no  interactive  effect  of  mycorrhizal  treatment  and  CO2  on  either  biomass  parameter.  

  Ambient  CO2  

Elevated  CO2  

  Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Total  Biomass  (g)   3.84  a   4.49  b     4.69  a   4.05  a   3.88  a  Root:Shoot   1.98  a   1.81  a     2.16  a   1.86  a   1.71  a  

Table  1:  Growth  (mean  seedling  mass)  and  root:shoot  (mean  seedling  root  mass/mean  seedling  shoot  mass)  by  treatment.  Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐mycorrhizal  columns,  and  columns  with  seedlings  colonized  by  either  S.  variegatus  ,  or  P.  fallax  (right  half  of  table).  

 Mycorrhizal  Colonization  Upon  harvest  we  observed  highly  variable  rates  of  mycorrhizal  colonization.    We  classified  the  seedlings  as  abundantly  colonized  (>50%  of  root  tips  colonized),  moderately  colonized  (50%  >  colonization  >5%),  or  sparsely  colonized  (<5%  colonized).  Of  the  20  seedlings  in  the  mycorrhizal  treatments  6,  4,  and  10  seedlings  were  abundantly,  moderately,  and  sparsely  colonized,  respectively,  at  the  time  of  harvest.  While  the  root  systems  extended  12-­‐21  cm  down  the  30  cm  columns,  no  mycorrhizae  were  found  deeper  than  6  cm.  There  were  no  extraradical  hyphae  or  ectomycorrhizae  resembling  Piloderma  fallax  or  Suillus  variegatus  observed  in  the  non-­‐mycorrhizal  treatment,  but  there  were  turgid,  smooth,  black  root  tips  observed  in  the  non-­‐mycorrhizal  treatments  that  may  have  been  Thelephoroid  mycorrhizae.  Chitin  analysis  of  roots  and  growing  medium  showed  almost  no  chitin  in  our  unplanted  controls,  and  significant  chitin  in  both  mycorrhizal  treatments  (Figure  1)  (p  <  0.002).  There  were  also  significant  amounts  of  chitin  (~45%  of  what  was  found  in  the  mycorrhizal  treatments)  in  the  non-­‐mycorrhizal  planted  treatments.    In  both  mycorrhizal  treatments  most  chitin  was  found  in  the  mineral  mix,  whereas  in  the  non-­‐mycorrhizal  treament  most  chitin  was  found  in  the  rhizosphere  and  roots.  Combining  the  two  mycorrhizal  treatments  we  found  moderately  more  chitin  in  the  elevated  CO2  treatment,  86  (±  17.8  S.E.)  mg  chitin/column  vs.  50  (±  9.1  S.E.)  mg  chitin  /  column  (p  <  0.09).  When  the  chitin  content  was  expressed  as  total  chitin  content  per  gram  seedling  biomass  (figure  2),  we  see  that  the  mycorrhizal  treatments  did  have  significantly  more  chitin  than  the  non-­‐mycorrhizal  treatment,  and  that  elevated  CO2  was  associated  with  a  higher  chitin  content  in  the  Piloderma  treatment.  

69    

Figure  1:  Chitin  contents  (mean/column)  by  seedling  treatment.  Columns  that  do  not  share  letters  were  significantly  different  (p  <  0.05).  

   

 Figure  2:  Chitin  content  (total/column)  per  unit  seedling  mass  (mg/g)  by  seedling  treatment  and  by  CO2  

treatment.  Error  bars  are  equivalent  to  two  standard  errors  in  length.  Columns  that  do  not  share  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  

 Low  Molecular  Weight  Organic  Acids  Formic,  lactic,  and  acetic  acids  made  up  the  majority  of  measured  low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOA),  comprising  82%,  12%,  and  4%  of  total  LMWOA’s,  respectively.    Much  smaller  amounts  of  malonate,  oxalate,  fumarate,  and  succinate  were  occasionally  detected,  but  their  occurrence  in  measurable  quantities  was  not  associated  with  any  treatment.    Nonplanted  columns  had  significantly  lower  LMWOA  levels  than  planted  columns  (p  <  0.001)  while  P.  fallax  columns  had  significantly  higher  LMWOA  concentrations  than  nonplanted,  but  significantly  lower  levels  than  either  the  

S. variegatusP. fallaxnon-mycnot planted

mg

chiti

n pe

r co

lum

n

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

'(')*+,(--./012" 34"51-/67189:" ;4"<1221="

1*>/6'8"?@%"

6265186A"?@%"

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

'(')*+,(--./012" 34/2245" 6/2(78-*1"

1*9/8':";<%"

828=1:87";<%"

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

'(')*+,(--./012" 34/2245" 6/2(78-*1"

1*9/8':";<%"

828=1:87";<%"

ambient CO2

elevated CO2

A AB

BCBC C

mg

chiti

n pe

r gr

am s

eedl

ing

wei

ght

70    

nonmycorrhizal  or  S.  variegtus  columns  (p  <  0.05).  These  differences  were  driven  by  differences  in  the  production  of  formate  and  lactate  (Figure  3A).  Columns  exposed  to  elevated  CO2  produced  significantly  more  total  LMWOA’s  (p  <  0.01),  and  this  difference  was  driven  primarily  by  significantly  greater  formic  acid  production  (Figure  3B).  When  amounts  of  LMWOA  are  calculated  per  gram  seedling  DW  there  are  no  significant  differences  between  mycorrhizal  or  CO2  treatments  (data  not  shown).  

 

   Figure  3:    Effect  of  seedling  treatment  (A)  and  CO2  treatment  (B:  planted  columns  only)  on  concentrations  of  low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOA)  in  the  column  leachate  (µmol/L).  Bars  that  do  not  share  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05).  Capital  letters  atop  each  bar  refer  to  total  LMWOA.  

 pH  of  flow  through  Solution  pH  was  measured  for  the  leachate  from  7  sampling  dates.  Leachate  pH  was  consistently  alkaline  (pH  7.0-­‐9.4).  The  nutrient  solution  used  to  water  the  columns  was  pH  5.  There  was  no  significant  difference  between  elevated  and  ambient  CO2  treatments  nor  between  the  non-­‐mycorrhizal  treatments  and  the  mycorrhizal  treatments  in  leachate  pH,  but  the  leachate  of  the  non-­‐planted  controls  was  significantly  lower  (p  <  0.001)  in  pH  than  the  planted  treatments  on  5  of  the  7  sampling  dates  (Figure  4)  and  moderately  but  not  significantly  lower  on  the  other  two  sampling  dates.  The  pH  of  the  column  leachate  

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

&#"

'!"

()" (*" +,"-./," ),"0.11,"

!"#$%&'()*+

,-."/(

01230+240(

2345/"6*789"

1.:;:".:<="

02/><:".:<="

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

&#"

'!"

()" (*" +,"-./," ),"0.11,"

!"#$%&'()*+

,-."/(

01230+240(

2345/"6*789"

1.:;:".:<="

02/><:".:<="!"

#!"

$!"

%!"

&!"

'!!"

'#!"

'$!"

'%!"

'&!"

#!!"

()" (*" +,"-./," ),"01.0,"

!"#$%&'()*+

,-."/(

01230+240(

.2341"5*678"

9:0;0":0<="

>.1?<0":0<="

A

C C

B

c c

b

ab

b b

a

A

!"

#"

$!"

$#"

%!"

%#"

&!"

&#"

'!"

()*+,-."/0%" ,1,2(.,3"/0%"

!"#$%&'()*+

,-."/(

4.5,6"7890:"

1(;<;"(;+3"

=46)+;"(;+3"

!"

#!"

$!"

%!"

&!"

'!!"

'#!"

'$!"

'%!"

'&!"

()*+,-."/0#" ,1,2(.,3"/0#"

!"#$%&'()*+

,-."/(

4.5,6"7890:"

1(;<;"(;+3"

=46)+;"(;+3"

!"!#$%!&'()*$+,-!.%'()*

B

A a

a

a

b

B

71    

from  the  planted  columns  did  not  change  appreciably  over  time,  while  the  leachate  from  the  unplanted  columns  decreased  slightly  over  time  (~0.4  pH  units).    

Figure  4:  Difference  in  pH  of  leachate  between  planted  and  non-­‐planted  columns    [planted  (n=8)  –  nonplanted  (n=28)]  on  7  different  sampling  dates.  Columns  topped  with  an  *  represent  significant  differences  (p  <0.001).    

 Leachate  elemental  losses  The  losses  of  K,  Ca,  Mg,  and  Si  were  lower  under  elevated  CO2,  and  higher  for  the  non-­‐planted  treatment  than  for  the  planted  treatments,  except  for  Si,  the  leaching  of  which  was  lower  for  the  non-­‐planted  control  columns  (table  2).  The  losses  of  K,  Ca,  Mg,  and  Si  were  all  relatively  steady  over  time  (figure  5).        Element   Ambient  

CO2  Elevated  CO2  

  Not  planted  

Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Ca   467  b   370  a     588  b   431  a   417  a   410  a  K   220  b   163  a     416  b   183  a   181  a   209  a  

Mg   43.0  b   31.7  a     61.8  b   36.5  a   36.1  a   39.4  a  Si   166  b   134  a     103  a   154  b   151  b   145  b  

Table  2:  Mean  total  elemental  losses  in  column  leachate  (total  µmol/  column).  Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  planted  columns  with  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐planted  columns,  non-­‐mycorrhizal  columns,  and  columns  with  seedlings  colonized  by  either  S.  variegatus,  or  P.  fallax  (right  half  of  table).  

 

!"!#$"

!#%"

!#&"

!#'"

("

%)" *+" ((*" ()'" (&)" ('&" $($"

!"#$

%$&'$("&()*+()

,-&.$!

(/(&0

&),-&.$!

(

1-23(3"&'$(),-&4&5(

* * * **

72    

   Figure  5:  Cumulative  elemental  losses  (mean  µmol  lost  per  column),  averaged  across  all  columns,  in  leachate  over  time.  

 Cation  Exchange  Capacity    Overall,  CO2  had  no  effect  on  ΔCEC.  For  Ca  and  Si,  the  presence  of  seedlings,  but  not  of  mycorrhizae,  significantly  increased  ΔCEC,  while  mycorrhizae,  but  not  seedlings  alone,  increased  the  ΔCEC  for  Mg  and  K  (table  3).  For  some  elements  and  treatments  the  CEC  was  considerably  higher  before  the  experiment  than  after,  and  thus,  the  ΔCEC  (difference  between  before  treatment  and  after  treatment)  is  negative  for  these  treatments  (table  3).  We  see,  in  particular,  a  sharp  decrease  in  CEC  for  calcium.  The  changes  in  CEC  for  Mg  and  K  are  also  negative  for  some  treatments.        Element   Ambient  

CO2  Elevated  CO2  

  Non  planted  

Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Ca   -­‐541  a   -­‐536  a     -­‐646  a   -­‐514  b   -­‐504  b   -­‐507  b  K   10  b   17  b     -­‐44  a   -­‐4  a   50.  b   38  b  

Mg   -­‐24  a   -­‐22  a     -­‐59  a   -­‐36  a   2  b   10.  b  Si   118  a   180  a     38  a   141  b   120.  b   222.  b  

Table  3:  Change  in  cation  exchange  capacity  ΔCEC  (CECfinal  –  CECinitial:  mean  µmol/  column).  Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  planted  columns  with  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐planted  columns,  non-­‐mycorrhizal  columns,  and  columns  with  seedlings  colonized  by  either  Suillus,  or  Piloderma  (right  half  of  table).  

         

0  

100  

200  

300  

400  

500  

600  

0   50   100   150   200   250   300  

Cumulative  umol  lost  

days  since  planting  

K  

Si  

Mg  

Ca  

73    

Seedling  elemental  contents  The  needle  concentrations  of  Ca,  K,  Mg,  Fe,  and  P  were  all  at  or  above  deficiency  thresholds  for  P.  sylvestris  (Breakke,  1994;  Bargagli,  1998)  (table  4),  though  P  is  near  the  lower  limit  of  optimal  growth.  CO2  treatment  had  no  effect  on  needle  nutrient  concentrations  and  mycorrhizal  treatment  only  affected  needle  [Ca]  (table  4).  Neither  CO2  level  nor  mycorrhizal  treatment  had  a  significant  effect  on  total  seedling  (root  +  shoot  +  needle)  contents  of  Ca,  K,  or  Mg  (table  5)  despite  significant  differences  in  seedling  biomass  between  CO2  treatments.  The  differences  in  seedling  Ca  and  K  contents  between  treatments  correlated  tightly  with  seedling  DW,  while  the  opposite  trend  was  found  with  Mg.  Ectomycorrhizal  colonization,  particularly  with  Piloderma,  increased  seedling  Mg  concentration.    Element  

(deficiency)  Ambient  CO2  

Elevated  CO2  

  Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Ca  (0.4-­‐2.0)   10.85  a   9.83  a     10.30  ab   12.02  a   8.69  b  K  (3.5-­‐4.0)   4.97  a   4.97  a     4.82  a   5.02  a   5.05  a  Mg  (0.4-­‐0.7)   1.68  a   1.77  a     1.68  a   1.74  a   1.75  a  P  (1.1-­‐1.3)   1.39  a   1.28  a     1.25  a   1.35  a   1.40  a  Fe  (0.10)   0.12  a   0.11  a     0.10  a   0.12  a   0.12  a  

Table  4:  Elemental  concentrations  (mg/g  dry  mass)  in  P.  sylvestris  needles  of  major  mineral  derived  nutrients.  Values  in  parenthesis  are  the  deficiency  thresholds:  ranges  strong  deficiency  -­‐  lower  level  of  optimum  growth  (Breakke,  1994);  single  value  for  Fe  represents  lower  level  of  optimum  growth  (Bargagli,  1998).  Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐mycorrhizal  seedlings,  and  seedlings  colonized  by  either  S.  variegatus,  or  P.  fallax  (right  half  of  table).  

   Element    

Ambient  CO2  

Elevated  CO2  

  Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Ca  (µmol/seedling)   651  a   757  a     776  a   740.  a   611  a  K    (µmol/seedling)   381  a   432  a     445  a   388  a   395  a  Si  (µmol/seedling)   13.7  a   17.5  b     16  a   15  a   16  a  Mg  (µmol/seedling)   429  a   537  a     442  a   454  a   545  a  Mg  (umol  /g  dry  mass  of  seedling)  

112  a   120.  a     95  a   110.  ab   139  b  

Table  5:  Elemental  contents  (µmol)  in  P.  sylvestris  seedlings  of  Ca,  K,  Si,  and  Mg.    Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐mycorrhizal  seedlings  and  seedlings  colonized  by  either  S.  variegatus,  or  P.  fallax    (right  half  of  table).          

74    

Weathering  budgets  Whole  column  weathering  budgets  for  the  4  elements:  Si,  Ca,  K,  and  Mg  show  no  effect  of  CO2  on  total  weathering  losses  (table  6).  The  presence  of  seedlings,  mycorrhizal  or  not,  did  significantly  enhance  weathering  losses  compared  to  non-­‐planted  controls  (table  6).  Mycorrhizal  inoculation  had  no  significant  effect  on  the  total  weathering  losses  of  any  of  the  elements  examined.  More  Si  (23%)  and  Mg  (27%)  were  weathered  in  columns  planted  with  P.  fallax  inoculated  seedlings,  but  these  differences  were  not  significant  (table  6).  The  major  pool  of  weathering  losses  for  Mg,  K,  and  Ca  in  the  seedling  treatments  was  uptake  into  the  growing  seedlings;  losses  of  magnesium  were  particularly  dominated  by  seedling  uptake  (figure  6B-­‐D).  Silica  losses  were  fairly  evenly  distributed  between  ΔCEC  and  column  leachate,  while  seedling  uptake  was  negligible  (figure  6A).  As  stated  previously,  ΔCEC  was  negative  for  calcium  and  slightly  negative  for  some  K  and  Mg  treatments.  When  the  nutrients  added  during  watering  were  subtracted  from  the  final  budgets  the  net  weathering  losses  of  Ca,  K,  and  Mg  in  the  non-­‐planted  treatment  are  negative  or  only  slightly  positive  (table  6),  suggesting  a  “missing  sink”  for  weathering  products.    Element   Ambient  

CO2  Elevated  CO2  

  Non  planted  

Non-­‐  mycorrhizal  

Suillus  variegatus  

Piloderma  fallax  

Ca   416  a   438  a     -­‐246  a   505  b   465  b   326  b  K   270  a   273  a     15  a   266  b   262  b   285  b  

Mg   280  a   377  a     -­‐175  a   264  b   313  b   396  b  Si   328  a   342  a     142  a   311  b   286  b   383  b  

Table  6:    Total  weathering  (µmol)  losses  for  Ca,  K,  Mg,  and  Si  (average/  column).  Total  weathering  =  Leachate  +  ΔCEC  +  Seedling  uptake  –  irrigation  additions.  Values  paired  with  different  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05)  either  between  planted  columns  with  ambient  and  elevated  CO2  (left  half  of  table)  or  between  non-­‐planted  columns,  non-­‐mycorrhizal  columns,  and  columns  with  seedlings  colonized  by  either  S.  variegatus,  or  P.  fallax  (right  half  of  table).    

         

75    

 Figure  6:    Total  elemental  (µmol)  losses  for  Si  (A),  Ca  (B),  Mg  (C),  and  K  (D)  (average/column).  NP=  nonplanted  columns.  NM=  nonmycorrhizal  columns.  P.  fal.  =  columns  with  seedlings  colonized  by  P.  fallax.  S.  var.  =  columns  with  seedlings  colonized  by  S.  variegatus.  Negative  values  for  ΔCEC  indicate  that  CEC  decreased  over  the  course  of  the  experiment.  

   DISCUSSION  Seedling  and  Ectomycorrhizal  Growth  Elevated  CO2  increased  the  biomass  of  the  Pinus  sylvestris  seedlings.  Other  studies  on  coniferous  seedlings  have  generally  found  a  growth  stimulation  with  elevated  CO2  (see  reviews  by  Ceulemans  and  Mousseau,  1994;  Norby  et  al.,  2005;  Hyvönen  et  al.,  2006),  and  this  trend  includes  several  studies  on  mycorrhizal  Pinus  sylvestris  seedlings  (Gorissen  and  Kuyper,  2000;  Alberton  et  al.  2007;  Temperton  et  al.,  2003),  although  some  other  studies  have  failed  to  find  an  effect  of  elevated  CO2  on  growth  (Gorissen  and  Kuyper,  2000;  Fransson  and  Johansson,  2009;  Fransson  et  al.,  2007).  We  found  a  slight  (though  not  significant)  reduction  in  root:shoot  with  elevated  CO2.  Most  studies  on  ectomycorrhizal  P.  sylvestris  seedlings  which  have  noted  a  growth  stimulation  from  elevated  CO2  also  found  an  increase  in  root:shoot  (Gorissen  and  Kuyper,  2000;  Janssens  et  al.,  2005;  Alberton  et  al.  

mea

n !"

#$%&'%$#()*+#$!

,-A

mea

n !"

#$%./%$#()*+#$!,

-

Bm

ean !"

#$%"0%$#()*+#$!,

- Cm

ean !"

#$%1%$#()*+#$!

,-D

NPNP

NP NPNM NM

NMNM

S. var.S. var.

S. var. S. var.

P fal.P fal.

P fal.P fal.

76    

2007).  A  decrease  in  root:shoot  does  not  necessarily  indicate  reduced  belowground  C  allocation  as  carbon  could  be  allocated  to  EM  fungi  rather  than  root  biomass.    If  we  use  Ekblad  and  Nasholm’s  (1996)  estimate  that  9.5%  of  fungal  biomass  is  chitin,  then  our  observed  21  mg  average  difference  in  chitin  between  elevated  and  ambient  CO2  treatments  would  correspond  to  220  mg  more  fungal  biomass  supported  by  seedlings  in  the  elevated  CO2  treatment.  This  difference  would  bring  the  root:  shoot  ratios  of  the  two  CO2  treatments  to  near  parity.  Additionally,  a  given  amount  of  ectomycorrhizal  biomass  typically  has  a  significantly  higher  respiration  rate  than  the  same  mass  of  fine  roots  and  thus  represents  more  belowground  carbon  allocation  (Heinonsalo  et  al.,  2010;  Rygiewicz  and  Andersen,  1994;  Fitter,  1991)  This  same  explanation  for  potentially  higher  belowground  carbon  allocation  despite  lower  root:shoot  applies  to  our  findings  of  slightly  lower  root:  shoot  in  the  two  mycorrhizal  treatments  vs.  the  nonmycorrhizal  treatment.  

Low  molecular  weight  organic  acid  (LMWOA)  production  was  strongly  associated  with  seedling  biomass  across  both  CO2  and  mycorrhizal  treatments.  While  EMF  are  often  mentioned  in  the  literature  to  produce  significant  amounts  of  LMWOA’s,  our  findings  seem  to  fall  in  line  with  the  majority  of  studies  examining  the  EMF  role  in  LMWOA  production  which  fail  to  find  an  increase  in  LMWOA  production  when  comparing  EMF  and  non-­‐EMF  seedlings  (van  Scholl  et  al.,  2006;  van  Hees  et  al.  2005).  However,  many  of  these  studies  do  find  that  EMF  significantly  alter  the  composition  of  LMWOA’s  produced,  particularly  increasing  oxalic  acid  concentrations  (van  Scholl,  2006;  van  Hees  et  al.  2006,  Ahonen-­‐Jonnarth,  2000),  which  we  did  not.    Similar  to  Fransson  and  Johansson  (2009),  we  did  not  find  that  elevated  CO2  increased  LMWOA  production  beyond  its  effect  on  seedling  biomass.    

Elevated  CO2  was  associated  with  significantly  increased  chitin  content  in  seedlings  colonized  by  Piloderma  fallax,  but  not  with  seedlings  colonized  by  Suillus  variegatus;  this  increase  was  due  to  elevated  chitin  levels  found  in  the  growth  matrix,  not  on  the  seedling  roots.  Increased  mycorrhizal  growth  (increased  colonization,  fungal  biomass,  and  hyphal  growth  proportionately  greater  than  increases  in  root  growth)  is  commonly  found  in  elevated  CO2  treatments  (see  reviews  by  Alberton  et  al.,  2005  and  Compant  et  al.,  2010).  Many  studies  show  that  this  response  is  highly  fungal-­‐species-­‐specific  (Fransson  et  al,  2005;  Fransson  et  al,  2007;  Gorissen  and  Kuyper,  2000;  Parrent  and  Vilgalys,  2007).  It  is  interesting  to  note  that  Fransson  and  Johansson  (2009),  in  which  they  assessed  the  effects  of  elevated  CO2  on  mycorrhizal  growth  of  5  ectomycorrhizal  species,  also  found  this  strain  of  Piloderma  fallax  responded  far  more  to  elevated  CO2  than  any  other  fungal  species  examined.  

Our  finding  of  no  increase  (and  a  moderate  though  not  significant  reduction)    in  seedling    biomass  in  the  mycorrhizal  seedlings  is  not  uncommon.  Despite  the  fact  that  Pinus  sylvestris  is  considered  obligately  mycorrhizal,  many  studies  have  also  found  a  growth  depression  of  P.  sylvestris  with  mycorrhizal  colonization  when  mycorrhizal  and  non-­‐mycorrhizal  seedlings  are  compared  (Stenström  et  al.  1990,  Alberton  et  al.  2007,  refs  contained  in  review  by  Jones  and  Smith,  2004).  Given  the  high  needle  nutrient  concentrations  in  our  non-­‐mycorrhizal  seedlings,  and  the  very  dense  rooting  we  observed,  it  seems  likely  that  high  nutrient  availability,  and  a  very  restricted  rooting  zone  were  the  primary  reasons  we  observed  no  growth  stimulation  by  mycorrhizae  

 

77    

The  generally  low  levels  of  mycorrhizal  colonization  (only  6  out  of  20  seedlings  were  intensely  colonized)  we  observed  were  likely  a  result  of  nutrient  levels  being  too  high  (we  saw  luxury  consumption  of  every  nutrient  measured),  or  insufficient  drainage  (mycorrhizae  were  relegated  to  only  the  upper  most  portion  of  the  roots,  and  upon  harvest  most  of  the  growth  medium  appeared  saturated).  

The  significant  amounts  of  chitin  observed  in  the  non-­‐mycorrhizal  treatments  may  indicate  either  the  presence  of  thelephoroid  mycorrhizal  contamination  or  saprotrophic  fungi  growing  in  the  mineral  mix.  Our  visual  observations  of  shiny,  turgid,  smooth,  black  roots,  and  the  fact  that  the  majority  of  the  chitin  found  in  the  non-­‐mycorrhizal  treatments  was  found  in  the  roots  and  not  in  the  mineral  mix  suggests  some  thelephoroid  mycorrhizal  contamination.    The  larger  size  (table  1)  of  the  non-­‐mycorrhizal  seedlings  and  their  lower  chitin  levels  (figure  2)  indicates  that  thelephoroid  infection  was  minor.  

Nutrient  levels  were  sufficient  for  healthy  balanced  growth.  Leachate  concentrations  of  nutrient  cations  were  steady  (figure  5)  suggesting  that  we  increased  the  nutrient  amounts  sufficiently  to  keep  up  with  the  increasing  nutrient  demand  of  the  growing  seedlings.  The  fact  that  none  of  the  needle  nutrient  concentrations  were  below  sufficiency  threshold  (table  4)  further  suggests  that  none  of  the  seedlings  had  severe  nutrient  deficiencies  that  could  have  compromised  carbon  allocation  physiology.      

 Biotic  Weathering  Activity  The  overall  negative  weathering  observed  for  some  mineral  nutrients  suggests  a  missing  sink  somewhere  in  our  weathering  budget.  The  two  most  likely  possibilities  are  the  formation  of  secondary  precipitates  that  were  not  extracted  upon  harvest  or  a  large  pulse  of  weathering  in  the  initial  3  weeks  of  equilibration  (in  which  flowthrough  was  not  collected),  before  seedlings  were  planted.  We  used  a  chemical  speciation  and  equilibria  model  Visual  MINTEQ  (Gustafsson,  2007)  to  determine  if  secondary  precipitates  may  have  formed.  Given  the  makeup  of  LMWOA’s  observed,  the  pH’s  measured  and  the  elemental  concentrations  in  the  drainage  as  input  parameters  the  only  compound  likely  to  have  precipitated  would  have  been  Ca-­‐oxalate,  but  only  in  very  small  quantities  <3  uM.  This  leaves  the  initial  “equilibration  flush”  as  the  likely  missing  sink  in  our  weathering  budget.  All  the  columns  were  treated  equally  before  planting  so  this  missing  sink  should  not  affect  the  merit  or  interpretation  of  our  results.    

Overall,  and  in  every  individual  elemental  flux  (seedling  uptake,  CEC,  leachate),  seedlings  had  a  significant  effect  on  weathering.  For  the  nutrient  cations  K,  Mg,  and  Ca,  extra  weathering  products  were  taken  up  by  the  seedlings,  while  for  Si,  which  was  not  taken  up  in  appreciable  quantities  (table  5,  figure  6),  extra  weathering  products  were  found  on  exchange  sites  in  the  mineral  matrix.    Mycorrhizal  colonization  did  not  significantly  increase  weathering  rates  or  nutrient  uptake,  but  seedlings  colonized  by  Piloderma  fallax  did  exhibit  a  trend  toward  increased  weathering.  More  Si  and  Mg  were  mobilized  in  the  P.  fallax  treatment  (23%  and  27%  greater  mobilization,  respectively,  than  non-­‐mycorrhizal  treatments)  despite  the  fact  that  P.  fallax  colonized  seedlings  were  on  average  smaller,  though  these  differences  were  not  statistically  significant.  P.  fallax  colonized  seedlings  also  had  significantly  higher  Mg  concentrations.  Elevated  CO2  had  no  effect  on  the  weathering  losses  of  Ca,  K,  or  Si,  but  increased  Mg  losses  (though  not  significantly).  While  seedlings  grown  in  elevated  CO2  did  have  higher  plant  and  fungal  

78    

biomass,  and  higher  total  seedling  elemental  contents,  these  increases  in  nutrient  uptake  were  balanced  by  reduced  leaching  losses  and  not  by  enhanced  mineral  dissolution.    

Soil  biota  are  capable  of  stimulating  weathering  of  alumina  silicate  minerals  by  four  distinct  mechanisms.  Proton  promotion:    positively  charged  hydronium  ions  exuded  by  biota  bind  with  partially  charged  negative  surface  sites  on  minerals,  displacing  cations  from  the  mineral  surface  and  destabilizing  Si  or  Al  on  mineral  surfaces,  facilitating  their  release  into  solution.  Plant  growth  is  generally  seen  as  a  net  acidifying  phenomenon  as  a  plant’s  greater  uptake  of  positively  charged  nutrient  cations  than  negatively  charged  nutrient  anions  leads  to  a  plant’s  net  exudation  of  protons.  Ligand-­promotion:  an  anion,  either  inorganic  or  organic,  binds  to  mineral  surface  cations,  again  destabilizing  the  bond  energy  at  the  mineral  surface  stimulating  release  of  surface  cations  and  framework  Si  or  Al.  Removal  of  transport  limitation:  the  removal  of  weathering  products  from  the  surface  boundary  layer  via  nutrient  uptake  or  enhanced  solution  flow  eliminates  or  reduces  the  constant  readsorption  of  these  mineral  weathering  products  that  occurs  in  concert  with  dissolution,  enhancing  net  dissolution.  Physical  stimulation  of  weathering  is  also  possible  as  hyphae  and  roots  can  fracture  minerals,  increasing  the  total  exposed  surface  area.  There  is  considerable  debate  as  to  which  of  these  four  mechanisms  dominates  the  biotic  influence  on  weathering  (see  reviews  by  Drever,  1994;  Hinsinger  et  al.,  2006;  Lucas,  2001;  Harley  and  Gilkes,  2000  and  articles  by  Hinsinger  et  al.,  2001;  Bonneville  et  al.,  2009).    

Proton-­‐promotion  was  not  the  primary  mechanism  of  the  enhanced  weathering  observed  in  columns  planted  with  seedlings.    The  high  pH  of  the  column  leachate  (7.0-­‐9.4)  may  not  reflect  the  pH  of  the  rooting  zone  because  we  measured  leachate  pH  after  30  cm  of  vertical  percolation  through  ground  primary  minerals,  and  ectomycorrhizae  and  most  roots  were  restricted  to  the  uppermost  portions  of  the  columns.  However,  the  pH  of  the  column  leachate  from  planted  treatments  was  significantly  HIGHER  than  the  pH  of  unplanted  columns  (figure  4),  which  is  the  opposite  of  what  we  would  expect  to  find  if  biotic  acidification  was  an  important  mechanism  by  which  seedlings  enhanced  weathering.  Thus,  it  seems  acceptable  to  rule  out  proton  exudation  as  the  dominant  mechanism  through  which  the  seedlings  have  enhanced  weathering  here.    

Ligand-­‐promoted  dissolution  may  be  an  important  mechanism  of  biotic  weathering  in  our  system,  but  this  is  not  likely  due  to  low  molecular  weight  organic  acids  (LMWOA’s).  The  stimulatory  effect  of  LMWOA’s  on  mineral  dissolution  is  considered  to  significantly  increase  at  near-­‐neutral  and  slightly  alkaline  pH’s,  as  the  relative  rate  of  proton-­‐promoted  dissolution  drops  sharply  (Welch  and  Ullman,  1993;  van  Hees  et  al.,  2002;  Stillings  et  al.,  1996),  but  it  is  di-­‐and  tri-­‐carboxylic  acids  such  as  citric  and  oxalic  acids  (measureable  quantities  of  which  were  not  consistently  found  in  any  columns)  that  have  been  shown  to  strongly  increase  weathering  rates  not  the  mono-­‐carboxylic  acids  formic,  lactic,  and  acetic  acids  (which  comprised  the  majority  of  LMWOA’s  in  this  experiment)  (Neaman  et  al.,  2006,  Drever  and  Stillings,  1997).  Additionally,  the  concentrations  of  the  most  weathering-­‐enhancing  organic  acids  required  to  significantly  increase  weathering  are  on  the  order  of  millimolar,  not  micromolar  concentrations,  as  was  the  case  in  this  experiment  (Drever  and  Stillings,  1997;  Drever,  1994,  Pokrovsky  et  al.,  2009).  So,  in  this  system,  LMWOA’s  were  likely  not  a  contributor  to  enhanced  weathering  in  the  planted  columns.  This  does  not  mean  that  we  can  rule  out  ligand-­‐

79    

promotion  as  a  potential  mechanism  of  biotic  weathering.  LMWOA’s  represent  one  of  a  few  possible  weathering-­‐promoting-­‐ligands  of  biotic  origin,  and  comprise  generally  well  less  than  10  %  of  dissolved  organic  carbon  (see  review  by  Strobel,  2001  and  refs  therein).  Humic  and  fulvic  acids  comprise  the  majority  of  DOC,  but  these  larger  organic  acids  either  have  no  effect  on  mineral  dissolution  or  inhibit  dissolution  rather  than  promote  it,  particularly  at  near  neutral  pH’s  (Pokrovsky  et  al.,  2009;  Ochs  et  al.,  1993;  Drever  and  Stillings,  1997).  Conversely,  organic  compounds  that  are  generally  found  in  much  lower  concentrations  than  LMWOA’s  may  be  key  ligand-­‐promoted  weathering  agents  in  the  soil  or  in  our  planted  columns.      Siderophores  can  significantly  increase  weathering  rates,  with  a  potential  multiplicative  effect  on  organic  acid  promotion  (Lierman  et  al.,  2000;  Reichard et al., 2007; Watteau and Berthelin, 1994)  and  have  been  found  to  be  actively  exuded  by  EMF  (van  Hees  et  al.,  2006)  and  bacteria  (Liermann  et  al.,  2000).  Rhizosphere  (Lemanceau  e  t  al.,  2009;  Robin  et  al.,  2007)  and  mycorrhizosphere  (Uroz  et  al.  2007)  bacteria  have  been  shown  to  stimulate  mineral  weathering  more  than  bacteria  from  the  bulk  soil,  and  siderophore  production  may  be  a  cause  (Uroz  et  al.  2007;  Uroz  et  al.  2009).  Ochs  et  al.  (1993)  found  that  mycorrhizal  exudates  other  than  LMWOA’s  significantly  increased  mineral  weathering  rates,  and  suggested  that  these  unidentified  agents,  present  in  micromolar  concentrations,  were  possibly  siderophores.  However,  Ochs  et  al.  (1993,  1996)  found  that  axenic,  non-­‐mycorrhizal  seedling  exudates  did  not  have  a  stimulatory  effect  on  weathering.  It  is  possible  that  rhizosphere  bacteria,  or  ectomycorrhizae  secreted  sufficient  siderophores  to  enhance  mineral  weathering.  This  could  be  why  we  see  evidence  of  enhanced  weathering  activity  by  P.  fallax  colonized  seedlings.  However,  needle  Fe  concentrations  were  at  or  near  the  lower  range  of  optimum  growth  and  did  not  vary  significantly  between  treatments.  Additionally,  siderophores  enhance  weathering  by  binding  with  and  destabilizing  mineral-­‐surface  iron  and  aluminum  atoms,  and  we  did  not  find  detectable  levels  of  iron  or  aluminum  in  column  leachate  (<  0.1µM  [Al]  and  [Fe]  vs.  >  50µM  [Si],  data  not  shown).  Thus,  siderophores  were  likely  not  a  significant  contributor  to  biotic  weathering  enhancement  in  our  system.    

Inorganic  anions  can  strongly  inhibit  dissolution  by  forming  complexes  on  mineral  surfaces.  While  no  measureable  levels  of  phosphate  were  noted  in  column  leachate,  significant  levels  of  phosphorous  were  noted  in  lysimeter  samples  collected  for  LMWOA  analysis  from  the  unplanted  columns.  Phosphate  concentrations  in  nonplanted  columns  ranged  from  6  to  30  µM  and  went  up  steadily  over  time  while  there  were  no  measureable  concentrations  in  the  samples  from  planted  controls,  likely  due  to  seedling  uptake.  Biber  et  al.  (1994)  found  that  maintaining  a  solution  [phosphate]  of  100  µM  inhibited  iron  oxide  dissolution  by  90%  by  forming  protective  bi-­‐dentate  surface  complexes  on  the  mineral  surface.  The  lack  of  phosphorous  in  the  column  leachate  or  CEC  extracts  from  non-­‐planted  columns  despite  our  having  added  it  in  the  nutrient  solution  at  a  concentration  of  60  µM  suggests  that  strong  phosphate-­‐mineral  complexes  may  have  formed.  Seedling  uptake  of  nearly  all  available  phosphate  would  have  prevented  the  formation  of  these  protective  surface  complexes,  which  could  have  enhanced  weathering  rates.  However,  a  total  of  200µM  of  phosphate  was  added  to  the  system,  and  using  the  conservative  estimates  of  surface  area  and  mineral  surface  cation  density,  this  amount  of  phosphate  could  not  have  protected  more  than  of  1%  of  all  mineral  surfaces.  

80    

Seedling  uptake  of  nutrient  cations  and  thus  inhibition  of  cation  readsorption  to  mineral  surfaces  stands  out  as  the  most  likely  mechanism  of  biotic  weathering  activity  through  which  P.  sylvestris  caused  elevated  weathering.    In  order  for  the  removal  of  transport  limitation  to  weathering  to  be  an  important  mechanism  by  which  seedlings  have  enhanced  mineral  weathering,  seedlings  must  significantly  reduce  the  concentrations  of  weathering  products  around  mineral  surfaces  and/or  significantly  alter  solution  flow  rates.  The  average  transpiration  rate  of  seedlings  was  23%  (+/-­‐  2%  S.E.).  This  is  the  amount  of  solution  that  flowed  into  the  columns  which  was  transpired  by  the  seedlings  and  was  calculated  as  follows:  

(Leachatenp  +  MCnp)  –  (leachatep    +  MCp)  total  solution  volume  added  to  columns  (3.4L)  

 Leachtenp      =  total  solution  volume    (mean  ml/column)  collected  from  column  flowthrough  in  nonplanted  treatments  Leachtep    =  total  column  flowthrough  in  planted  treatments  MCnp    =  total  solution  volume  remaining  in  nonplanted  columns  (dry  mineral  mass  X  %  moisture  determined  by  drying)  (mean  ml/column)  upon  harvest  MCp    =  total  solution  volume  remaining  in  planted  columns  upon  harvest    The  %  uptake  of  each  of  the  4  weathering  products  studied  was  calculated  as  follows:  

 %  Uptake  =  seedling  uptake/  (fertilizer  input  +  weathering  –  ΔCEC)  

 We  subtract  ΔCEC  because  we  are  specifically  looking  at  uptake  from  solution.  We  find  that  at  the  root  surface  seedlings  take  up  significantly  less  Si  (9%+/-­‐2%  S.E.)  and  significantly  more  K  (68%  +/-­‐3%  S.E.),  Ca  (54%  +/-­‐3%  S.E.),  and  particularly  Mg  (91%  +/-­‐3  %  S.E.)  than  can  be  explained  by  solution  concentrations  and  transpiration  rate.  By  diverting  23%  of  column  moisture  and  taking  up  54-­‐91%  of  the  major  nutrient  cations,  seedlings  exerted  considerable  influence  on  both  column  hydrology  and  elemental  concentration  gradients  through  nutrient  uptake.    

Despite  considerable  debate  as  to  the  importance  of  transport-­‐limitation,  our  findings  are  in  line  with  a  growing  acceptance  of  the  importance  of  biotic  nutrient  uptake  to  mineral  weathering  rates.    Studies  using  batch  reactions  have  consistently  shown  that  surface  detachment  of  Si  and  Al  complexes,  due  to  either  proton-­‐  or  ligand-­‐destabilization,  so  called  “surface  reaction  control”,  is  the  rate  limiting  step  for  mineral  dissolution  (Barman  et  al.,  1992;  Seyama  et  al.,  2002).  Reviews  by  Lasaga  et  al.  (1994),  Drever  (1994),  and  Velbel  et  al.  (1993)  have  also  suggested  that  surface  reaction  control  is  the  limiting  factor  for  terrestrial  mineral  weathering  rates.  However,  experiments  using  column  reactors  (not  unlike  ours)  that  are  not  saturated  and  well-­‐mixed,  as  batch-­‐reactors  are,  have  shown  that  reduced  transport  of  weathering  products  away  from  mineral  surfaces  reduces  weathering  rates  by  several  orders  of  magnitude,  and  that  weathering  rates  are  directly  proportional  to  flow  rates  (Evans  and  Banwart,  2006;  van  Grinsven  and  van  Riemsdijk,  1991).  These  abiotic  experiments  and  the  results  of  our  mesocosm  experiment  provide  experimental  evidence  to  support  a  recent  comprehensive  field  study  by  White  et  

81    

al.  (2009)  as  well  as  two  more  recent  reviews  (Maher,  2010;  Harley  and  Gilkes,  2000)  that  have  identified  transport  limitation  as  the  predominant  process  governing  weathering  rates  of  minerals  on  the  earth’s  surface.  By  taking  up  nutrients  and  stimulating  solution  flow  plant  growth  exerts  a  major  influence  on  solution  composition  around  mineral  surfaces,  stimulating  weathering.  While  the  actual  weathering  mechanism  is  likely  ligand-­‐  or  proton-­‐promotion,  the  weathering  rate  is  controlled  by  nutrient  uptake  by  plants.  In  a  review  of  ectomycorrhizal  weathering  studies,  Rosenstock  (2010)  also  identified  increased  nutrient  uptake  as  the  most  common  mechanism  by  which  ectomycorrhizae  stimulate  weathering.  Despite  what  seems  like  growing  consensus  that  the  manner  in  which  plants  influence  weathering  rates  is  predominantly  via  nutrient  and  solution  uptake,  there  is  a  rather  distinct  lack  of  mention  of  transport  limitation  to  weathering  in  the  literature  on  ectomycorrhizal  weathering.    

 Relevance  to  Natural  Systems  Our  system  departs  from  natural  forest  soil  conditions  in  a  number  of  important  ways,  but  our  main  findings  are  representative  of  forest  ecosystem  processes.  The  great  majority  of  temperate  and  boreal  forests,  and  other  forests  where  ectomycorrhizae  dominate  are  acidic  soils,  generally  far  below  pH  6.  Some  generalizations  have  been  made  suggesting  that  across  very  broad  pH  gradients  ectomycorrhizae  dominate  at  increasingly  acidic  pH’s  (Smith  and  Read,  2008).  In  these  pH  ranges  proton-­‐promotion  and  ligand-­‐promotion  are  likely  to  be  important  components  of  the  biotic  influence  on  weathering.    Furthermore,  over  longer  time  scales  the  total  exposed  surface  area  of  primary  minerals  is  likely  to  be  greatly  diminished.  In  forests  that  are  close  to  steady  state  nutrient  uptake  via  plant  growth,  may  be  offset  by  similar  nutrient  inputs  from  decomposing  plant  derived  organic  matter.    Ectomycorrhizae  enhance  plant  growth  in  natural  settings,  and  the  explorative  growth  patterns  and  small  size  of  ectomycorrhizal  hyphae  enable  ectomycorrhizal  roots  to  come  into  contact  with  and  draw  from  pockets  of  soil  solution  in  contact  with  a  much  larger  volume  of  soil  than  non-­‐mycorrhizal  roots.  Over  long  time  scales  it  is  likely  that  the  biota  are  the  main  physical  force  for  breaking  up  bedrock  into  more  weatherable  smaller  rocks  (with  the  obvious  exception  of  glaciation)  (Gabet  et  al.,  2003).  Our  system  stands  in  some  contrast  to  these  conditions.  We  have  very  high  pH  due  to  the  abundance  of  fresh  mineral  surfaces.  Total  organic  content  and  organic  acid  concentrations  are  likely  to  be  much  lower  than  what  would  be  found  in  natural  soils.  Additionally,  the  high  rates  of  cation  weathering  we  see  are  also  reflective  of  our  use  of  unweathered  freshly  ground  primary  minerals.  Numerous  weathering  experiments  have  reported  an  initial  early  phase  of  non-­‐stoichiometric  weathering  in  which  base  cations  are  rapidly  dissolved  from  mineral  surfaces  followed  by  the  a  more  stable  phase  of  stoichiometric  weathering  (Seyama  et  al.,  2002;  Malmström  and  Banwart,  1997).  Stoichiometric  weathering  of  our  mineral  mix  would  yield  a  ratio  of  base  cations:Si  of  around  1:2  -­‐  1:3,  depending  on  the  relative  contributions  of  different  minerals,  instead  our  base  cation:Si  was  closer  to  4:1.  Lastly,  EMF  did  not  enhance  growth  in  our  system  and  the  restricted  container  volume  we  employed,  and  the  additional  restriction  of  ectomycorrhizae  to  only  the  uppermost  portion  of  these  containers  greatly  decreased  the  ability  of  ectomycorrhizae  to  increase  the  relative  rooting  volume  of  their  hosts.  Despite  our  system’s  inability  to  full  represent  natural  soil  conditions,  our  main  findings  that  

82    

plants  primarily  stimulate  weathering  through  their  influence  on  soil  hydrology  and  nutrient  uptake,  are  applicable  to  plants  in  steady  state  ecosystems.  It  has  been  shown  in  whole  ecosystem  weathering  models,  that  failing  to  account  for  nutrient  uptake  by  the  biota  in  forested  ecosystems,  even  those  near  steady  state  in  relation  to  growth  and  nutrient  cycling,  can  reduce  calculated  weathering  rates  by  as  much  as  80%  (Benedetti  et  al.,  1994;  Moulton  and  Berner,  2000).  While  we  found  significant  stimulation  of  P.  sylvestris  growth  and  ectomycorrhizal  colonization  with  elevated  CO2,  the  growth  conditions  of  our  plants  are  important  to  consider.  In  forests  and  natural  soils  plants  are  likely  to  be  more  limited  by  light  or  nutrients  than  in  our  system,  and  CO2  may  have  less  of  a  growth-­‐stimulatory  effect  (Körner,  2003).    

 Conclusions  In  our  experiment  seedlings  significantly  increased  weathering  rates,  while  elevated  CO2  and  ectomycorrhizal  colonization  had  limited  effects;  Piloderma  fallax  showed  some  potential  to  enhance  weathering  rates,  particularly  with  respect  to  Mg.  The  lack  of  a  mycorrhizal  effect  may  have  been  due  to  low  mycorrhizal  colonization  or  a  lack  of  mycorrhizal  growth  promotion.  Enhancement  of  weathering  by  seedlings  was  most  likely  caused  by  nutrient  uptake  through  its  influence  on  transport-­‐limitation.    Future  studies  investigating  the  weathering  effects  of  ectomycorrhizae  should  be  conducted  in  sufficiently  large  containers  to  allow  mycorrhizae  and  roots  to  grow  in  an  explorative  unrestricted  growth  pattern.  Caution  is  advised  when  relating  results  from  ectomycorrhizal  weathering  experiments  in  containers  with  low  organic  content,  primary  minerals,  and  restricted  volume  to  phenomenon  occurring  in  natural  forests.  Studies  on  biotic  weathering  must  separate  biotic  influences  on  weathering  mechanisms  (proton  promotion,  ligand-­‐promotion)  from  biotic  influences  on  limiting  factors  to  weathering  (ligand-­‐inhibition,  transport  limitation).                                      

83    

References  cited        Ahonen-­‐Jonarth  U,  van  Hees  PAW,  Lundstrom  U,  Finlay  RD.  2000.  Organic  acids  produced  by  mycorrhizal  Pinus  sylvestris  exposed  to  elevated  aluminium  and  heavy  metal  concentrations.  New  Phytologist  146:557–567.    Ainsworth  EA,  Long  SP.  2005.  What  have  we  learned  from  15  years  of  free-­‐air  CO2  enrichment  (FACE)?  A  meta-­‐analytic  review  of  the  responses  of  photosynthesis,  canopy  properties  and  plant  production  to  rising  CO2.  New  Phytologist  165:  351–372.    Akselsson  C,    Westling  O,  Sverdrup  H,  Gundersen  P.  2007.  Nutrient  and  carbon  budgets  in  forest  soils  as  decision  support  in  sustainable  forest  management.  Forest  Ecology  and  Management  238:167–174.    Alberton  O,  Kuyper  TW,    Gorissen  A.  2005.  Taking  mycocentrism  seriously:  mycorrhizal  fungal  and  plant  responses  to  elevated  CO2.  New  Phytologist  167:859-­‐868.   Balogh-­‐Brunstad  Z,  Keller  CK,  Dickinson  JT,  Stevens  F,  Li  CY,  Bormann  BT.  2008.  Biotite  weathering  and  nutrient  uptake  by  ectomycorrhizal  fungus,  Suillus  tomentosus,  in  liquid-­‐culture  experiments.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  72:2601–2618.    Bargagli  R.  1998.  Trace  Elements  in  Terrestrial  Plants:  an  Ecophysiological  Approach  to  Biomonitoring  and  Biorecovery.  Springer.  324  p.    Baribault  TW,  Kobe  RK,  Rothstein  DE.  2010.  Soil  calcium,  nitrogen,  and  water  are  correlated  with  aboveground  net  primary  production  in  northern  hardwood  forests.  Forest  Ecology  and  Management  260:723–733    Barman  AK,  Varadachari  C,  Ghosh  K.  1992.  Weathering  of  silicate  minerals  by  organic  acids.  I.  Nature  of  cation  solubilization.  Geoderma  53:45-­‐63.    Benedetti  MF,  Menard  O,  Noack  Y,    Carvalho  A,  Nahon  D.  1994.  Water-­‐rock  interactions  in  tropical  catchments:  field  rates  of  weathering  and  biomass  impact.  Chemical  Geology  118:203-­‐220.    Biber  M,  Afonso  MD,  Stumm  W.  1994.  The  coordination  chemistry  of  weathering:  IV.  Inhibition  of  the  dissolution  of  oxide  minerals.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  58:1999-­‐2010.    Bonneville  S,  Smits  MM,  Brown  A,  Harrington  J,  Leake  JR,  Brydson  R,  Benning  LG.  2009.  Plant-­‐driven  fungal  weathering:  Early  stages  of  mineral  alteration  at  the  nanometer  scale.  Geology  37:615–618  

84    

 Breakke  FH.  1994.  Diagnostic  levels  of  nutrient  elements  in  Norway  spruce  and  Scots  pine  needles.  Aktuelt  Skogforsk  15:1-­‐11.    Buscot  F,  Weber  G,  Oberwinkler  F.  1992.  Interactions  between  Cylindricarpon-­destructans  and  ectomycorrhizas  of  Picea  abies  with  Laccaris  laccata  and  Paxillus  involutus.  Trees-­‐Structure  and  Function  6:83-­‐90.    Ceulemans  R,  Mousseau  M.  1994.  Tansley  Review  No.  71  Effects  of  elevated  atmospheric  CO2  on  woody  plants.  New  Phytologist  127:425-­‐446.    Compant  S,  van  der  Heijden  MGA,  Sessitsch  A.  2010.  Climate  change  effects  on  beneficial  plant  microorganism  interactions.    FEMS  Microbial  Ecology  73:197-­‐214.    Courtois  S,  Frostegard  A,  Goransson  P,  Depret  G,  Jeannin  P,  Simonet  P.  2001.  Quantification  of  bacterial  subgroups  in  soil:  comparison  of  DNA  extracted  directly  from  soil  or  from  cells  previously  released  by  density  gradient  centrifugation.  Environmental  Microbiology  3:431-­‐439.    Dahlen  J,  Hagberg  J,  Karlsson  S.  2000.  Analysis  of  low  molecular  weight  organic  acids  in  water  with  capillary  zone  electrophoresis  employing  indirect  photo-­‐  metric  detection.    Journal  of  Analytic  Chemistry  336:488–493.    Drever  JI.  1994.  The  effect  of  land  plants  on  weathering  rates  of  silicate  minerals.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  58:2325-­‐2332.    Drever  JI,  Stillings  LL.  1997.  The  role  of  organic  acids  in  mineral  weathering.  Colloids  and  Surfaces  A:  Physicochemical  and  Engineering  Aspects  120:167  181.    Duschesne  L,  Houle  D.  2006.  Base  cation  cycling  in  a  pristine  watershed  of  the  Canadian  boreal  forest.  Biogeochemistry  78:  195-­‐216.      Ekblad  A,  Näsholm  T.  1996.  Determination  of  chitin  in  fungi  and  mycorrhizal  roots  by  an  improved  HPLC  analysis  of  glucosamine.  Plant  Soil  178:  29–35.    Entry  JA,  Donnelly  PK,  Cromack  Jr  K.  1991.  Influence  of  ectomycorrhizal  mat  soils  on  lignin  and  cellulose  degradation.    Biology  and  Fertility  of  Soils  11:75-­‐78.    Faegri  A,  Torsvik  VL,  Goksoyr  J.  1977.  Bacterial  and  fungal  activities  in  soil-­‐  Separation  of  bacteria  and  fungi  by  a  rapid  fractionated  centrifugation  technique.  Soil  Biology  and  Biogeochemistry  9:105-­‐112.    

85    

Fitter  AH.  1991.  Costs  and  benefits  of  mycorrhizas:  implications  for  functioning  under  natural  conditions.  Experientia  47:  350-­‐355.    Fransson  PMA,  Johansson  EM,  2010.  Elevated  CO2  and  nitrogen  influence  exudation  of  soluble  organic  compounds  by  ectomycorrhizal  root  systems.  FEMS  Microbial  Ecology  71:186-­‐196.    Fransson  PMA,  Anderson  IC,  Alexander  IJ.  2007.  Does  carbon  partitioning  in  ectomycorrhizal  pine  seedlings  under  elevated  CO2  vary  with  fungal  species?  Plant  Soil  291:323–333.      Fransson  PMA,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2005.    Mycelial  production,  spread  and  root  colonisation  by  the  ectomycorrhizal  fungi  Hebeloma  crustuliniforme  and  Paxillus  involutus  under  elevated  atmospheric  CO2.  Mycorrhiza  15:25–31.    Gabet    EJ,  Reichman  OJ,  Seabloom  EW.  2003.  The  effects  of  bioturbation  on  soil  processes  and  sediment  transport.    Annual  reviews  in  Earth  and  Planetary  Science  31:249-­‐273.    Gadgil  RL,  Gadgil  PD.  1971.  Mycorrhiza  and  Litter  Decomposition.  Nature  233:133-­‐134.    Godbold  DL,  Hoosebeek  MR,  Lukac  M,  Cotrufo  MF,  Janssens  IA,  Ceulemans  R,  Polle  A,  Velthorst  EJ,  Scarascia-­‐Mugnozza  G,  De  Angelis  P,  Miglietta  F,  Peressotti  A.  2006.  Mycorrhizal  hyphal  turnover  as  a  dominant  process  for  carbon  input  into  soil  organic  matter.  Plant  and  Soil  281:15-­‐24.    Gorissen  A,  Kuyper  TW.  2000.  Fungal  species-­‐specific  responses  of  ectomycorrhizal  Scots  pine  (Pinus  sylvestris)  to  elevated  [CO2].  New  Phytologist  146:163–168.    Gustafsson  JP.  2007.  Visual  MINTEQ  version  2.53,  http://www.lwr.kth.se/English/OurSoftware/vminteq/    Harley  AD,  Gilkes  RJ.  2000.  Factors  influencing  the  release  of  plant  nutrient  elements  from  silicate  rock  powders:  a  geochemical  overview.  Nutrient  Cycling  in  Agroecosystems  56:  11–36.    Hatch  AB.  1937.  The  physical  basis  of  mycotrophy  in  the  genus  Pinus.  Black  Rock  Forest  Bulletin  6:168.    Heinonsalo  J,  Pumpanen  J,  Rasilo  T,  Hurme  KR,  Ilvesniemi  H.  2010.  Carbon  partitioning  in  ectomycorrhizal  Scots  pine  seedlings.  Soil  Biology  &  Biochemistry  42:1614-­‐1623.    Hinsinger  P,  Barros  ONF,  Benedetti  MF,  Callot  G.  2001.Plant-­‐induced  weathering  of  a  basaltic  rock:  Experimental  evidence.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta,  65:137–152.  

86    

 Hobbie  EA.  2006.  Carbon  allocation  to  ectomycorrhizal  fungi  correlates  with  belowground  allocation  in  culture  studies.  Ecology  87:563-­‐569.    Hobbie  EA,  Colpaert  JV.  2003.  Nitrogen  availability  and  colonization  by  mycorrhizal  fungi  correlate  with  nitrogen  isotope  patterns  in  plants.  New  Phytologist  157:115-­‐126.      Hodson  ME,  Langan  SJ.  1999.  Considerations  of  uncertainty  in  setting  critical  loads  of  acidity  of  soils:  the  role  of  weathering  rate  determination.  Environmental  Pollution  106:73-­‐81.    Holmstrom  SJM,  Lundstrom  US,  Finlay  RD,  van  Hees  PAW.  2004.  Siderophores  in  forest  soil  solution.  Biogeochemistry  71:247-­‐258.    Hyvönen  R,  Ågren  GI,  Linder  S,  Persson  T,  Cotrufo  MF,  Ekblad  A,  Freeman  M,  Grelle  A,  Janssens  IA,  Jarvis  PG,  Kellomäki  S,  Lindroth  A,  Loustau  D,  Lundmark  T,  Norby  RJ,  Oren  R,  Pilegaard  K,  Ryan  MG,  Sigurdsson  BD,  Strömgren  M,  van  Oijen  M,  Wallin  G.  2007.  The  likely  impact  of  elevated  [CO2],  nitrogen  deposition,  increased  temperature  and  management  on  carbon  sequestration  in  temperate  and  boreal  forest  ecosystems:  a  literature  review.  New  Phytologist  173:  463–480.    Ingestad  T.  1979.  Mineral  nutrient  requirements  of  Pinus  silvestris  and  Picea  abies  Seedlings.  Physiologia  Plantarum  45:373-­‐380.    Janssens  IA,  Medlyn  B,  Gielen  B,  Laureysens  I,  Jach  ME,  van  Hove  D,  Ceulemans  R.  2005.  Carbon  budget  of  Pinus  sylvestris  saplings  after  four  years  of  exposure  to  elevated  atmospheric  carbon  dioxide  concentration.  Tree  Physiology  25:325–337.    Jentschke  G,  Brandes  B,  Kuhn  AJ,  Schroder  WH,  Godbold  DL.  2001.  Interdependance  of  phosphorous,  nitrogen,  potassium,  and  magnesium  translocation  by  the  ectomycorrhizal  fungus  Paxillus  involutus.  New  Phytologist  149:327-­‐337.    Johansson  EM,  Fransson  PMA,  Finlay  RD,  van  Hees  PAW.  2009.  Quantitative  analysis  of  soluble  exudates  produced  by  ectomycorrhizal  roots  as  a  response  to  ambient  and  elevated  CO2.    Soil  Biology  &  Biochemistry  41:1111–1116.    Jones  MD,  Smith  SE.  2004.  Exploring  functional  definitions  of  mycorrhizas:  Are  mycorrhizas  always  mutualisms?  Canadian  Journal  of  Botany  82:1089–1109.    Körner  C.  2003.  Carbon  limitation  in  trees.  Journal  of  Ecology  91:4-­‐17.    Lasaga  AC,  Soler  JM,  Ganor  J,  Burch  TE,  Nagy  KL.  1994.  Chemical  weathering  rate  laws  and  global  geochemical  cycles.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  58:2361-­‐2386.    

87    

 Lemanceau  P,  Bauer  P,  Kraemer  S,  Briat  JF.  2009.  Iron  dynamics  in  the  rhizosphere  as  a  case  study  for  analyzing  interactions  between  soils,  plants  and  microbes.  Plant  and  Soil  321:513–535.    Liermann  LJ,  Kalinowski  BE,  Brantley  SL,  Ferry  JG.  2000.  Role  of  bacterial  siderophores  in  dissolution  of  hornblende.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  64:587–602.    Lindner  M,  Maroschek  M,  Netherer  S,  Kremer  A,  Barbati  A,  Garcia-­‐Gonzalo  J,  Seidl  R,  Delzon  S,  Corona  P,  Kolstrom  M,  Lexer  MJ,  Marchetti  M.  2010.  Climate  change  impacts,  adaptive  capacity,  and  vulnerability  of  European  forest  ecosystems.  Forest  Ecology  and  Management  259:698–709.    Li  H,  McNulty  SG.  2007.  Uncertainty  analysis  on  simple  mass  balance  model  to  calculate  critical  loads  for  soil  acidity.  Environmental  Pollution  149:315-­‐326.    Lucas  Y.  2001.  The  role  of  plants  in  controlling  rates  and  products  of  weathering:  Importance  of  biological  pumping.  Annual  Reviews  of  Earth  Planetary  Science  29:135–63    Maher  K.  2010.  The  dependence  of  chemical  weathering  rates  on  fluid  residence  time.  Earth  and  Planetary  Science  Letters  294:101–110.    Malmström  M,  Banwart  S.  1997.  Biotite  dissolution  at  25°C:  The  pH  dependence  of  dissolution  rate  and  stoichiometry.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  61:2779-­‐2799.    Marx  DH.  1969.  The  influence  of  ectotrophic  ectomycorrhizal  fungi  on  the  resistance  of  pine  roots  to  pathogen  infections  I.  Antagonism  of  mycorrhizal  fungi  to  root  pathogenic  fungi  and  soil  bacteria.  Phytopathology  59:153-­‐163.    McDonnell  TC,  Cosby  BJ,  Sullivan  TJ,  McNulty  SG,  Cohen  EC.  2010.  Comparison  among  model  estimates  of  critical  loads  of  acidic  deposition  using  different  sources  and  scales  of  input  data.  Environmental  Pollution  158:2934-­‐2939.    Moulton  KL,  West  J,  Berner  RA.  2000.  Solute  flux  and  mineral  mass  balance  approaches  to  the  quantification  of  plant  effects  on  silicate  weathering  American  Journal  of  Science  300:539  -­‐570.    Muhsin  TM,  Zwiazek  JJ.  2002.  Ectomycorrhizas  increase  apoplastic  water  transport  and  root  hydraulic  conductivity  in  Ulmus  americana  seedlings.  New  Phytologist  153:153-­‐158.  

Naples  BK,  Fisk  MC.  2010.Belowground  insights  into  nutrient  limitation  in  northern  hardwood  forests.Biogeochemistry    97:109–121.      

88    

Neaman  A,  Chorover  J,  Brantley  SL.  2006.  Effects  of  organic  ligands  on  granite  dissolution  in  batch  experiments  at  pH  6.  American  Journal  of  Science  306:451–  473.      Norby  RJ,  Wullschleger  SD,  Gunderson  CA,  Johnson  DW,  Ceulemans  R.  1999.  Tree  responses  to  rising  CO2  in  field  experiments:  implications  for  the  future  forest.  Plant,  Cell  and  Environment    22:683–714.      Norbya  RJ,  DeLucia  EH,  Gielen  B,  Calfapietra  C,  Giardina  CP,  King  JS,  Ledford  J,  McCarthy  HR,  Moore  DJP,  Ceulemans  R,    De  Angelis  P,  Finzi  AC,  Karnosky  DF,  Kubiske  ME,    Lukac  M,  Pregitzer  KS,  Scarascia-­‐Mugnozza  GE,  Schlesinger  WH,  Oren  R.  2005.  Forest  response  to  elevated  CO2  is  conserved  across  a  broad  range  of  productivity.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  102:  18052-­‐18056.    Paris  F,  Botton  B,  Lapeyrie  F.  1996.  In  vitro  weathering  of  phlogopite  by  ectomycorrhizal  fungi.  II.  Effect  of  K+  and  Mg2+  deficiency  on  accumulation  of  oxalate  and  H+.  Plant  and  Soil  813:141–150.    Parrent  JL,  Vilgalys  R.  2007.  Biomass  and  compositional  responses  of  ectomycorrhizal  fungal  hyphae  to  elevated  CO2  and  nitrogen  fertilization.  New  Phytologist  176:164–174.    Pinkard  EA,  Beadle  CL,  Mendham  DS,  Carter  J,  Glen  M.  2010.  Determining  photosynthetic  responses  of  forest  species  to  elevated  [CO2]:  Alternatives  to  FACE.  Forest  Ecology  and  Management  260:1251–1261.    Pokrovsky  OS,  Shirokova  LS,  Benezeth  P,  Schott  J,  Golubev  SV.  2009.  Effect  of  organic  ligands  and  heterotrophic  bacteria  on  wollastonite  dissolution  kinetics.  American  Journal  of  Science  309:731–772.    Reichard  PU,  Kretzschmar  R,  Kraemer  SM.  2007.  Rate  laws  of  steady-­‐state  and  non-­‐steady-­‐state  ligand-­‐controlled  dissolution  of  goethite.  Colloids  and  Surfaces  A:  Physicochemical  Engineering  Aspects  306:22–28.    Robin  A,  Mazurier  S,  Mougel  C,  Vansuyt  G,  Corberand  T,  Meyer  JM,  Lemanceau  P.  2007.  Diversity  of  root-­‐  associated  fluorescent  pseudomonads  as  affected  by  ferritin  over-­‐expression  in  tobacco.  Environmental  Microbiology  9:1724–1737.      Rosling  A,  Suttle  KB,  Johansson  E,  van  Hees  PAW,  Banfield  JB.  2007.  Phosphorous  availability  influences  the  dissolution  of  apatite  by  soil  fungi  .  Geobiology  5:265-­‐280.    Rosling  A,  Lindahl  BD,  Taylor  AFS,  Finlay  RD.  2004.  Mycelial  growth  and  substrate  acidification  of  ectomycorrhizal  fungi  in  response  to  different  minerals.  FEMS  Microbiology  Ecology  47:31-­‐37.    

89    

Rygiewicz  PT,  Andersen  CP.  1994.    Mycorrhizae  alter  quality  and  quantity  of  carbon  allocated  below  ground.  Nature  369:58-­‐60.    Seyama  H,  Kinoshita  K,  Soma  M.  2002.  Surface  alteration  of  plagioclase  during  acid  dissolution.    Surface  and  Interface  Analysis  34:  289–292      Shindo  J,  Bregt  AK,  Hakamata  T.  1995.  Evaluation  of  estimation  methods  and  base  cation  data  uncertainties  for  critical  loads  of  acid  deposition  in  Japan.  Water,  Air  and  Soil  Pollution  85:  2571-­‐2576.    Smith  SE,  Read  DJ.  2008.  Mycorrhizal  Symbiosis:  3rd  Edition.  London:  Academic  Press.  787  p.    Stenstrom  E,  Ek  M,  Unestam  T.  1990.  Variation  in  field  response  of  Pinus  sylvestris  to  nursery  inoculation  with  four  different  ectomycorrhizal  fungi.  Canadian  Journal  of  Forest  Research  20:1796-­‐1803.    Stillings  LL,  Drever  JI,  Brantley  SL,  Sun  Y,  Oxburgh  R.  1996.  Rates  of  feldspar  dissolution  at  pH  3-­‐7  with  0-­‐8  m  M  oxalic  acid.  Chemical  Geology  132:79-­‐89.    Strobel  BW.  2001.  Influence  of  vegetation  on  low-­‐molecular-­‐weight  carboxylic  acids  in  soil  solution—a  review.  Geoderma  99:169–198.    Sverdrup  H,  Thelin  G,  Robles  M,  Stjernquist  I,  Sorensen  J.  2006.  Assessing  nutrient  sustainability  of  forest  production  for  different  tree  species  considering  Ca,  Mg,  K,  N  and  P.  Biogeochemistry  81:219-­‐238.      Tagliavini  M,  Rombola  AD.  2001.  Iron  deficiency  and  chlorosis  in  orchard  and  vineyard  ecosystems.  European  Journal  of  Agronomy  15:71-­‐92.    Talbot  JM,  Allison  SD,  Treseder  KK.  Decomposers  in  disguise:  mycorrhizal  fungi  as  regulators  of  soil  C  dynamics  in  ecosystems  under  global  change.  Functional  Ecology  22:955–963.    Temperton  VM,  Millard  P,  Jarvis  PG.  2003.  Does  elevated  atmospheric  carbon  dioxide  affect  internal  nitrogen  allocation  in  the  temperate  trees  Alnus  glutinosa  and  Pinus  sylvestris?  Global  Change  Biology  9:286-­‐294.    Uroz  S,  Calvaruso  C,  Turpault  MP,  Pierrat  JC,  Mustin  C,  Frey-­‐Klett  P.  2007.  Effect  of  the  Mycorrhizosphere  on  the  Genotypic  and  Metabolic  Diversity  of  the  Bacterial  Communities  Involved  in  Mineral  Weathering  in  a  Forest  Soil.  Applied  and  Environmental  Microbiology  73:  3019-­‐3027.    

90    

Uroz  S,  Calvaruso  C,  Turpault  MP,  Sarniguet  A,  de  Boer  W,  Leveau  JHJ,  Frey-­‐Klett  P.  2009.  Efficient  mineral  weathering  is  a  distinctive  functional  trait  of  the  bacterial  genus  Collimonas.  Soil  Biology  &  Biochemistry  41:2178–2186.    van  Hees  PAW,  Jones  DL,  Jentschke  G,  Godbold  DL.  2004.  Mobilization  of  aluminum,  iron  and  silicon  by  Picea  abies  and  ectomycorrhizas  in  a  forest  soil.  European  Journal  of  Soil  Science  55:101–111.    van  Hees  PAW,    Jones  DL,  Jentschke  G,  Godbold  DL.  2005.  Organic  acid  concentrations  in  soil  solution:  effects  of  young  coniferous  trees  and  ectomycorrhizal  fungi.  Soil  Biology  &  Biochemistry  37:771–776.    van  Hees  PAW,  Rosling  A,  Finlay  RD.  2006.  The  impact  of  trees,  ectomycorrhiza  and  potassium  availability  on  simple  organic  compounds  and  dissolved  organic  carbon  in  soil.  Soil  Biology  &  Biochemistry  38:  1912–1923.    van  Hees  PAW,  Lundström  US,  Mörth  CM.  2002.  Dissolution  of  microcline  and  labradorite  in  a  forest  O  horizon  extract:  the  effect  of  naturally  occurring  organic  acids.  Chemical  Geology  189:199–211.    Van  Scholl  L,  Smits  MM,  Hoffland  E.  2006a.  Ectomycorrhizal  weathering  of  the  soil  minerals  muscovite  and  hornblende.  New  Phytologist  171:805–814.    van  Scholl  L,  Hoffland  E,    van  Breemen  N.  2006b.  Organic  anion  exudation  by  ectomycorrhizal  fungi  and  Pinus  sylvestris  in  response  to  nutrient  deficiencies.  2005.  New  Phytologis  170:153-­‐163.    Velbel  MA.  1993.  Formation  of  protective  surface  layers  during  silicate-­‐mineral  weathering  under  well-­‐leached,  oxidizing  conditions.  American  Mineralogist  78:405-­‐414.    Wallander  H.  2000.  Uptake  of  P  from  apatite  by  Pinus  sylvestris  seedlings  colonized  by  different  ectomycorrhizal  fungi.  Plant  and  Soil  218:249–256.    Watteau  F,  Berthelin  J.  1994.  Microbial  dissolution  of  iron  and  aluminium  from  soil  minerals:  efficiency  and  specificity  of  hydroxamate  siderophores  compared  to  aliphatic  acids.  Eurupean  Journal  of  Soil  Biology  30:1-­‐9.    Welch  SA,  Ullman  WJ.  1993.  The  effect  of  organic  acids  on  plagioclase  dissolution  rates  and  stoichiometry.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  57:2725-­‐2736.          

91    

White  AF,  Schulz  MS,  Stonestrom  DA,  Vivit  DV,  Fitzpatrick  J,  Bullen  TD,  Maher  K,  Blum  AE.  2009.  Chemical  weathering  of  a  marine  terrace  chronosequence,  Santa  Cruz,  California.  Part  II:  Solute  profiles,  gradients  and  the  comparisons  of  contemporary  and  long-­‐term  weathering  rates.  Geochimica  et  Cosmochimica  Acta  73:2769-­‐2803.    Whitfield  CJ,    Watmough  SA,  Aherne  J,  Dillon  PJ.  2006.  A  comparison  of  weathering  rates  for  acid-­‐sensitive  catchments  in  Nova  Scotia,  Canada  and  their  impact  on  critical  load  calculations.  Geoderma  136:899–911.    Zarcinas  BA,  Cartwright  B,  Spouncer  LR.  1987.  Nitric-­‐acid  digestion  and  multielement  analysis  of  plant  material  by  inductively  coupled  plasma  spectrometry.  Communications  in  Soil  Science  and  Plant  Analysis  18:131-­‐146.