Los autores se han tomado la libertad de presentar esteoriginal en dos partes. La primera parte es una breve in-troduccin a la ecologa microbiana, porque, aunque laimportancia de la ecologa microbiana en las enferme-dades periodontales est ampliamente reconocida, la ma-yora de los odontlogos no conoce de forma precisa elsignificado de este trmino. La segunda seccin es unarevisin bastante extensa de los estudios actuales de laecologamicrobianabucodental,basadacasiporcom-pleto en los ltimos estudios realizados in vivo.Principios de la ecologa microbianaLa ecologa microbiana estudia las interrelaciones en-tre los microbios y sus entornos. Los ecologistas del h-bitat, incluidos los microbilogos periodontales, exami-nanlosmicroorganismosdeunhbitatconcretoeintentan analizar los efectos de estos microbios sobre suentorno, as como los efectos de la influencia del hbitatsobre sus residentes. Muchos de los principios de la eco-loga microbiana fueron esbozados en una excelente mo-nografa realizada por Alexander (2), y sern analizadosde forma breve a continuacin, junto con algunos ejem-plosadecuados,paradestacaralgunosdesuspuntosclave.El ecosistemaUn concepto clave en la ecologa microbiana es el eco-sistema. Un ecosistema es un complejo constituido porlos microorganismos situados en un entorno especficoy por componentes no mricobianos circundantes con losque los microorganismos estn asociados. El ecosistemaincluye el ensamblaje entre especies y constituyentes or-gnicos e inorgnicos que caracterizan esa zona en par-ticular. Cada ecosistema posee una coleccin de micro-organismosycomponentesnomicrobianossingularesparalysloparal.Elensamblajedelosmicroorga-nismosqueconstituyenunacomunidadconstadepo-blaciones de especies microbianas individuales. Esto con-duceaunajerarquadesdeelecosistemahastalacomunidad, la poblacin y una nica clula. Uno de losobjetivos de este nmero de Periodontology 2000 es de-finirelensamblajedelasespeciesenelhbitatperio-dontal, para determinar de qu modo los cambios en elhbitatafectanalacomunidadydequmodolaco-munidad afecta al hbitat.Hbitat y nichos ecolgicosElhbitateslazonaenlaqueunapoblacinoco-munidad crece, se reproduce o sobrevive. El papel de unmicroorganismo dentro de un determinado hbitat es sunicho. El nicho ecolgico no connota la localizacin sinoms bien la funcin. Una especie puede tener un nichoenunhbitatyunnichodiferenteenotrohbitatdis-tinto.Sucesin microbianaEn un ecosistema que evoluciona, ciertas especies de-nominadas microorganismos pioneros colonizan en pri-mer lugar. Estas especies a menudo son sustituidas porotras especies, tras haber alterado el hbitat, convirtin-dolo en adecuado para que sea colonizado por otras es-pecies. Existen dos tipos de sucesin microbiana. En lasucesin autgena, la secuencia de las especies surge por-quelaspoblacionesresidentesalteransusentornosdetal manera que son sustituidas por especies mejor adap-tadas al hbitat modificado. En la sucesin algena, untipo de comunidad es sustituido por otro porque el h-bitat es alterado por factores no microbianos, tales comolos cambios en las propiedades fsicas o qumicas de laregin o los cambios en el anfitrin. Los factores que con-tribuyen a la sucesin son: Provisin por una comunidad de un nutriente que con-fiereunaventajaecolgicaparalaespecieenelsi-guiente estadio de sucesin. Elhechodequeunapoblacinhagadisponibleunconstituyente presente en insuficiente suministro, parapermitir el crecimiento de una poblacin posterior. Alteracinenlaconcentracindeunnutrienteinor-gnico. Modificacin de los substratos heterogneos tales comoel tejido animal. Un efecto de autointoxicacin. Eliminacin de un microorganismo por medios fsicos. Aparicindebarreras,debidoalaretroalimentacinambiental.Eldesarrollodelagingivitisproporcionaunejemplode la sucesin microbiana, as como la interaccin entrelas especies del hbitat. Loe y cols. (90) y Theilade y cols.(170) demostraron que la placa bacteriana causaba gin-givitis. Se mostr que la interrupcin del cepillado de los135Periodontology 2000 (Ed Esp), Vol. 12, 2006, 135-187Ecologa microbial periodontalSIGMUND S. SOCRANSKYY ANNE D. HAFFAJEECopyri gh t Black wellMu n k sgaardPERIODONTOLOGY2000ISSN0906- 6713Copyright Grupo Ars XXI de Comunicacin, S.L.PERIODONTOLOGY2000(EdEsp)ISSN1695- 1808dientesdurante28dasenvoluntariosconperiodonciosano dio como resultado una rpida acumulacin de placabacteriana sobre los dientes. La gingivitis se produjo entodoslosindividuosenelplazode10-21das.Elresta-blecimiento de los procedimientos de higiene bucoden-tal elimin la placa bacteriana e invirti la gingivitis. Lospreparados citolgicos teidos obtenidos en el transcursode los 28 das revelaron una colonizacin inicial de cocosybacilosgrampositivos,seguidosporcocosybacilosgramnegativos, luego, fusobacterias y filamentos, y, final-mente, espirilos y espiroquetas. La aparicin de gingivi-tis clnica se relacion con la presencia de formas gram-negativas.Estosdatosconcuerdanconlosdeotrosestudiosquedemostraronlasucesinmicrobianaeneldesarrollo de la placa bacteriana (140, 161, 188). Los es-tudios daneses asociaron ciertos morfotipos bacterianoscon un cambio en el estado clnico de la zona, es decir,el desarrollo de gingivitis. Los datos presentados a conti-nuacindemuestranquelasespeciesdeloscomplejosrojo y naranja (que se describirn ms adelante) son msprevalentesyseencuentranenmayorescantidadesenlas lesiones de una gingivitis establecida. Los mismos ta-xones son, incluso, ms predominantes y numerosos enlaslesionesquesupuran.Porlotanto,elcambioenlacomposicin de la placa bacteriana parece afectar al h-bitat, ocasionando una gingivitis clnicamente evidente.Otros estudios indican que un cambio en el hbitat, comoel desarrollo de la gingivitis, tambin afecta al desarrollodelaplacabacteriana.Traslalimpieza,laplacabacte-riana se acumul mucho ms rpidamente en las zonasque exhiban gingivitis ms que en aquellas zonas sanas(25, 132). En consecuencia, es posible postular un ordende sucesin microbiana en la interaccin recproca entreel anfitrin y las bacterias (fig. 1). Los miembros de cadaunodeloscomplejoscodificadosporcoloressedescri-ben ms adelante en otro apartado. La colonizacin ini-cialpareceinvolucraralosmiembrosdeloscomplejosamarillo,verdeymorado,juntoconlasespeciesActi-nomyces. Ello conduce a una sucesin autgena en la quelosmiembrosdelcomplejonaranjay,luego,delrojosevuelven ms dominantes. Se formul la hiptesis de queelaumentodelasconcentracionesdelosdosltimoscomplejos ocasiona un cambio en el hbitat, clnicamentemanifestado por la gingivitis. La gingivitis, a su vez, favo-recelaproliferacinadicionalnoslodelosmiembrosde los complejos naranja y rojo, sino probablemente tam-bin los miembros de las primeras especies colonizado-ras.Esteciclopodrarompersedemuchasmaneras.Laprimera sera eliminar la placa bacteriana; esta estrategiaparcialmente exitosa es la ms frecuentemente empleadahoyenda.Lasegundaseraeliminarlosmiembrosdelos complejos rojo y/ o naranja. Esto seguramente limita-ralagingivitisysuefectoderetroalimentacindeunamayor formacin de placa bacteriana. La tercera sera re-ducirlagingivitiscontratamientonoantibitico;estoconducira a reducir la acumulacin de placa bacterianay, posiblemente, a reducir el desarrollo de los complejosrojo y naranja. Merece la pena destacar que el efecto deuna pauta de prevencin o de tratamiento sera un ejem-plo de la sucesin algena.Factores que limitan la colonizacinExistendeterminadosfactoresquelimitanlacoloni-zacin. Una limitacin obvia es la disponibilidad del es-pacio fsico. La colonizacin preventiva es una segundasituacin en la que la previa colonizacin por una espe-cie excluye a otra. La exclusin est producida por la ocu-pacin, por parte de una especie, de un nicho ecolgicoque estaba ocupado por otra. La primera especie realizalas actividades, utiliza los nutrientes y/ o ocupa los luga-res fsicos de la especie excluida. La resistencia ambien-taleslarestriccinencantidadesdeindividuosobio-masa impuesta por factores fsicos, qumicos o biolgicosdel ecosistema. La condicin que sostiene a la poblacinbajo control es considerada una barrera. La colonizacinSocransky y Haffajee136Sucesin microbianaMoradoActinomyces sp.AmarilloVerdeNaranja Rojo GingivitisInteraccin recprocaFig. 1. Hiptesis de la adicin de especies durante la sucesinmicrobiana que ocasiona la aparicin de la inflamacin gin-gival. A su vez, el aumento de la inflamacin ocasionara unincremento del crecimiento de las especies colonizadoras.preventiva es uno de los principales medios de exclusinde los microbios que llegan ms tarde y constituye, jun-tamente con las barreras fsicas y qumicas locales, unode los componentes de la resistencia del entorno. Cual-quierinvestigadorperiodontalquehaintentadointro-ducir una especie de prueba en la placa bacteriana pe-riodontal puede atestiguar la eficacia de estas barreras.Diseminacin de los microorganismosPara que los microorganismos que estn limitados porsu naturaleza a vivir en asociacin con un anfitrin ade-cuado puedan continuar sobreviviendo, su dispersin esesencial. La diseminacin puede realizarse de un modoactivo o pasivo. Por ejemplo, el crecimiento y la movili-dad pueden propagar activamente una especie de un lu-gar a otro dentro de la cavidad bucal y de una persona aotrapersona.Ladiseminacinpasivaseproducetantodentro de la cavidad bucal como de un individuo a otro.Losmicroorganismosmuestrancentrosdedispersin,regionesdesdelasquelasespeciessediseminanoex-tienden. En estas zonas, las condiciones son favorablespara un aumento en la densidad de la especie, y las zo-nas sirven como puntos desde los cuales las especies pue-den emanar. Una zona con estas caractersticas recibe elnombre de reservorio de la infeccin. Cuanto mayor seala eficiencia del mecanismo de dispersin, menor es elnmero de microorganismos necesarios para la disper-sin. Las especies bucales pueden diseminarse desde unindividuoatravsdepequeasgotculasodeobjetosinanimados. Se han utilizado herramientas de la epide-miologa molecular para demostrar la transmisin verti-cal(depadresahijos)porActinobacillusactinomyce-temcomitans (124, 125, 128) y Porphyromonas gingivalis(125), as como la transmisin horizontal que sucede en-tre la pareja por P. gingivalis (143, 175). Otro ejemplo detransmisinprocededeestudiosanterioresrealizadosacerca de la gingivitis ulcerativa necrosante aguda, tam-binconocidacomoanginadeVincent(bocadetrin-chera). Esta enfermedad era transmitida entre las tropasen la primera guerra mundial y, posteriormente, a la po-blacin civil (154).Riviere y cols. (141) descubrieron que la incidencia deespiroquetasyP. gingivalis eramayorenlaszonasen-fermasdeindividuosenfermosqueenlaszonassanasdeindividuosenfermos(fig.2).Demayorimportanciafue el descubrimiento adicional de que las zonas sanasde los individuos enfermos albergaban estas especies conmayor frecuencia que las zonas sanas de las personas sa-nas. Este hallazgo se ha confirmado en otros estudios, talcomosedescribirmsdelante.Losautorespensaronque las bolsas ms profundas de las personas enfermasestaban actuando como reservorios para extender la in-feccin a las zonas sanas. Esto de hecho es una posibili-dad, aunque son posibles otras hiptesis alternativas.Enfermedad infecciosaLaenfermedadinfecciosarepresentanunacategorade interacciones entre la poblacin y el entorno, que in-volucraaunanfitrinyaunmicroorganismoconpo-tencial tanto para la colonizacin como para la patoge-nia.Desdeelpuntodevistaecolgico,lacaractersticaque gobierna el ecosistema es la vida animal y humana.El anfitrin debe poder ser colonizado, es decir, debe serreceptivo a la invasin efectuada por un agente patgenoconcreto.Notodoslosanimalessuperiorespuedensercolonizados por todas las bacterias, hongos o virus pa-Ecologa microbial periodontal137Espiroquetas268268Salud5Gingivitis11Periodontitisprecoz61Periodontitisavanzada29Salud5Gingivitis11Periodontitisprecoz61Periodontitisavanzada29%dezonas6045301501612840408408SanasGingivitisPeriodontitis precozPeriodontitis avanzada1361361708121436017081214360609609363363342342154154P. gingivalisFig. 2. Grficos de barras de la frecuencia de deteccin deespiroquetas y P. gingivalis en zonas e individuos con ca-ractersticasclnicasdistintas. Lasespiroquetasfueronidentificadasutilizandolamicroscopiadecontrastedefase, yP. gingivalis, medianteelanlisisinmunocitoqu-mico. Los nmeros encima de las barras indican la canti-dad de muestras examinadas. Los colores de las barras in-dican las caractersticas de la muestra. Las calificacionesbajo las barras indican la clasificacin del sujeto de estu-dio, ylosnmerosbajolasbarrasindicanelnmerodeindividuos examinados. Datos adaptados de Riviere y cols.(141).tgenos. Tres tipos de barreras son la base de la ausen-cia de receptividad: Las barreras del anfitrin no receptivo. Los factores asociados con la resistencia del anfitrinreceptivo antes de su primer contacto. Losobstculosparaunmayordesarrollooactividadbacteriana, que aparecen a consecuencia de la infec-cin.En efecto, existe una retroalimentacin ambiental, unamodificacin del hbitat ocasionada por la presencia deuna o ms poblaciones bacterianas, un cambio que puedeafectaraltamao,laactividadolasupervivenciadelapoblacin invasora o uno o ms segmentos de la comu-nidad.Laproduccindeanticuerposfrentealasespe-cies colonizadas es un ejemplo de retroalimentacin am-biental.Estetemaseanalizarenmayordetallemsadelante en este captulo.Colonizacin exitosaEl xito de la colonizacin de una especie depende de: Supresenciaenellugarcolonizableenelmomentoadecuado. Posesin de capacidad de supervivencia que permitauna viabilidad prolongada en circunstancias nocivas. Capacidad para obtener del ecosistema todos los nu-trientes que necesita. Capacidadparatolerartodoslosfactoresnomicro-bianos ecolgicamente significativos del entorno, porejemplo, pH, concentraciones de O2, temperatura, pre-sin osmtica, potencial de reduccin de oxidacin. Posesin de mecanismos para superar la resistencia delentorno atribuible a anfitriones viables, o para hacerlefrente. Capacidadparavencerlaresistenciaambientalatri-buible a las especies que ya forman parte del hbitat,o para hacerle frente. Capacidad para crecer tan rpidamente como sus ve-cinos. Capacidad para adherir a las superficies apropiadas.El papel que desempean algunos de estos factores enla formacin de complejos microbianos fue analizado enSocransky y cols. (156).La comunidad culminante (clmax)La interaccin entre los componentes microbianos yno microbianos de un ecosistema conduce, finalmente,aunaformadeestabilizacinenlaquelasformasmi-crobianas y no microbianas existen en armona y equi-librio con su entorno. ste es el clmax de la comunidad.Esta situacin permanece relativamente estable a travsdel tiempo y refleja una situacin dinmica en la que lasclulas mueren y se sustituyen. Este clmax es esencial-mente una entidad autorreplicante, que se reproduce as misma con una fidelidad extraordinaria. Dada la pre-sencia de zonas con las mismas caractersticas fsicas yqumicasiniciales,olapresenciadeanfitrionesidnti-cos, sern iniciadas y promovidas las mismas secuenciasdesucesingenerales,quedarnlugaracomunidadesclmax notablemente similares. El clmax puede modifi-carse de tiempo en tiempo, debido a la accin de fuer-zas exgenas. El equilibrio tiende a ser restaurado a me-dida que el hbitat vuelve a su estado original. En otrasocasiones,losentornospuedenestarirreversiblementealterados; esta situacin conduce a un diferente estadode equilibrio y a un diferente clmax de la comunidad. Elclmaxcontienemuchosnichosecolgicos,ylasespe-cies que ocupan cada uno de ellos estn exclusivamenteadaptadas a la funcin asociada con el nicho, al menosentre las especies que tienen acceso al lugar. A medidaque hay ms nichos o funciones potenciales, particular-mente cuando existe un entramado de cadenas alimen-tarias,muchosgruposdiferentesdemicrobiospuedencoexistir indefinidamente.La mayora de las placas bacterianas desarrolladas re-presentanunacomunidadclmax.Lasperturbacionesmenores probablemente producen un nuevo desarrollode la misma comunidad. Las estrategias preventivas o te-raputicas posiblemente encuentran una tendencia delecosistema a regresar al equilibrio original tras finalizarel tratamiento. Esta tendencia puede ser frustrante parael mdico, pues es necesaria una fase de mantenimientoprolongadadespusdelaterapia.Amenudo,elprofe-sional desea que se produzcan cambios ms profundosen la microbiota periodontal tras el tratamiento. Sin em-bargo, como dice el viejo refrn: cuidado con lo que de-seas, porque puede hacerse realidad. Pueden efectuarsecambios permanentes en la microbiota empleando po-tentesfuerzasexgenasdenaturalezapersistente.Re-sulta instructivo analizar un caso clnico reciente de unpacienteenelquelamicrobiotaofrecaunaconstanteresistencia al tratamiento. El paciente en cuestin es unprofesional de la odontologa que exhibi signos inicia-les de periodontitis hace aproximadamente 10 aos. Sutratamientoinicialconsistienraspadoyalisadoradi-culary,posteriormente,tratamientoquirrgico.Laen-fermedadcontinuavanzandoyprodujolaprdidadecinco piezas dentarias en 2 aos, acompaada, adems,por mucho dolor. Se le administraron, en secuencia: te-traciclina intravenosa, ampicilina, amoxicilina + metro-nidazol, clindamicina, ciprofloxacino, dosis bajas a largoplazo de doxiciclina y diversos agentes locales como Ac-tidite, clorhexidina y Triclosn (flumetasona) duranteunperodoaproximadode4aos.Enelmomentoenquesetomaronmuestras,sumicrobiotasehabasim-plificado, de forma que Streptococcus oralis comprendael 95 % de la microbiota cultivable. Las espiroquetas, for-mas mviles, Fusobacterium, Veillonella, Prevotella, Cap-nocytophaga y Eikenella fueron indetectables por cultivoo sonda de ADN. Una nueva poblacin clmax se habaestablecido en este individuo, la que impeda el estable-cimiento de taxones adicionales. Lamentablemente, estapoblacin clmax no era compatible con el anfitrin. SeSocransky y Haffajee138supone que cada uno de estos tratamientos reduca losnmeros de nuevas poblaciones clmax y se lograba unalivioqueduraba5-6semanas.Sinembargo,lamismaespecieresurgadespusdelaterapia(lanuevacomu-nidad clmax no tena competencia) y proseguan los da-os al hbitat. Este caso clnico refuerza la importanciadecontrolarlosmicroorganismospatgenos,perosinque se produzcan cambios nocivos en el ecosistema res-tante. Es primordial definir con claridad los ecosistemascompatiblesconelanfitrin,afindeproporcionarlasvariables teraputicas deseadas. Los efectos de varias for-masdeterapiasobrelacomunidadclmaxsubgingivalson analizados en Haffajee y Socransky (65).Estudios actuales de la ecologamicrobiana bucodentalLos 215 cm2de rea de superficie de la cavidad bucal(23)presentannumerosassuperficiesparalacoloniza-cin microbiana. Las diversas superficies mucosas estnrecubiertas por distintos tipos de epitelios, mientras quelas superficies duras son representadas por las piezas den-tarias o diversos tipos de prtesis. Estas superficies se en-cuentrancontinuamentebaadasporunvolumendefluido, principalmente saliva, Existe, por lo tanto un en-tornoexcelenteparaeldesarrollodelabiopelcula.Losmicroorganismos que colonizan estas superficies produ-cenbiopelculasdedistintascomplejidades,enfuncinde la localizacin intrabucal, los antecedentes genticosylosfactoresambientalesespecficosdecadapersona.Las superficies de la cavidad bucal pueden ser coloniza-das por 700 bacterias (120). Se ha demostrado que pue-denproducirsenotablesdiferenciasenlacomposicinmicrobiana de una persona a otra, de un tipo de locali-zacinintrabucalaotroenelmismoindividuo(p.ej.,dorso de la lengua frente a placa subgingival) y de tiposparecidos de zonas en el mismo individuo (por ejemplo,dos bolsas periodontales separadas). Tan compleja comopueda parecer esta microbiota, las aproximadamente 500especiesquepuedendetectarseenlaplacasubgingivalsonunaminsculafraccindelasespeciesbacterianaspresentes en el planeta Tierra (aproximadamente, mil mi-llones, o ms), las que, potencialmente, podran coloni-zar la cavidad bucal. Est claro que existen potentes fuer-zasquecontrolanelestablecimientodelamicrobiotabucal, gobiernan su composicin e influyen sobre su res-tablecimiento cuando el ecosistema ha sido alterado. Laintencin de este apartado es describir algunos de los fac-tores que influyen sobre el desarrollo y la composicin delas biopelculas intrabucales humanas y que originan lasvariaciones que pueden observarse de un individuo a otroy de una zona a otra en la misma persona.El estudio de las relaciones entre el anfitrin y el mi-crobio no es fcil, en parte a causa de la complejidad dela microbiota, y en parte a causa de la multiplicidad defactoresqueinfluyensobrelacomposicinmicrobianade una biopelcula en una zona dada. Todas las biopel-culas constan de tres componentes (fig. 3): la necesidadde una superficie para la adherencia de la biopelcula, lapropia comunidad de la biopelcula, y el caudal de fluidoquepasasobrelabiopelcula,proporcionandonutrien-tes para los microorganismos colonizadores, eliminandolosproductosmetablicosdedesechoytransportandolas clulas a nuevas zonas de colonizacin. Cada uno deestos componentespuede ser alterado por factores lo-calesodelindividuo,quepuedeninfluirsobrelacom-posicin microbiana de la biopelcula colonizadora. Porejemplo, la naturaleza de la superficie presentada para lacolonizacin puede estar influida por el tipo de tejido pre-sente, los antecedentes genticos del individuo (que pue-den alterar los receptores de superficie), la posible intro-duccin de superficies artificiales, las prcticas higinicas,etc. Dada esta heterogeneidad, es esencial examinar gran-descantidadesdemuestrasdeemplazamientossimila-res y diferentes para intentar discriminar los factores lo-cales y del anfitrin que gobiernan la composicin de lasbiopelculasbucodentaleshumanas.Escrticoparalacomprensin de estos factores el reconocimiento de queestasrelacionesnosonunidireccionales.Elanfitrinpuedeinfluirsobrelamicrobiota,pero,asuvez,lami-crobiotainfluyesobreelanfitrin,localmentey,quizs,deunmodosistmico.Lacolonizacinbacterianaqueprovocaunarespuestainflamatorialocalest,asuvez,influida por la respuesta inflamatoria que, a su vezetc.Lasinteraccionesentrelasespeciesbacterianasenunabiopelcula y entre las especies bacterianas y el hbitat nobacteriano son dinmicas. stas reflejan una interaccinde ida y vuelta permanente entre el anfitrin y las espe-Ecologa microbial periodontal139BIOPELCULALQUIDO CIRCULATESUPERFICIEFig. 3. Componentes de la biopelcula.ciescolonizadas.Cuandolosinvestigadoresobtienenmuestras de diversas biopelculas, obtienen una serie defotos en especficos momentos de esta dinmica relacin,que intentan integrar en una imagen coherente. La com-prensin de las relaciones ecolgicas que existen dentrode las biopelculas intrabucales y entre la composicin dela biopelcula y el anfitrin ha sido lenta, debido a la di-ficultadparaobtenersuficientesfotosdelacomposi-cinmicrobianadelasbiopelculasrecogidasensitua-cionesclnicasestrechamentecontroladas.Laprincipallimitacin ha sido la carencia, hasta hace poco, de tcni-cas microbianas lo suficientemente especficas y rpidasparapermitirlaevaluacindegrandescantidadesdemuestras, necesarias para llevar a cabo provechosos es-tudiosinvivo.Elsiguienteapartadoproporcionarunarevisin de las tcnicas que se han empleado para el es-tudio de la composicin de las biopelculas intrabucalesy describir el desarrollo, en los ltimos aos, de mto-dos, que permiten realizar estudios ecolgicos vlidos.Deteccin y enumeracin de las especiesbacterianas en las muestras del complejode la biopelculaElestudiodelasenfermedadesinfecciosastradicio-nalmente se ha centrado en un agente patgeno (o en unpequeo nmero de agentes) en una enfermedad infec-ciosa dada. Incluso cuando se toman muestras de las reasdondecoexistencomplejasmezclasdeespecies,sehapuesto nfasis en buscar un nmero limitado de agentespatgenos de esa zona. El resto de los microorganismosfrecuentemente son considerados parte de la flora nor-mal.Enlamayoradeloscasostalesespeciespuedenmuybiensercompatiblesconelanfitrin,yresidenteshabituales de la zona analizada; sin embargo, en otros ca-sos, estas especies pueden contribuir a la patogenia de laenfermedad observada. Adems, la ausencia de algunasespecies compatibles con el anfitrin puede ser tan im-portante en el inicio o en la progresin de la enfermedadcomo la presencia de una o ms especies patgenas. Elexamen de las complejas mezclas de microbios se ha vistoobstaculizado por, al menos, dos factores. El primero eslacostumbredecentrarseenunescasonmerodees-pecies consideradas patgenas. El segundo es la ausen-cia de tcnicas de identificacin tiles y rpidas para ae-valuar grandes cantidades de muestras tomadas de reascon complejas microbiotas. Esta capacidad ha evolucio-nado de una forma lenta y, por lo tanto, hasta hace po-cos aos no se realizaban estudios acerca de las comple-jasrelacionesecolgicasqueexistenentrelasespeciesbacterianas y el anfitrin y los efectos que producen lasdiferentes terapias sobre el ecosistema gingival.Los primeros estudios de la composicin de la biope-lcula subgingival utilizaban las tcnicas de microscopiaptica. Estas tcnicas eran razonablemente rpidas, perolimitadas en cuanto a la precisin de la identificacin decada una de las especies. Por lo tanto, mientras podanreconocerse convenientemente unos nueve morfotipos(88), de hecho haba alrededor de 500 especies bacteria-nas en las muestras de la biopelcula bucal (120). El exa-men ,a travs del microscopio ptico, de preparacionesde base hmeda se hizo popular durante algunos aoscomo parte de una terapia periodontal monitorizada ymoduladaenlaqueseemplelaerradicacindelasformasmviles,incluidaslasespiroquetas,comounaayuda para guiar la intensidad de la terapia periodontal(70).Eladvenimientodelmicroscopioelectrnicoper-mitielexamendelasmuestrasdelabiopelculaconuna mayor resolucin. Las tcnicas de microscopio elec-trnico permitieron una mejor distincin de los gruposmicrobianos,basndoseenlaultraestructuradelapa-red celular y la presencia y la organizacin de varios apn-dices de la clula microbiana, como los filamentos axia-les o los flagelos. El microscopio electrnico por s solonopodaidentificardeformaexactaunaclulacomoperteneciente a una especie en particular; sin embargo,en combinacin con las tcnicas inmunoqumicas o dehibridacin in situ, la tcnica permita una precisa loca-lizacindelasclulasbacterianas,ensurelacinrec-proca y en relacin con el anfitrin, cuando se tomabansecciones en bloque del anfitrin (72, 110-113). La granfuerzadelastcnicasdemicroscopia,incluidoelpro-metedor microscopio confocal, es la delineacin de lasdisposiciones espaciales de los microorganismos. La granflaqueza de estas tcnicas, desde una perspectiva ecol-gica, es que son lentas y muy laboriosas y, por lo tanto,limitan el nmero de muestras que pueden examinarse.Adems,laclasificacinexactadelaespeciemediantetcnicas inmunolgicas o de hibridacin slo puede serrealizadaenunnmeromuylimitadodeespeciesencualquier muestra dada.Durante muchos aos, la principal tcnica de que dis-ponan los investigadores para identificar las bacterias dela placa era el cultivo de los microorganismos y la identi-ficacin de las especies por sus rasgos fenotpicos, lo querepresentabaunprocesolargo,complicadoycaro(tabla1). En consecuencia, podan examinarse relativamente po-casmuestrasdeplacaenreducidosnmerosdeindivi-duos. Por ejemplo, en los estudios llevados a cabo en TheForsyth Institute entre 1982 y 1988, se evaluaron 300 mues-trasdeplacasubgingivalprocedentesdelesionesperio-dontalesconprogresinactivaantesdeltratamientoydespusdeste,utilizandolastcnicasdecultivosconvencionales(37,62).Enaquelmomento,estoestabaconsiderado un estudio en gran escala, y por supuesto lacaracterizacin de aproximadamente 15.000 cepas clnicasen un perodo de 6 aos fue un proyecto enorme. Sin em-bargo, nicamente se tomaron dos o tres muestras por in-dividuo, en cada uno de los intervalos de muestreo esta-blecidos,deuntotalde88participantes.Losclsicosestudios de Moore y Moore (105), en los que se examinla composicin de las muestras de placa subgingival de in-dividuos con el periodoncio sano y con diferentes estadosde enfermedad periodontal, emplearon tcnicas de culti-vos para examinar ms de 17.000 cepas clnicas de ms de600 zonas periodontales. Ello represent una enorme can-Socransky y Haffajee140tidaddetrabajosobreunlimitadonmerodemuestras,segn los estndares del momento, A pesar de sus limita-ciones, estos estudios y otros estudios de cultivos micro-biolgicos de las dcadas de 1970 y 1980 definieron las es-pecies consideradas importantes en el inicio y la progresinde las enfermedades periodontales, as como las especiesconsideradas compatibles o beneficiosas para el anfitrin.Elprincipalpuntofuertedelcultivoesque,enteora,lamayora de las especies bacterianas muestreadas crecerny podrn ser identificadas. Sin embargo, las especies queson difciles de cultivar o las incultivables, como muchasdelasespiroquetas,nopodrndetectarsemedianteestatcnica.Otrasespeciesrequierencondicionesespecialespara su crecimiento. Si no se cumplen estas condiciones,sus recuentos se vern seriamente subestimados. Por ejem-plo,laimportanciadelreconocidoagentepatgenope-riodontal,Tannerellaforsythia (Bacteroidesforsythus),nofue confirmada por cultivo hasta que se determinaron lossingularesrequerimientosdecrecimientodeestemicro-organismo(182).Sinembargo,fueronnecesariaslastc-nicas de inmunofluorescencia para mostrar, por primeravez, la relativamente elevada incidencia de T. forsythia enlas muestras de placa subgingival de los individuos con pe-riodontitis crnica (52). Pese a sus desventajas, los cultivosan ocupan un lugar destacado en los estudios de micro-biologa periodontal, especialmente para la identificacinde microbios en las enfermedades clnicas infrecuentes yen las situaciones donde son necesarios cultivos puros paraanlisis adicionales.Las tcnicas de microscopia ptica, microscopia elec-trnicaydecultivosmicrobiolgicoshansidosustitui-das, en gran parte, por los estudios de la ecologa micro-bianayeltratamientoperiodontalrealizadosmediantetcnicas ms rpidas. Los mtodos basados en los anti-cuerpos fueron unos de los primeros en ser utilizados paraenumerarlasespeciesespecficasdemicroorganismos,sinrealizarsucultivo.Lastcnicasdeinmunofluores-cenciaylosanlisisdeinmunoabsorcinenzimtica(ELISA) han sido utilizadas con xito para examinar unaserie limitada de especies bacterianas en mayores canti-dades de muestras de placa de las que han sido exami-nadas utilizando las tcnicas de cultivo (8, 46, 51, 52, 56,97, 187). Estas tcnicas dependen de la especificad de losanticuerpos desarrollados para taxones especficos. El an-tisuero monoclonal o policlonal adecuadamente prepa-rado y evaluado proporciona un mtodo sensible y espe-Ecologa microbial periodontal141Tabla 1. Mtodos para determinar la composicin microbiana de las muestras bucalesMtodo Puntos fuertes Puntos dbiles AplicacinPredominantescultivablesMedio selectivoInmunofluorescenciaPCRPCR en tiempo realHibridacin ADN-ADNHibridacin ADN-ADN en dameroClonacin ampliadade ADNr 16SPuede detectar especies noreconocidas; proporcionacultivos para el anlisisposteriorModeradas cantidades demuestras para moderadascantidades de especiesEspecificidad;razonablemente rpidaSensibilidad; especificidadSensibilidad; especificidad;cuantitativoSensibilidad; especificidad;cuantitativaSensibilidad; especificidad;cuantitativa; puede utilizarla muestra entera; grandescantidades de especies ymuestras; econmicaDeteccin de especiescultivables e incultivables;posicin filogentica de lostaxonesProceso sumamente largo y caro;con frecuencia los cultivos sondifciles de especiarEscasos medios selectivos tilesdisponibles; a menudo losmedios de cultivo son demasiadoselectivos o no suficientementeselectivos; costosoCantidad limitada de antisuerotil; realizado en pequeascantidades de muestrasNo cuantitativo(presencia/ ausencia); caro;dependiente de ampliacinComparativamente lento; muycaro; limitado en el nmero demuestras y especiesConfinado a las especies para lasque se dispone de sondas;escasas cantidades de especiespara escasos nmeros demuestrasConfinado a las especies para lasque se dispone de sondas;posibilidad de reaccionescruzadasSumamente caro; nmero demuestras extremadamentepequeoEstudios de nuevos ecosistemasEstudios de alcance limitado queimplican 1-10 especies en escasosnmeros de muestrasPosiblemente ms til para estudiosdiagnsticos que ecolgicos o detratamientoDeteccin de especies en unindividuo (incidencia); deteccinde bajas cantidades de especiesdespus del tratamientoEstudios en los que se requiere lacuantificacin de una gama muylimitada de especies en escasos omoderados nmeros de muestrasBsqueda de un conjunto especficode especies en moderadascantidades de muestrasEstudios de grandes cantidades deespecies y muestras, por ejemplo,estudios de ecologa y tratamientoSondea una serie de especies quepueden producirse en hbitatsespecficoscfico de deteccin de especies bacterianas especficas enlas muestras de placa bacteriana. Estas tcnicas tienen laventaja de que las muestras no tienen que ser cultivadaspara su enumeracin; adems, son ms rpidas y menoscostosas que los cultivos. Sin embargo, estn limitadas aaquellas especies para las que se dispone de reactivo. Porotraparte,esdifcilutilizarestastcnicas,enparticularlastcnicasdeinmunofluorescencia,paraevaluarmu-chsimas especies en grandes volmenes de muestras deplaca bacteriana. Sin embargo, Singleton y cols. (152) handescritorecientementeunmtodocompletamenteau-tomatizado de enumeracin bacteriana mediante el mi-croscopio,quepermiteevaluarmayorescantidadesdemuestras. Otra desventaja de las tcnicas basadas en losanticuerpos es el tiempo requerido para elaborar y vali-dar un antisuero especfico frente a las nuevas especies.Durante la ltima dcada, se ha utilizado la tcnica dereaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para detec-tar la presencia de seleccionadas especies bacterianas enlas muestras de placa subgingival (5, 82, 92, 101, 102, 172).Con los cebadores apropiados, este mtodo es rpido ysencillo y puede detectar cantidades muy pequeas declulas de una determinada especie. Tiene la desventajade no proporcionar informacin cuantitativa (hasta hacepoco) (69, 95), pero habitualmente indica la presencia ola ausencia de alguna especie en la muestra. Para algu-nasaplicaciones,estoserasuficiente.Paralasaplica-ciones donde se consideran importantes las concentra-ciones relativas de las especies, el mtodo PCR puede noserideal.Adems,examinargrandescantidadesdees-pecies en un gran nmero de muestras es difcil y, posi-blemente, poco rentable. La tcnica PCR en tiempo realha sido aadida a los mtodos potenciales para exami-narlacomposicindelabiopelcula(69,95).Estem-todo tiene las ventajas de ser especfico, sensible y pro-porcionarlacuantificacindelaconcentracindeespecies seleccionadas en las muestras de la biopelcula.Sin embargo, tiene limitaciones similares a la tcnica PCRconvencional, pues no es un mtodo adecuado para iden-tificar sistemticamente grandes volmenes de muestrasde numerosas especies bacterianas.Las sondas de ADN proporcionan otro acercamientoparalaidentificacinylaenumeracindelasespeciesbacterianasencomunidadescomplejas,talescomolaplaca bacteriana. Las sondas oligonucletidas son son-das cortas diseadas para identificar regiones nicas deADN en el interior de la clula de una determinada es-peciebacteriana.Sehasugeridoqueestassondassonmuyespecficasyque,porlotanto,laprobabilidaddereacciones cruzadas con otras especies es muy baja. Al-gunos estudios han utilizado estas sondas para identifi-car bacterias periodontales (47, 103, 104, 106). Dado quesu objetivo es un limitado segmento del ADN de un mi-croorganismo, las sondas oligonucletidas tienden a sermenos sensibles para detectar bajos nmeros de bacte-rias que las sondas genmicas completas. Sin embargo,las sondas oligonucletidas dirigidas hacia objetivos quetienen mltiples copias en las clulas, como el ARNr 16S,tienen el potencial de ser ms sensibles. Hasta la fecha,no se ha llevado a cabo ningn estudio en gran escala delamicrobiotagingivalquehayautilizadosondasoligo-nucleotidas para detectar y enumerar una amplia gamade especies bacterianas.LassondasdeADNgenmicascompletashansidomuy utilizadas en los estudios que evalan la composi-cin de la placa bacteriana subgingival (24, 61, 94, 116-118, 156, 183, 184). Las sondas genmicas completas seconstruyenutilizandoelgenomacompletodeunaes-peciebacterianacomoobjetivoy,porlotanto,puedenser muy sensibles. Una de las crticas hacia estas sondases que el uso del genoma completo puede aumentar laprobabilidad de que se produzcan reacciones cruzadasentre las distintas especies, debido a las regiones de ADNcomunes entre las especies que estn estrechamente re-lacionadas. Se ha planteado, tambin, que es posible quelas sondas de ADN genmicas completas no detecten to-das las cepas de una determinada especie y que las son-dastenganunabajasensibilidadencuantoalnmerodeclulasquedetectan.Sinembargo,lasinvestigacio-nesrealizadaspor TheForsythInstitute,queutilizaronsondas de ADN genmicas completas, han mostrado quemuchas de las objeciones concernientes a su empleo soninjustificadas o pueden superarse (159).Las sondas de ADN pueden ser muy eficaces para ladeteccin de especies bacterianas, pero cuando se em-pleanconelformatotpico(unasondadirigidahaciamltiples objetivos), slo pueden emplearse nmeros desondaslimitadosparaenumerarcantidadesrelativa-mente grandes de muestras. Los procedimientos en da-mero (checkerboard), tanto si se emplean procedimien-tos de hibridacin directa como de hibridacin inversa,puedenampliarnotablementeelnmerodemuestrasevaluadasparaunaampliagamadeespeciesbacteria-nas. Paster y cols. (9, 122) han combinado la potencial-mente elevada especificidad del mtodo de sonda oligo-nucletidaconunformatoendamerodecapturainversa Los investigadores vencieron el tema de la sen-sibilidaddelasondaoligonucletidaampliandolare-ginADNr16SdelADNextradodirectamentedelasmuestras de la biopelcula mediante la utilizacin de ce-badoresdeconsenso(consensusprimers),iniciadoresquepermitirnlaampliacindeunaextensagamadetaxones bacterianos. Las sondas oligonucletidas espe-cficas para diferentes especies se fijan en lneas parale-las sobre una membrana de nailon, y las muestras indi-vidualesquesemarcaroncondigoxigeninadurantelaampliacin de PCR se hibridizan en canales paralelos, enngulos rectos a las lneas de la sonda. Esta tcnica per-miteladeteccindealmenos28taxonesen44mues-tras en una sola membrana de nailon (9). La tcnica tienela ventaja de ser rpida, relativamente econmica y po-tencialmenteespecficaparaunaespecie,ungneroouna familia (a eleccin del investigador). Tambin ofrecela ventaja de detectar las especies incultivables. Tiene ladesventajadenopermitirlacuantificacinexactaydeser algo ms cara que la tcnica en damero directa, des-Socransky y Haffajee142crita a continuacin, a causa de la necesidad de ampliarlamuestrautilizandoPCR.Adems,laampliacinporPCRpuedeintroducirciertosesgoenlosresultados,acausa de las posibles diferencias en la ampliacin de lasespecies diana en la muestra biolgica.La tcnica de hibridacin ADN-ADN en damero di-recto(fig.4)ofrecealgunasventajasenelestudiodemltiples especies de bacterias en grandes cantidades demuestrasconmezclascomplejasdemicroorganismos.Dado que esta tcnica proporciona la informacin de lamayora de los ejemplos descritos en este captulo, se ladescribirenmayordetalle.Esnecesarioenfatizarqueesta tcnica no es el nico mtodo de valor para el estu-diodelacomposicindelasbiopelculasbucales.Sinembargo, la capacidad para poder estudiar grandes vo-lmenesdemuestrasenungrannmerodeespeciesproporciona un mayor beneficio para los estudios de laecologa microbiana bucodental. La tcnica en dameroesrpida,sensibleyrelativamenteeconmica.Superamuchas de las limitaciones de los cultivos microbiolgi-cos, como la prdida de viabilidad de los microorganis-mos durante el transporte, el problema de enumerar lasespecies difciles de cultivar (o incluso incultivables) y lascomplicaciones para clasificar en especies determinadostaxones que son difciles de crecer en cultivos o que ex-hiben escasos rasgos fenotpicos positivos. Otra ventajaesquelamuestracompletapuedeemplearsesindilu-cinoampliacin(sieltamaototaldelamuestrasedeterminaadecuadamente),superandolosproblemasde cuantificacin impuestos por los procedimientos dedilucin en serie (utilizado en los cultivos) o de amplia-cinporPCR.Latcnicaensuformatooriginalevala28 muestras para determinar el contenido de 40 taxones(es decir, 1.120 recuentos bacterianos) en una sola mem-brana de nylon de 15 ! 15 cm. Posteriormente, si se de-sea, se despojan las membranas y se fija un nuevo con-junto de otras 40 sondas de ADN diferentes. La tcnicaes sensible, dado que puede detectar habitualmente 104clulasdeunadeterminadaespecieenunamuestra,ylas condiciones de hibridacin y deteccin pueden mo-dificarse para detectar 103clulas (31). Por lo general, seha encontrado que las sondas de ADN genmicas com-pletas son notablemente especficas; 93,5 % de sonda: lasreaccionescruzadasdelasespecieshetrologasfueroninferiores al 5 % de la seal de sonda homloga (159).La hibridacin ADN-ADN en damero tiene limitacio-nes. La tcnica slo puede detectar las especies para lascualessehanpreparadosondasdeADN.Porlotanto,este mtodo no podra detectar nuevas especies patge-nas o relevantes del entorno que fueran detectadas me-diante cultivos u otras tcnicas moleculares. Las sondasdebenusarseparadetectarlosmicroorganismosenmuestras de tamao apropiado. Las sondas optimizadaspara detectar especies en el intervalo de 104-107con fre-cuenciaproporcionarnreaccionescruzadassiseem-plean muestras ms grandes.Cuandoseempleanadecuadamente,lastcnicasdehibridacinADN-ADNendameroyotrastcnicasmi-crobiolgicasrpidaspermitenlainvestigacindelosproblemas etiolgicos, teraputicos y ecolgicos que nopodranseralcanzadosporotrosmedios.Losdatosdelasmuestrasclnicaspresentadosenestecaptulode-muestran la viabilidad de describir la microbiota en zo-nasconenfermedadesclnicaslocalesdiferentes,ascomo en individuos con distintos antecedentes sistmi-cos y diferentes estados de enfermedad periodontal o desalud. Adems, a partir de los datos obtenidos con estatcnicapuedencalcularselaabundanciadelaespecie,ladiversidaddeespeciesylaestructuradelacomuni-dad(156).AmedidaquesediseennuevasymejoressondasdeADNyseempleentcnicasmicrobiolgicasmsrpidas,lacomprensindelasrelacionesecolgi-casdelascomplejascomunidadesmicrobianaspodrdesarrollarse en un grado hasta ahora fuera de nuestroalcance.El primer componente: composicin microbianade las biopelculas subgingivalesRecuentos totales de bacterias subgingivalesen individuos con periodoncio sano y enfermoLa primera pregunta que se podra formular, con res-pecto a la ecologa microbiana es: cul es la cantidad declulas bacterianas presentes en las biopelculas subgin-givalesenlosindividuosconelperiodonciosanoyenlos individuos con el periodoncio enfermo? Podra reali-zarseunaestimacindelacantidaddebacteriassub-gingivalesapartirdelosdatossuministradosporSha-rawyycols.(149).Estosinvestigadoresrecogieroncuidadosamente toda la placa subgingival (o toda la quefue posible) de las superficies dentarias subgingivales demedia boca en 14 individuos con el periodoncio sano y21 con periodontitis. El peso medio de las muestras enseco fue de 1,6 0,8 y 8,3 3,9 mg, respectivamente, paralosdosgruposclnicos.Estosetradujoenunpesoenmojado por media boca de alrededor de 8,0 y 41,5 mg,respectivamente,oenuntotaldepesoenmojadodeplaca bacteriana de 16 y 83 mg, respectivamente. Dadoque, por trmino medio, el recuento microscpico totalde microorganismos en la placa subgingival es de 2,1 !108por mg de peso en mojado (153), la cantidad total declulas microbianas en la placa subgingival de los indi-viduos sanos puede estimarse en 33,6! 108, y la canti-dad de clulas microbianas en la placa subgingival de losindividuos con periodontitis, en 174,3 !108, con una con-siderable variacin interpersonal. Es interesante que losrecuentos medios de toda la boca difirieran por un fac-tor slo de 5, ya que en ocasiones los odontlogos reti-ran grandes cantidades de placa bacteriana de los indi-viduos con periodontitis. No obstante, debe reconocerseque la acumulacin masiva de placa subgingival se pro-duce nicamente en un pequeo nmero de pacientes,y que la mayora de las zonas periodontales en la mayorparte de los individuos con periodontitis estn sanas,es decir, exhiben mnima enfermedad y poca placa sub-gingival.Ecologa microbial periodontal143Abundancia de especiesUno de los primeros pasos que realizara un ecologistaen el estudio de cualquier ecosistema sera analizar el al-cance y la naturaleza de las especies que existen en unhbitat de inters. Esto ha sido admirablemente descritopor Paster y cols. (121). Estos autores indicaron que enlas biopelculas subgingivales podan encontrarse apro-ximadamente500especies,yresumieronlanaturalezade los taxones encontrados. La figura 5 (de Paster y cols.[121])describelos10filotiposquehansidodetectadasen las muestras de placa subgingival, proporciona ejem-plos de conocidas especies de estos filotipos y demues-tra que ms de la mitad de los grupos taxonmicos de-Socransky y Haffajee14411 12 13 14 15 16 17 21 22 23 24 25 26 27 31 32 33 34 35 36 37 41 42 43 44 45 46 47 105106A. naeslundii IS. constellatusE. nodatumP. gingivalisA. actinomycetem.F. nuc. ss vincentiiC. rectusT. socranskiiE. saburreumP. microsV. parvulaA. naeslundii IIS. anginosusS. sanguisA. gerencseriaeS. oralisC. ochraceaA. israeliiS. intermediusT. denticolaP. nigrescensA. odontolyticusF. nuc. ss polymorphumC. showaeF. periodonticumN. mucosaF. nuc. ss nucleatumC. gingivalisS. gordoniiT. forsythiaS. noxiaP. acnesP. melaninogenicaS. mitisE. corrodensG. morbillorumC. sputigenaL. buccalisC. gracilisP. intermediaFig. 4. Ejemplo de hibridacin de ADN-ADN en damero, uti-lizado para detectar 40 especies bacterianas en 28 muestrasdeplacasubgingivalenunsolopaciente. Laslneasverti-cales son las muestras de placa numeradas desde el 11 (in-cisivo central derecho del maxilar superior) hasta el 47 (se-gundomolarderechomandibular). Esteindividuocarecade las piezas dentarias 16, 17, 21 y 37. Las dos lneas verti-cales de la derecha son valores estndar con 105o 106clu-las de cada especie de prueba. Las lneas horizontales con-tienen las sondas de ADN indicadas en un amortiguador dehibridacin. Una seal en la interseccin de las lneas ver-tical y horizontal indica la presencia de una especie. La in-tensidad de la seal est relacionada con el nmero de mi-croorganismos de esa especie en la muestra. Poco despus,las muestras de placa se colocaron en tubos Eppendorf y elADN fue liberado de los microorganismos tras hervirlos enNaOH. Despusdelaneutralizacin, elADNliberadofuetransferido a la superficie de una membrana de nailon uti-lizandolos30canalesdeundispositivoMinishot(Immu-netics, Cambridge, MA). El ADN se fij a la membrana conluz UV y coccin y se coloc en un Miniblotter 45 (Immu-netics) con las lneas de ADN formando ngulos rectos conlos 45 canales del dispositivo Miniblotter. Las sondas de ADNgenmicascompletasradiomarcadascondigoxigeninasecolocaron en un amortiguador de hibridacin en 40 de laslneasyfueronhibridadasdurantetodalanoche. Trasunlavadoestricto, lassealessedetectaronutilizandoanti-cuerpos conjugados por fosfatasa frente a la digoxigenina ysustratosquimiofluorescentes. Lassealessecompararona los valores estndar mediante un Store Fluorimager y seconvirtieronarecuentos. Reimpresin, tomadodeSo-cransky y cols. (159), con autorizacin.tectadoseranespeciesnuevas.Sinembargo,estclaroque los aproximadamente 500 taxones que pueden en-contrarsenoestnuniformementedistribuidosenlasmuestras de placa subgingival, por ejemplo, algunos ta-xones se detectan con mucha mayor frecuencia y en ma-yores nmeros que otros en cualquier hbitat bucal deinters. En la figura 6 se muestra la frecuencia de detec-cin de los taxones cultivables y de los todava no culti-vadosenmuestrastomadasdediferenteszonasperio-dontales (121). Veintisis de los 306 taxones detectadoscorrespondan a ms del 50 % de los clones secuencia-dos, mientras que 103 taxones (43 %) fueron detectadossolamente en uno de los 31 individuos.Laconclusindequelasespeciesnoseencuentrandistribuidasdeunmodouniformeenlaszonasperio-dontalestambinpuedesersacadadeotrosdatos.Las40 sondas de ADN mencionadas en la figura 4 identifi-caron un 85 % de 3.400 cultivos puros en las muestras deplacasubgingivalde62individuos.El15 %restanteseidentific mediante pruebas fenotpicas o secuenciacindeARNr16S.Ningunadeestascepasclnicasaisladasera una especie en la serie de pruebas, lo que indica quelas sondas podan captar todas las cepas clnicas de esaespecie. Dado que, por trmino medio, se recupera apro-ximadamente el 70 % de las clulas enumeradas por re-cuento microscpico, las 40 sondas de ADN representa-ran el 55-60 % de las bacterias en las biopelculas sub-gingivales. Este hallazgo coincide con los datos propor-cionados por Paster y cols. (121) y apoya la nocin de queun limitado conjunto de especies representa la vasta ma-yora de las clulas bacterianas encontradas en las mues-tras de biopelcula subgingival.La abundancia de las especies puede expresarse de mu-chas maneras. La figura 7 muestra los recuentos medios! 105de 40 taxones en 20.247 muestras subgingivales re-cogidas de 184 individuos con periodoncio sano y 592 in-dividuos con periodontitis crnica. La especie dominantefue Actinomyces naeslundii de la genoespecie 2. Esto noessorprendente,dadoquelamayorpartedelaszonasmuestreadas presentaban bolsas periodontales poco pro-fundas. Si se hubiesen obtenido muestras de bolsas pro-fundas,surgirauncuadroalgodistinto,comosecom-probarmsadelante.Otrasespeciespredominantesfueron:Prevotellanigrescens, Prevotellaintermedia, Vei-llonella parvula, T. forsythia y Prevotella melaninogenica.Diversidad de especiesLos ndices de diversidad son utilizados con frecuenciapor los ecologistas para describir la riqueza de especies yEcologa microbial periodontal145Tipo bacterianoObsidian poolTM7DeferribacteresSpirochaetaFusobacteriaActinobacteriaFirmicutesClostridiaProteobacteriaBacteroidetesN de especies N de nuevosconocidas filotipos0 10 50 810 456 1312 1823 1219 4026 1917 24113 195Especies conocidas detectadasalmenos en 4 individuos___T. medium, T. denticola, T. maltophilumT. lecithinolyticum, T. socranskiiF. naviforme, F. nuc ss nucleatum,F. nuc ss polymorphum, F. animalisL. buccalisA. naeslundii 2, R. dentocariosa,C. matruchotii, Atopobium parvulumA. rimaeS. oralis, S. mitis, S. sanguis, S. cristatusS. intermedius, S. constellatus,S. anginosus, Abiotrophia adiacensG. morbillorum, G. haemolysansE. brachy, E. saphenum, Filifacter alocisP. micros, Catonella morbi, V. disparV. parvula, Dialister pneumosintesSel. sputigena, S. noxia, S. infelixN. mucosa, H. parainfluenzae,C. gracilis, C. concisus, C. rectusPrev. denticola, P. oris, P. tannerae,T. forsythia, P. gingivalisP. endodontalis, Capno gingivalisC. ochraceaFig. 5. Gamadeespeciescultivableseincultivables(hastael momento) detectadas en las muestras de placa subgin-gival. Los10tiposbacterianosdetectadosseilustranalaizquierda, acompaados del nmero de especies conocidasy los filotipos nuevos detectados en cada tipo. A la derechasepresentanejemplosdeespeciesparacadatipobacte-riano. Todas estas especies fueron detectadas en cuatro in-dividuos, al menos. Datos tomados de Paster y cols. (121).launiformidaddeespeciesenlosdiversosecosistemas(93). En la figura 8 se presentan algunos ejemplos del usode estos ndices. Para cada ndice, se calcul la diversidadencadazona,seobtuvolamediadetodaslaszonasenun individuo, y luego la media entre individuos en los gru-posconperiodonciosanoyconperiodontitiscrnicaarriba descritos. Los tres primeros ndices (N0, N1 y N2 deHill) fueron elegidos porque son fcilmente interpretablesen trminos de la cantidad de especies reales. El ndice N0de Hill representa el nmero de especies detectadas, conuna media de 22 y 24 por zona para los individuos sanosy con periodontitis, respectivamente. La cantidad efectivadeespeciesabundantesfuecasiigualenambosgruposclnicos, mientras que la cantidad efectiva de especies muyabundantes fue ms elevado en las muestras obtenidas delosperiodonciossanosqueenlasmuestrasdeaquelloscon periodontitis. El ndice de uniformidad de Hill oscilade 0 a 1; el valor 1 indica una distribucin perfectamenteuniforme de las especies, y el valor 0, una distribucin muydesviada. Pareci haber una mayor uniformidad en lasmuestras de los individuos sanos que en las de los indivi-duos con periodontitis. Segn puntualizan Ludwig y Rey-nolds (9), en ecologa se utilizan a menudo los ndices dediversidad, pero son difciles de interpretar.Asociaciones microbianas en las biopelculassubgingivalesEl examen casual de nuestro macroentorno indica queexisten asociaciones de especies especficas fcilmente dis-cerniblesenlosdistintoshbitats.Confrecuenciaestasasociaciones son conducidas por el hbitat. Por ejemplo,un clima seco puede seleccionar un conjunto de especiesde plantas, un clima hmedo, otro, y un clima que alternaperodos de nevadas con estaciones calurosas, otros con-juntos de plantas. El hbitat es tambin un factor destacoen la determinacin de las asociaciones de especies entremicroorganismos. Algunas de las presiones selectivas quedeterminanlosensamblajesdelasespeciesbacterianasfueron brevemente mencionados al analizar los principiosde la ecologa microbiana, en este trabajo: nutrientes o re-querimientosdelentornocompartidos,receptoressimi-lares para su adhesin inicial, mecanismos compartidosdeproteccincontraelanfitrinyotrasespecies,yde-pendencia de una especie hacia la otra, para la coloniza-cin. Se han realizado intentos in vitro para definir algu-nosdelosprincipiosdelaasociacindeespecies,porejemplo,losesfuerzosparadefinirparesdeespecieses-pecficas involucradas en la coagregacin (74, 75) o parainvestigar las interacciones entre las especies que puedenproducirse en los experimentos de cultivos mixtos in vi-tro (142, 164, 180). En el ao 1998 (156), se intentaron de-finir las asociaciones de especies que suceden, in vivo, enlas biopelculas bacterianas subgingivales. El origen de esteacercamiento fue la expectacin de que en las biopelcu-las subgingivales deben producirse asociaciones de espe-ciesespecficas,yaquestasseproducenregularmenteen otros ecosistemas en la naturaleza. Adems, en los pri-meros aos, las membranas de hibridacin ADN-ADN endamero eran ledas visualmente por los autores, quienesacabaron reconociendo que cuando ciertas especies se de-tectaban en una zona, era virtualmente seguro que otrasciertasespeciestambinestuvieranall.Estanocinsecomprob analizando los datos de ms de 13.000 mues-Socransky y Haffajee146N Clones of ataxon detected N taxa1 1032 523 304 115 116 107 68 119 510 311-19 3820-29 1130-39 440-49 550-99 2100+ 4103 taxones (34 %) cada uno representa el 0,04 %: total = 4,1 %52 taxones (17 %) cada uno representa el 0,08 %: total = 4,1 %242 taxones (79 %) representan el total de 661/ 2522 = 26,2 %26 taxones (8,5 %) representan > 50 %de la microbiotaFig. 6. Relativaen las muestras de placa subgingival de 31 in-dividuos empleando la tcnica de ampliacin PCR de los ge-nes ADNr 16S, seguida por la clonacin y secuenciacin de losinsertos. La figura indica el nmero de taxones que fueron de-tectados una, dos, tres veces, etc., en las muestras de los indi-viduos de estudio. Datos tomados de Paster y cols. (121).tras de biopelcula subgingival procedentes de 185 indivi-duoscondiferentesestadosdesaludyenfermedadpe-riodontal (156). Las asociaciones entre todos los pares deespeciesfuerondeterminadassegnvarioscoeficientesde semejanza, y las matrices de semejanza resultantes fue-ron sometidas al anlisis por grupos (cluster analysis). Es-tos anlisis reforzaron la hiptesis de que existan distin-toscomplejosdemicroorganismosenlasbiopelculassubgingivales. Posteriormente, los datos fueron examina-dos utilizando dos tcnicas de ordenacin de comunida-des: el anlisis de los principales componentes y el anli-sisdecorrespondencia.Estosanlisisfueronvaliosos,porque confirmaron los complejos descritos por los an-lisis por grupos emparejados y sugirieron la naturaleza dela relacin que existe entre cada uno de los complejos (co-munidades). La publicacin de este trabajo se recibi conun entusiasmo mayor que el anticipado. Esto pareci seren gran parte debido a que la delineacin de los comple-jos por colores proporcion una estructura para descri-bir y comprender el ecosistema subgingival. En la figura9sepresentalasntesisoriginaldelosanlisisdeorde-nacin por grupos y comunidades.Tal como se ver ms adelante, los complejos espec-ficosestnrelacionadosconsuhbitatentrminosdesalud/ enfermedad,lascaractersticasclnicaslocalesylos antecedentes sistmicos del anfitrin. Las relacionesentre las especies descritas por Socransky y cols. (156) seequipararon a los hallazgos de los estudios de coagrega-Ecologa microbial periodontal147Recuentos ! 1050,0 1,2 2,5 3,8 5,0A. naeslundii 2P. nigrescensP. intermediaV. parvulaT. forsythiaP. melaninogenicaC. gingivalisP. gingivalisA. naeslundii 1F. nucleatum ss nucleatumF. nucleatum ss vincentiiA. gerencseriaeC. gracilisN. mucosaA. israeliiC. rectusF. nucleatum ss polymorphumP. microsF. periodonticumC. sputigenaL. buccalisE. nodatumT. denticolaE. corrodensS. noxiaC. showaeA. odontolyticusC. ochraceaE. saburreumG. morbillorumS. sanguisA. actinomycetemcomitansS. oralisS. godoniiS. mitisP. acnesS. anginosusT. socranskiiS. intermediusS. constellatusFig. 7. Grfico de barras dede los taxones subgingivales,determinado por hibridacin de ADN-ADN en damero. Sepresentan los recuentos medios de 40 especies en las mues-trasde184individuosperiodontalmentesanosy592in-dividuos adultos con preriodontitis crnica. El nmero to-taldemuestrasfuede20.247(mediade26,1porindivi-duo). Se obtuvo la media de los recuentos de cada especiedentro de un individuo e interindividual. Las barras y pa-tillas representan los recuentos medios ! 105, ESM (errorestndar de la media).cin realizados in vitro (74, 75). Las especies que consti-tuyen los complejos tambin parecen estar distribuidasendiferentesregionesdelabolsaperiodontalosurcogingival segn se determina por el anlisis inmunocito-qumicoinsitu.Lafigura10,basadaenlaspublicacio-nes de Kigure y cols. (72) y Noiri y cols. (110-113), indicalas regiones en el rea subgingival que parecen estar en-riquecidas por especficos complejos microbianos.El segundo componente:influencia de la superficie en la composicin delas biopelculas intrabucalesComparacin de la composicin microbianaentre las biopelculas que se forman sobre las piezasdentarias y sobre los tejidos blandosUno de los determinantes clave de la composicin dela biopelcula bacteriana es la naturaleza de la superficiesobre la cual se desarrolla esta biopelcula. En ningn lu-gar puede demostrarse esto con mayor facilidad que enla cavidad bucal, examinando la composicin de las bio-pelculas que se desarrollan sobre las superficies de losdientes y de los diversos tejidos blandos de dicha cavi-dad. Mager y cols. (98) utilizaron hibridacin ADN-ADNen damero para comparar la composicin de la micro-biota obtenida de 11 zonas, en el mismo individuo: sa-liva,placasupragingival,placasubgingivalyochosu-perficiesdetejidoblandodiferentes.Lasmuestrasdifirieron notablemente en cuanto a las proporciones delos40taxonesdepruebaexaminados.Porejemplo,seobservaronproporcionesmuchomsaltasdeespeciesActinomyces en las muestras procedentes de las superfi-cies dentarias; se apreciaron altas proporciones de P. me-laninogenica en las muestras de la saliva y de las super-ficiesdorsalylateraldelalengua,yaltasproporcionesdeStreptococcusmitis yS. oralis enlasmuestrasdelasrestantes superficies de tejido blando (fig. 11). El anli-sisporgruposdelasmuestras(fig.12)revelquelasmuestras obtenidas de las superficies dorsal y lateral dela lengua y las muestras de la saliva eran similares entres; de ese modo, se confirm la previa nocin de que lafuente de la mayora de las clulas bacterianas en la sa-liva era la superficie de la lengua. Las microbiotas de lasotras superficies de tejido blando la parte ventral de lalengua, el suelo de la boca, el paladar duro, las mejilla,elvestbulolabialylainsercingingivalformaronunsegundo grupo. Los dos grupos formados por las mues-tras de tejido blando y saliva fueron ms similares entreSocransky y Haffajee148N2 de Hill (Nmero efectivo de especies muy abundantes)N0 de Hill (Nmero de especies)Periodoncio sanoPeriodontitisP < 0,05P < 0,05 ns2418126016128401296301,000,750,500,250,00P < 0,001N1 de Hill (Nmero de especies abundantes)ndice de uniformidad (E5)Fig. 8. Grfico de barras de cuatro ndices de diversidad uti-lizados para comparar las muestras subgingivales de 184individuosconperiodonciosanoconlos592individuosadultos con periodontitis crnica presentadas en la figura7. Losndicesdediversidadsecalcularon(93)paracadazona, seobtuvolamediadentrodeunindividuoyluegola media interindividual en los dos grupos.s que las muestras tomadas de la placa supragingival ysubgingival, que constituyeron un tercer grupo.Los descubrimientos de este estudio subrayan la im-portancia de la naturaleza de la superficie que es colo-nizada sobre la composicin de biopelcula subsecuente.En este estudio, cada individuo actuaba como su propiocontrol, descartando posibles diferencias de anteceden-tes del anfitrin. El caudal de fluido de la saliva que ba-abalassuperficieseraesencialmenteidnticoparatodas las localizaciones, excepto para las muestras sub-gingivales. A pesar de estos factores del entorno idnti-cos, las biopelculas difirieron notablemente a causa delas singulares diferencias en las superficies que se colo-nizaban. En ningn otro emplazamiento fue esto tan evi-dente como para el dorso de la lengua frente el paladarduro.Estasdossuperficiesdetejidoblandoentranencontacto cientos de veces cada da y, an as, los micro-organismosquecolonizanestassuperficieseranradi-calmente diferentes en trminos de proporciones tantode abundancia como de especies.Comparacin de la composicin microbianaentre las biopelculas que recubren las piezasdentarias y las prtesis dentalesLa sustitucin de todas las piezas dentarias naturalespor dentaduras postizas completas proporciona un m-todo directo de valorar el posible efecto de los cambiosen las superficies de tejido duro intrabucales sobre la com-posicin de las biopelculas que recubren el tejido duroy el blando. La microbiota del individuo desdentado noes del todo comprendida, ya que se han realizado relati-vamente pocos estudios de la microbiota que coloniza lasprtesisdentalesodelasmembranasmucosasolasa-liva en individuos desdentados. En uno de los extremosde edad, los estudios de la cavidad bucal desdentada delos lactantes antes de la erupcin dentaria sugieren quepuedendetectarseespeciesanaerobiasenausenciadepiezas dentarias.P. melaninogenica fue la especie anae-robia aislada con mayor frecuencia: fue hallada en el 70 %deloslactantes(77).OtrosanaerobioscomunesfueronFusobacterium nucleatum, especies de Veillonella y Pre-votella no pigmentada. La fuente de anaerobios pareciser la madre, ya que haba una correlacin entre la con-centracin salivar materna y la colonizacin por P. mela-ninogenica del lactante (78). Al otro extremo del espectrode edad, se estudi la microbiota de 51 individuos des-dentados (media de 74 aos de edad) con prtesis tota-les(76).Lasmuestrasserecogierondelasuperficiedeacoplamiento de la dentadura, as como del paladar, mu-cosabucal,dorsodelalenguaysaliva.SeencontraronBacteroides pigmentados de negro en el 96 % de los in-dividuos, y hongos en el 49 % de los participantes. De lasmuestras de saliva, en el 84 % se hallaron mutantes de es-Ecologa microbial periodontal149Especies deActinomycesV. parvulaA. odontolyticusS. constellatusC. gracilisC. rectusE. nodatumC. showaeE. corrodensC. gingivalisC. sputigenaC. ochraceaC. concisusA. actino. aP. intermediaP. nigrescensP. microsF. nuc. vincentiiF. nuc. nucleatumF. nuc. polymorphumF. periodonticumP. gingivalisT. forsythiaT. denticolaA. actino. b S. noxiaS. mitisS. oralisS. sanguisStreptococcus sp.S. gordoniiS. intermediusFig. 9. Representacinenformadediagramadelasrela-cionesentrelasespeciesdentrodeloscomplejosmicro-bianos y entre los complejos. Actualizado de Socransky ycols. (156); B. forsythus fue cambiado por T. forsythia.treptococos y en el 92 %, lactobacilos. Los datos en la bi-bliografasugierenqueciertasespecies,comoStrepto-coccus mutans, requieren superficies duras para mante-nerlacolonizacin(18,43,91,169),aunquepuedendetectarse, en bajas concentraciones, en los tejidos blan-dosdeindividuosdesdentados.Losestudioshansuge-rido que S. mutans prcticamente desaparece de la cavi-dadbucalcuandotodoslosdientessonextradosyreaparecesilassuperficiesdurasseproporcionanenlaformadeprtesisdentalescompletas(18,43,91,169).Otros estudios han sugerido que A. actinomycetemcomi-tans y P. gingivalis desaparecen de la cavidad bucal trasla extraccin de todas las piezas dentarias y no reapare-cen incluso cuando las superficies duras se sustituyen porprtesis completas (26). S. mutans, as como los lactoba-cilos, pueden encontrarse en las bocas de personas des-dentadasquellevandentaduraspostizas,loqueindicaque las dentaduras proporcionan una superficie para lacolonizacin (18, 43, 169). Theilade y cols. (168, 169) exa-minaronlamicrobiotacultivablepredominanteenlasprtesis dentales en pacientes con membranas mucosassanas o con estomatitis inducida por la prtesis. Descu-brieronquelamicrobiotaenlasdossituacionesestabadominadapormicroorganismosgrampositivos,princi-palmente de los gneros Streptococcus, Actinomyces y Lac-tobacillus. Las especies de Veillonella constituyeron alre-dedor del 10 % de la microbiota, mientras que los bacilosgramnegativos constituyeron menos del 1 %.Los datos de los estudios citados son interesantes, puessugieren que la existencia de piezas dentarias puede seresencialparalacolonizacindeespeciescomoA. acti-nomycetemcomitans y P. gingivalis. Adems, las superfi-cies duras parecen ser primordiales para la colonizacinde S. mutans. Los datos de Theilade y cols. (168) indicanqueelsurcogingival,ascomoellquidoquepasaporl, pueden ser imprescindibles para la colonizacin de lamayoradelasespeciesdebacilosgramnegativos,in-cluidas las especies ms habituales, como F. nucleatum,P. intermedia y P. nigrescens.Porconsiguiente,loshallazgosenlabibliografasu-gieren la necesidad de superficies duras para la coloni-zacin de algunas especies y el lquido crevicular gingi-valdelsurcogingivalobolsasperiodontalesparalacolonizacin de otras. Esta nocin nos impuls a com-parar la microbiota de las dentaduras postizas de aque-llos individuos totalmente desdentados y que haban es-Socransky y Haffajee150ActinosAmarilloMoradoComplejo naranjaEpitelio Complejo rojoVerdeSUPERFICIE RADICULARSUPERFICIE RADICULARPARED DE LA BOLSAPARED DE LA BOLSAFig. 10. Seccin histolgica de placa bacteriana subgingi-val humana teida con toluidina azulazul de metileno. Lasuperficie del diente est a la izquierda, y el revestimientoepitelial de la bolsa periodontal, a la derecha. La placa bac-teriana adherida a la superficie dentaria se aprecia haciala parte superior derecha del corte, en tanto que puede ob-servarseunasegundazonademicroorganismosrevis-tiendolapareddelabolsaperiodontal. (CortesadelDr.Max Listgarten.) La localizacin sospechada de especies enlos diferentes complejos ha sido indicada en la seccin, so-bre la base de los datos de Kigure y cols. (72) y Noiri y cols.(110-113).tadollevandoprtesisdentalesdurantecomomnimo1 ao con la microbiota presente en las muestras de placasupragingival de individuos con periodoncio sano o quesufran periodontitis crnica. Las muestras de placa su-pragingival fueron recogidas del aspecto mesial de cadapieza dentaria (o pieza de la prtesis) en 28 participan-tes con periodoncio sano, 8 con periodontitis y 18 total-mente desdentados portadores de prtesis completas, yse analizaron individualmente para evaluar el contenidode 41 especies bacterianas (el estndar de 40 especies +S. mutans)utilizandohibridacindeADN-ADNenda-mero.Seobtuvolamediadelosrecuentosencadain-dividuoporseparadoy,luego,entreindividuosenlos3 grupos clnicos. Los recuentos de sonda de ADN tota-les medios (! 105, error estndar de la media, ESM) fue-ron 45 7, 66 13 y 52 11 en los individuos sanos, conperiodontitis y desdentados, respectivamente. La mediade los perfiles microbianos difiri de forma bastante no-table entre los grupos clnicos (fig. 13). Es de destacar quesehallaronbajasconcentracionesdeCapnocytophagaochracea, Capnocytophaga sputigena, Campylobacter rec-tus, Campylobacter showae, T. forsythia, Neisseria mucosay P. melaninogenica en las muestras de los participantescon dentaduras postizas. Estos datos, aunque limitadosal nmero de individuos estudiados hasta la fecha, rea-firman el concepto de que la naturaleza de la superficiede tejido duro impacta en la composicin de las biope-lculas que se forman sobre las superficies de tejido duro.Asimismo, se examinaron las muestras de tejido blandoysalivaenelmismogrupodeindividuosmediantehi-bridacin ADN-ADN en damero (fig. 14). En general, losperfiles microbianos medios en los distintos lugares demuestreofueronmssimilaresentrelosindividuossa-nos y con periodontitis que en[entre/ con respecto a] losindividuosdesdentados.Lasproporcionesdesubespe-cies de F. nucleatum, Eikenella corrodens y V. parvula fue-ron significativamente bajas para la mayor parte de loslugares de muestreo en los individuos desdentados. Encambio, las proporciones de S. mitis y Streptococcus gor-donii fueron significativamente altas en todas las zonasde tejido blando, excepto en el dorso y los laterales de lalengua en los individuos desdentados. Se detect Fuso-bacteriumperiodonticum deformaconstanteenpro-porciones significativamente ms altas en las superficiesde tejido blando y en la saliva de los pacientes sin dien-tes.Adems,losrecuentostotalesdelasondadeADNfueron ms elevados en los tejidos blandos de estos in-dividuos. Estos datos sugieren que la microbiota del te-Ecologa microbial periodontal151Supra0 9 18Recuento de la sondade ADN en %A. naeslundii 2A. naeslundii 1V. parvulaN. mucosaA. israeliiA. gerencseriaeL. buccalisF. nucleatum ss nucleatumE. corrodensF. nucleatum ss vincentiiS. sanguisF. nucleatum ss polymorphumA. odontolyticusE. nodatumF. periodonticumC. gracilisS. mitisS. oralisC. gingivalisP. intermediaC. sputigenaE. saburreumG. morbillorumP. gingivalisS. gordoniiP. microsC. ochraceaS. noxiaP. nigrescensP. melaninogenicaC. showaeS. anginosusT. forsythiaC. rectusP. acnesS. constellatusT. socranskiiT. denticolaS. intermidusA. actinomycetemcomitansSub0 9 18Saliva0 9 18Dorso dela lengua0 9 18Laterales dela lengua0 9 18Parte ventralde la lengua0 9 18Suelo dela boca0 9 18Bucal0 9 18Paladarduro0 9 18Vestbulolabial0 9 18Insercingingival0 9 18Fig. 11. Porcentaje medio del recuento de la sonda de ADN( ESM)paralasmuestrasprocedentesde11zonasen41individuos con el periodoncio sano y 39 con periodontitis.Lasespeciesestnordenadassegnsuproporcinmediade placa subgingival. La significacin estadstica de las di-ferencias entre la localizacin de las muestras se determinutilizandolapruebadeKruskal-Wallis, yselaajustparacomparacionesmltiples(157). Todaslasespeciesfueronsignificativamente diferentes entre los grupos, con un valorp < 0,001, con la excepcin de Streptococcus constellatus yGemella morbillorum. Las barras de colores representan lasespeciesquemostrarondiferenciasespecialmenteacusa-das entre las zonas de muestra. Actualizado de Mager y cols.(98), con la adicin de 36 individuos de estudio.jidoblandobucaldelosindividuosdesdentadostam-bin es muy diferente de la observada en los individuossanos o con periodontitis e indican que la naturaleza dela superficie del tejido duro en la cavidad bucal no sloimpacta sobre la naturaleza de las especies que coloni-zan sobre estas superficies duras, sino tambin sobre lasque colonizan en las superficies del tejido blando. Unaadvertenciaparalainterpretacindeloshallazgosen-contrados en esta seccin es que los diferentes mtodosutilizados por los individuos dentados y desdentados paracepillarsusdientestambinpuedeninfluirenlami-crobiota colonizadora.El tercer componente: influenciadel caudal de fluido sobre la composicinde las biopelculas intrabucalesLa crtica funcin de la salivaElcaudaldefluidoescrticoparalasupervivenciadelosmicroorganismosenlabiopelcula.Estelquidoproporciona nutrientes, elimina los productos de dese-cho y acta como vehculo para el transporte de las c-lulasbacterianasdeunlugaraotroenelinteriordelacavidad bucal y, probablemente, facilita la transferenciadepersonaapersona.Elprincipalfluidoenlacavidadbucal es el constituido por la saliva, que es esencial parala supervivencia de casi todas las biopelculas bucoden-tales,conlaexcepcindelasbiopelculasenlasreassubgingivales o reas dentro de lesiones patolgicas ta-lescomolasinfeccionesdelcanalradicularolosabs-cesosbucales.Larevisindelabibliografaexistentesugiereciertonmerodeaparentesincongruenciasin-quietantes. Por ejemplo, por trmino medio, los recuen-tos viables totales de bacterias en la saliva son de unos108por ml (13, 66, 139). La cantidad total diaria de salivasecretadahasidodiversamenteestimada:500ml(178,179), 1.000 ml (138) o 1.500 ml (32, 45). Por consiguiente,tericamente, se tragan aproximadamente 1 ! 1011bac-terias cada da. Esto se traduce en alrededor de 1 gramodepesoenmojadodeclulasbacterianas.Dedndeprocedenestasbacterias?Sehaestimadoquelamasatotal media de bacterias sobre los dientes de un indivi-duo sano es aproximadamente de 16 mg, mientras queel valor medio para los individuos con periodontitis fuede unos 83 mg (149). Se desconoce la masa y el nmerode microorganismos que colonizan los tejidos blandos.Collins y Dawes (23) midieron el rea de superficie de lacavidadbucalyencontraronquelaspiezasdentariasconstituanaproximadamenteel20 %delasuperficiedisponibleparalacolonizacinmicrobiana.Silosmi-croorganismos colonizan con la misma densidad sobrelos tejidos blandos que sobre los dientes, entonces puedeestimarse que la masa de microorganismos sobre los te-jidos blandos es cuatro veces superior a la masa de bac-terias sobre los tejidos duros, quizs, hasta un total de 400mg. Por lo tanto, se podra estimar que aproximadamente500 mg de bacterias pueden colonizar la cavidad bucal.Inclusosilamasatotalfuera1gramodebacterias,ellosugerira que la entera masa de microorganismos, por tr-minomedio,seduplicaracadada.Lostiemposdelasgeneraciones tendran que ser ms cortos si masas infe-riores de bacterias colonizaran la cavidad bucal o si ni-camente un limitado segmento de la microbiota fuera ca-pazdemultiplicarse.UnaposibleexplicacinparalasSocransky y Haffajee152% similitud (coeficiente de semejanza mnima)60 70 80 90SubgingivalSupragingivalDorso de la lenguaSalivaLaterales de la lenguaGrupo AGrupo BGrupo CPaladar duroParte ventral de lalenguaBucalSuelo de la bocaInsercin gingivalVestbulo labialFig. 12. Dendrograma de un anlisis por grupos de las pro-porciones de especies medias de las 11 zonas descritas enla figura 11. Se emple un coeficiente de semejanza mnimayunamediadeordenacindeenlacenoequilibrada. Seformaron tres grupos, considerando una semejanza > 80 %.El Grupo B fue ms semejante al Grupo C que el Grupo A.grandes cantidades de bacterias en la saliva es que stafavorezca la reproduccin bacteriana mientras las bacte-rias estn en la saliva (14, 28-30, 174). Ello es posible, peroel alto ritmo de recambio de la saliva en la cavidad bucallohaceimprobable.Sehaestimadoqueelvolumendesaliva dentro de la cavidad bucal habitualmente oscila en-tre 0,77 y 1,07 ml (81). Si la velocidad del flujo fuera, portrmino medio, de 1 ml por minuto, entonces el recam-bio de la saliva sera muy corto y la probabilidad de unamultiplicacin bacteriana en la saliva que explicara la can-tidad de bacterias observadas sera bastante escasa.Estas observaciones preparan el escenario para un con-juntodeinteresantesinterrogantes.Silavelocidaddelflujo de saliva estuviera notablemente disminuida, ques lo que pasara con los recuentos de bacterias en la sa-liva, con las microbiotas que colonizan los tejidos blan-dos y con las que colonizan las superficies duras? Por unlado, la saliva puede eliminar o limitar la cantidad de bac-terias sobre los tejidos duros y blandos y, quizs, afectea la composicin microbiana. Por el otro lado, la salivapuede proporcionar nutrientes para las especies que co-lonizan las superficies y proporcionar un medio de trans-porte de una superficie a otra, aumentando la carga bac-teriana. As pues, una disminucin de saliva podra alterarla composicin microbiana de una forma tanto benefi-ciosa como perjudicial. Los estudios sobre la xerostoma,Ecologa microbial periodontal153Recuentos ! 1050,0 2,3 4,6 6,9 9,2ActinosMoradoAmarilloVerdeNaranjaRojoOtrosDesdentadosPeriodoncio sanoPeriodontitisA. gerencseriaeA. israeliiA. naeslundii 1A. naeslundii 2A. odontolyticusV. parvulaS. gordoniiS. intermediusS. mitisS. oralisS. sanguisA. actinomycetemcomitansC. gingivalisC. ochraceaC. sputigenaE. corrodensC. gracilisC. rectusS. showaeE. nodatumF. nucleatum ss nucleatumF. nucleatum ss polymorphumF. nucleatum ss vincentiiF. periodonticumP. microsP. intermediaP. nigrescensS. constellatusT. forsythiaP. gingivalisT. denticolaE. saburreumG. morbillorumL. buccalisN. mucosaP. acnesP. melaninogenicaS. anginosusS. mutansS. noxiaT. socranskiiFig. 13. Perfilesdelosrecuentosmediosde41taxonesenmuestrasdeplacasupragingivalde28individuosconunperiodonciosano, 8conperiodontitiscrnicay18com-pletamentedesdentados. Lasmuestrasdeplacasereco-gieron del aspecto mesial de cada pieza dentaria natural oprotsica, y fueron analizadas por separado para evaluar elcontenido de 41 especies. Se obtuvo la media de los datosde cada especie en un individuo y, posteriormente, la me-dia interindividual en los tres grupos clnicos por separado.Se busc la significacin estadstica de las diferencias en-tre los grupos utilizando la prueba de Kruskal-Wallis, y sela ajust para comparaciones mltiples (157); *p < 0,05; **p 8AgAn2An1AiSgSiSmSoSsAaCgCoCspEcCgrCrCsEnFnpFnnFnvFp PmScEsGmLbPaSaSn TsNmPmeiPiPnPgTdTfAoVp12963AmarilloVerdeNaranjaRojoOtrosFig. 30. Recuentos medios (!105) de 40 especies en las mues-tras de placa subgingival de bolsas periodontales de dife-rentes profundidades en individuos con periodontitis. Es-tasmuestrasseobtuvieronde14.577zonasen588in-dividuos con periodontitis crnica en el momento inicial,y fueron analizadas para evaluar el contenido de 40 espe-cies subgingivales utilizando hibridacin de ADN-ADN endamero. Seobtuvolamediadelosrecuentosdecadaes-pecie en cada individuo en las categoras de profundidadde la bolsa de < 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y > 8 mm, y luego se ob-tuvo la media interindividual para cada categora. Las es-pecies fueron agrupadas de acuerdo con el orden de com-plejos microbianos presentado en la figura 28. La altura decadarepresentalosrecuentosmediosparacadaespecieen cada categora de profundidad de la bolsa. nicamentelas especies de los complejos rojo y naranja estuvieron sig-nificativamenterelacionadasconlaprofundidaddelabolsa, tras realizar el ajuste para comparaciones mltiples.de estas zonas. Otra posibilidad es que la persona ya tu-vieracolonizadasvariaszonasperiodontalesmssu-perficialesantesdequelaenfermedadsurgieraenal-gunas de las zonas. Cualquiera que fuera la causa de ladiferenciaenlasconcentracionesenlaszonasdepe-riodoncio sano, la presencia de mayores concentracio-nesdemicroorganismosperiodontalespatgenosenlas zonas sanas de los individuos con periodontitis cons-tituyeunimportanteaspectoquedebesertenidoencuenta en el tratamiento, tal como se ha analizado enotro artculo (65).Relacin entre los parmetrosdel anfitrin y la composicinde la biopelcula subgingivalYa se han mencionado los factores locales que afectana la composicin de la microbiota bucal: la naturaleza dela superficie que se coloniza y el estado clnico del anfi-trin Reviste importancia clnica que la placa supragin-givalysubgingivalasociadaconunazonaperiodontalsana es bastante diferente de la placa asociada con teji-dosgingivalesinflamados,sangradoalsondajeybolsasSocransky y Haffajee172Recuentos ! 1050,0 1,3 2,6 4,0 5,3ActinomycesMoradoAmarilloVerdeNaranjaRojoOtrosSAS negativoSAS positivoA. gerencseriaeA. israeliiA. naeslundii 1A. naeslundii 2A. odontolyticusV. parvulaS. gordoniiS. intermediusS. mitisS. oralisS. sanguisA. actinomycetemcomitansC. gingivalisC. ochraceaC. sputigenaE. corrodensC. gracilisC. rectusS. showaeE. nodatumF. nucleatum ss nucleatumF. nucleatum ss polymorphumF. nucleatum ss vincentiiF. periodonticumP. microsP. intermediaP. nigrescensS. constellatusT. forsythiaP. gingivalisT. denticolaE. saburreumG. morbillorumL. buccalisN. mucosaP. acnesP. melaninogenicaS. anginosusS. mutansS. noxiaT. socranskiiFig. 31. Recuentos medios (! 105) de 40 especies en mues-trasdeplacasubgingivalobtenidasdezonasquesan-graron o no sangraron durante el sondaje en individuosconperiodontitis. Lasmuestrasdeplacasubgingivalserecogieron de 6.920 zonas que sangraron durante el son-daje de profundidad y 7.656 zonas sin sangrado en el son-dajeen588individuosconperiodontitiscrnicaalco-mienzodelestudio, yseanalizaronparaevaluarelcontenido de 40 especies subgingivales utilizando hibri-dacin de ADN-ADN en damero. Se saco la media de losrecuentosdecadaespecieencadaindividuoenlaszo-nas que sangraron y en las que no sangraron durante elsondajedeprofundidad, yluegoseobtuvolamediain-terindividualparacadacategora. Lasespeciesseorde-naron segn los complejos microbianos descritos en So-cranskyycols. (156). Sedeterminlasignificacinestadstica de las diferencias entre los grupos utilizandola prueba de Mann-Whitney, y se la ajust para compa-raciones mltiples (157); *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.SAS: sangrado al sondaje.periodontales profundas. Asimismo, existen factores ni-cos para cada anfitrin que afectan considerablemente ala composicin de la placa subgingival. No se analizarnahora todos los factores del anfitrin que pueden influirsobre la composicin de la placa subgingival, pero a con-tinuacinsedescribirnlosefectosdeciertosfactoresclave, incluidos los antecedentes genticos, la obesidad yciertos hbitos como el tabaquismo sobre la composi-cin de la placa subgingival. Adems, se sugerir que lanaturalezadelamicrobiotasubgingivalpuedeestarin-fluida por la localizacin geogrfica del individuo.Segn se ha mencionado al analizar los principios delaecologamicrobiana,elanfitrinpuedemodificarlaconcentracin de especies que colonizan y, posiblemente,modular el desenlace clnico de la enfermedad, medianteunmecanismoconocidocomoretroalimentacinam-biental. En la figura 33 se ilustra un ejemplo de este me-canismo. Se obtuvieron muestras de suero y de placa sub-gingivalde48pacientesconperiodontitiscrnica.Sedeterminaronlasconcentracionessricasdeanticuer-pos anti-P. gingivalis utilizando el mtodo ELISA, y la con-centracin de este microorganismo en la placa subgin-gival, mediante las tcnicas de cultivo. Los datos indicaronuna significativa relacin inversa entre las concentracio-nes de anticuerpos anti-P. gingivalis y las concentracio-nesdeestaespecie,porejemplo,altosvaloresdeanti-cuerpos anti-P. gingivalis se asociaron a bajos valores deeste microorganismo en la microbiota subgingival. Dadala importante relacin de estas especies con la intensi-dad de la enfermedad periodontal, la disminucin de susconcentraciones por retroalimentacin ambiental debe-ra ayudar a limitar el avance de la enfermedad y a au-mentar las estrategias teraputicas.TabaquismoNumerososestudiosenlabibliografahanexami-nadolarelacinqueexisteentreeltabaquismoylosEcologa microbial periodontal173Recuentos ! 1050,0 3,2 6,5MoradoAmarilloVerdeNaranjaRojoOtrosSanoPB < 4 mm, SAS PB ! 6 mm, SAS +ActinomycesA. gerencseriaeA. israeliiA. naeslundii 1A. naeslundii 2A. odontolyticusV. parvulaS. gordoniiS. intermediusS. mitisS. oralisS. sanguisA. actinomycetemcomitansC. gingivalisC. ochraceaC. sputigenaE. corrodensC. gracilisC. rectusS. showaeE. nodatumF. nucleatum ss nucleatumF. nucleatum ss polymorphumF. nucleatum ss vincentiiF. periodonticumP. microsP. intermediaP. nigrescensS. constellatusT. forsythiaP. gingivalisT. denticolaE. saburreumG. morbillorumL. buccalisN. mucosaP. acnesP. melaninogenicaS. anginosusS. noxiaT. socranskiiFig. 32. Recuentos medios (! 105) de 40 especies subgingi-vales de las zonasyen 209 individuos con periodontitisavanzadaydelaszonasen78individuosperiodontal-mente sanos. Las zonas de periodoncio enfermo en los in-dividuos con periodontitis presentaron unas profundida-des bsales de la bolsa periodontal ! 6 mm y sangraron enelsondaje, mientrasqueenlaszonaslasprofundidadesbasales fueron < 4 mm y no sangraron durante el sondajetanto en el grupo de periodontitis como en el grupo sano.Lasmuestrasdeplacasubgingivalserecogieronalco-mienzo del estudio (basales) y se analizaron para evaluarelcontenidode40especiessubgingivalesutilizandohi-bridacin de ADN-ADN en damero. Se obtuvo la media delos recuentos de cada especie en cada individuo en una ca-tegoradezonadaday, luego, interindividualmenteparacadacategora. Lasespeciesestnordenadassegnloscomplejos microbianos descritos en Socransky y cols. (156).La tonalidad ms oscura de cada color representa a los in-dividuos con periodontitis, mientras que la tonalidad mssuave representa a los individuos sanos. Todas las especiesdifirieron de forma significativa entre los grupos utilizandola prueba de Kruskal-Wallis, incluso tras ajustar para com-paracionesmltiples(157). PB: profundidaddelabolsa;SAS: sangrado al sondaje.Todaslasespeciessediferenciabansignificativamenteentregruposinclusodespus del ajuste segn comparaciones mltiplesparmetrosclnicosdelasenfermedadesperiodonta-les. Estos estudios han indicado un mayor grado de en-fermedadperiodontalentrminosdemayorprdidadehuesoalveolar(11,56,114,123),bolsasperiodon-tales ms profundas (10, 11, 59, 126) y mayor prdidadel nivel de insercin (3, 6, 7, 12, 15, 34, 42, 57, 58, 96,97, 148) en las personas fumadoras con respecto a aque-llaspersonasquefumaronenelpasadooquenuncahanfumado.Losmismosestudiostambinindicaronque los fumadores de tabaco presentan un menor san-grado en el sondaje, en comparacin con los no fuma-dores. Si bien mltiples estudios demuestran de modoconcordante fuertes relaciones entre los datos clnicosperiodontales y el tabaquismo, el efecto del consumode tabaco sobre la composicin de la microbiota sub-gingival es menos claro. Algunos estudios sugieren quefumartabacotieneunescasoimpactosobrelacom-posicindelaplacasubgingival.Preberycols.(127),enunestudiqueincluy142pacientesconperio-dontitis del adulto, mostraron que los recuentos de A.actinomycetemcomitans, P. gingivalis y P. intermedia nofueron significativamente diferentes entre fumadores ynofumadores,sobrelabasedeunasolamuestradeplaca por individuo obtenida de una zona con una pro-fundidad de la bolsa ! 6 mm. Stoltenberg y cols. (162)evaluaron ocho muestras de placa subgingival recogi-das de un sextante posterior elegido de forma aleato-ria en cada uno de los 615 adultos participantes en elestudio.Utilizandotcnicasdeinmunoanlisis,noseencontraron diferencias significativas entre fumadoresynofumadoresenlaincidenciadelasespeciesdeprueba:A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. in-termedia, E. corrodens y F. nucleatum. En un grupo de25 jvenes adultos con gingivitis, Lie y cols. (85) no en-contraron ninguna diferencia entre fumadores y no fu-madores en los recuentos de nueve especies subgingi-valesogruposenunconjuntodemuestrasdeplacasupragingivalysubgingival,conlaexcepcindere-cuentos ms elevados de especies de Streptococcus enlosnofumadores.Renvertycols.(137)evaluaronelefecto de la terapia periodontal sobre la microbiota sub-gingival en individuos fumadores y no fumadores y su-girieronqueelcambiomicrobianopostratamientocoincida ms bien con los cambios clnicos que con lainfluencia del tabaco.Otrosestudioshanencontradodiferenciasentrelamicrobiota subgingival de las personas fumadoras y ladelasnofumadoras.Eggertycols.(40),mediantein-munoanlisis,demostraronqueP. gingivalis, P. inter-media yA. actinomycetemcomitans eranencontradasconmayorfrecuenciaenlaszonasperiodontalessu-perficiales (" 5 mm) en fumadores que en zonas simi-lares en no fumadores. Kamma y cols. (68) utilizaron lastcnicas de cultivo para examinar dos muestras de placaobtenidas de cada uno de los 60 individuos con perio-dontitis de inicio precoz. Los autores encontraron quelas proporciones y/ o la incidencia de P. micros, Campy-lobacter concisus, T. forsythia, C. rectus, Campylobactergracilis, Selenomonassputigena yP. gingivalis semos-trabansignificativamenteelevadasenlosfumadores,mientras que las especies Streptococcus intermedius, A.naeslundii, Actinomycesisraelii yEubacteriumlentumfueron significativamente ms altas en los no fumado-res. Zambon y cols. (187) encontraron que los fumado-res tenan concentraciones mucho ms altas de T. forsyt-hia y mayor riesgo de contraer la infeccin que los nofumadores. Tambin informaron que los fumadores te-nanunaprobabilidad2,3vecessuperiordealbergareste agente patgeno periodontal con respecto a los exfumadoresonofumadores,trasajustarparalagrave-daddelaenfermedad.Umedaycols.(173)encontra-ron que las personas que haban fumado en el pasadotenanmenorriesgodealbergarA. actinomycetemco-mitans en la saliva (odds ratio, cociente de posibilida-des[CP]=0,23),mientrasquelosfumadoresactivospresentaban un mayor riesgo de albergar subgingival-mente T. denticola (CP = 4,61), aunque el riesgo de co-lonizacin por T. forsythia, P. intermedia, P. gingivalis yP. nigrescens nodifirientrelosgruposdefumadores.Losdatosdenuestroestudio,queexaminaronlami-crobiotasubgingivalmediantehibridacindeADN-ADN en damero, en 124 individuos no fumadores quenuncahabanfumado,98exfumadoresy50fumado-res activos, indicaron que no hubo ninguna diferenciasignificativa en las concentraciones y proporciones delas 29 especies de prueba entre los distintos grupos defumadores (64). No obstante, la incidencia (% de zonascolonizadas) de algunas especies del complejo naranjaSocrans