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Ecologia MicrobianaDra. Ana Paula Ramos
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•Informação genética
•Replicação do DNA e elementos envolvidos
•Técnicas moleculares mais usadasIsolamento de material genético٭Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos٭
-PCR e variações, PCR em tempo real*Técnicas de amplificação do sinal
-HibridizaçõesFase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot)Fase líquida
*Técnicas para análise de seqüências-RFLP -RAPD
•Aplicações das técnicas
Objetivos da Aula:
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DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Composição do DNA e do RNA
- DNA: carrega a informação genética
- RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica
Ácidos Nucleicos são formados por “blocos de construção pareados”: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas)
fosfato e açúcar
Ligações químicas
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DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Replicação do DNA: várias enzimas
• DNA Polimerase • SSB (Single Strand Binding Protein)• Primase• Helicases • DNA ligase
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DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
– Adenina – Guanina– Citosina – Timina
– Adenina– Guanina– Citosina– Uracila
Purinas
Pirimidinas
DNA RNA
Açúcar
Desoxirribose Ribose
Fita dupla Fita simples
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DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Transcrição e Tradução (expressão gênica): dogma central
• É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir
da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma
molécula de DNA de fita dupla
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Por que métodos moleculares??
•Metodologia clássica x Métodos moleculares
-Dificuldade em recuperar as células de um sistema
•Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...)
•Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)
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Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA
Pop
ula
ção a
ser
est
ud
ad
a
Amplificação específica
Detecção específica
Análise de seqüências
Amplificação in vitro
Hibridizações
RFLP, RAPD e sequenciamen
to
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Isolamento e purificação do material genético
– Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares
• Recuperação celular: por centrifugação• Lise celular: detergentes • Desproteinização: uso de enzimas• Extração de ácidos nucléicos• Purificação de ácidos nucléicos
Métodos diferentes para amostras diferentes
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PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Desnaturação: 95°C
Anelamento: 55°C
Extensão: 72°C
Desnaturação: 95°C
Anelamento: 55°C
Extensão: 72°C
25 a 40
ciclos 25 a 40
ciclos
• Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas
– DNA molde (alvo)– Iniciadores– Nucleotídeos (dNTP’s)– Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima)– DNA polimerase– Tampão (manutenção do pH ótimo)
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REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR
Seqüência alvo
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Ciclo da PCR - etapa 1
Seqüência alvo
Seqüência alvo
DESNATURAÇÃO DO DNADESNATURAÇÃO DO DNA
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Ciclo da PCR - etapa 2
Seqüência alvo
Seqüência alvo
Iniciador 1Iniciador 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVOHIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO
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Ciclo da PCR - etapa 3
Seqüência alvo
Seqüência alvo
Iniciador 1
Iniciador 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
Polimerase
SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQTAQ DNA DNA POLIMERASE POLIMERASE
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Final do primeiro ciclo da PCR
Seqüência alvo
Seqüência alvo
DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVODUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO
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Ciclos da PCR
Desnaturação
Hibridação
ExtensãoFinal do ciclo
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1 ciclo = 2 Amplicons
2 ciclos = 4 Amplicons
3 ciclos = 8 Amplicons
4 ciclos = 16 Amplicons
5 ciclos = 32 Amplicons
6 ciclos = 64 Amplicons
7 ciclos = 128 Amplicons
No. No. No. Amplicons No. Amplicons CiclosCiclos Copias do DNA alvoCopias do DNA alvo
11 2 2
22 4 4
33 8 8
44 16 16
5 5 32 32
66 64 64
2020 1.048.5761.048.576
3030 1.073.741.8241.073.741.824
Produtos de PCR
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Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese
• Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas
• Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -)
• Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida
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• RT-PCR – Transcrição reversa• Nested-PCR – Iniciadores internos, dois “rounds” de
amplificação• PCR Multiplex – Vários iniciadores• ICC/PCR – PCR associada à cultura celular
Variações da PCR
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RT- PCR
Não segue o dogma central da biologia molecular
Não segue o dogma central da biologia molecular
Trabalhar com DNA é mais estável !Trabalhar com DNA é mais estável !
• Utilizado em estudos de expressão gênica
• Utilizado para detecção viral (vírus de RNA)
RNA Transcrição Reversa
cDNA
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Nested PCR
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Multiplex PCR
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ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR)
Amostra processada
Cultura
Crescimento / efeito citopático
Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado
RT-PCR / PCR
Eletroforese: produto específico
• Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais
• Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR
• Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR
• Volume de análise muito maior
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PCR em tempo real - quantitativo
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Diagrama de um “sinalizador” molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.
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Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.
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MÉTODO TAQMAN
•Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente.
•Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada.
•A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.
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• Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça;
• Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica
Hibridização
Utilizada para confirmação
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Hibridização
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• Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção
– Fase líquida: captura híbrida
– Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot
Hibridização
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Fase Líquida: captura híbrida
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• Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita.
Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido
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Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido
Sou
thern
e N
ort
hern
B
lot
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Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo
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• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem
• exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado
– Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos;
– Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição;
– Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não);
Análise de seqüências
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• RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting
– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado)
– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma– Uniformidade no padrão de bandas para espécies
relacionadas
Análise de seqüências
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DNA
Desnaturação a 95oCDesnaturação a 95oC
DNA
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Extensão a 72ºCExtensão a 72ºC
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400bp400bp
310bp310bp
260bp260bp
75bp75bp
Fragmentos de RAPD
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Visualização de Fragmentos de RAPD
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• Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado
• Processamento das amostras é de extrema importância
ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores
Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana
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Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos
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Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos:
• O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos;
• Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura
• Moluscos: animais filtradores concentram patógenos
Salmonella spp.
Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,
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Necessidade de diminuição de
inibidores presentes na carne
de ostras e enriquecimento da amostra em meio
de cultivo (viabilidade e aumento do
número de células)
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Análise de contaminação viral em amostras de águas:
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Método de filtração e concentração(Katayama et al., 2002)
Centriprep - Millipore
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• Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes;
• Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado
• Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido.
Problemas...
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2008-2011: MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO.
2007-2009: Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais
2007-2009: Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas..
30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense.
2009-2010: AECID: “Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo” (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos.
PROJETOS EM ANDAMENTO