第10卷 第23期 Vol.10 No.23 2017 年 12 月 December 2017

基于分子对接虚拟筛选中药丹参中的 MDM2 靶向抑制活性成分

刘军锋 1，2，姚云峰 1，昝俊峰 3，李 辉 1，陈仕红 1， 陈林霖 1，2，常 聪 1，2*

（1. 湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，武汉 430065； 2. 老年病中药新产品湖北省协同创新中心，武汉 430065；

3. 湖北中医药大学药学院，武汉 430065）

摘要：目的：在中医药理论的指导下，利用分子对接虚拟筛选技术从活血化瘀类中药丹参中发现 MDM2-p53蛋白相互作用抑制活性成分。方法：利用三维分子药物辅助设计软件 PyRx 的 Vina 模块，以 MDM2 蛋白（PDB ID：5TRF）为受体，对丹参中的小分子化合物进行虚拟筛选，并以 MDM2-p53 蛋白相互作用的高活性抑制剂

Nutlin-3 为对照，发现 MDM2 靶向抑制活性成分。结果：从丹参已探明的 202 种成分中，共发现二氢丹参酮Ⅰ、

二氢丹参内酯、丹参螺缩酮内酯、丹参新醌 d 和次甲丹参醌 5 个单体化合物能够与 MDM2 蛋白形成较稳定的

复合物，可能成为 MDM2 抑制剂的小分子化合物。结论：本研究通过将现代计算机虚拟筛选技术与传统中医

药理论结合，发现了活血化瘀类中药丹参在 MDM2-p53 蛋白相互作用位点的抗肿瘤活性成分，有助于阐释其

可能存在的抗肿瘤药效物质基础与作用机理。 关键词：中药学其他学科；活性成分；虚拟筛选；分子对接；丹参；MDM2-p53 蛋白相互作用 中图分类号：[R932] 文献标识码：A 文章编号：1674-2850(2017)23-2649-06

Identify active components as MDM2 antagonists from Radix Salviae based on molecular docking-based virtual screening

LIU Junfeng1, 2, YAO Yunfeng1, ZAN Junfeng3, LI Hui1, CHEN Shihong1, CHEN Linlin1, 2, CHANG Cong1, 2

(1. Key Laboratory of Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, Ministry of Education, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China;

2. New Products of TCM Senile Diseases Co-Innovation Center of Hubei, Wuhan 430065, China;

3. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

Abstract: Objective: According to traditional Chinese medical principles, we attempted to identify MDM2-p53 protein-protein interaction antagonists from herbal medicine Danshen (Radix Salviae) of blood-activating and stasis-resolving using molecular docking-based virtual screening techniques. Methods: A structure-based pharmacophore search and docking simulation were carried out targeting MDM2 protein (PDB ID: 5TRF) using Vina modular of PyRx to filter small molecule compounds in Danshen. And then novel scaffolds inhibiting MDM2-p53 protein-protein interaction were found using potent MDM2-p53 protein-protein interaction antagonist Nutlin-3 as control. Results: Among the 202 proven constituents of Danshen, 5 compounds, dihydrotanshinone I, dihydrotanshinlactone, danshenspiroketallactone, dan-shexinkum d and methylenetanshinquinone could form more stable compound with MDM2 protein, which were identified as potential MDM2 antagonists. Conclusion: In this paper, computer aided molecular virtual docking technology was combined with traditional Chinese

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究计划重点项目（D20142003） 作者简介：刘军锋（1977—），男，副教授，主要研究方向：中药及制剂药效物质基础、中药资源与开发利用. E-mail: liujf456@hotmail.com

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medicine theory to explore and identify anti-cancer active compounds in Danshen targeting MDM2-p53 protein-protein interaction. It helps to explain the chemical material basis and mechanisms of anti-tumor efficacy of herbal medicine Danshen. Key words: other subjects of traditional Chinese pharmacology; active constituent; virtual screening; molecular docking; Radix Salviae; MDM2-p53 protein-protein interaction

0 引言 在自然环境持续恶化、老年人口比重逐年加大和不良生活习惯等多种因素的共同影响下，恶性肿瘤

的发生率呈逐年上升趋势，已成为严重威胁人类健康的重大难治疾病之一。现代研究证实，癌症是一种

基因病，是人体细胞在外环境因素作用下，内在多种前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段长期演变

过程[1]。p53 是迄今为止研究最透彻、功能最强大的肿瘤抑制基因。研究显示，50%以上的恶性肿瘤会出

现 p53 基因的突变[2~3]。MDM2（murine double minute 2）蛋白可与 p53 蛋白结合，通过阻断其传导通路、

将 p53 蛋白向细胞核外转移及促进 p53 蛋白的降解 3 个途径可使其失活。因此，1996 年 MDM2-p53 蛋

白组共结晶图谱被成功解析[4]后，运用非多肽类小分子化合物干扰 MDM2 与 p53 蛋白组的特异性结合，

从而释放内生性 p53 以清除癌细胞的抗癌策略受到世界各国新药研发机构和制药企业的关注[5~6]。 气血瘀阻，积久蕴毒，损伤五脏，可能导致恶性肿瘤的发生；而活血化瘀类中药，能缓解血液高度

凝集状态，消除瘀滞、畅通血脉，因此中医临床常用这类中药配伍治疗肿瘤[7~8]。活血化瘀类临床常用中

药丹参（Radix Salviae），又名赤参、红根等，为唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，

具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，常用于胸痹心痛、脘腹胁痛、瘕瘕积聚、热痹

疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛。《神农本草经》记载，丹参“味苦，微寒，无毒……

主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚；破症除瘕，止烦满，益气”；陶弘景在《名医别录》中说，丹

参“养血，去心腹痼疾结气，腰脊强，脚痹；除风邪留热，久服利人”；《日华本草》曰，丹参“养神定

志，通利关脉；治冷热劳，骨节疼痛，四肢不遂；排脓止痛，生肌长肉；破宿血，补新生血；安生胎，

落死胎；止血崩带下，调妇人经脉不匀，血邪心烦；恶疮疥癣，瘿赘肿毒，丹毒；头痛，赤眼，热温狂

闷”；孟诜曾在《必效方》中用丹参配白芷、芍药等分，咀，以醋腌一夜，猪脂半斤，微火煎成膏，敷贴

而治乳痈……可见，在中医临床上用丹参配伍治疗肿瘤类疾病，自古即验。现代研究显示，临床常用的

具有抗肿瘤疗效的活血化瘀药包括川芎、丹参、莪术、牛膝等[9]。 本文以 MDM2 蛋白为受体，以活血化瘀药丹参的已知成分构建的小分子化合物库为配体，运用分子

对接虚拟筛选技术，从中筛查 MDM2-p53 蛋白相互作用的活性抑制剂，从而阐释丹参用于肿瘤类疾病治

疗的药效物质基础。

1 材料 1.1 软件

由美国斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）的 Olson 实验室开发与维护的 AutoDock Vina、AutoDock Tools（ADT）、Raccoon 和 PyRx[10]；由 Warren Lyford DeLano 创建的蛋白三维图形软件

PyMol（http://www.pymol.org/）.

1.2 数据库

TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology）数据库（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp. php）；PDB（Protein Data Bank）蛋白数据库（http://www.rcsb.org）。

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1.3 中药

本文选择活血化瘀类中药丹参，以其已知成分构建小分子化合物库，入库化合物总计 202 个。

2 方法 2.1 小分子化合物库的建立

本文从 TCMSP 数据库中获取丹参的小分子化合物结构的 MOL2 格式文件，并采用 Raccoon 软件进

行批量处理，保存为 PDBQT 格式文件构建小分子化合物数据库。

2.2 蛋白受体的准备

从 PDB 蛋白数据库中下载 MDM2 蛋白与其抑制剂 SAR405838 的复合物（PDB ID：5TRF），此复合

物包含 5 条链，分离、选取 chain D 为对接受体。在进行虚拟对接前，利用 ADT 程序进行去掉配体、去

水、加氢、加电荷等操作，并保存为 PDBQT 格式文件。

2.3 虚拟筛选

利用 PyRx 软件的 Vina 模块实施虚拟筛选，以 5TRF 蛋白的 7HC 配体为活性中心，设置对接中心、

对接范围。虚拟对接完成后，按照各个小分子化合物与蛋白受体对接的结合能大小，由低到高排序。

2.4 抑制活性对照

顺式咪唑啉类 Nutlin-3 是 MDM2 蛋白的高活性抑制剂，它通过与 MDM2 结合，抑制 MDM2 和 p53的相互作用，从而激活 p53，诱导细胞凋亡，并发挥抗肿瘤作用[11~12]。本文以 Nutlin-3 为对照配体，在

上述条件下利用 PyRx 软件的 Vina 模块实施虚拟对接。

3 结果 3.1 结合能分析

选取对接结合能排名前 25 的小分子化合物，并利用“利宾斯基五原则（Lipinski’s rule of five）”进行筛

选[13~15]，选出 10 种高活性化合物，如表 1 所示。同时进行虚拟对接的对照配体 Nutlin-3，其结合能为 −8.1 kcal/mol（1 kcal=4.185 J），而 10 种小分子结构的对接结合能均小于 Nutlin-3，说明这些小分子化合

物均能与 MDM2 蛋白受体形成稳定的复合物，达到一定的抑制效果。

表 1 筛选出的结合能小于−8.1 kcal/mol 的前 10 个高活性化合物 Tab. 1 Screening of top 10 high potency compounds with the binding energy below −8.1 kcal/mol

化学名 InChiKey 结合能/(kcal/mol)

二氢丹参内酯（dihydrotanshinlactone） ABYLBRBPUQGWOU-JTQLQIEISA-N −9.2

丹参新醌 d（dan-shexinkum d） LOLTUKHHUOCHAV-LAJNKCICSA-N −8.9

丹参螺缩酮内酯（danshenspiroketallactone） RHNCMDZNEAIYJX-ADLMAVQZSA-N −8.9

次甲丹参醌（methylenetanshinquinone） QDFFAXSMLUUJSG-UHFFFAOYSA-N −8.7

紫丹参萜醚 a（przewalskin a） ZWMNXVIUPFQWFJ-QTEQDKRBSA-N −8.7

剑麻皂苷元（tigogenin） GMBQZIIUCVWOCD-DSGQTALYSA-N −8.6

丹参新醌 b（dan-shexinkum b） XUJXNYAIAKCUMO-UHFFFAOYSA-N −8.6

二氢丹参酮 I（dihydrotanshinone I） HARGZZNYNSYSGJ-SNVBAGLBSA-N −8.6

异丹参酮 I（isotanshinone I） XYKZSUXWBGUGQV-UHFFFAOYSA-N −8.6

丹参内酯（tanshilactone） VDYMGLBSIBHGCP-UHFFFAOYSA-N −8.6

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3.2 药物数据分析

口服生物利用度（OB）是指药物经口服给药后吸收进入全身血液循环的相对量，OB 值越高说明口

服吸收越好（OB≥30%为口服吸收较好）[16]。Caco-2 细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，其结构和功

能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可以用来模

拟体内肠转运的实验，Caco-2 数值越高说明肠转运效果越好。血脑屏障能够阻止某些药物进入脑组织，

BBB 数值反映药物透过血脑屏障的能力：BBB＜−0.3 的化合物被认为是非穿透性，−0.3≤BBB≤0.3 为中

度穿透，BBB＞0.3 为强穿透[17]。类药性（drug-likeness，DL）指化合物与已知药物的相似性，用于评估

一个化合物成为药物的可能性；化合物的 DL 标准为 0.18，也以此来判断中药中的成分（需要 DL≥0.18）[18]。 由表 2 可知，根据 OB 进行排序，有 4 种小分子的 OB 值低于 30%，其生物利用度较差；紫丹参萜

醚 a 的 Caco-2 和 BBB 数值均较低，即该分子很难经肠吸收，也难以透过血脑屏障发挥作用。综合分析

10 个对接结合能排名靠前的丹参源小分子化合物的 OB、Caco-2 和 BBB 等参数，最终优选出 5 个高活性

化合物，提取出它们与靶蛋白 MDM2 虚拟对接后结合能最低的结合模式图例，并确定了参与分子间相互

作用的氢键；它们的结构式及其对应的结合模式如图 1 所示。 表 2 化合物性质数据表

Tab. 2 Data sheet of compound properties

化学名 OB/% Caco-2 BBB DL

丹参螺缩酮内酯 50.431 0.876 0.506 0.306 70

二氢丹参酮 I 45.043 0.955 0.425 0.360 15

丹参新醌 d 38.883 0.671 −0.149 0.554 53

二氢丹参内酯 38.685 1.259 0.807 0.322 27

紫丹参萜醚 a 37.107 −0.263 −0.694 0.649 01

次甲丹参醌 37.073 1.033 0.458 0.360 17

异丹参酮 I 29.719 1.008 0.186 0.361 38

丹参内酯 25.106 1.264 0.748 0.324 43

丹参新醌 b 21.671 0.831 0.182 0.259 55

剑麻皂苷元 14.086 0.866 0.313 0.807 46

图 1 优选的 5 个高活性化合物的结构式及其与 MDM2 靶蛋白的最优结合模式

Fig. 1 Constitutional formulas of 5 high potency compounds and their best binding mode with MDM2 target protein

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3.3 中药材分析

丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎。目前对丹参的抗肿瘤研究较多，有研究表明，丹参的酮类、

内脂等成分有较高的抗肿瘤活性[19~20]。在本文分子对接实验中发现，丹参中的二氢丹参酮 I、二氢丹参

内酯、丹参螺缩酮内酯、丹参新醌 d 和次甲丹参醌能够与 MDM2 蛋白形成较稳定的复合物，抑制 MDM2活性，产生一定的抗肿瘤效果。

4 结论 分子对接技术是最近十几年发展起来的一种计算机应用技术，利用该技术进行药物虚拟筛选，有助

于阐释中药的活性成分和药效物质基础，选出一些对应靶点的潜在药物分子。利用此技术，能为实验者

节省大量的财力、精力和时间，所获得的结果需进一步结合细胞与分子生物学实验研究、模型动物研究

验证其活性。 本文通过将现代计算机虚拟筛选技术与传统中医药理论结合，研究、发现活血化瘀类中药丹参在

MDM2-p53 蛋白相互作用位点的抗肿瘤活性成分，有助于阐释其可能存在的抗肿瘤药效物质基础与作用

机理。本研究对临床常用中药丹参所含的已知小分子化合物进行分子对接与虚拟筛选，并综合结合能、

“利宾斯基五原则”和这些小分子化合物本身的特性进一步优化结果，最终共发现 5 种可能成为 MDM2抑制剂的小分子化合物。本研究的基本原理为虚拟对接技术中的“为锁配钥匙”原理，亦即将备选的配

体小分子化合物逐一与标靶分子的活性位点对接，并凭借最低结合能评分函数筛选出接近配体分子天然

构象，且与受体蛋白亲和力最优的配体及其结合模式。该方法的局限性在于，未能综合考虑配体分子和

标靶分子活性位点区域氨基酸残基的柔性位移，以及由此导致的分子构象变化和结合模式差异。因此，

在后续研究工作中，将适度增加标靶蛋白 MDM2 的源数据来源，借此验证虚拟对接评分参数，获得更准

确、可靠的筛选结果。 [参考文献] (References)

[1] HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[2] CHENG Q, CHEN L, LI Z, et al. ATM activates p53 by regulating MDM2 oligomerization and E3 processivity[J]. The

EMBO Journal, 2009, 28(24): 3857-3867.

[3] 李小龙，高明. p53 与 MDM2 及 MDMX 的相互作用和研究进展[J]. 中国肿瘤临床，2012，39（15）：1123-1126.

LI X L, GAO M. Interplay among p53, MDM2, and MDMX and progress in related studies[J]. Chinese Journal of Clinical

Oncology, 2012, 39(15): 1123-1126. (in Chinese)

[4] 陈红，谢丽，刘宝瑞. MDM2 作为肿瘤标志物的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志，2011，16（8）：751-754.

CHEN H, XIE L, LIU B R. Clinical significance of MDM2 as a tumor biomarker[J]. Chinese Clinical Oncology, 2011, 16(8):

751-754. (in Chinese)

[5] KUSSIE P H, GORINA S, MARECHAL V, et al. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor

transactivation domain[J]. Science, 1996, 274(5289): 948-953.

[6] GANGULI G, WASYLYK B. p53-independent functions of MDM2[J]. Molecular Cancer Research, 2003, 1(14): 1027-1035.

[7] 申东艳，陈美婉，王胜鹏，等. 抗肿瘤中药新型药物传递系统的研究（二）：活血化瘀类中药[J]. 世界科学技术—中医

药现代化，2013，15（1）：34-38.

SHEN D Y, CHEN M W, WANG S P, et al. Progress in novel drug delivery systems of anti-tumor traditional Chinese

medicine: blood-activating and stasis-resolving Chinese medicine[J]. World Science and Technology-Modernization of

Traditional Chinese Medicine, 2013, 15(1): 34-38. (in Chinese)

第10卷 第23期

2017 年 12 月 刘军锋等：基于分子对接虚拟筛选中药丹参中的 MDM2 靶向抑制活性成分 2654

[8] 姜林，孔庆志. 活血化瘀药抗肿瘤作用的实验研究概况[J]. 湖北中医杂志，2008，30（8）：63-64.

JIANG L, KONG Q Z. An overview of experimental research on the antitumor effect of blood-activating and stasis-resolving

Chinese medicine[J]. Hubei Journal of Traditional Chinese Medicine, 2008, 30(8): 63-64. (in Chinese)

[9] 魏长志，屈岭，寇天芹. 抗肿瘤中药集锦[M]. 北京：中医古籍出版社，2010.

WEI C Z, QU L, KOU T Q. Anti-tumor Chinese medicine collection[M]. Beijing: Traditional Chinese Medicine Publisher,

2010. (in Chinese)

[10] TROTT O, OLSON A J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient

optimization, and multithreading[J]. Journal of Computational Chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

[11] 李玉梅，吴穷，秦叔逵，等. MDM2 在恶性肿瘤中的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志，2012，17（3）：277-280.

LI Y M, WU Q, QIN S K, et al. Research progress of murine doubleminute 2 gene in maligance[J]. Chinese Clinical Oncology,

2012, 17(3): 277-280. (in Chinese)

[12] 王莉，邬黎青. Nutlins 在肿瘤治疗中的作用机制及其研究进展[J]. 实验与检验医学，2013，31（1）：39-42.

WANG L, WU L Q. The mechanism and advances of Nutlins in tumor treatment[J]. Experimental and Laboratory Medicine,

2013, 31(1): 39-42. (in Chinese)

[13] LIPINSKI C, HOPKINS A. Navigating chemical space for biology and medicine[J]. Nature, 2004, 432(7019): 855-861.

[14] LIPINSKI C A, LOMBARDO F, DOMINY B W, et al. Experimental and computational approaches to estimate solubility and

permeability in drug discovery and development settings[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, 46(1-3): 3-26.

[15] 韩春艳，李燕，刘刚. 类药性：预测与实践[J]. 化学进展，2008，20（9）：1335-1343.

HAN C Y, LI Y, LIU G. Drug-likeness: predication and practice[J]. Progress in Chemistry, 2008, 20(9): 1335-1343.

(in Chinese)

[16] XU X, ZHANG W, HUANG C, et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J].

International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(6): 6964-6982.

[17] TATTERSALL M H, SODERGREN J E, DENGUPTA S K, et al. Pharmacokinetics of actinoymcin D in patients with

malignant melanoma[J]. Clin. Pharmacol. Ther., 1975, 17(6): 701-708.

[18] TAO W, XU X, WANG X, et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of

Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013,

145(1): 1-10.

[19] 张伟伟，陆茵. 丹参抗肿瘤活性成分研究新进展[J]. 中国中药杂志，2010，35（3）：389-391.

ZHANG W W, LU Y. Advances in studies on antitumor activities of compounds in Salvia miltiorrhiza[J]. China Journal of

Chinese Materia Medica, 2010, 35(3): 389-391. (in Chinese)

[20] 郝文慧，赵文文，陈修平. 丹参酮类抗肿瘤作用与机制研究进展[J]. 中国药理学通报，2014，30（8）：1041-1044.

HAO W H, ZHAO W W, CHEN X P. Research progress on the anti-cancer effect and mechanisms of the natural

tanshinones[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2014, 30(8): 1041-1044. (in Chinese)