Bioquímica Experimental I
Departamento de Química e Bioquímica
Licenciatura em Bioquímica
Docente: Marta Silva
Trabalho realizado por:
Alexandra Salvado, nº 40267
Andreia Sousa, nº 40261
Telmo Paiva, nº 40243
PL 3
7 de Novembro
Ano Lectivo 2011/2012
Cromatografia
de Exclusão
Molecular
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Índice
Resumo ......................................................................................................................... 3
Material e Métodos ....................................................................................................... 4
Resultados e Discussão ................................................................................................. 5
Cromatogramas ou gráficos de eluição das separações realizadas .............................. 5
#1. Absorvência a 620 nm do azul de dextrano em função do volume de eluição ... 5
#2. Absorvência da mistura padrão + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280 nm ..... 8
#3. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do volume
de eluição ............................................................................................................ 17
Discussão global dos resultados obtidos .................................................................. 20
Conclusão ................................................................................................................... 24
Bibliografia ................................................................................................................. 25
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Resumo
Este trabalho experimental teve como objectivo ilustrar os princípios de
separação de uma mistura de proteínas globulares durante a realização de uma
cromatografia de exclusão molecular (também designada como cromatografia de
filtração em gel).
Inicialmente, empacotou-se a coluna com gel Sephadex G-100 obtendo-se uma
coluna de separação com 39 cm de altura e 0,65 cm de raio (ao que corresponde um
volume total de 51,76 mL). Depois da montagem da coluna, aplicaram-se as misturas
que se pretendia separar por esta técnica.
À mistura padrão e à amostra desconhecida foram adicionados 200µL de azul de
dextrano (Mr=2000 Da). Como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento
entre os 8 e 80 kDa, o azul de dextrano vai ser totalmente excluído pelas partículas do
gel, pelo que o seu volume de eluição vai corresponder ao volume morto da coluna.
Conhecendo o volume morto da coluna e o seu volume total foi possível calcular o
coeficiente de distribuição Kav para cada componente, retirando o seu volume de eluição
do respectivo cromatograma. O Kav obtido para o azul de dextrano foi , para o
BSA foi , para a mioglobina foi , para o cromato de potássio
e para a amostra desconhecida foi
Através dos Kav do BSA, da mioglobina e do cromato de potássio e das suas
massas moleculares relativas conhecidas, obteve-se uma recta de calibração com
equação:
Da equação anterior retirou-se o valor da massa molecular relativa da amostra
desconhecida, que foi 19670 Da, que não correspondeu a nenhuma das massas
moleculares relativas da amostra padrão devido a erros experimentais e à utilização de
uma recta de calibração. Como qualquer dos erros mencionados aumentam o tempo de
retenção da proteína, a massa molecular obtida é inferior à massa molecular real da
proteína. Por comparação com os componentes da mistura padrão, estimou-se que a
amostra desconhecida era BSA.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Material e Métodos
Neste trabalho laboratorial foi seguido o protocolo experimental à excepção de
alguns casos a seguir identificados:
Só foi preparada uma mistura padrão e não duas, sendo esta composta por:
7,5 mg mL-1
Albumina sérica bovina (BSA)
5 mg mL-1
Mioglobina Amostra Padrão
2 mg mL-1
K2CrO4
4 mg mL-1
Azul de dextrano
Não se procedeu à aplicação isolada do azul de dextrano, visto que este foi
adicionado tanto à mistura padrão como à solução desconhecida.
A aplicação da mistura padrão foi de 600µL e não de 500µL como referido no
protocolo.
À amostra desconhecida (300 µL) foi adicionado 200 µL azul de dextrano 4
mg/mL.
Apenas se traçou o espectro de absorção do azul de dextrano.
A absorvência da mistura padrão foi medida a 280, a 410 e a 620 nm. A
absorvência da amostra padrão foi medida a 280 e a 620 nm.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Resultados e Discussão
Cromatogramas ou gráficos de eluição das separações realizadas
#1. Absorvência a 620 nm do azul de dextrano em função do volume de
eluição
Na aplicação das misturas na coluna, não se aplicou a amostra de azul de
dextrano isoladamente, pelo que, para realizar o cromatograma do azul de dextrano se
considerou as duas outras aplicações: azul de dextrano + amostra desconhecida e azul
de dextrano + mistura padrão.
O traçado do cromatograma do azul de dextrano permite calcular o volume
morto, ou de exclusão, da coluna. Este volume corresponde ao volume total do espaço
que rodeia as partículas do gel. Como o azul de dextrano apresenta uma massa
molecular na ordem dos 2000 kDa e como o gel utilizado apresenta a sua gama de
fraccionamento entre os 8 e 80 kDa, este vai ser totalmente excluído pelas partículas do
gel. Esta exclusão é observada visivelmente devido à cor azul do composto utilizado.
Quadro 1. Valores de absorvência obtida e considerada para amostra padrão e
desconhecida de azul de dextrano.
Resultados Obtidos Resultados Considerados
Veluição (mL)
Abs620
Mistura
Padrão
Abs620
Amostra
Desconhecida
Abs620
Mistura
Padrão
Abs620
Amostra
Desconhecida
1 0,000 -0,005 0,000 0,000
2 0,028 0,128 0,028 0,128
3 -0,010 0,018 0,000 0,018
4 0,060 0,016 0,060 0,016
5 0,002 -0,003 0,002 0,000
6 0,001 0,082 0,001 0,082
7 0,003 0,031 0,003 0,031
8 0,078 0,213 0,078 0,213
9 0,098 0,386 0,098 0,386
10 0,014 0,288 0,014 0,288
11 0,016 0,077 0,016 0,077
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Figura 1. Cromatograma de absorvência a 620 nm do azul de dextrano na mistura
padrão e na amostra desconhecida
Como se pode observar pela figura anterior (Figura 1), registou-se um máximo de
absorvência para o azul de dextrano aos 9 mL de eluição, a uma absorvência de 620 nm
(Abs620 = 0,098). O azul de dextrano tem uma massa molecular bastante elevada, como
já foi dito e, por isso, não conseguiu penetrar nos poros do gel, sendo o primeiro
composto a ser eluído.
Em todos os ensaios realizados, verificou-se um máximo de absorção para este
composto também aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de dextrano
absorve, de facto, aos 620 nm e aos 280 nm, traçou-se um espectro de absorção desta
solução, entre os 200 nm e os 700 nm.
0,0000,0200,0400,0600,0800,1000,1200,1400,1600,1800,2000,2200,2400,2600,2800,3000,3200,3400,3600,3800,4000,420
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abso
rvên
cia
a 620 n
m
Volume de Eluição /mL
Absorvência a 620 nm do Azul de Dextrano na Mistura Padrão e
na Amostra Desconhecida
Azul Dextrano (Mistura
Padrão)
Azul Dextrano (Amostra
desconhecida)
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Figura 2. Espectro de absorção do azul de dextrano.
No espectro obtido, traçado entre 200 e 700 nm observam-se então dois
máximos de absorção. Esses máximos são, aproximadamente, aos 280 e aos 620 nm, tal
como esperado. No entanto, seria esperado que o máximo aos 620 nm fosse superior ao
máximo a 280 nm. O que influência as absorvências medidas para as fracções, como
exemplo, para a fracção 9, volume de eluição 9 mL, registou-se um máximo de
absorção aos 620 nm, o valor da absorvência obtido foi de 0,098 enquanto para o
mesmo volume de eluição, a 280 nm o valor obtido foi de 0,499.
Como já foi dito anteriormente, o objectivo da eluição do azul de dextrano é o
de determinar o volume morto da coluna cromatográfica. Este composto vai ser o
primeiro a ser eluído uma vez que não consegue penetrar nos poros do gel devido à sua
grande massa molecular, sendo assim o valor de Kav deste composto é igual a 0.
O volume morto da coluna, Vm, corresponde, então ao volume de eluição do
azul dextrano que é 9 mL.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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#2. Absorvência da mistura padrão + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280
nm
Tal como explicado no procedimento, aplicou-se uma mistura de azul de
dextrano com a mistura padrão. Procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das
fracções recolhidas e traçou-se o respectivo cromatograma.
Quadro 2. Valores de absorvência obtidos durante a eluição da mistura com o azul de
dextrano e considerados na construção do cromatograma
Veluição
(mL)
Resultados obtidos Resultados considerados
Cor Composto Absorvência Absorvência
620
nm
410
nm
280
nm
620
nm
410
nm 280 nm
1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -
Azul
Dextrano
2 0,028 0,019 0,016 0,028 0,019 0,016 -
3 -0,010 0,010 0,010 0,000 0,010 0,010 -
4 0,060 0,088 0,085 0,06 0,088 0,085 -
5 0,002 0,007 0,004 0,002 0,007 0,004 -
6 0,001 0,002 0,003 0,001 0,002 0,003 -
7 0,003 0,003 0,008 0,003 0,003 0,008 -
8 0,078 0,035 0,308 0,078 0,035 0,308 Azul
9 0,098 0,049 0,499 0,098 0,049 0,499 Azul
10 0,014 0,026 0,233 0,014 0,026 0,233 Azul claro
11 0,016 0,077 0,189 0,016 0,077 0,189 -
12 0,120 0,243 0,227 0,120 0,243 0,227 Amarelo claro
BSA e
Mioglobina
13 0,014 0,300 0,134 0,014 0,3 0,134 Amarelo claro
14 0,017 0,513 0,156 0,017 0,513 0,156 Amarelo
15 0,022 0,813 0,204 0,022 0,813 0,204 Amarelo
16 0,066 0,936 0,275 0,066 0,936 0,275 Amarelo
17 0,034 1,067 0,267 0,034 1,067 0,267 Amarelo
18 0,023 0,935 0,208 0,023 0,935 0,208 Amarelo
19 0,018 0,732 0,164 0,018 0,732 0,164 Amarelo
20 0,015 0,610 0,147 0,015 0,610 0,147 Amarelo claro
21 0,010 0,414 0,139 0,01 0,414 0,139 Amarelo claro
22 0,008 0,334 0,223 0,008 0,334 0,223 Amarelo claro
23 0,007 0,356 0,514 0,007 0,356 0,514 Amarelo claro
K2CrO4
24 0,004 0,396 0,934 0,004 0,396 0,934 Amarelo
25 0,003 0,486 1,399 0,003 0,486 1,399 Amarelo
26 0,002 0,451 1,385 0,002 0,451 1,385 Amarelo
Cromatografia de Exclusão Molecular
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27 0,003 0,367 1,125 0,003 0,367 1,125 Amarelo
K2CrO4
28 0,002 0,214 0,625 0,002 0,214 0,625 Amarelo
29 0,002 0,132 0,354 0,002 0,132 0,354 Amarelo claro
30 0,001 0,093 0,241 0,001 0,093 0,241 Amarelo claro
31 0,010 0,103 0,210 0,001 0,103 0,210 Amarelo claro
32 0,001 0,062 0,163 0,001 0,062 0,163 Amarelo claro
33 0,001 0,049 0,129 0,001 0,049 0,129 Amarelo claro
34 0,002 0,045 0,119 0,002 0,045 0,119 -
35 0,002 0,038 0,101 0,002 0,038 0,101 -
36 0,002 0,035 0,087 0,002 0,035 0,087 -
Figura 3. Cromatograma da eluição da mistura de mistura de azul de dextrano com a
mistura padrão.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
1,100
1,200
1,300
1,400
1,500
1,600
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Abso
rvên
cia
Volume de Eluição /mL
Absorvência da Mistura Padrão com Azul de Dextrano a 620, 410 e
280 nm
Absorvência a 620 nm
Absorvência a 410 nm
Absorvência a 280 nm
Cromatografia de Exclusão Molecular
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De forma a determinar quais os comprimentos de onda a que se deve monitorizar
as diferentes separações realizadas é necessário traçar o espectro de absorção de cada
um dos componentes que constituem a mistura, determinando a que comprimento de
onda corresponde o seu máximo de absorção. É, então, a este comprimento de onda que
se devem efectuar as leituras de absorvência das fracções que contêm o composto em
questão.
Assim, os comprimentos de onda usados para realizar as leituras de absorvência
das fracções eluídas correspondem ao comprimento de onda máximo para cada um dos
compostos que constituem a mistura.
Sabendo que o azul de dextrano foi o primeiro composto a ser eluído (por
apresentar maior massa molecular, poderá afirmar-se que o primeiro pico do
cromatograma corresponderá ao azul de dextrano e, assim, o máximo de absorção do
azul de dextrano ocorrerá aos 620 nm. Para além disto, nas fracções que, possivelmente,
conteriam azul de dextrano, observa-se também um pico de absorção ao comprimento
de onda de 280 nm. Estes factos são comprovados, tal como explicado anteriormente,
quando se observa o espectro de absorção do azul de dextrano e se distinguem dois
picos de absorção, um perto dos 280 nm e outro próximo dos 620 nm.
Relativamente aos outros compostos constituintes da mistura padrão (BSA,
mioglobina e K2CrO4), pode supor-se que estes terão o seu máximo de absorção ao
comprimento de onda de 410 nm. Esta conclusão deve-se ao facto de se observarem
picos de absorvência correspondentes a estes compostos quando se lê a absorvência (das
fracções que se supõe que as contenham) a este comprimento de onda.
Pelas razões atrás mencionadas, para a mistura do azul de dextrano com a
amostra padrão A efectuaram-se leituras de absorvência aos comprimentos de onda de
280, 410 e 620 nm.
Para interpretar o cromatograma obtido é necessário, em primeiro lugar, ter em
conta que o tamanho e a forma das moléculas são os factores dominantes em todo o
processo de separação. Portanto, moléculas com maior massa molecular relativa e com
maior raio de Stokes não penetram nos poros do gel e, como tal, são as primeiras a ser
eluídas.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Conhecendo a massa molecular de cada um dos compostos que constituíam a
mistura aplicada na coluna cromatográfica, facilmente se pode prever a ordem de
eluição de cada um delas:
1º composto a ser eluído: Azul de Dextrano
2º composto a ser eluído: BSA
3º composto a ser eluído: Mioglobina
4º composto a ser eluído: K2CrO4
Procede-se, então, à análise do cromatograma de forma a comprovar os
pressupostos explicitados anteriormente.
Pela análise da absorvência medida a 620 nm, observa-se um pico (mais
saliente) correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico corresponde à eluição do
maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava, foi o primeiro composto a
ser eluído. No entanto, tal como referido anteriormente, o azul de dextrano também
absorve radiação a 280 nm, pelo que o pico que se observa a este comprimento de onda
para o mesmo volume (9 mL) corresponde também à eluição deste composto. Assim,
conclui-se que o raio de Stokes do Azul de Dextrano é superior ao diâmetro dos poros
do gel, pelo que este não tem capacidade de penetrar neste último, tal como referido
anteriormente.
Relativamente à curva que corresponde à absorvência medida a 410 nm, esta vai
dar-nos informação acerca da segunda e da terceira proteínas eluídas, a BSA e a
mioglobina. Na fracção correspondente a 17 mL eluídos detecta-se a presença de um
pico relativamente elevado de absorvência. Este pico corresponde à eluição da BSA, tal
como esperado. No entanto, observa-se que se trata de um pico com uma largura
bastante elevada, permitindo inferir que, a este volume, a BSA não foi a única proteína
eluída, tendo sido eluída juntamente com a mioglobina. Sabe-se que a mioglobina
possui menor massa molecular, quando comparada com a BSA logo, seria de esperar
que esta tivesse ficado retida por mais tempo nos poros do gel, sendo-se recolhido
apenas BSA a este volume de eluição. No entanto isto não aconteceu, dado que a
Cromatografia de Exclusão Molecular
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mioglobina poderá ter sido arrastada durante a eluição da BSA, tendo-se recolhido BSA
(em maior quantidade) e um pequeno volume de mioglobina.
Continuando a seguir o cromatograma ao nível da absorvência a 410 nm,
detecta-se um novo e último pico de absorvência (menor que o anterior) a um volume
de eluição de, aproximadamente, 25 mL. Conclui-se, então, que este pico corresponde à
eluição do restante (e maior) volume de mioglobina que terá ficado retido na coluna
após a eluição do volume inicial acoplado à eluição da BSA, o que comprova a
diminuição da altura deste pico relativamente ao anterior. Este dado encontra-se de
acordo com o esperado, uma vez que a mioglobina possui menor massa molecular que a
BSA e, desta forma menor raio de Stokes.
No que diz respeito à curva da absorvência medida a 280 nm, é de salientar,
essencialmente, a observação de dois picos a 9 e a 25 mL, respectivamente. O primeiro
corresponde à eluição do Azul de Dextrano, tal como referido, enquanto que o segundo
pico corresponde à eluição do K2CrO4. De facto, este composto é aquele que apresenta
menor massa molecular, pelo que faz todo o sentido que seja aquele que permanece
retido nos poros do gel durante mais tempo e, como tal, é o último a ser eluído. Apesar
disso, analisando o cromatograma, conclui-se que é eluído, praticamente, em simultâneo
com a mioglobina nas fracções próximas dos 25 mL, ainda que em maior volume e em
mais fracções que esta última.
No geral conclui-se que a ordem de eluição verificada experimentalmente
correspondeu àquela que era suposto, sendo que o azul de dextrano foi aquele que
permaneceu menor tempo na coluna (não foi retido pelos poros do gel), enquanto o
K2CrO4 foi o composto que permaneceu mais tempo retido nos poros do gel. Assim,
relativamente ao raio de Stokes, este assume um menor valor quando se trata deste
último composto.
O volume morto da coluna corresponde ao volume presente no exterior das
partículas do gel, ou seja, o volume de eluição de um composto de massa molecular
elevada, o qual não consegue penetrar no interior dos poros do gel. Neste caso, dado que
o Azul de Dextrano corresponde a um composto com as características acima descritas,
o seu volume de eluição corresponde ao volume morto da coluna:
Cromatografia de Exclusão Molecular
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O volume total diz respeito ao volume total do leito do gel na coluna e obtêm-se
conhecendo a altura ocupada pelo gel na coluna (39 cm) e o seu raio (0,65 cm):
Dado que o volume ocupado pelo gel é um parâmetro de difícil determinação,
para caracterizar o comportamento de um composto, desprezando a contribuição do
volume sólido das partículas de gel para o volume total da coluna. Este parâmetro
corresponde ao Kav e é dado por:
Em que Vt e V0 correspondem aos parâmetros acima explicitados e Ve ao volume
necessário para a remoção de um determinado componente da coluna, ou seja, volume
de eluição.
Assim, procedeu-se ao cálculo do Kav para cada um dos compostos eluídos e,
consoante esse resultado, interpreta-se da seguinte forma:
Kav < 0: existem canais no leito do gel por onde as moléculas podem passar
facilmente (é necessário proceder a novo empacotamento da coluna para que se
possa proceder a uma cromatografia em condições correctas);
Kav = 0: as moléculas do soluto não podem penetrar nas partículas do gel;
Kav < 1: as moléculas do soluto encontram-se em maior percentagem no exterior
do que no interior das partículas do gel;
Kav = 1:as moléculas de soluto encontram-se igualmente distribuídas no interior
e no exterior das partículas do gel;
Kav> 1: as moléculas do soluto encontram-se em maior percentagem no interior
das partículas do que no seu exterior (ocorreu alguma adsorção das partículas do
soluto ao gel).
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Para o cálculo do Kav dos compostos considera-se o seu volume de eluição (Ve) –
observado no cromatograma – e usam-se os valores de Vt e V0 descritos anteriormente,
os quais são iguais para cada um dos compostos.
Azul de Dextrano (Mr=2 000 000 Da)
Albumina sérica bovina (Mr=66 400 Da)
Mioglobina (Mr=16 900 Da)
K2CrO4 (Mr = 194 Da)
Os resultados obtidos nos cálculos do Kav e a sua interpretação encontram-se
sintetizados no quadro seguinte:
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Quadro 3. Valores de Kav calculados para cada composto e respectiva interpretação.
Composto Kav Interpretação
Azul de
Dextrano 0 Não penetrou nos poros do gel.
BSA 0,07 Encontra-se em maior percentagem no exterior do gel do que
no interior.
Mioglobina 0,16 Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da
BSA) no exterior do gel do que no interior.
K2CrO4 0,37 Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da
mioglobina) no exterior do gel do que no interior.
O azul de dextrano, como já explicado no cromatograma 1, não entra nos poros
do gel, Kav=0. Sendo um composto não retido pelo coluna, o seu volume de eluição
corresponde ao volume morto.
Relativamente à BSA, obtém-se um Kav maior do que 0 e muito menor do que 1,
ainda que, quando aproximado, corresponde a 0. Para a mioglobina, o Kav foi menor que
o da proteína anterior e, consequentemente, mais próximo de 1, ainda que bastante
afastado desse valor. No que diz respeito ao cromato de potássio, o seu Kav é maior que
todos os anteriores e, consequentemente, mais próximo de 1.
No geral, todos os valores de Kav calculados permitem confirmar as conclusões
retiradas da análise dos cromatogramas, ou seja, a ordem de eluição de acordo com a
diminuição da sua massa molecular. Segundo isto, conclui-se que a BSA se encontrava
em maior quantidade no exterior do que nos interior dos poros do gel, passando-se o
mesmo para a mioglobina e para o cromato de potássio. Comparativamente uns com os
outros, pode dizer-se que o composto que se encontrava em maior quantidade no
exterior dos poros do gel era o Azul de Dextrano, seguido da BSA, da mioglobina e,
finalmente, do cromato de potássio.
Em suma, a percentagem relativa de cada composto no exterior dos poros do gel
é consequência da massa molecular de cada um deles e, portanto, do seu raio de Stokes.
Desta forma, quanto maior a quantidade de composto no exterior dos poros do gel, mais
rápida foi a eluição e, consequentemente, menor o seu tempo de retenção.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Usando os valores de Kav calculados e conhecendo a massa molecular de cada
um dos compostos constituintes da mistura padrão traça-se a curva de calibração da
coluna. Os dados usados encontram-se especificados no quadro a seguir:
Quadro 4. Valores usados na construção da curva de calibração da coluna.
Figura 4. Curva de calibração da coluna.
Através da equação onde A e B são duas constantes e
Mr é o valor da massa molecular relativa de cada proteína, traçou-se uma regressão
linear, a qual corresponde à recta de calibração [y corresponde ao Kav e x ao ].
Pela equação da recta de calibração retira-se o valor das constantes A e B: A =
0,116 e B = 0,6384. Assim:
y = -0,116x + 0,6384
R² = 0,9951
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0 1 2 3 4 5 6
Kav
log10 (Mr)
Relação linear entre Kav e o log10(Mr)
Componente Kav Mr (Da)
BSA 0,07 66400 4,822
Mioglobina 0,16 16900 4,228
K2CrO4 0,37 195 2,29
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#3. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do
volume de eluição
A amostra aplicada na coluna consiste em 300 µL de amostra desconhecida e
200 µL de azul de dextrano. Da cromatografia de exclusão molecular, obtiveram-se os
seguintes resultados:
Quadro 5. Registos dos resultados obtidos para a amostra desconhecida
Veluição
(mL)
Resultados Obtidos Resultados considerados
Cor Composto Absorvência Absorvência
620 nm 280 nm 620 nm 280 nm
1 -0,005 -0,001 0,000 0,000 -
Azul de
Dextrano
2 0,128 0,105 0,128 0,105 -
3 0,018 0,056 0,018 0,056 -
4 0,016 0,053 0,016 0,053 -
5 -0,003 0,017 0,000 0,017 -
6 0,082 0,098 0,082 0,098 -
7 0,031 0,077 0,031 0,077 -
8 0,213 0,397 0,213 0,397 Azul
9 0,386 0,645 0,386 0,645 Azul
10 0,288 0,573 0,288 0,573 Azul
11 0,054 0,323 0,054 0,323 Azul
12 0,064 0,249 0,064 0,249 -
Amostra
desconhecida
13 0,089 0,202 0,089 0,202 -
14 0,098 0,167 0,098 0,167 -
15 0,172 0,151 0,172 0,151 -
16 0,159 0,141 0,159 0,141 -
17 0,019 0,081 0,019 0,081 -
18 0,002 0,042 0,002 0,042 -
19 -0,003 0,011 0,000 0,011 -
20 -0,003 0,010 0,000 0,010 -
21 -0,004 0,006 0,000 0,006 -
22 -0,004 0,006 0,000 0,006 -
23 0,053 0,092 0,053 0,092 -
24 -0,004 0,003 0,000 0,003 -
Note-se que se mediu a absorvência a 280 e a 620 nm porque à amostra
desconhecida juntou-se azul de dextrano, e como mostrado anteriormente, são os
comprimentos de onda onde os valores de absorvência são máximos. Como se
Cromatografia de Exclusão Molecular
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obtiveram valores de absorvência negativos, esses valores foram considerados zero, e
obteve-se o seguinte cromatograma:
Figura 5. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do
volume de eluição.
Numa cromatografia de exclusão molecular a separação das moléculas é efectuada
com base na sua massa molecular relativa ( ), ou seja, moléculas com maior são
menos retidas pelo gel da coluna sendo eluídas primeiro, enquanto moléculas com
menor são mais retidas pelo gel da coluna – por entrarem nos seus poros – sendo as
ultimas a serem eluídas. Assim, a ordem de eluição dá-se das moléculas com maior
para moléculas com menor .
Sabendo que a massa molecular relativa do azul de dextrano é cerca de 2 000 000
Da, pode-se afirmar que este será o primeiro composto a ser eluído, constituindo o
composto que não é retido pela coluna, ou seja, o seu volume de eluição corresponde ao
volume morto da coluna ( ). Assim, através do cromatograma da mistura padrão
(Figura 3), da observação do quadro e da representação gráfica anterior (Quadro 5 e
Figura 5, respectivamente) é possível identificar que o volume de eluição do azul de
dextrano é 9 mL, seguindo-se, depois, a eluição da amostra desconhecida
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0,550
0,600
0,650
0,700
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Ab
sorvên
cia
a 2
80 n
m
Volume de Eluição (mL)
Absorvência da Amostra Desconhecida a 280 e a 620 nm
Absorvência a 280 nm
Absorvência a 620 nm
Cromatografia de Exclusão Molecular
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No segundo cromatograma (cromatograma da mistura padrão) através do cálculo
do coeficiente de distribuição, Kav, para cada componente da mistura e da sua relação
linear com o logaritmo de base 10 do valor da massa molecular relativa, ,
obteve-se uma recta de calibração com equação:
Através da equação anterior, calculando o Kav da amostra desconhecida é possível
determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compará-la à dos
compostos da mistura padrão. Então, para a amostra desconhecida, que corresponde ao
pico do cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluição é 15 mL logo
o seu Kav é:
Substituindo na equação da recta de calibração obtém-se:
Ao comparar a massa molecular relativa obtida com a dos componentes da
mistura padrão é possível verificar que existe uma grande discrepância entre massa
molecular dos componentes da mistura padrão e da amostra desconhecida, podendo
então concluir-se erroneamente que a amostra desconhecida não se encontrava na
mistura padrão.
No entanto, é possível prever que a massa molecular relativa obtida encontra-se
abaixo do valor real devido a erros experimentais e às aproximações realizadas na
utilização de uma curva de calibração.
Durante a aplicação da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano,
o topo da coluna secou o que conduziu à abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da
mistura no gel exigiu um maior volume de eluição, o que aumenta o Kav obtido (maior
volume de eluição da amostra), e como tal a massa molecular relativa obtida é menor
que a real.
Na utilização de uma curva de calibração admite-se que a separação dos
compostos de uma mistura é apenas condicionada por efeitos estéreos e de partição no
caso de se estabelecerem interacções entre os componentes, o volume de eluição será
maior do que o suposto o que resulta no cálculo de uma massa molecular relativa
inferior à real, como é o caso.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Como a massa molecular relativa da amostra calculada é inferior à real, quando
comparada com a mistura padrão, poderá estimar-se que a amostra desconhecida era
albumina sérica bovina (BSA) com massa molecular relativa de 66 400 Da.
Discussão global dos resultados obtidos
Através dos cromatogramas traçados foi possível determinar o volume morto da
coluna, calcular o Kav dos diferentes componentes da mistura padrão e preparar a curva
de calibração da coluna.
O gráfico de eluição do azul de dextrano permitiu calcular o volume morto da
coluna, uma vez que a massa molecular relativa deste composto é da ordem dos 2000
kDa e, como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento entre os 8 e 80
kDa, este vai ser totalmente excluído pelas partículas do gel. Esta exclusão é observada
visivelmente devido à cor azul do composto utilizado e podemos concluir que volume
de eluição do azul de dextrano se deu até aos 9 mL (que corresponde também ao
máximo de absorvência a 620 nm), pelo que este volume corresponde ao volume morto.
No entanto, em todos os ensaios realizados, verificou-se um máximo de absorção
para este composto também aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de
dextrano absorve a estes dois comprimentos de onda – 620 nm e 280 nm –, traçou-se
um espectro de absorção desta solução, entre os 200 nm e os 700 nm.
Como este composto vai ser o primeiro a ser eluído devido à sua grande massa
molecular e consequente não penetração nos poros do gel, o valor de Kav do azul de
dextrano é igual a 0.
Traçou-se também o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a mistura
padrão e procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das fracções recolhidas. Os
comprimentos de onda usados para realizar estas leituras correspondem ao comprimento
de onda máximo para cada um dos compostos que constituem a mistura.
Relativamente aos compostos constituintes da mistura padrão (BSA, mioglobina e
K2CrO4), supôs-se que estes teriam o seu máximo de absorção ao comprimento de onda
Cromatografia de Exclusão Molecular
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de 410 nm, uma vez que se observaram picos de absorvência correspondentes a estes
compostos quando se lê a absorvência, das fracções que se supõe que os contenham, a
este comprimento de onda. Portanto, para o traçar do cromatograma, foram lidas as
absorvências para os comprimentos de onda de 280 nm, 410 nm e 620 nm.
Uma vez conhecendo a massa molecular relativa de cada um dos compostos que
constituíam a mistura aplicada na coluna cromatográfica e tendo em conta que o
tamanho e a forma das moléculas são os factores dominantes em todo o processo de
separação, facilmente se pode prever a ordem de eluição de cada um delas, visto que
moléculas com maior massa molecular relativa e com maior raio de Stokes não
penetram nos poros do gel e, como tal, são as primeiras a ser eluídas, seguindo-se as de
menor massa. Assim, a ordem prevista para a eluição seria: azul de dextrano, BSA,
Mioglobina, K2CrO4, respectivamente por ordem decrescente de massa molecular
relativa.
Pela análise do cromatograma 2 (Figura 3), observa-se um pico (mais saliente) da
absorvência medida a 620 nm, correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico
corresponde à eluição do maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava,
foi o primeiro composto a ser eluído. O pico que se observa ao comprimento de onda de
280 nm para o mesmo volume de azul de dextrano corresponde também à eluição deste
composto, uma vez que este também absorve radiação a 280 nm, como já foi dito.
A curva que corresponde à absorvência medida a 410 nm dá-nos informação
acerca da segunda e da terceira proteínas eluídas, a BSA e a mioglobina. Na fracção
correspondente a 17 mL eluídos detecta-se a presença de um pico relativamente elevado
de absorvência. Este pico corresponde à eluição da BSA, tal como esperado. No
entanto, como se tratou de um pico com uma largura bastante elevada, permitiu assumir
que, a este volume, a BSA não foi a única proteína eluída, tendo sido eluída juntamente
com a mioglobina. Aos 25 mL de eluição detectou-se um novo e último pico de
absorvência, concluindo-se, então, que este pico corresponde à eluição do restante
volume de mioglobina. A diminuição da altura deste pico relativamente ao anterior
deve-se ao facto de ter sido eluído volume de mioglobina inicial acoplado à eluição da
BSA. Este dado também se encontra de acordo com o esperado, uma vez que a
Cromatografia de Exclusão Molecular
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mioglobina possui menor massa molecular que a BSA e, desta forma menor raio de
Stokes.
No que diz respeito à curva da absorvência medida a 280 nm, é de salientar,
essencialmente, a observação de dois picos: 9 e 25 mL, respectivamente. O primeiro
corresponde à eluição do azul de dextrano, como já foi referido, enquanto o segundo
pico corresponde à eluição do K2CrO4. De facto, este composto é aquele que apresenta
menor massa molecular, pelo que permaneceu retido nos poros do gel durante mais
tempo e, como tal, foi o último a ser eluído. Apesar disso, através da análise do
cromatograma, concluiu-se que é eluído praticamente em simultâneo com a mioglobina.
Os resultados obtidos para os valores de Kav foram, respectivamente, para o azul
de dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4:0, 0,07, 0,16 e 0,37. Os valores de Kav
calculados permitiram confirmar as conclusões retiradas da análise do cromatograma,
ou seja, a ordem de eluição de acordo com a diminuição da sua massa molecular assim
como traçar a curva de calibração da coluna (Figura 4).
Foi traçado também o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a
mistura desconhecida e procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das fracções
recolhidas.
Pela observação do cromatograma 3 (Figura 5) foi possível identificar que o
volume de eluição do azul de dextrano foi de 9 mL, seguindo-se, depois, a eluição da
amostra desconhecida. Através da equação obtida no cromatograma 2 é possível
determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compará-la à dos
compostos da mistura padrão, calculando o Kav para os picos obtidos na eluição da
mistura desconhecida. Então, para a amostra desconhecida, que corresponde ao pico do
cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluição é 15 mL pelo que o
seu valor de Kav é de 0,14. A massa molecular relativa obtida foi de 19 670 Da. A
comparação deste valor com o dos componentes da mistura padrão permite verificar que
existe uma grande discrepância entre a massa molecular dos componentes da mistura
padrão e da amostra desconhecida, concluindo-se erroneamente que a amostra
desconhecida não se encontrava na mistura padrão. Erroneamente porque durante a
aplicação da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano, o topo da coluna
secou o que conduziu à abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da mistura no gel
Cromatografia de Exclusão Molecular
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exigiu um maior volume de eluição, o que aumenta o Kav obtido e como tal a massa
molecular relativa obtida é menor que a real. Sendo a massa molecular relativa da
amostra calculada inferior à real, quando comparada com a mistura padrão, poderá
estimar-se que a amostra desconhecida era albumina sérica bovina (BSA) com massa
molecular relativa de 66 400 Da.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Conclusão
Através do método cromatográfico de exclusão molecular, baseado na velocidade
de migração das partículas em função do seu raio de Stokes e da sua massa molecular
relativa, Mr, procurou-se determinar a massa molecular de uma proteína desconhecida,
tendo por base o comportamento de uma amostra padrão.
Através do cromatograma obtido para a mistura padrão com azul de dextrano, e
tal como era esperado, a ordem de eluição dos componentes foi a seguinte: azul de
dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4 (cromato de potássio), que corresponde a uma
ordem decrescente de valores de massas moleculares relativas.
Através do cálculo do volume morto, correspondente ao volume de eluição do
azul de dextrano (V0=9mL) foi possível estabelecer uma relação de Kav entre os
diferentes componentes e as suas respectivas Mr.
Para o azul de dextrano, o valor de Kav obtido foi igual zero, o que coincide com o
valor previsto, uma vez que este composto apresenta uma massa molecular relativa
bastante elevada e superior ao limite de exclusão do gel, para o BSA, mioglobina e
cromato de potássio, os Kav são superiores a 0 e inferiores a 1, assumindo valores
distintos entre si devido às suas diferentes massas moleculares relativas. Através destes
valores de Kav, foi possível traçar uma recta de calibração de onde se obteve o valor da
massa molecular relativa da amostra desconhecida.
Apesar do valor obtido para a massa molecular da proteína desconhecida não ter
correspondido a nenhuma das massas moleculares relativas da amostra padrão, estimou-
se, por comparação com os componentes da mistura padrão, que a amostra
desconhecida era BSA.
Cromatografia de Exclusão Molecular
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Bibliografia
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