Download - Metode u citogenetici
Metode u citogenetici
dr. sc. Vesna Boraska
Ljudski genom
Genom: skup svih molekula DNA koje čine nasljedni materijal određene vrste organizma
Gen: temeljna jedinica nasljeđivanja koja određuju neko svojstvo
Kromosom: struktura u stanici koja
nosi DNA, sastoji se od proteina i DNA molekule
Kromosom svaki kromosom sadrži jednu linearnu dvolančanu DNA čija
veličina varira 50-250 milijuna baza kromosom se sastoji od > 1000 gena, koji su u rangu
veličine od nekoliko tisuća pa do 2 milijuna baza za vrijeme staničnog ciklusa, interfaze, kromosomi su
slabije kondenzirani i ne mogu se prepoznati kao zasebna tjelešca
za vrijeme stanične diobe, mitoze, kromosomi podliježu visokom stupnju kondenzacije i tek se tada raspoznaju kao zgusnuta tjelešca unutar st. jezgre
Kromosomsko bojenje kromosomi su maksimalno vidljivi i prepoznatljivi u metafazi st.
ciklusa veliki korak u humanoj citogenetici: tehnike bojenja karakteristične horizontalne linije na kromosomima
1) identifikaciju svih kromosoma2) prepoznavanje strukturnih promjena3) prepoznavanje lomova kromosoma
Kromosomska bojanja su omogućila prepoznavanje ogromnog broja kariotipskih aberacija (abnormalnosti) te stvaranje fizičke i genetičke mape kromosoma.
Ljudski kariotip skup svih kromosoma porijeklom iz jedne stanice naziva se
kariotip kariotip humane diploidne (2n) normalne stanice ima 46
kromosoma, a čine ga 22 para autosoma i 2 spolna kromosoma (2X kromosoma za žene ili X i Y kromosomi za muškarce)
poremećaj broja i strukture kromosoma nazivamo kromosomskom aberacijom
svaki poremećaj broja ili ustroja kromosoma uzrokuje teške poremećaje funkcije, koji izazivaju višestruka oštećenja fenotipa
Kariotip muškarca i žene
Y
X
X X
Kariogram
grafički prikaz kariotipa pri čemu su kromosomi poredani po veličini
Standardna citogenetika
za rutinsku analizu kromosoma metode pruganja omogućuju identifikaciju pojedinih
kromosoma na temelju rasporeda svjetlije i tamnije obojenih regija uzduž krakova kromosoma
aberacije koje zahvaćaju manje segmente DNA nije moguće sa sigurnošću otkriti metodama klasične citogenetike pa se koriste molekularne metode
Primjena citogenetičkih metoda
1. prenatalno zbog sumnje na postojanje kromosomskih aberacija zbog
obiteljske anamneze ili zbog starosti majke (> 35 godina)→ analiza stanica iz plodove vode→ analiza pobačenog ploda
2. postnatalno→ tumorska citogenetika→ citogenetika kod djece s multiplim malformacijama→ citogenetika bračnih parova sa sterilitetom
G-pruge najučestalije se koriste u standardnoj citogenetici ime po Giemsa boji (akridine orange i metilene blu) kromosomi se tretiraju sa slanom otopinom na 60 °C ili s
proteolitičkim enzimom (tripsin) koji uništava proteine, a potom boje Giemsa bojom
tamne pruge nas usmjeravaju na postojanje heterokromatina i AT bogati dio kromosoma
svjetlije pruge nas usmjeravaju da bi to mogao biti eukromatin i GC bogati dio kromosoma
pomoću pruganja G-metodom moguće je otkriti poremećaje segmenata kromosoma veličine 5Mb
Kariotip nakon G-bojenja
Q-pruge
1970. otkrivena DNA-vezujuća fluorokromatska boja quinacrine mustard
quinacrine je planarna molekula koja se interkalira između nukleotidnih baza u DNA
Q-pruge daju istu informaciju kao G-pruge samo što se svjetle Q-pruge prikazuju kao tamne G-pruge i obrnuto
kromosomi pokazuju fluorescentne linije različitog intenziteta, pregled fluorescentnim mikroskopom
Q-pruge
obe tehnike (G i Q pruganje) stvaraju otprilike 300 pruga u haploidnom metafaznom genomu te 850-1250 pruga u prometafaznom i profaznom (jer su duži)
najintezivnije se vide satelitne DNA regije izrazito bogate AT pb te duža ruka Y-kromosoma
nema predtretmana – morfologija ostaje očuvana intezitet boje se može mjeriti
Kariotip nakon Q-bojenja
C-pruge
kromosomi se najčešće kratko tretiraju s kiselinom, potom s lužinom (barij hidroksid), a na kraju se boje Giemsa bojom
C-pruge boje mjesta oko centromere jake C-pruge se vide na krom 1, 9, 16 i distalno na Y-
kromosomu različite boje uzrokuju različita, ali i slična obojenja
pojedinih kromosoma: Q-bojenjem Y-krom izgleda jednako C-bojenju, ali npr. dijelovi 1, 9, 16 krom nisu svjetli nego tamni
Kariotip nakon C-bojenja
R-pruge
R-pruge (“reverse”) su otprilike pruge obrnute od G-pruga tamnije regije su eukromatin, a svijetla područja
heterokromatin kromosomi se tretiraju s vrućom lužinom i potom boje
Giemsa ili acridine orange bojom acridine orange može interkalirati među nukleotidne baze i
tada svjetli žuto dobro za uočavanje strukturalnih promjena na krajevima
kromosoma
Kariotip nakon R-bojenja
Heteromorfizmi veličina Q i C-pruga varira između ljudi: heteromorfizmi heteromorfizmi najčešće nastaju prilikom inverzija velikih
heterokromatinskih dijelova DNA konstitutivni heterokromatin ne sadrži gene i ne transkribira se,
stoga heteromorfizmi, odnosno varijacije C-pruga, ne utječu na fenotip
heteromorfizmi se koriste kod testiranja očinstva, razlikovanja jednojajčanih od dvojajčanih blizanaca, kod otkrivanja trisomija ili triploidija prilikom određivanja roditelja koji je prenio višak kromosoma
nove preciznije tehnike su više u upotrebi
Bojenje u visokoj rezoluciji
profazni i prometafazni kromosomi su puno duži od metafaznih kromosoma
na njima se vidi puno više pruga i zbog toga se najčešće koriste za prepoznavanje malenih strukturalnih promjena
za visoku rezoluciju se stanice dovode u istu fazu: zaustavljanje u S-fazi staničnog ciklusa ametopterinom (metrotreksatom), otpuštanje velikog broja stanica iz S-faze u mediju bogatom timidinom = sinhroniziranje stanica i bojenjem kromosoma u željenoj fazi (npr. prometafazi)
Ostale vrste bojenja
postoji još puno fluorokromatskih boja koje se koriste u citološkim bojenjima
→ neke se vežu specifično za AT pb (DAPI)→ neke se vežu specifično GC pb (kromomicin) postoje i nefluorescentne boje koje se specifično vežu
za pojedine baze→ metil-zeleno se veže za AT pb→ aktinomicin se veže za GC pb
kariotip psa lijevo su DAPI
obojeni metafazni kromosomi
desno su inverzni DAPI kromosomi
Priprema kariotipa direktne ili indirektne metode obrade koštane srži, periferne krvi, limfnog
čvora i tjelesnih izljeva potrebno je uzgojiti stanice u kratkotrajnoj kulturi 24-satnoj ili nešto dužoj 48-
72 satnoj staničnoj kulturi s primjenom faktora rasta ili mitogena ili bez njih standardna tehnika pruganja uključuje slijedeće postupke:
1. zaustavljanje dijeljenja stanica u metafazi primjenom kolhicina ili kolcemida 2. razbijanje stanica u hipotoničnoj otopini3. fiksaciju stanica u metanolu i octenoj kiselini
Priprema preparata za vizualizaciju
4. smještanje kromosoma u jednu ravninu “squash” tehnikom (gnječenjem)
5. bojenje kromosoma6. pregled kromosoma pod
svjetlosnim ili fluorescentnim mikroskopom
7. slikanje, izrezivanje kromosoma i izrada kariograma
Bojenje antitijelima
imunocitokemijske studije su korištenjem antitijela na adenin i citozin prve pokazale da kromosomske pruge odražavaju razlike u sastavu baza (anti-A i anti-C antitijela)
antitijela se vezuju za baze u jednolančanoj (denaturiranoj) DNA, ali ne u dvolančanoj DNA
razvijen je veliki broj antitijela koji se vezuju za specifična mjesta na DNA molekuli: antitijela na acetilirane histone ili na metilirane baze npr. antitijela na 5-metilcitozin proizvode C-pruge
Korištenje restrikcijskih endonukleaza
restrikcijske endonukleaze (RE) cijepaju DNA na točno određenim slijedovima
ako je slijed DNA promijenjen RE ne cijepaju DNA RE se koriste za cijepanje C-pruga na svojim slijedovima i za
analizu heteromorfizama
Nazivlje (nomenklatura) strukturnih dijelova na obojenim kromosomima
predložena na konferenciji u Parizu 1971. godine telomere, centromere i brojne jake pruge se koriste kao
mjesta prepoznavanja (oznake) dijelovi kromosoma između dviju oznaka se nazivaju
područjima (regijama) i numerirana su brojevima 1, 2, 3 i 4 na p ("p" za "petit") i q ("q" za "queue") kraku počevši od centromere
pruge su numerirane na isti način ideogram
Nazivlje
bojenje u visokoj rezoluciji je dovelo do dodatnih podjela u ideogramskom prikazu tj. do pojave subpruga
subpruge se označavaju točkom i brojem iza nje kada su subpruge dodatno podijeljene u još pruga tada se
pri imenovanju dodaje još jedan broj najnovije nazivlje je standardizirano ISCN (International
System for Human Cytogenetic Nomenclature) dogovorom 2005. godine
Ideogram kromosoma
ISCN nomenklatura
t – translokacija: prijenos genetskog materijala s jednog kromosoma na drugi
ins – insercija: jedan dio kromosoma premjestio se na novu poziciju u istom ili nekom drugom kromosomu
inv – inverzija: označava rotaciju dijela kromosoma za 180° del – delecija: označava gubitak dijela kromosoma dup – duplikacija: prisutnost dodatne kopije dijela
kromosoma
ISCN nomenklatura i – izokromosom: sastoji se od dvaju krakova od kojih je jedan
krak zrcalna slika drugog kraka r – ring kromosom: označava kromosom koji ima izgled
prstena mar – marker kromosom označava bilo koju strukturnu
promjenu kromosoma koja se ne može objasniti standardnim terminima
der – derivirani kromosom: strukturna promjena koja uključuje dva ili više kromosoma
(+) plus ili (-) minus označava višak ili manjak pojedinog kromosoma
In situ hibridizacija metoda koja se koristi za identifikaciju specifičnih manjih dijelova
kromosoma npr. ako nam je poznata sekvenca nekog gena (najčešće preko
Human Genome projekta), ali ne znamo na kojem je kromosomu lokalizirana, upotrijebit ćemo ovu metodu radi pronalaženja točne lokacije gena
sjedinjuje citogenetičke i molekularne metoda ispitivanja, a temelji se na hibridizaciji komplementarnih sekvenci nukleinskih kiselina
procesom denaturacije ili disocijacije razbijaju se nekovalentne vodikove veze između komplementarnih baza i dolazi do razdvajanja lanaca DNA
In situ hibridizacija
denaturacija se može postići povišenjem temperature, dok se njenim snižavanjem obnavljaju vodikove veze, a lanci DNA se ponovo sparuju – renaturacija
korištenjem fluorescentnih DNA ili RNA probi mogu se detektirati određeni DNA slijedovi (npr. geni) na nitroceluloznom filteru (molekularna hibridizacija) ili na citološkim preparatima (in situ hibridizacija)
prisutnost ili odsutnost fluorescentnog signala upotrijebljene DNA probe ukazuje na prisutnost ili odsutnost specifičnih DNA sekvenci u genomu pojedinih stanica
In situ hibridizacija ponavljajućih i jedinstvenih DNA slijedova
DNA ili RNA probe mogu biti obilježene radioaktivnim izotopima ili fluorescentnim bojama (FISH)
probe hibridiziraju na denaturirane metafazne kromosome koji su fiksirani na podlogu
pod strogo određenim uvjetima temperature i koncentracije soli događa se sparivanje probe i isključivo njenih komplementarnih slijedova
samo vodikove veze formirane između komplementarnih baza ostaju stabilne
mjesta hibridizacije se određuju autoradiografski (kod radioaktivnih probi) ili prema fluorescenciji
Hibridizacija probe
Postupak izrade
uzorak suspenzije metafaznih kromosoma se suši na mikroskopskom staklu i tretira s formamidom da kromosomi postanu denaturirani, ali se čuva karakteristična metafazna morfologija
dodavanje i lokalizacija probe koja je hibridizirala sa kromosomalnom DNA
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
DNA probe se u FISH tehnici mogu detektirati na 2 načina:
1. DNA probe se mogu označiti s nekoliko kemijskih skupina (bromodeoksiuracil, digoksigenin, dinitrofenol) koje se potom detektiraju sa specifičnim fluorescirajućim antitijelima
2. fluorescentne skupine mogu biti kovalentno vezane za DNA probu pa nema potrebe za dodavanjem neke druge fluorescentne molekule koja se vezuje za probu
postoje kromosomski specifične fluorescentne boje koje različite kromosome “boje” različitim bojama
FISH – rezolucija i primjena FISH je moguće izvoditi u interfaznim stanicama stoga je moguće
obuhvatiti veći broj stanica te se metoda koristi za ispitivanje i procjenu mozaicizma
fluorescentno obilježene probe pokazuju jaku rezoluciju i dobre su za mapiranje gena
vrlo osjetljivim digitalnim kamerama i računalnom obradom može se detektirati gotovo svaki signal
FISH detektira hibridizaciju na slijedove kratke čak 1 kb može se detektirati jedinstven RNA transkript te odrediti broj RNA
transkripata pojedinog gena u stanici u ispitivanju i otkrivanju submikroskopskih poremećaja genoma
Interfazne stanice s translokacijom t(9;22)
Kromosomske i lokus specifične probe
mogu se stvarati biblioteke probi – kolekcija probi dobivena kloniranjem fragmenata DNA, ubačena u odgovarajući vektor (plazmid, lambda fag, kozmid) i umnožena u odgovarajućem domaćinu (npr. bakterijama)
1988. godine su prvi put upotrijebljene biblioteke probi specifičnih za pojedine kromosome
koriste se za otkrivanje strukturalnih i brojčanih kromosomskih promjena
PCR-om (engl. polymerase chain reaction – lančana reakcija polimerazom) se mogu napraviti lokus-specifične probe tj. probe specifične za neki gen, odnosno dio genoma
FISH – detekcija kromosoma 18
Raznobojni FISH i spektralni kariotip
raznobojni FISH (engl. multicolor FISH) ili M-FISH i spektralni kariotip ili SKY omogućavaju rutinske detekcije svakog kromosoma u metafaznoj ploči
ove dvije metode koriste 24 kromosomske probe i 5 florokromatskih boja
zbog specifičnih kombinacija hibridiziranja probi i njihovog obilježavanja dolazi do različitog obojenja svakog kromosoma
ove metode ne mogu detektirati intrakromosomske promjene (npr. delecije, duplikacije, inverzije), ali su jako dobre za uočavanje promjena u broju kromosoma te za detekciju strukturalnih promjena kao što su translokacije
M-FISH
Interfazni FISH
razvijene su tehnike kojima se može obojati kromatin u interfaznoj, hipotonično-nabubrenoj jezgri
razdaljine između probi na kromatinskim nitima direktno odgovaraju stvarnim molekularnim razdaljinama – mogu se mjeriti veličine raznih struktura
mnogobrojne probe i raznobojne fluorofore za obilježavanje omogućavaju točniju analizu i precizniju detekciju finih promjena u strukturi kromosoma
a i b) histološki prikaz koštane srži – velike atipične limfoidne stanice
c i d) kariotipovi dobiveni G-bojenjem
e i f) M-FISH kariotipovi
g i h) FISH sa specifičnim probama za gene IGH (14q32) i BCL2 (18q23)
Hvala na pozornosti!