Download - Caracterizacion OMG
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DESARROLLO Y CARACTERIZACIN DE UN OGM
M S C . L Z A R O N E Z C R D E N A S
BIOTECNOLOGA MODERNA
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- Enzimas de restriccin
- Ligasas
- Plsmidos - Agrobacterium tumefasien
Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio
de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la
naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)
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Conceptos bsicos relacionados a la Biotecnologa Moderna
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Desarrollo de un OGM
BIOTECNOLOGA MODERNA
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- Enzimas de restriccin
- Ligasas
- Plsmidos - Agrobacterium tumefasien
Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio
de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la
naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)
DESARROLLO DE UN OVGM
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PLANTAS MICROORGANISMOS ANIMALES
ARNm
PROTEINA/ENZIMAS
METABOLITOS
ARNm
PROTEINA/ENZIMAS
METABOLITOS
ARNm
PROTEINA/ENZIMAS
METABOLITOS
Mtodos de obtencin en
animales
Microinyeccin pronuclear de ADN.
Manipulacin de clulas embrionarias.
Clonacin somtica. Transferencia de genes
mediada por espermatozoides
Vectores lentivirales
Mtodos de obtencin en plantas
Agrobacteriumtumefaciens.
Transferencia por polietilenglicol.
Microinyeccin. Tecnologa de
electroporacin de clulas intactas
Lanzagenes o biolistica.
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Ejemplos de Transgnesis en Animales
Transferencia de genes mediada por espermatozoides
Promotor ADNc del gen
XPA
Seleccin del donante de semen.
Colecta del semen.
Lavado de los espermatozoides y coincubacin con el ADN de inters.
Inseminacin artificial.
PA: Secuencia de corte y poliadenilacin
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Transferencia de genes mediada por
espermatozoides
Limitaciones de la SMGT.Se desconocen los eventos moleculares que
median la internalizacin del ADN en los
espermatozoides.
Es necesario evaluar un gran nmero de
sementales antes de encontrar uno con las
caractersticas adecuadas para el procedimiento.
Baja reproducibilidad.
Escepticismo.
ADN unido a espermatozoides
Blastosistos
multitransgnicosWebster NL, Lavitrano ML et al., (2005). Multi-transgenic pigs expressing three fluorescent proteins produced with high
efficiency by sperm mediated gene transfer. Mol Reprod Dev. 72:68-76
Microinyeccin pronuclear de ADN
Consiste en la microinyeccin directa de ADN desnudo en el
proncleo masculino de un embrin fertilizado.
Si el material gentico se integra en uno de los cromosomas
embrionarios, el animal nacer con esta nueva informacin en cada
clula.
El ADN forneo debe integrarse en el genoma antes de la duplicacin
del material gentico que precede al primer clivaje.
Construccin de un cassette de expresin para microinyeccin.
Promotor ADNc del gen X PA
Promotor PA
ADN genmico del gen X
PAPromotor gen
Xgen
Y
IRES
IRES: Internal ribosome entry
sitePA: Secuencia de corte y poliadenilacin
Microinyeccin pronuclear de ADN
50 m
Tratamiento hormonal para inducir la
maduracin de los folculos y la ovulacin.
Transferencia a hembra pseudogestada
Chequeo de la progenie para detectar las
cras transgnicas (PCR, Southern blot).
Cruzamiento de los transgnicos fundadores
para obtener una lnea homocigtica.
Colecta de los zigotos
Microinyeccin pronuclear del transgn
Microinyeccin pronuclear de ADNPasos para la generacin de un ratn transgnico por
microinyeccin.
Microinyeccin Pronuclear de ADN
Limitaciones de la Microinyeccin Pronuclear
1. Efecto de posicin:
Los transgenes se integran en zonas de la cromatina transcripcionalmente inactivas o silentes.
Los transgenes que se integran en secuencias codificantes nativas podran conducir a una discapacidad
o a la muerte del animal transgnico.
2. Integracin de mltiples copias:
Antes de que ocurra la integracin, los casetes de expresin pueden formar concatmeros de forma tal
que mltiples copias del transgn se integran en una posicin nica del genoma.
Estos concatmeros inducen silenciamiento mediado por metilacin de las citosinas o
heterocromatinizacin.
3. Eficiencia de integracin:
La eficiencia de integracin del transgen mediante MIP difiere significativamente entre las especies
[ratn (5%), conejo(5%), cerdo (2%), cabra y oveja (1%), vaca (-1%)].
Wells K., Moore K., Wall R., (1999). Transgene vectors go retro.Nat. Biotech. 17: 25-26.
Aplicaciones
Produccin de protenas recombinantes. (Cultivos Celulares)
Fibra Hueca
Rollers
Suspensin
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Aplicaciones
Produccin de protenas recombinantes.
Empleo de animales como biofactoras para la produccin de protenas recombinantes en fluidos corporales:
Sangre
Orina
Lquido seminal
Saliva
Leche
Fisiologa de la glndula
mamaria
Capacidad de sntesis: 2gr/leche por gr de tejido por da
Alta densidad celular: 2x108 clulas/gr de tejido (100 o
1000 ms alto que en cultivos celulares)
Produccin de leche 10-8 gr/clula/da
Animal Drug/protein Use
sheep alpha1 anti trypsin deficiency leads to emphysema
sheep CFTR treatment of cystic fibrosis
sheep tissue plasminogen activator treatment of thrombosis
sheep factor VIII, IX treatment of hemophilia
sheep fibrinogen treatment of wound healing
pig, tissue plasminogen activator treatment of thrombosis
pig factor VIII, IX treatment of hemophilia
goat human protein C treatment of thrombosis
goat antithrombin 3 treatment of thrombosis
goat glutamic acid decarboxylase treatment of type 1 diabetes
goat Pro542 treatment of HIV
cow alpha-lactalbumin anti-infection
cow factor VIII treatment of hemophilia
cow fibrinogen wound healing
cow collagen I, collagen II tissue repair, treatment of rheumatoid arthritis
cow lactoferrin treatment of GI tract infection, treatment of infectious arthritis
cow human serum albumin maintains blood volume
chicken, cow, goat monoclonal antibodies other vaccine production
AplicacionesProduccin de protenas recombinantes.
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Transgnesis en Plantas
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EJEMPLOS DE MTODOS DE OBTENCIN DE PLANTAS TRANSGNICAS
Biolgicos: Agrobacteriumtumefaciem o A. rhizogenes
Fsicos: Lanza genes o Biolstica
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ESQUEMA COMPARATIVO DE OBTENCIN DE PLANTAS TRANSGNICAS
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Nuevas Tecnologas de Obtencin de OGM
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CARACTERIZACIN MOLECULAR DE UN OGM
CARACTERIZACIN MOLECULAR DE UN OVGM
Proceso que integra el trabajo de diferentes especialistas:
Presentacin del expediente (Registro del producto)
Anlisis de laboratorio (Identificacin del OVGM)
Caracterizacin qumica estructural (aa, peso molecular, glicosilacin, estructura, 3D)
Caracterizacin funcional.
Digestibilidad/estabilidad.
Ensayos fisiolgicos y toxicolgicos (animales, agudos, subcrnicos, mutagenicidad, otros)
Alergenicidad e historial de uso.
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ANLISIS OVGM: CONCEPTOS
Caracterizacin: elucidar la estructura molecular del eventotransgnico en el sitio de insercin.
Deteccin: confirmar la presencia de los elementos genticosde un OGM respecto al T-ADN insertado. (promotor,
terminador).
Identificacin: confirmar la presencia de los elementosgenticos que son caractersticos de un evento transgnico
especifico y que permite determinar su presencia o no.
Cuantificacin : estimar el contenido del OGM.
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CMO IDENTIFICAR UN OVGM?
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IDENTIFICACIN
FENOTIPO
MTODOS BASADOS
ADN
MODIFICADO
MTODOS BASADOS
EN LA PROTEINA
EXPRESADA
La mayora de los OVGM
comercializados, presentan
idntica apariencia a su contraparte tradicional
Las diferencias genticas pueden
ser determinadas con el anlisis de
las secuencias del ADN (si es conocida)
La nueva protena expresada
puede ser detectada por mtodos
inmuno enzimticos
ESTRATEGIA DE DETECCIN DE UN OVGM
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Mtodos de anlisis
Bio analticosQumicos
(cidos Grasos)
(Estructura de la fibra)
(HPLC/GC)
Biolgicos
(Toda la Planta) (Ensayos inmunolgicos)
Protenas(Ensayos inmunolgicos)
ADN
(PCR)
FenotipoGenotipo
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Material crudo IngredienteProducto final
Procesamiento Procesamiento
Muestra laboratorio
Muestra anlisis/
muestra analtica
ADN
Protena
extraccin
extraccin
Preparacin muestra
/homogenizacin
Identificacin y
semicuantificacin
OGM
ELISA/STRIP
a) Deteccin OGM
b) Identificacin OGM
c) Cuantificacin OGM
PCR cualitativo
PCR cuantitativo
Procedimientos para la deteccin de un OVGM
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ANLISIS DE OVGM BASADO EN ENSAYOS INMUNO ENZIMTICOS
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ANLISIS DE OGM BASADO EN PCR
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VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS ADN& PROTENAS
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OTRAS VAS DE CARACTERIZACIN DE UN OGM
ANLISIS DE RIESGO=EVALUACIN INOCUIDAD
1. Efecto pleiotrpicos. 2. Metablicos.
3. Mutacionales.4. Efectos y propiedades nueva(s) protena(s)
expresadas.5. Composicin, valor nutricional.
6. Toxinas y anti-nutrientes naturales del alimento.
Equivalencia Sustancial!
OECD (Organizacin para cooperacin econmica y el desarrollo 1993)
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MARCO DE LA EVALUACIN DE LA INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS
(045 DIRECTRICES CODEX ALIMENTARIUS)
A) Descripcin de la planta de ADN recombinante;B) Descripcin de la planta base y de su utilizacin como
alimento;C) Descripcin del organismo u organismos donantes;D) Descripcin de la modificacin o modificaciones genticas;E) Caracterizacin de la modificacin o modificaciones
genticas;
F) Evaluacin de la inocuidad:a) sustancias expresadas (sustancias distintas de cidos nucleicos);b) anlisis de los componentes esenciales;
c) evaluacin de los metabolitos;
d) elaboracin del alimento;e) modificacin nutricional; y
G) Otras consideraciones.
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ES(1993-2002-2013)
1. IDENTIDAD.
2. LA FUENTE DE ORIGEN Y LA COMPOSICION DEL OGM.
3. PROCESO DE TRANSFORMACIN.
4. EL PRODUCTO DE LA EXPRESIN DEL NUEVO ADN.(alergenicidad y toxicidad)
5. POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS EXPRESIN GEN.(micro-nutrientes crticos anti-nutrientes, factores txicos endgenos, alrgenos, etc.)
OECD/FAO/WHO, 2000,2002 OEM, EFSA 2012
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APLICACIONES DE LA ES.
1. El alimento o ingrediente AGM es sustancialmenteequivalente al anlogo convencional, en cuanto a su
composicin qumica, aspectos agronmicos ytoxicolgicos.
2. El alimento o ingrediente AGM es sustancialmente
equivalente al anlogo convencional, excepto poralgunas pocas diferencias definidas con claridad.
3. El alimento o ingrediente AGM NO es sustancialmente
equivalente al anlogo convencional.
DONALDSON, MAY, 1999.
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EVALUACIN DE LA ES DE AGM
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ANLISIS ES RESPECTO A EFECTOS DEL PROCESAMIENTO
ANLISIS DEL ADN INSERTADO
Gen de seleccin (0,1-1 g ADN/da vs 0,000001 g ADNr).(JONAS ET AL 2001; EFSA 2004)
1. Genes de resistencia Kanamicina e Higromicina
2. Genes de resistencia a la Ampicilina (uso restringido a estudio de campo experimentales y no plantas comercializadas).
3. No pueden estar presente en ninguna especie vegetal GM.
Procesamiento del ADN.(BETZ,FUCHS, 2000)
Transferencia de genes desde el alimento modificado hacia las bacterias intestinales.(KUPFER ET AL, 1999)
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Ensayos de toxicologa aguda en animales, de las nuevas protenas sin historia alimentaria.(Si procede)
Ensayos toxicologa subcrnica o crnica de las nuevas protenas o del alimento completo.(Si Procede)
Estos estudios deben considerar:
- limitacin calrica del animal
- las consecuencias negativas de uso nico de un producto/alimento (desequilibrios nutricionales y efectos txicos por ingestin excesiva de un componente)
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ANLISIS TOXICOLGICO EN ANIMALES
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ESTUDIOS DE TOXICIDAD REALIZADOS A PROTENAS EXPRESADAS EN AGM COMERCIALIZADOS
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ESTUDIOS TOXICOLGICOS REALIZADOS A OGM.ENSAYOS CON ANIMALES
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EQUIVALENCIA NUTRICIONAL
Exmenes para la deteccin del gen insertado o la protena expresada por este gen. (leche, carne, huevos)
OGM 3ra generacin se debe considerar la diferencia de la composicin ( carotenoides, Vitaminas, cidos grasos, etc) y su efecto en el procesamiento sobre el
tenor de nutrientes o biodisponibilidad.
(EINSPAINER et al., 2001).
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EQUIVALENCIA NUTRICIONALPermite determinar la ocurrencia de problemas nutricionales cuando
el OGM es fuente crtica de nutrientes.
Est diseada a la demostracin de su equivalencia en Zootecnia.
Equivalencia al linaje parenteral.( Inocuidad)
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DESEMPEO DE ANIMALES ALIMENTADOS CON
CULTIVARES GM
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ANLISIS TOXICOLGICO (ALERGENICICAD Y TOXICIDAD)
el 90 % alergias alimentarias: man, soya, leche, huevo, pescado,crustceos, trigo, nueces (METCALFE et al.,1996).
Resistencia a la digestin, alta estabilidad trmica, homologa aaantignicos, resistencia a la glicosilacin
Identificacin de alrgenos y toxinas conocidas en las especiesdonantes y receptoras a travs de la homologa de secuenciasmediante el uso de bases de datos pblicas. Estudios bioinformtica6-8 aa, homologa protenas alergnicas)
Similitud de los nuevos productos expresados con alrgenosconocidos.
Ensayos inmunolgicos.
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ALERGENICIDAD.(RBOL DE DECISIONES)
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BSQUEDA DE INFORMACIN EN BASES DE DATOS
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool/Programainformtico de alineamiento de secuencias de tipolocal)
Creado por los institutos nacionales de salud de EE.UU.
Puede usarse desde el servidor del Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica (NCBI)
Utiliza un algoritmo heurstico.
Blastn, Blastp, PDB, PFAM, UniProt data, InterPro, Allergenic Database, Allergen Database for Food Safety, ect.
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BLAST (Programa informtico de alineamiento de secuencias de tipo local)
No garantiza que las secuencia que alinea
sean homlogas o que tengan la misma
funcin.
Su puntuacin depende del largo de la secuencia.
El eValor depende del tamao de la base de datos
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EFECTOS INTENCIONALES Y NO INTENCIONALES.
Alteraciones que puedan aparecer en varios niveles:
- morfologa de la planta y/o tejido.
- metabolismo, composicin qumica.
- influencia del medio ambiente sobre la expresin
gnica.
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EFECTOS NO INTENCIONALES DETECTADOS EN PRODUCTOS GM.
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PAISES Y MEGAPAISES PRODUCTORES CULTIVOS BIOTECNOLGICOS 2013FUENTE: CLIVE JAMES, 2013.
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SITUACIN MUNDIAL DE LOS CULTIVOS BIOTECNOLGICOS GM/2013
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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN