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DESARROLLO Y CARACTERIZACIN DE UN OGM

M S C . L Z A R O N E Z C R D E N A S

BIOTECNOLOGA MODERNA

Uruguay Dic-2014 2

- Enzimas de restriccin

- Ligasas

- Plsmidos - Agrobacterium tumefasien

Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio

de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la

naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)

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Conceptos bsicos relacionados a la Biotecnologa Moderna

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Desarrollo de un OGM

BIOTECNOLOGA MODERNA

Uruguay Dic-2014 15

- Enzimas de restriccin

- Ligasas

- Plsmidos - Agrobacterium tumefasien

Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio

de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la

naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)

DESARROLLO DE UN OVGM

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PLANTAS MICROORGANISMOS ANIMALES

ARNm

PROTEINA/ENZIMAS

METABOLITOS

ARNm

PROTEINA/ENZIMAS

METABOLITOS

ARNm

PROTEINA/ENZIMAS

METABOLITOS

Mtodos de obtencin en

animales

Microinyeccin pronuclear de ADN.

Manipulacin de clulas embrionarias.

Clonacin somtica. Transferencia de genes

mediada por espermatozoides

Vectores lentivirales

Mtodos de obtencin en plantas

Agrobacteriumtumefaciens.

Transferencia por polietilenglicol.

Microinyeccin. Tecnologa de

electroporacin de clulas intactas

Lanzagenes o biolistica.

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Ejemplos de Transgnesis en Animales

Transferencia de genes mediada por espermatozoides

Promotor ADNc del gen

XPA

Seleccin del donante de semen.

Colecta del semen.

Lavado de los espermatozoides y coincubacin con el ADN de inters.

Inseminacin artificial.

PA: Secuencia de corte y poliadenilacin

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Transferencia de genes mediada por

espermatozoides

Limitaciones de la SMGT.Se desconocen los eventos moleculares que

median la internalizacin del ADN en los

espermatozoides.

Es necesario evaluar un gran nmero de

sementales antes de encontrar uno con las

caractersticas adecuadas para el procedimiento.

Baja reproducibilidad.

Escepticismo.

ADN unido a espermatozoides

Blastosistos

multitransgnicosWebster NL, Lavitrano ML et al., (2005). Multi-transgenic pigs expressing three fluorescent proteins produced with high

efficiency by sperm mediated gene transfer. Mol Reprod Dev. 72:68-76

Microinyeccin pronuclear de ADN

Consiste en la microinyeccin directa de ADN desnudo en el

proncleo masculino de un embrin fertilizado.

Si el material gentico se integra en uno de los cromosomas

embrionarios, el animal nacer con esta nueva informacin en cada

clula.

El ADN forneo debe integrarse en el genoma antes de la duplicacin

del material gentico que precede al primer clivaje.

Construccin de un cassette de expresin para microinyeccin.

Promotor ADNc del gen X PA

Promotor PA

ADN genmico del gen X

PAPromotor gen

Xgen

Y

IRES

IRES: Internal ribosome entry

sitePA: Secuencia de corte y poliadenilacin

Microinyeccin pronuclear de ADN

50 m

Tratamiento hormonal para inducir la

maduracin de los folculos y la ovulacin.

Transferencia a hembra pseudogestada

Chequeo de la progenie para detectar las

cras transgnicas (PCR, Southern blot).

Cruzamiento de los transgnicos fundadores

para obtener una lnea homocigtica.

Colecta de los zigotos

Microinyeccin pronuclear del transgn

Microinyeccin pronuclear de ADNPasos para la generacin de un ratn transgnico por

microinyeccin.

Microinyeccin Pronuclear de ADN

Limitaciones de la Microinyeccin Pronuclear

1. Efecto de posicin:

Los transgenes se integran en zonas de la cromatina transcripcionalmente inactivas o silentes.

Los transgenes que se integran en secuencias codificantes nativas podran conducir a una discapacidad

o a la muerte del animal transgnico.

2. Integracin de mltiples copias:

Antes de que ocurra la integracin, los casetes de expresin pueden formar concatmeros de forma tal

que mltiples copias del transgn se integran en una posicin nica del genoma.

Estos concatmeros inducen silenciamiento mediado por metilacin de las citosinas o

heterocromatinizacin.

3. Eficiencia de integracin:

La eficiencia de integracin del transgen mediante MIP difiere significativamente entre las especies

[ratn (5%), conejo(5%), cerdo (2%), cabra y oveja (1%), vaca (-1%)].

Wells K., Moore K., Wall R., (1999). Transgene vectors go retro.Nat. Biotech. 17: 25-26.

Aplicaciones

Produccin de protenas recombinantes. (Cultivos Celulares)

Fibra Hueca

Rollers

Suspensin

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Aplicaciones

Produccin de protenas recombinantes.

Empleo de animales como biofactoras para la produccin de protenas recombinantes en fluidos corporales:

Sangre

Orina

Lquido seminal

Saliva

Leche

Fisiologa de la glndula

mamaria

Capacidad de sntesis: 2gr/leche por gr de tejido por da

Alta densidad celular: 2x108 clulas/gr de tejido (100 o

1000 ms alto que en cultivos celulares)

Produccin de leche 10-8 gr/clula/da

Animal Drug/protein Use

sheep alpha1 anti trypsin deficiency leads to emphysema

sheep CFTR treatment of cystic fibrosis

sheep tissue plasminogen activator treatment of thrombosis

sheep factor VIII, IX treatment of hemophilia

sheep fibrinogen treatment of wound healing

pig, tissue plasminogen activator treatment of thrombosis

pig factor VIII, IX treatment of hemophilia

goat human protein C treatment of thrombosis

goat antithrombin 3 treatment of thrombosis

goat glutamic acid decarboxylase treatment of type 1 diabetes

goat Pro542 treatment of HIV

cow alpha-lactalbumin anti-infection

cow factor VIII treatment of hemophilia

cow fibrinogen wound healing

cow collagen I, collagen II tissue repair, treatment of rheumatoid arthritis

cow lactoferrin treatment of GI tract infection, treatment of infectious arthritis

cow human serum albumin maintains blood volume

chicken, cow, goat monoclonal antibodies other vaccine production

AplicacionesProduccin de protenas recombinantes.

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Transgnesis en Plantas

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EJEMPLOS DE MTODOS DE OBTENCIN DE PLANTAS TRANSGNICAS

Biolgicos: Agrobacteriumtumefaciem o A. rhizogenes

Fsicos: Lanza genes o Biolstica

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ESQUEMA COMPARATIVO DE OBTENCIN DE PLANTAS TRANSGNICAS

Uruguay Dic-2014 32

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Nuevas Tecnologas de Obtencin de OGM

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CARACTERIZACIN MOLECULAR DE UN OGM

CARACTERIZACIN MOLECULAR DE UN OVGM

Proceso que integra el trabajo de diferentes especialistas:

Presentacin del expediente (Registro del producto)

Anlisis de laboratorio (Identificacin del OVGM)

Caracterizacin qumica estructural (aa, peso molecular, glicosilacin, estructura, 3D)

Caracterizacin funcional.

Digestibilidad/estabilidad.

Ensayos fisiolgicos y toxicolgicos (animales, agudos, subcrnicos, mutagenicidad, otros)

Alergenicidad e historial de uso.

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Uruguay 2014 49 Uruguay 2014 50

ANLISIS OVGM: CONCEPTOS

Caracterizacin: elucidar la estructura molecular del eventotransgnico en el sitio de insercin.

Deteccin: confirmar la presencia de los elementos genticosde un OGM respecto al T-ADN insertado. (promotor,

terminador).

Identificacin: confirmar la presencia de los elementosgenticos que son caractersticos de un evento transgnico

especifico y que permite determinar su presencia o no.

Cuantificacin : estimar el contenido del OGM.

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CMO IDENTIFICAR UN OVGM?

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IDENTIFICACIN

FENOTIPO

MTODOS BASADOS

ADN

MODIFICADO

MTODOS BASADOS

EN LA PROTEINA

EXPRESADA

La mayora de los OVGM

comercializados, presentan

idntica apariencia a su contraparte tradicional

Las diferencias genticas pueden

ser determinadas con el anlisis de

las secuencias del ADN (si es conocida)

La nueva protena expresada

puede ser detectada por mtodos

inmuno enzimticos

ESTRATEGIA DE DETECCIN DE UN OVGM

Uruguay Dic-2014 53

Mtodos de anlisis

Bio analticosQumicos

(cidos Grasos)

(Estructura de la fibra)

(HPLC/GC)

Biolgicos

(Toda la Planta) (Ensayos inmunolgicos)

Protenas(Ensayos inmunolgicos)

ADN

(PCR)

FenotipoGenotipo

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Material crudo IngredienteProducto final

Procesamiento Procesamiento

Muestra laboratorio

Muestra anlisis/

muestra analtica

ADN

Protena

extraccin

extraccin

Preparacin muestra

/homogenizacin

Identificacin y

semicuantificacin

OGM

ELISA/STRIP

a) Deteccin OGM

b) Identificacin OGM

c) Cuantificacin OGM

PCR cualitativo

PCR cuantitativo

Procedimientos para la deteccin de un OVGM

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ANLISIS DE OVGM BASADO EN ENSAYOS INMUNO ENZIMTICOS

Uruguay Dic-2014 55

ANLISIS DE OGM BASADO EN PCR

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VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS ADN& PROTENAS

Uruguay Dic-2014 57 Uruguay Dic-2014 58

OTRAS VAS DE CARACTERIZACIN DE UN OGM

ANLISIS DE RIESGO=EVALUACIN INOCUIDAD

1. Efecto pleiotrpicos. 2. Metablicos.

3. Mutacionales.4. Efectos y propiedades nueva(s) protena(s)

expresadas.5. Composicin, valor nutricional.

6. Toxinas y anti-nutrientes naturales del alimento.

Equivalencia Sustancial!

OECD (Organizacin para cooperacin econmica y el desarrollo 1993)

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MARCO DE LA EVALUACIN DE LA INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

(045 DIRECTRICES CODEX ALIMENTARIUS)

A) Descripcin de la planta de ADN recombinante;B) Descripcin de la planta base y de su utilizacin como

alimento;C) Descripcin del organismo u organismos donantes;D) Descripcin de la modificacin o modificaciones genticas;E) Caracterizacin de la modificacin o modificaciones

genticas;

F) Evaluacin de la inocuidad:a) sustancias expresadas (sustancias distintas de cidos nucleicos);b) anlisis de los componentes esenciales;

c) evaluacin de los metabolitos;

d) elaboracin del alimento;e) modificacin nutricional; y

G) Otras consideraciones.

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ES(1993-2002-2013)

1. IDENTIDAD.

2. LA FUENTE DE ORIGEN Y LA COMPOSICION DEL OGM.

3. PROCESO DE TRANSFORMACIN.

4. EL PRODUCTO DE LA EXPRESIN DEL NUEVO ADN.(alergenicidad y toxicidad)

5. POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS EXPRESIN GEN.(micro-nutrientes crticos anti-nutrientes, factores txicos endgenos, alrgenos, etc.)

OECD/FAO/WHO, 2000,2002 OEM, EFSA 2012

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APLICACIONES DE LA ES.

1. El alimento o ingrediente AGM es sustancialmenteequivalente al anlogo convencional, en cuanto a su

composicin qumica, aspectos agronmicos ytoxicolgicos.

2. El alimento o ingrediente AGM es sustancialmente

equivalente al anlogo convencional, excepto poralgunas pocas diferencias definidas con claridad.

3. El alimento o ingrediente AGM NO es sustancialmente

equivalente al anlogo convencional.

DONALDSON, MAY, 1999.

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EVALUACIN DE LA ES DE AGM

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ANLISIS ES RESPECTO A EFECTOS DEL PROCESAMIENTO

ANLISIS DEL ADN INSERTADO

Gen de seleccin (0,1-1 g ADN/da vs 0,000001 g ADNr).(JONAS ET AL 2001; EFSA 2004)

1. Genes de resistencia Kanamicina e Higromicina

2. Genes de resistencia a la Ampicilina (uso restringido a estudio de campo experimentales y no plantas comercializadas).

3. No pueden estar presente en ninguna especie vegetal GM.

Procesamiento del ADN.(BETZ,FUCHS, 2000)

Transferencia de genes desde el alimento modificado hacia las bacterias intestinales.(KUPFER ET AL, 1999)

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Ensayos de toxicologa aguda en animales, de las nuevas protenas sin historia alimentaria.(Si procede)

Ensayos toxicologa subcrnica o crnica de las nuevas protenas o del alimento completo.(Si Procede)

Estos estudios deben considerar:

- limitacin calrica del animal

- las consecuencias negativas de uso nico de un producto/alimento (desequilibrios nutricionales y efectos txicos por ingestin excesiva de un componente)

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ANLISIS TOXICOLGICO EN ANIMALES

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ESTUDIOS DE TOXICIDAD REALIZADOS A PROTENAS EXPRESADAS EN AGM COMERCIALIZADOS

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ESTUDIOS TOXICOLGICOS REALIZADOS A OGM.ENSAYOS CON ANIMALES

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EQUIVALENCIA NUTRICIONAL

Exmenes para la deteccin del gen insertado o la protena expresada por este gen. (leche, carne, huevos)

OGM 3ra generacin se debe considerar la diferencia de la composicin ( carotenoides, Vitaminas, cidos grasos, etc) y su efecto en el procesamiento sobre el

tenor de nutrientes o biodisponibilidad.

(EINSPAINER et al., 2001).

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EQUIVALENCIA NUTRICIONALPermite determinar la ocurrencia de problemas nutricionales cuando

el OGM es fuente crtica de nutrientes.

Est diseada a la demostracin de su equivalencia en Zootecnia.

Equivalencia al linaje parenteral.( Inocuidad)

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DESEMPEO DE ANIMALES ALIMENTADOS CON

CULTIVARES GM

Uruguay Dic-2014

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ANLISIS TOXICOLGICO (ALERGENICICAD Y TOXICIDAD)

el 90 % alergias alimentarias: man, soya, leche, huevo, pescado,crustceos, trigo, nueces (METCALFE et al.,1996).

Resistencia a la digestin, alta estabilidad trmica, homologa aaantignicos, resistencia a la glicosilacin

Identificacin de alrgenos y toxinas conocidas en las especiesdonantes y receptoras a travs de la homologa de secuenciasmediante el uso de bases de datos pblicas. Estudios bioinformtica6-8 aa, homologa protenas alergnicas)

Similitud de los nuevos productos expresados con alrgenosconocidos.

Ensayos inmunolgicos.

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ALERGENICIDAD.(RBOL DE DECISIONES)

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BSQUEDA DE INFORMACIN EN BASES DE DATOS

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool/Programainformtico de alineamiento de secuencias de tipolocal)

Creado por los institutos nacionales de salud de EE.UU.

Puede usarse desde el servidor del Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica (NCBI)

Utiliza un algoritmo heurstico.

Blastn, Blastp, PDB, PFAM, UniProt data, InterPro, Allergenic Database, Allergen Database for Food Safety, ect.

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BLAST (Programa informtico de alineamiento de secuencias de tipo local)

No garantiza que las secuencia que alinea

sean homlogas o que tengan la misma

funcin.

Su puntuacin depende del largo de la secuencia.

El eValor depende del tamao de la base de datos

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EFECTOS INTENCIONALES Y NO INTENCIONALES.

Alteraciones que puedan aparecer en varios niveles:

- morfologa de la planta y/o tejido.

- metabolismo, composicin qumica.

- influencia del medio ambiente sobre la expresin

gnica.

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EFECTOS NO INTENCIONALES DETECTADOS EN PRODUCTOS GM.

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PAISES Y MEGAPAISES PRODUCTORES CULTIVOS BIOTECNOLGICOS 2013FUENTE: CLIVE JAMES, 2013.

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SITUACIN MUNDIAL DE LOS CULTIVOS BIOTECNOLGICOS GM/2013

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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN