Rcv. Med. Univ. Navarra, XVI: 217, 1972
UNIVERSIDAD DE NAVARRA. FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIONES MEDICAS
(CENTRO COORDINADO DEL C.S.I.C.)
Caracterización estructural de la proteína C reactiva
NÍ. Pérez Miranda* y P. Liso lrurzun
RESUMEN
Se ha aislado la proteína C reactiva (PCR) contenida en líquido ascítico humano, por medio de precipitación con SO, (NHa}2 y posterior cromatografía en DEAE-celulosa. La PCR aislada ha sido fraccionada sucesivamente, mediante su incubación con urea SM y mercaptoetanol. Las características inmunoelectroforéticas, antigénicas y de ultracentrifugación de la molécula completa y de sus fragmentos han sido analizadas. El peso molecular de PCR ha sido 135.000 (7, 4 S); el de las fracciones obtenidas con urea SM (PCR-U), 21.000; el de las obtenidas tras la acción del mercaptoetanol (PCR-M), 23.000; finalmente, el de las tratadas sucesivamente con urea y mercaptoetanol (PCR-2F), 10.000.
Los fragmentos PCR-U conservan las características antigénicas e inmunoelectroforéticas de la PCR. Por el contrario, los fragmentos PCR-M mostraron haber perdido las características específicas de la PCR. Estos resultados sugieren que la PCR está formada por 6 unidades que contienen en su interior un puente S-S, tendido entre dos subfragmentos iguales, y que están unidas 'entre sí, en forma circular, por medio de puentes H-H, para constituir la molécula completa.
La significación fisiológica de la proteína C reactiva sigue siendo desconocida. Esta proteína ha sido identificada en los sueros patológicos, en el curso de muy diversos cuadros clínicos 28 • Pero nos-
(*) Trabajo realizado con una Ayuda de Investigación del Ministerio de Educación y Ciencia.
otros pudimos demostrar que esta proteína se encuentra también en los sueros normales, siendo posible demostrarla en ellos mediante su precipitación en agar por medio de un antisuero específico 22• El análisis antigénico de esta proteína de los sueros normales evidenció su completa independencia de las restantes clases de inmuhoglobulinas u. Por in-
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munoelectroforesis pudo demostrarse igualmente que sus características electroforéticas son distintas de las inmunoglobulinas, dibujándose el arco de precipitación correspondiente a esta proteína entre los de la Ig A e Ig G. 2•
11•
28•
32• Las
pequeñas diferencias existentes en las características de su migración electroforética, pudimos demostrar también que son debidas solamente a diferencias de su concentración sérica 11 •
Dadas las características inmunoelectroforéticas de la proteína e reactiva, que son las de una gamma globulina, y la importante misión que esta substancia desempeña en los procesos infecciosos, en los que parece jugar un pape1 defensivo humoral 2• 28 , sugerimos la posibilidad de que ella fuese una inmunoglobulina 22.
Habla a favor de esta interpretación el hecho de que una proteína idéntica a la que se detecta en los sueros humanos, se encuentra también en los sueros de diversos animales estudiados 1• 28 .
Aunque estas razones son suficientes para admitir que el papel fisiológico de la proteína C reactiva sea semejante al de una inmunoglobulina, no pueden considerarse como una demostración 6• Todas las inmunoglobulinas hasta ahora conocidas tienen una composición estructural semejante 9• 16• La estructura fundamental de las mismas la constituye una unidad formada por cuatro cadenas pelipeptídicas, iguales dos a dos : dos cadenas ligeras o L, de un peso molecular de alrededor de 20.000 y dos cadenas pesadas o H, de un peso ·molecular variable entre 40.000 y 60.000 3• 4• 30• Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas de distintas clases son iguales entre sí, mientras que las cadenas pesadas son distintas, no mostrando comunidad antigénica con las de otras clases de inmunoglobulinas 15, 25 ,21 .
Por estas razones continuamos nuestras investigaciones sobre la proteína e reac-
tiva con un estudio encaminado a caracterizar la composición estructural de esta proteína. Como se comunica en una publicación inmediata 21 , pudimos demostrar que la proteína C reactiva es una substancia de compos1c1on compleja, constituida por subunidades elementales más simples. Estas unidades elementales están unidas entre sí por enlaces no convalentes, del tipo de puentes de hidrógeno, y por enlaces convalentes de puentes disulfuro.
En el presente trabajo se ha hecho un estudio de las características de ultracentrifugación de los fragmentos obtenidos por reducción con mercaptoetanol y por disociación con urea 8-m. Al mismo tiempo se ha caracterizado por ultracentrifugación el peso de la molécula completa y se han analizado por inmunodifusión e inmunoelectroforesis sus caraeterísticas antigénicas.
MATERIAL Y MÉTODOS
l. Ultracentrifugación
La ultracentrifugación de las diversas muestras objeto del estudio fue hecha de acuerdo con la clásica sistemática de Pedersen 20, en la que se introdujeron algunas modificaciones condicionadas por la ultracentrífuga utilizada 7 o por el tipo de muestras proteicas que se utilizaron 33 •
Para este estudio se utilizó la ultracentrífuga Spinco-E, de Beckman Instruments Corp. Se usó el rotor analítico D, que permitió utilizar 42.040 r. p. m. y 59.780 r. p.m. (equivalentes a 261.600 g). Se utilizó el sistema óptico de lentes cilíndricos. Ello obligó a hacer una concentración de las muestras de un mínimo de 20 mgr. por ml. Para conseguir esta concentración fue necesario concentrar los eluídos cromatográficos por pervapo. ración.
La sistemática seguida en las operaciones de ultracentrifugación fue la habitual
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en este tipo de estudios. Las fotogra fías de los distintos "picos" se hicieron en placa metalográfica ortocromática Kodak, que se reveló con D-76. Los intervalos entre cada fotografía fueron de 8 minutos. La constante de sedimentación se
dx/dt calculó según la fórmula S = ----
con corrección de temperatura para 20º c.
2. Cálculo del Peso Molecular
Se hizo a partir del valor de Ja constante de sedimentación corregida a 20º C (S2o), siguiendo la fórmula siguiente 17• 31• Peso Molecular = R. T. S20 / D (1 - V p), en la que R, es la constante de los gases ; T, la temperatura absoluta ; D, la cons-tante de difusión; V, el volumen específico parcial y p, la densidad del solvente. Se consideró un volumen específico parcial de 0,75 como corresponde a las proteínas y una densidad de solvente de l. (0,15 M cloruro sódico).
3. Reducción de puentes disulfuro (S-S)
Se hizo mediante el tratamiento de las preparaciones con mercaptoetanol 8· 10).
4. Rotura de puentes de hidrógeno
Puesto que habíamos comprobado que es posible romper la molécula de proteína C reactiva en unidades más elementales mediante el tratamiento de la misma con urea hipermolar, utilizando de nuevo este método para obtener estas fracciones. La sistemática seguida ahora ha sido, igualmente, la de Slobin y Sela 29•
5. Inmunosueros monoespecíficos
Los hemos obtenido mediante inmunización de conejos con las preparaciones proteicas correspondientes. Antisueros
monoespecíficos frente a PCR, a las inmunoglobulinas y frente a cadenas ligeras y pesadas de Ig G, fueron obtenidos de fuente comercial.
6. Análisis antigénico por inmunodifusión
Se realizó con el método de Ouchterlo. ny 18, en la forma habitual en nuestro laboratorio 23 , :u.
7. Obtención de proteína C reactiva
Se realizó siguiendo la pauta de Hokama y Riley 14 que ya ha sido descrita detalladamente en---informes precedentes. Se utilizó igualmente líquido ascítico, como fuente de proteína C.
8. Test de Latex para determinación de proteína e reactiva
Con objeto de disponer de un método más sensible de identificación de las características antigénicas de la PCR que el de la precipitación en agar, se utilizaron partículas de latex recubiertas de antisuero anti-PCR. Se utilizó un equipo de latex y de buffer de reacción que se obtuvo de fuente comercial (Hyland Lab., Los Angeles). Se siguió la sistemática de reacción que recomienda la casa comercial suministradora.
RESULTADOS
l. Selección de preparaciones cromatográficas de PCR
Con objeto de disponer de suficiente cantidad de proteína e reactiva para poder hacer la ultracentrifugación y las experiencias de fragmentación, fue necesario proceder a su aislamiento cromatográfico un total de 8 veces. Se utilizaron otras tantas preparaciones distintas de precipitados de líquido ascítico. Los resultados obtenidos en esta etapa del trabajo fue-
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ron semejantes a los que ya fueron descritos en un informe precedente 21 •
Durante la purificación de las preparaciones, en la segunda columna de DEAEcelulosa, con gradiente de pH y de fuerza iónica, se obtuvo siempre una gráfica como la que se reproduce en la figura l. Como en ella puede observarse, se obtuvieron 3 fracciones diferentes. La fracción I era la que contenía contaminantes proteicos que no mostraron características antigénicas de PCR. Las fracciones Il y III mostraron ambas características de PCR, tanto por inmunodifusión en gel de agar como por medio del test de latex. La fracción II fue cuantitativamente la más importante aunque por su proximidad con la fracción I mostró contener contaminantes de otras proteínas séricas en su porción inicial (fig. 2).
En las pruebas de ultracentrifugación se usó esta fracción, que era cuantitativamente la más importante después de concentrada hasta un total de 20 veces.
z o -- E u c.. z o
X
LIJ
.. . 1
'º 20
Antes de hacer la concentración se eliminaron los tubos correspondientes al primer tramo del pico, para evitar los contaminantes que se habían detectado en ellos. Para las pruebas de reducción se usaron mezclas de la fracción II y de la fracción III, puesto que todas ellas mostraron ser antigénicamente idénticas. Al enfrentar estas preparaciones a los antisueros monoespecíficos dirigidos frente a cada una de las inmunoglobulinas y frente a la albúmina, pudo comprobarse la ausencia de comunidad antigénica de esta preparación con estas otras proteL nas séricas (fig. 3).
2. Fraccionamiento de las preparaciones de PCR
Se hicieron tres distintos tipos de fraccionamiento:
a) Fraccionamiento en columna de Sephadex equilibrada con urea 8 M.;
DEAE- CELULOSA
11
JO 40 50
TUBOS
Fig. 1. Gráfica de la elución de PCR durante la purificación cromatográfica en DEAE-celulosa, con gradiente iónico y de pH.
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Fig. 2. Inmunodifusión de los picos I, lI" y III de la cromatografía, precipitados por antiSHN y anti-PCR.
b) Fraccionamiento por reducción con mercaptoetanol;
c) Fraccionamiento sucesivo con urea 8 M y con mercaptoetanol.
a) Fraccionamiento con urea 8 M: Una porción del total de PCR de las fracciones II y III fue dializada contra urea 8 M y filtrada en Sephadex G-200. La lectura del contenido proteico del eluído mostró un solo pico, siendo la gráfica de delución semejante a la que se reproduce en la figura 4. El pico obtenido de esta forma fue concentrado por pervaporación 10 veces. El test de Latex para proteína e reactiva dio un título de positividad de este concentrado de 1/4. A esta fracción se la denominó PCR-U y con ella se inmunizaron 2 conejos.
b) Frriccionamiento con mercaptoetanol:
Fig. 3. Inmunodifusión de una mezcla de los picos ll y 111 (en el centro) frente a antisueros anti-SHN y antiinmunoglobulinas.
Se procedió de la manera que ha sido descrito en la sección correspondiente utilizándose igualmente una mezcla de las fracciones II y III de PCR. Como resultado de la filtración final en columna de Sephadex se obtuvo igualmente un único pico. El eluído se concentró por pervaporación 10 veces. El test de Iatex para proteína C reactiva fue negativo con estas preparaciones, que fueron denominadas PCR-M. Con esta preparación se inmunizaron otros 2 conejos.
c) Fraccionamiento combinado: Una parte de las preparaciones PCR-U fueron tratadas también con mercaptoetanol. Como resultado final se obtuvo igualmente un eluido que mostró contener solamente un pico proteico. El test de Latex de estas preparaciones dio, como en el caso anterior, un resultado negativo.
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z o u z I
X
lJ.J
1 1
BMU-Seph.
----- ----' ' '
TUBOS
Fig. 4. Elución en columna de Sephadex G-200 equilibrado con urea 8 M, de una mezcla de los picos II y lll.
Estas preparaciones fueron denominadas PCR-2F, para indicar el doble fraccionamiento que se había realizado en ellas.
3. Análisis antigénico diferencial de PCR y de sus fracciones
Por medio de la inmunodifusión se enfrentaron las distintas fracciones a los antisueros anti-PCR, anti-PCR-U y antiPCR-M.
Con el suero anti-PCR enfrentado a todas las demás fracciones sólo se consiguió precipitación frente a PCR y frente a PCR-U (fig. 5A).
Con el suero anti-PCR-U, el resultado fue idéntico al obtenido en el caso precedente (fig. 5B).
Con el suero anti-PCR-M sólo se obtuvo la formación de precipitación frente a PCR-M y frente a PCR-2F, mientras que el resultado fue negativo con las otras dos preparaciones (fig. 5C).
4. Resultados de la ultracentrifugación
El cálculo del peso molecular por ultracentrifugación, realizado según las fórmulas que hemos referido, dio los si-
Fig. 5A). fracciones.
Anti-PRC frente a las distintas
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Fig. 5B). Anti-PCR-U
guientes valores: La preparac10n de PCR completa, 135.000. Las preparaciones de PCR-U, un peso molecular de 21.000. Las preparaciones de PCR-M un peso molecular de 23.000. Las preparaciones de PCR-2F, un valor de peso molecular de 10.000.
DISCUSIÓN
Los resultados que hemos obtenido hasta ahora evidencian que la PCR es una proteína compleja compuesta de subunidades. Por medio de la reducción con urea SM hemos obtenido una substancia homogénea, de un peso molecular aproximadamente 6-7 veces menor que el de la molécula completa y que presenta las mismas propiedades antigénicas que ella. Como la urea lo que hace es romper las uniones no covalentes 29, ello significa que estas unidades de peso molecular más pequeño y que conservan las mismas propiedades antigénicas pueden haberse reunido entre sí espontáneamente, o bien a consecuencia del proceso físico de obtención de proteína e reactiva, o bien como consecuencia de las circunstancias
patológicas diversas que hacen que esta proteína se presente en el suero en cantidad considerable. Efectivamente, la posibilidad de que la acción del calor, cambios de pH, etc., den lugar a agregados macromoleculares de esta substancia ha sido comunicado 5 •
Sin embargo, la gran constancia de presentación de la agregación molecular en dos líquidos ascíticos que fueron utilizados para su obtención, sugieren que en este líquido estuviese ya en forma macromolecular. Ello explicaría las diferentes características inmunoelectroforéticas que esta substancia ha mostrado tener en sueros de pacientes con procesos patológicos distintos 2• 19.
En cualquier caso, estas unidades estructurales fundamentales son todas idénticas, puesto que la filtración en Sephadex proporcionó único pico. La reducción con mercaptoetanol dio lugar también a la aparición de unidades idénticas entre sí con un peso molecular aproximadamente igual, de 23.000.
Estas subfracciones, en cambio, no tienen las mismas propiedades antigénicas que la PCR y no pudieron dar lugar a la
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aglutinación del latex, a pesar de que Ja concentración de las preparaciones se hizo en las mismas condiciones que la de las preparaciones obtenidas bajo la acción de la urea, 8M. Como la redueción con mercaptoetanol lo que hace es romper uniones S-S 13• 16• 27, los resultados que hemos obtenido evidencian que en Ja molécula de PCR existen estos puentes disulfuro y que su rotura lleva consigo la pérdida de las características antigénicas de la proteína. Cuando hicimos el doble fraccionamiento, obtuvimos fragmentos que tienen un peso molecu. lar de 10.000, siendo todos ellos idénticos y careciendo igualmente de las propiedades antigénicas de la molécula completa. Según estos resultados podría suponerse que la unidad fundamental de
p. m. 21.000, y que a su vez está compuesta de dos unidades idénticas, que se unen entre sí por una unión disulfuro. Sin embargo, no es posible decidir aún si esta unidad fundamental se presenta como tal en el suero o sólo en forma de un agregado macromolecular de un peso molecular 6 ó 7 veces superior, o por acción de diversas circunstancias patológicas. Puesto que la proteína C reactiva es posible detectarla en el suero normal 11 • n habría que hacer el estudio que hemos realizado usando una preparación de CPR obtenida de un pool de s~elos normales. De esta manera, podría saberse si la formación macromoJecular es espontánea o está condicionada por una circunstancia patológica.
SuMMARY
Structural Aspects of C Reactive Protein
C-Reactive Protein (CRP), contained in human ascitic fluid, has been isolated by means of precipitation witb (NHa)z SQ4 and afterwards with Cellulose-DEAE chromatography. The CRP thus isolated was successfully fractionated by incubation in 8M Urea with mercaptoethanol. The immunoelectrophoretic, antigenic and ultracentrifugal characteristics of the complete molecule and its fragments were ana!ysed. 135,000 (7,4S) was found to be the molecular weight of CRP; 21,000 that of fractions obtained with 8M Urea; 23,000, that obtained after the action of mercaptoethanol (CRP-M); and finally 10,000, that of
the fractions treated successfully with urea and mercaptoethanol (CRP-2.F). The CRP-U fragments retain the antigenic and immunoelectrophoretic characteristics of the CRP. On the contrary, the CRP-M fragments show a loss of the specific characteristics of CRP. These results suggest, therefore, that the CRP is formed by six units of which contain an S-S bond in its interior, shared between two equal fragments and that they are in themselves united in a circular manner, by means of H-H bonds to form a complete molecule.
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