Approche Diagnostique des
Infections Fongiques Invasives
Frédéric Lamoth, M.D.
Service des Maladies Infectieuses
Institut de Microbiologie
CHUV, Lausanne
Bactériologie
VirologieParasitologie
Laboratoire de Microbiologie
Place de la Mycologie
Les Champignons sont partout !
Mycoses Superficielles / Localisées4ème maladie la plus fréquente (1 billion d’individus / an)
Pytiriasis versicolor
(Malassezia furfur)
Tinea nigra
(Hortaea werneckii)Onychomycosis
(Trichophyton rubrum)
Phaeohyphomycosis
(Exiophiala jeanselmei)
Atteintes cutanées / sous-cutanées
Fungal keratitis
(Fusarium solani)
Atteintes muqueuses / oculaires
Oral candidiasis
(Candida albicans)
1 million de cas
de cécité / an
Infections Fongiques Invasives
300 millions d’individus / an
1.3 millions de décès
Mycoses endémiques
Histoplasmose
Blastomycose
Coccidioidomycose
Paracoccidioidomycose
Mycoses opportunistes
Pneumonie à Pneumocystis
Cryptococcose
Pénicilliose (P. marneffei)
Candidiase invasive
Aspergillose invasive
Mucormycose
Fusariose
Diagnostic des Infections Fongiques Invasives
Facteurs de
l’hôte
Critères
cliniques
Critères
mycologiques
1 1+
Possible
1 1+
Probable
1+
Classification selon EORTC-MSG
Ascioglu et al. Clin Infect Dis 2002; 34:7-14, De Pauw et al. Clin Infect Dis 2008: 46:1813-21
Histopathologie / culture
sites stérilesProuvée
Critères Mycologiques
Type Test
Direct Microscopie
Histologie
Culture
Indirect Galactomannane
Beta-D-Glucan
Mannane / Anti-mannane
Antigène Crypto
Antigène Histoplasma
PCR
Espèce HSCT SOT
Aspergillus spp. 65% 63%
Mucorales 12% 8%
Fusarium spp. 5%22%
Other molds 10%
Unspecified 8% 7%
Infections à Champignons Filamenteux
Incidence cumulative des infections fongiques invasives
chez patients à risques (onco-hématologiques, transplantés
d’organes): 2 – 8% / an
Champignons filamenteux: 30-60%
Kontoyiannis et al., Clin Infect Dis 2010; 50:1091-1100
Pappas et al., Clin Infect Dis 2010; 50:1101-1111
Aspergillose
Degré d’invasion
Immunité
normale
Traitement
stéroïde
Transplantation
organes solides
Greffe de moelle
allogénique
Aspergillose
broncho-
pulmonaire
allergique
Aspergillose
pulmonaire
chronique
Aspergillose
invasive
Degré d’immunosuppression
Neutropénie
Nodule isolé
Forme fibrosante
Forme nécrosante
Aspergillome
Pneumopathie
chronique
Spectre de présentation clinique
Subgenus Section
Circumdati Circumdati, Flavi, Candidi, Flavipedes, Nigri, Terrei
Nidulantes Nidulantes, Usti, Ochraceorosei, Sparsi
Fumigati Fumigati, Clavati, Cervini
Aspergillus Cremei, Restricti, Aspergillus
Famille des Trichochomaceae
3 Lignées: Aspergillaceae, Thermoascaceae, Trichochomaceae
14 clades
Clade: Aspergillus (Env. 344 espèces)
Autres clades:
Penicillium, Penicilliopsis, Paecilomyces, Rasamsonia, Monascus,
Phialomyces, Thermoascus, Talaromyces, Trichocoma,
Thermomyces, Sclerocleista, Sagenomella, Hamigera
Aspergillus spp.
Culture - Identification
Macroscopique
Examen morphologique
Microscopique
Identification à la
section
Séquençage rDNA (ITS, 18S, 26S/28S)
Séquençage gènes spécifiques (beta-tubuline
+/- calmoduline)Identification à
l’espèce
Lab
ora
toir
e
sta
nd
ard
Lab
ora
toir
e
sp
écia
lisé
MALDI-TOF (section et espèce !?)
Lab
ora
toir
e
Bio
l. M
ol.
Aspergillose Invasive
PATH Alliance SENTRY (HSCT) SENTRY (SOT)
A. fumigatus 73% A. fumigatus 59% A. fumigatus 64%
A. flavus 10% A. niger 11% A. flavus 8%
A. niger 9% A. flavus 10% A. niger 6%
A. terreus 4% A. terreus 7% A. terreus 5%
mixtes, autres 4% mixtes, autres 13% mixtes, autres 17%
Leader: A. fumigatus
Outsiders: A. flavus, A. niger, A. terreus
Marginaux: A. nidulans, A. ustus, A. versicolor, A. glaucus…
Steinbach WJ et al. J Infect 2012; 65:453-64
Kontoyiannis DP et al. Clin Infect Dis 2010; 50:1091-100
Pappas PG et al. Clin Infect Dis 2010; 50:1101-11
Aspergillus Section Fumigati
Première cause de l’aspergillose invasive (75-90%)
63 espèces: anamorphes: Aspergillus (ex.: A. fumigatus)
téléomorphes: Neosartorya (ex.: N. fischeri)
A. fumigatus 95-97% des cas d’AI
Formes cryptiques
A. lentulus
A. udagawae
A. viridinutans/felis
A. thermomutatus
…
Rares AI (3-5%)
Défaut de sporulation
Moins de thermotolérance
Résistance naturelle aux
azoles !
A. felis: aspergillose sino-orbitale chez chats / chiens
Aspergillus Section Flavi
Deuxième cause de l’aspergillose invasive (10%)
Première cause d’aspergillose sinusale ou cérébrale dans certaines
régions du monde (Asie, Afrique, Moyen Orient)
Fléau de l’agriculture (contamination des céréales, aflatoxine)
A. flavus Principal pathogène de la
section
Formes
cryptiques
A. alliaceus
A. tamarii
A. oryzae
…
Rares « case reports »
d’infection
Résistance à l’amphotéricine
B (A. alliaceus)
Aspergillus Section Nigri
Rare cause (5-10%) d’aspergillose invasive
La cause d’otite externe fongique
« Black mold » (fruits, légumes, cuir, murs, papiers peints)
Production d’acide oxalique (atteinte rénale)
Ochratoxine A (A. carbonarius, pourriture du raisin)
Champignon domestique (acide citrique, amylases)
Fréquent contaminant des laboratoires
A. niger Otite externe, endocardite,
aspergillose invasive
Formes cryptiques
A. tubingensis
A. awamori
A. carbonarius
A. brasiliensis
…
Jusqu’à 50% des isolats
cliniques
Quelques cas d’infection
décrits
Aspergillus Section Terrei
Rare cause d’aspergillose invasive (5-10%)
Historiquement: haute mortalité (réfractaire aux traitements)
Résistance intrinsèque à l’amphotéricine B
Source initiale de la mévinoline (lovastatine)
Champignon domestique: production d’acide itaconique
(peintures, cosmétiques)
A. terreus Le plus fréquent en clinique
Aspergillose pulmonaire invasive
Autres infections (ostéomyélites)
Formes cryptiques
A. citrinoterreus
A. alabamensis
Pathogènes potentiels (rares)
Aspergillus Section Usti
Rare cause d’aspergillose invasive (<3%)
Pathogène émergent
Majorité des cas observés sous prophylaxie de triazoles
Résistance intrinsèque aux triazoles
(Sensibilité diminuée aux autres antifongiques)
Colonise les systèmes de distribution d’eau
Infections fongiques réfractaires aux traitements
(infections disséminées extrapulmonaires: cutanées primaires)
A. calidoustus Seul pathogène reconnu de
la section
Formes cryptiques
A. ustus
A. insuetus
A. granulosus
…
Non pathogènes (?)
(Non thermotolérants)
Aspergillus Section Nidulantes
Aspergillus (Emericella) nidulans
Champignon « modèle » de laboratoire
2ème cause d’aspergillose invasive chez les
patients atteints de maladie granulomateuse
chronique (atteintes pulmonaires, osseuses)
Très rare chez les autres populations
immunosupprimées (neutropéniques,
SOT…)
Cause d’eumycétome en régions tropicales
Sensibilité diminuée à l’amphotéricine B
Test Detection Site
Galactomannan
Platelia EIA (Bio-Rad)
Aspergillus
(Fusarium, Histoplasma)
Serum, LBA,
LCR
Beta-D-Glucan
Fungitell (ACC)
Wako / Maruha
Fungitec-G (Seikagaku)
Aspergillus, Candida, Others
Exceptions: Mucorales,
Cryptococcus
Serum
PCR
« Home-made »
qq kits commerciaux
Aspergillus-Specific
Multiplex Aspergillus / Mucor
Panfungal
Serum, Plasma
LBA
Tissus
Marqueurs Fongiques
Marqueurs Fongiques - Serum
Performance (Meta-Analyses)
Test Author (Year) Sensitivity Specificity
Galactomannan Pfeiffer (2006)
Leeflang (2008)
61
78
93
81
Beta-D-Glucan Karageorgopoulos (2011)
Lu (2011)
Lamoth (2012)
Onishi (2012)
77
76
62
80
85
85
91
82
PCR Mengoli (2009)
Arvanitis (2015)
88
84
75
76
PCR or
Galactomannan
Arvanitis (2015) 99 64
Patients onco-
hématologiques
Transplantés d’organes
solides
Galactomannane (Se / Sp)
58 / 95 41 / 85
Beta-glucan (Se / Sp)
62 / 91 (71 / 59)
Marqueurs Fongiques - Serum
Performance Variable
Une valeur Deux valeurs
consécutives
Galactomannane (Se / Sp)
97 / 90 92 / 97
Beta-glucan (Se / Sp)
62 / 91 50 / 99
Performance
(Se et Sp)
médiocre !
Se
Sp ~ 100% !
Marqueurs Fongiques - LBA
Performance (Meta-Analyses)
Test Author (Year) Sensitivity Specificity
Galactomannan Guo (2010)
Zou (2012)
Heng (2015)
85
86
92
94
95
98
PCR Sun (2011)
Avni (2012)
91
90
92
96
PCR or
Galactomannan
Avni (2012) 97 98
Performance similaire dans diverses populations (HM, SOT…)
Onco-Hem
Autres IS
Exclusion “Zone grise” Confirmation
- Negatif
1x positif
2x positif
- Negatif
Positif
Marqueurs Fongiques – Interprétation ?
Exclusion “Zone grise” Confirmation
Negatif Positif
0.5 - 3
Positif ≥3
SERUM (GM, BDG)
LBA (GM)
Onco-HEM et
autres IS
2x ?
CAVE:
Mucormycose !
Faux pos ?
Mucormycose
Mucorales
Mucor spp.
Rhizopus spp.
Rhizomucor spp.
Lichtheimia spp. (Absidia spp.)
Cunninghamella spp.
Atteinte rhino-sinusal, pulmonaire
Patients diabétiques ou immunocompromis
Résistances multiples (voriconazole; échinocandines)
Traitement: amphotéricine B, isavuconazole, (posaconazole)
Mucormycose - Diagnostic
Test Utilité
Culture ? OUI (sensibilité médiocre)
Galactomannan ? NON
Beta-Glucan ? NON
PCR ? OUI
Millon L et al. Clin Infect Dis 2013; 56:95-101.
Millon L. et al. Clin Microbiol Infect 2015 (in press)
PCR multiplex (Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Lichtheimia)
Positive dans 80% des cas de mucormycoses prouvées/probables
Pas de kits commercialisés actuellement
Fusarium spp.
F. solani
F. verticilloides
F. oxysporum
Patients neutropéniques
Origine pulmonaire ou cutanée
Fongémie (40%)
Galactomannane et/ou beta-
glucan souvent positifs
Multi-résistants
Mortalitée très élevée
Fusariose
Nucci and Anaissie, Clin Infect Dis 2002; 35:909-20
Gram stain – Blood culture
Scedosporiose
Scedosporium apiospermum complex
- Scedosporium apiospermum
- Scedosporium (Pseudallascheria) boydii
- Scedosporium auranthiacum
Cause d’eumycétomes en régions tropicales
Colonisant fréquent chez patient avec mucoviscidose
Infections type aspergillose pulmonaire chronique ou invasive
Résistance intrinsèque à l’amphotéricine B (traitement: voriconazole)
Scedosporium prolificans Lomentospora prolificans
Multi-résistance !
Les Penicillium
P. citrinum P. roqueforti P. camemberti
P. marneffei
Ceux du quotidien…
Celui qui sauve… Celui qui tue…
P. chrysogenum
Les “Penicillium-Like” Pathogènes Chez l’Humain
Paecilomyces variotii
Rares infections, souvent extrapulmonaires:
Péritonite, endophtalmite, otite, infection de
plaie, fongémie
Résistance au voriconazole
Purpureocillium lilacinum
(Paecilomyces lilacinus)
Nématophage (agent de biocontrôle)
Infections oculaires, cutanées
Rares infections disséminées (immunosupp.)
Résistance à l’amphotéricine B (ttt: voriconazole)
Rasamsonia (Geosmithia) argillacea
Très fréquemment confondu avec P. variotii
Rares infections disséminées, d’origine
pulmonaire (patients avec CGD)
Colonisation fréquente chez mucoviscidose
Multi-résistant (surtout voriconazole)
Pas de traitement Triazoles
Amphotericin B
Echinocandines
Fongicide FongistatiqueCroissance normale
Standard
(CLSI / EUCAST)
E-TestsMicrodilution manuelle Sensititre YeastOne
Test de Sensibilité aux Antifongiques en Routine
Alternatives
Fastidieux
Lent
Interprétation ? Corrélation clinique ?
Sensibilité Amphotericin Voriconazole Posaconazole Echinocandins
Aspergillus spp.
A. fumigatus
A. lentulus
A. terreus
A. ustus
Champignons filamenteux autres
Mucorales
Fusarium
S. apiospermum
S. prolificans
P. variotii
P. lilacinum
Profils de Sensibilité Antifongique –
Champignons Filamenteux
Inactif Actif
Environnementale
« Hollandaise »
Acquise
« Anglaise »
Source Fongicides
(agriculture)
« In patient »
Patients Naïfs de traitement Exposés aux azoles
Maladie Aspergillose invasive Aspergillose pulmonaire
chronique
Résistance Pan-azole Variable
Mécanisme CYP51A:
- TR34/L98H
- TR46/Y121F/T289A
Divers (CYP51A, ABC
transporters)
Fréquence 0-15% 0-25%
Distribution Europe (Pays-Bas),
Asie, Amérique
Partout (Grande-
Bretagne)
Résistance aux Azoles Chez A. fumigatus
1026 clinical isolates (22 states)
2 TR34/L98H
2 TR46/Y121F/T289AWiederhold NP, JCM 2016; 54:168-71
60 soil samples (flower fields)
1 TR34/L98H
17 TR46/Y121F/T289ALe Pape P, EID 2016; 22:156-7
Azole Resistance of Aspergillus fumigatus Worldwide
You won’t find it if you don’t look !
First Detection of TR34/L98H Mutation in Aspergillus fumigatus
Isolates from Environmental Samples in Switzerland
Riat A, Ischer F, Schrenzel J, Gindro K, Sanglard D.
Poster SGM 2016 (Bern, 13-16th June 2016)
20 clinical samples (cystic fibrosis patients), 69 environmental samples
(Romandy)
SamplesMIC (mg/l) Gene
mutationsCSP Types
ITZ VRZ POZ5d >16 0.25 1 G54R t0115a >16 >8 1 TR34/L98H t0215f >16 4 0.25 TR34/L98H t1137c >16 2 0.25 TR34/L98H t02
50a >16 4 0.25 TR34/L98H t0261a 1 0.5 0.12 TR34/L98H t03
geodata © swisstopo
Figure 2. Map of southwest Switzerland showing the locations of azole-resistant A.
fumigatus, which are illustrated with colour stars.
Recycling centre
Commercial samples
Public garden
Agriculture field
5 (7%) environmental
samples with Cyp51A
mutations
-4 TR34/L98H
-1 G54R
Conclusions
• Mycologie: souvent considérée comme un secteur
marginal au sein d’un laboratoire de microbiologie
MAIS:
• Science complexe
– Identification (requiert une grande expertise)
– Lecture / interprétation des antifongigrammes
– Indication / interprétation tests indirects
• Importance croissante
– Augmentation et diversité de la population immunosupprimée
– Progrès dans les méthodes diagnostiques (PCR, MALDI-TOF)