Z Lebensm Unters Forsch (1992) 194:520-523 Zeitschrift for

�9 Springer-Verlag 1992

Originalarbeit

Empfindliches und selektives HPLC-Verfahren mit priichromatographischer Derivatisierung zur Bestimmung von Cyclamat in Lebensmitteln Jochem Riiter und D.I. Ulrich Raczek

Zentrale Analytik Bayer AG, W-5090 Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland

Eingegangen am 27. Januar 1992

Sensitive and selective HPLC procedure with prechromatographical derivatisation for the determination of cyclamate in food stuffs

Summary. A sensitive and selective high pressure liquid chromatography (HPLC) procedure for the determinati- on of sodium cyclamate in juices and preserves is presen- ted. The method depends on the oxidation of cyclamate to cyclohexylamine, which then is converted prechroma- tographically into a fluorescent derivative. It is analyzed by HPLC on a C18: reversed-phase column and determi- ned with fluorescence detection (exitation at 350 nm, emission at 440-650 nm). The detection limit of sodium cyclamate was 0.5-5 mg/kg, depending on the nature and dilution of the samples. The relative standard deviations thus obtained were _+ 1.0 to _+2.6%. The average reco- very was 90%.

Zusammenfassung. Es wird eine empfindliche und selekti- ve-HPLC Methode zur Bestimmung yon (Na-) Cyclamat in diversen Lebensmittelproben vorgestellt. Das Verfah- ren beruht auf der Oxidation des Cyclamats zum Cyclo- hexylamin. Das gebildete Cyclohexylamin wird prfichro- matographisch zu einem fluoreszenzaktiven Derivat um- gesetzt, anschlieBend an einer C18-Umkehrphase chro- matographiert und bei einer Anregungswellenl/inge yon 350nm sowie einer Emissionwellenl/inge von 440- 650 nm vermessen. Die Bestimmungsgrenze liegt zwi- schen 0,5-5 mg Na-Cyclamat/kg Lebensmittel, abh/ingig von Probenart und -verdfinnung. Die ermittelten relati- veu Standardabweichungen liegen in einem Bereich von __ 1,0% bis +_ 2,6%. Die Wiederfindungsrate betr/igt im Durchschnitt 90%.

Einleitung

Die Bedeutung von SfiBstoffen als Lebensmittelzusfitzen ist im letzten Jahrzehnt stark gestiegen. In der Vergan-

Offprint requests to: J. Riiter

genheit wurden Sfigstoffe haupts/ichlich in di/itetischen Lebensmitteln ffir Diabetiker verwendet. Heute hat sich deren Einsatzgebiet auf brennwertarme Produkte ffir ,calorienbewugte" Konsumenten erweitert. Zu den wichtigsten verwendeten Sfigstoffen z~hlt neben dem Saccharin-Natrium, Aspartam und Acesulfam K das Natriumcyclamat (Natriumcyclohexylsulfamat).

In der Literatur werden eine Vielzahl an Verfahren zur quantitativen Cyclamatbestimmung beschrieben. Als klassisch anzusehen sind nagchemische Verfahren, bei denen das Cyclamat mit Nitrit zu Cyclohexen, Stickstoff und Sulfat oxidiert wird. Je nach Methode wird der Cy- clamatgehalt entweder titrimetrisch fiber den Nitritver- brauch oder gravimetrisch fiber das Sulfat als Bariumsul- fat bestimmt [1, 2]. Die publizierten DC-Methoden sind zum Teil aufwendig und besitzen eine mangelhafte Pr/izi- sion [3-5]. Uber eine vorausgehende Oxidation zu Cyclo- hexen 1/iBt sich Cyclamat mit Kopfraum-Gaschromato- graphie analysieren [6]. Zache und Griinding ver6ffentli- chen ein Capillar-Isotachophoretisches Verfahren, bei dem das Cyclamat mittels seiner Leitffihigkeit detektiert wird [7]. Die fiblicherweise angewandten HPLC-Verfah- ren werden beeintr/ichtigt durch die ungenfigende UV- Absorption des Cyclamats. Eine Direktbestimmung yon Cyclamat bei einer Wellenlfinge von 200 nm ist praktisch nur bei reinen SfiBstoff-Formulierungen m6glich [8]. Hermann, Damawandi und Wagmann beschrieben ein flfissigchromatographisches System, bei welchem eine in- direkte photometrische Detektion angewendet wurde. Hierbei wird dem Elutionsmittel Tetrabutylammonium- p-toluolsulfonat zugesetzt. Dessen hohe Absorption bei 260 nm erm6glicht eine empfindliche Detektion des Cy- clamats als negativen Peak. Dadurch, dab alle Proben- komponenten sichtbar werden, ist diese indirekte Metho- de, ebenso wie die direkte Detektion bei 200 nm, wenig geeignet ffir eine Cyclamatbestimmung in komplexen Matrices.

Erst in jfingster Zeit wurden Methoden ver6ffentlicht, bei denen das Cyclamat pr/ichromatographisch derivati- siert wird, mit dem Ziel, eine photometrisch aktive Ver- bindung zu erhalten [10]. Allerdings gibt es auch hier

521

Nachweisprobleme bei speziellen Probengemischen (z. B. Gurkenaufgfissen). Eine wesentliche Verbesserung der Selektividit und der Nachweisgrenze l~il3t sich durch die Umse tzung von Cyc lamat zu einer f luorimetrisch detek- t ierbaren Verbindung erzielen [11].

Die vorliegende Methode nutzt die Vorteile einer pr~i- ch romatograph i schen Derivat is ierung zu einer f luoro- phoren Verbindung. Hierdurch kann der (Na-)Cyclamat- gehalt diverser Lebensmittel best immt werden. Das Prin- zip der Me thode basiert a u f der Oxidat ion des Cyclamats zum Cyclohexylamin. Das gebildete Cyclohexylamin wird mit o r tho-Phtha ld ia ldehyd (OPA), einem in der Aminos~iurenanalytik verwendeten Derivatisierungsrea- genz [12, 13], zu einem fluorescensaktiven Isoindolderi- vat umgesetzt (Reakt ionsschema 1). Das ents tandene Re- ak t ionsproduk t wird mittels H P L C an einer RP-C18- Phase anatysiert.

S-(CH2)2-COOH

,-, N-O LC)j.." + H2N_~x_ 2 HS-(CH2)2COOH > v C H O RT, 5 min

Reaktionsschema 1. Umsetzung yon Cyclohexylamin zum Fluor- escenzderivat

Experimentelles

filtrieren. - Konfitfire, Obst und Gemi~sekonserven: Die Probe in ei- nem Haushaltsmixer zerkleinern und homogenisieren. Hiervon ca. i 0 g in einem Becherglas einw~igen, mit 50 ml Wasser versetzen und 30 min auf einem Magnetriihrer dihren. Die Probensuspension in Zentrifugengl~iser fiberffihren und 20 min mit 3000 g zentrifugieren. Die fiberstehende Fliissigkeit in einen 100-ml-MeBkolben iiberffih- ten. Den Rfickstand im Zentrifugenglas erneut mit 10 ml Wasser suspendieren, nochmals zentrifugieren, den Oberstand in den Me6- kolben iiberfiihren und mit Wasser auffiillen.

5 Derivat&ierung

5.1 Oxidation des Cyclamats. 2 ml Probel6sung in ein 10-ml-Rea- gensglas mit Schliff pipettieren. 1 ml 30%ige H2Oz-L6sung und 0,3 ml 37%ige Salzsfiure zusetzen. Nach dem Aufsetzen eines Steig- rohres das Reaktionsgef'~i6 ffir 60 min in einen auf 100 ~ temperier- ten Thermostaten einsetzen. Nach erfolgter Oxidation die L6sung auf Raumtemperatur abkiihlen und zur Neutralisation 0,4 ml 40% ige Natronlauge zusetzen. AnschlieBend die Probel6sung in einen 25-ml-Me6kolben iiberffihren und mit Boratpuffer (pH 10,0) auf- ffillen.

5.2 Umsetzen zum Fluorescensderivat. 1 ml der oxidierten Probel6- sung in einen 10-ml-MeBkolben pipettieren und mit OPA-Reagens- 16sung bis zur Marke auffiillen. Dieses Reaktionsgemisch nach exakt 5 min in das chromatographische System injizieren.

1 Chemikalien

Acetonitril, chromasolv (Riedel de Haen 34851); Natriumdihydro- genphosphat-2-hydrat (Riedel de Haen 4269); Dinatriumhydrogen- phosphat-12-hydrat (Riedel de Haen 30414); H/O2, 30%ige L6- sung (Riedel de Haen 31642); Salzsfiure pro anal. mind. 37%ig (Riedel de Haen 30721); Kaliumhydroxid 85%ig (Riedel de Haen 30603); Natriumhydroxid, P1/itzchen zur Analyse (Reinighaus Chemie); Bors~iure pro anal. (Merck 165); o-Phthaldialdehyd (Merck 821027); Ethanol absolut (Riedel de Haen 32205); 3-Mer- captopropions~iure (Aldrich M 580-1); Cyclohexylamin (Merck 802885).

2 Reagensl6sungen

40%ige Natriumhydroxidl6sung. - Boratpuffer: 25 g Bors~iure mit ca. 900 ml Wasser 16sen. Den pH-Wert yon 10,0 mit konz. Kalilauge einstellen. AnschlieBend mit Wasser auf 1 L auffiillen. - OPA-Rea- gensl6sung: 200 mg o-Phthaldialdehyd in 5 ml Ethanol 16sen, 1,0 ml 3-Mercaptopropions~iure zugeben und anschlieBend mit Boratpuf- fer auf 100 ml auffiillen. Das Reagens sollte mindestens 16 h ausrea- gieren und bei Verwendung nicht ~ilter als 10 Tage sein. Lagerung im Dunkeln. - Kalibrierl6sung: 100 mg Cyclohexylamin in einen a00-ml-Me6kolben einw~igen, mit Wasser 16sen und bis zur Marke aufffillen. Zur Messung 1 ml dieser Stamml6sung zu 100 ml mit Wasser verdiinnen.

3 Instrumentation - Gerdte

Sigma Laborzentrifuge 2-15; Thermostat Paratherm HTU5 Juch- heim Labortechnik; 10 ml-Reagensglas mit Schliff und Steigrohr (15 cm); Filtereinheiten 0,45 gm Millipore Millex HA; Varian Vista 5500 HPLC-Chromatograph; Biotronik Fluorescensdetektor BT 0320.

4 Probenvorbereitung

Sdfte: Den Saft 20 min bei 3 000 g zentrifugieren, die iiberstehende Fliissigkeit abdekantieren und mit einem 0,45-1am-Millex HA-Filter

6 Chromatographische Bedingungen

Trenns~iule: Licrospher 100 RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 Ixm, Fa. Merck. Injektionsvolumen: 10 gl. Sfiulentemperatur: 40 ~ Volu- menstrom: 1,0 ml/min. Eluent: Acetonitril/Puffer 64 + 36 (v/v), Puf- fer= 3 g Dinatriumhydrogenphosphat x 12 H20 + 3 g Natriumdi- hydrogenphosphat x H20 auf 1 L mit deionisiertem Wasser auffiil- len. Fluorescensdetektion: Anregung 350 nm max.; Emission 440- 650 nm.

7 Auswertung

Die Messungen wurden nach der Methode des externen Standards gegen entsprechende Cyclohexylamin-Kalibrierl6sungen ausgewer- tet.

Ergebnisse und Diskussion

Zuerst erfolgte die Opt imierung der einzelnen Methoden- parameter . Die Derivatisierung (Dauer, Zusammenset - zung des Derivatisierungsreagenses) wurde anhand von Cyclohexylaminkal ibr ier l6sungen und oxidierten Proben von Orangennek ta r verbessert. Die Opt imierung der Oxi- da t ion von Na -Cyc l ama t zum Cyclohexylamin wurde mittels Orangennek ta r vollzogen. Der Orangennek ta r wurde bei 100 ~ 15-120 min oxidiert. N a c h 30 min war die Umse tzung zum Cyclohexylamin bereits abgeschlos- sen und erst nach 90 min Daue r war ein leichter A b b a u des gebildeten Cyclohexylamins erkennbar . Aus diesem Grunde wurde die Reakt ionszei t au f 60 min limitiert. Die genauen Methodenbed ingungen sind in Abschni t t Expe- rimentelles beschrieben.

Die Linearit~it der Kal ibr ierfunkt ion ist zwischen 0 ,1- 1 0 0 m g Cyclohexylamin/L (entsprechend 0,2-203 mg

522

Cyclamat

I I I I I

0 5 iO 15 2C

Z e i t ( rain )

Abb. 1. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen im Oran- gennektar. A ohne Cyclamatzusatz, B mit Cyclamatzusatz von 1 mg/kg Nektar

Cyclamat

\ ohannisbeernektar

auerkonserve Cornichons

/ ~ O b s t k o n s e r v e Rote GrOTe

BrombeerkonfitOre

I I I i 0 5 10 15

Zeit ( rain )

Abb. 2. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen in diver- sen Lebensmittelproben

Na-Cyclamat/L) gegeben. Der Korrelationskoeffizient der Kalibriergeraden ist 0,99995. Die Nachweisgrenze fiir Cyclohexylamin liegt bei 0,02 mg/L, daraus resultierend fiir Na-Cyclamat 0,04 mg/L. Die Bestimmungsgrenze ffir Na-Cyclamat ist auf Grund der hervorragenden chroma- tographischen Trennbedingungen auch in den Lebens- mittelproben nur unwesentlich h6her (Abb. 1). Durch die Verdfinnung bei der Probenaufarbeitung ergibt sich je-

Tabelle 1. Reproduzierbarkeit

Produkt Relative Standardabweichung %

Orangennektar + 1,0 Grapefruitnektar _ 2,2 Obstkonserve ___ 2,6 Mandarin-Orangen Sauerkonserve Cornichons +2,0

doch eine Erh6hung der Bestimmungsgrenze auf 0,5 mg Na-Cyclamat/L (ffir flfissige Proben), bzw. 5 mg Na-Cy- clamat/kg (ffir feste Proben).

Die Reproduzierbarkeit wurde innerhalb vier ver- schiedener Probenmatrices untersucht. Hierbei wurden von jedem Lebensmittel jeweils 10 vollst/indige Proben- aufarbeitungen durchgefiihrt, diese doppelt vermessen, so dab jede Me6reihe 20 Einzelmessungen umfa6te (Aus- nahme: Mandarine-, Cornichons-Reproduzierbarkeit; 5 Einw/igungen mit jeweils 2 Oxidationen, jede oxidierte Probe wurde 2fach bestimmt. Gesamtzahl der Messun- gen ebenso 20). Die festgestellten guten Reproduzierbar- keiten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Die Oberpriifung der Richtigkeit erfolgte durch den definierten Zusatz von Na-Cyclamat (200 mg/L) zu ei- nem reinen Orangennektar. Aus 10 Messungen ergab sich eine mittlere Wiederfindungsrate yon 90,0%. Des weiteren wurden verschiedene di/itetische Lebensmittel beziiglich ihres Na-Cyclamatgehaltes analysiert und die

Tabelle 2. Richtigkeit: Vergleich der analysierten Gehalte mit den Herstellerangaben

Produkt Gehalt Na-Cyclamat Wiederfindungs- mg/kg rate %

HPLC mit Fluo- Hersteller- reszenzdetektion angaben

Orangennektar 175,3 195,5 90 Grapefruitnektar 183,6 195,5 94 Mandarinen 121,0 136,0 89

Fruchtsaftgetr/ink Limonade Orange 534,4 600,0 89 Multivitamin 269,4 313,6 86

Mehrfruchtnektar Brombeerkonfitiire 976,8 1364 72 Obstkonserve Rote Griitze 711,8 909,1 78 Johannisbeernektar 341,3 340,9 100 Obstkonserve Rhabarber 1629 1363 120 Pfirsich-Maracuja- 1083 1364 79

Konfitiire Obstkonserve 701,7 909,1 77

Mandarin-Oralxgen Sauerkonserve Cornichons 271,3 272,7 100

523

Cyc2amat

l /

.i

Umonade Orange < Multivitamin Mehrfrucht-

Mandarinen Fruchtsaft- I I t getrAnk I

0 5 10 J.5

Z e i t ( min )

Abb.3. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen in diver- sen Lebensmittelproben

festgestellten Werte mit den Herstellerangaben vergli- chen (Tabelle2). Die zugeh6rigen Chromatogramme sind in Abb. 2 und 3 dargestellt. Die Chromatogramme sind nut qualitativ vergleichbar. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, konnte eine befriedigende Ubereinst immung mit den Herstellerangaben erzielt werden.

Die vorliegenden Ergebnisse bescheinigen der ausge- arbeiteten Methode eine gute Verwendbarkeit. Die fest- gestellten Wiederfindungsraten sind zum Teil weniger be- friedigend. Es ist bekannt, dab Oxidationsmittel die Derivatisierung mit OPA st6ren k6nnen. Eventuell be-

steht hier eine M6glichkeit, durch eine matrixspezifische Dosierung des Oxidationsmittels die Wiederfindungsra- ten weiter zu verbessern.

Literatur

1. Acker L, Bergner KG, Diemair W, Heimann W, Kiermeier F, SchormiiUer J, Souci SW (1970) Handbuch der Lebens- mittelchemie, VI. Springer, Berlin Heidelberg New York, S 733

2. Amtliche Sammlung yon Untersuchungsverfahren nach w 35 LMBG (1988) L 57.22.99 - 2

3. Rymon Lipinski GW von, Britus HC (1979) Z Lebensm Unters Forsch 168:212-213

4. Miiller B, Ludwig J (1972) Mitteilungsbl GDC Fachgruppe Lebensmittelchem 26: 3-5

5. The Nordic Commitee on Food Analysis (1984) Z Lebensm Un- ters Forsch 179:453-454

6. Groebel W, Wessels A (1972) Dtsch Lebensm Rundsch 68 (12) 393

7. Zache U, Griinding H (1987) Z Lebensm Unters Forsch 184:503-509

8. GDCH Fortbildungkurs-Analytik von SiiBstoffen und Zucker- alkoholen, Vortrag D. Rohrdanz Staatl. Chem. Untersu- chungsamt 2120 Liineburg: Probenvorbereitung und Nachweis yon Siil3stoffen in Lebensmitteln

9. Hermann A, Damawandi E, Wagrnann M (1983) J Chromatogr 280: 85-90

10. Schwedt G, Hauck M (1988) Z Lebensm Unters Forsch 187:127-129

11. Hauck M, K6bler H (1990) Z Lebensm Unters Forsch 191:322- 324

12. Schneider H, H6pker H (1985) Firmenpublikation HPLC- Aminos/iure Analyse. LKB Instrument, Gr/ifelfing

13. Legrer J, Schuster R (1987) Laborpraxis 9:922-925