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1 Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento Kathelyn Paredes V. Ingrid Morales B. Edwin Magariños S. Documento Científico No. 2 - 2008 FOMABO-PROINFOR

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Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium

tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento

Kathelyn Paredes V. Ingrid Morales B.

Edwin Magariños S.

Documento Científico No. 2 - 2008 FOMABO-PROINFOR

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El “Documento Científico” crece de la colaboración FOMABO entre las tres universidades la Carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad

Autónoma Gabriel René Moreno (UAGRM) de Santa Cruz, la Escuela de Ciencias Forestales (ESFOR) de la Universidad Mayor de San Simón

(UMSS) de Cochabamba y la División Bosques y Paisaje de la Universidad de Copenhague (KU), Dinamarca. El proyecto FOMABO esta financiado

por la Cooperación Danesa (DANIDA) a través del programa de capacitación e investigación ENRECA.

El documento tiene el fin de acelerar el proceso de difusión resultados de

investigaciones científicas resultado de la colaboración e impulsar la discusión de los resultados.

Las opiniones y juicios expresados en este documento son de exclusiva

responsabilidad del autor y no reflejan necesariamente la opinión o política de UAGRM, UMSS o KU.

Referencia Paredes, K., Morales, I., Magariños, E. 2007. Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento. Documento Científico 2-2008. Proyecto de Manejo de Bosques en Bolivia (FOMABO), Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR). Santa Cruz, Bolivia. Editorial Carrera de Ingeniería Forestal UAGRM Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR) Vallecito, Carretera al Norte Km. 8,5 Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación se puede reproducir, almacenar en sistema de recuperación ni transmitir en forma alguna por medios electrónicos, mecanismos, fotocopia o cualquier otro medio, sin una adecuada referencia a la fuente.

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Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium

tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento

Kathelyn Paredes 1,*, Ingrid Morales 2, Edwin Magariños 3

1. *Investigador Forestal Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Ingeniería Forestal, Programa de Investigaciones (PROINFOR), El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 3051, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]

2. Profesor Titular de la Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Biología, El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]

3. Profesor Adjunto de la Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Ingeniería Forestal, El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]

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CONTENIDO

SUMMARY .................................................................................................................................................................. 5 RESUMEN.................................................................................................................................................................... 6 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 7 2. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................................................ 8

2.1. MATERIAL DE ESTUDIO ....................................................................................................................................... 8 2.2. DESINFECCION DEL MATERIAL VEGETAL........................................................................................................... 12 2.3. PRUEBAS DE PROPAGACION IN VITRO ................................................................................................................ 12 2.4. DETERMINACION DEL EFECTO DE LAS FITOHORMONAS EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LAS YEMAS DE ROBLE ...................................................................................................................................................................... 13

2.4.1. Efecto del AG3 y Kinetin .......................................................................................................................... 13 2.4.2. Efecto del AG3 y BAP............................................................................................................................... 14 2.4.3. Efecto del IBA y BAP................................................................................................................................ 14

2.5. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LAS FITOHORMONAS EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LAS YEMAS DE TEJEYEQUE............................................................................................................................................................... 15 2.6. MULTIPLICACIÓN .............................................................................................................................................. 15 2.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO...................................................................................................................................... 16

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................................................ 17 3.1. FASE DE INTRODUCCIÓN DEL ROBLE (AMBURANA CEARENSIS)............................................................................ 17 3.2. FASE DE ESTABLECIMIENTO DEL TEJEYEQUE (CENTROLOBIUM TOMENTOSUM)................................................... 20

4. CONCLUSIONES.................................................................................................................................................. 25 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................. 26 REFERENCIAS......................................................................................................................................................... 27 ANEXOS..................................................................................................................................................................... 30

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Summary

Roble is a species which is characterized by slow growth, hardwood and high commercial value.

On the other hand, tejeyeque is fast-growing and soft wood. But both species have difficulties in

their regeneration because of their phenological characteristics and / or morphology. Under this

approach is necessary to take steps for their repopulation and in vitro cultivation is an excellent

alternative to overcome the above-mentioned difficulties, because through this technique it is

possible to reproduce clones with high genetic value, achieving high quality plants and the

proliferation of best individuals of woody species in less time.

This work was undertaken with the aim of contributing to the development of an applicable

methodology to the propagation of Amburana cearensis and Centrolobium tomentosum. To that

end, we studied alternative culture mediums and management of explants at the establishment

phase. The explants of auxiliary buds and apical plant juveniles were established in the culture

medium Murashige and Skoog (MS) supplemented with AG3/KIN, AG3/BAP, IBA / BAP for

roble and BAP/AG3 for tejeyeque.

The explants not survived in all treatments, this is the case of roble (Amburana cearensis). All the

tests of establishing roble presented difficulties for being this specie of slow growth in addition to

its high percentage of contamination and phenolization of explants in the laboratory. However,

the results showed that using BAP and AG3 in the culture medium in concentrations 0.5/0.5

respectively, it was possible to achieve a high regeneration and growth of apical segments of

tejeyeque (Centrolobium tomentosum).

Key words: in vitro, establishment phase, roble, tejeyeque, phenolization.

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Resumen El roble es una especie que se caracteriza por su crecimiento lento, madera dura y alto valor

comercial. Por otro lado, el tejeyeque es de rápido crecimiento y madera blanda. Pero ambas

especies presentan dificultades en su regeneración debido a sus características fenológicas y/o

morfológicas. Bajo este enfoque es necesario tomar acciones para su repoblación siendo el

cultivo in vitro una excelente alternativa para superar las dificultades antes mencionadas, pues

por medio de esta técnica es posible reproducir clones con alto valor genético, conseguir plantas

de alta calidad y la multiplicación de los mejores individuos de especies leñosas en menor

tiempo.

El presente trabajo se realizó con la finalidad de contribuir con el desarrollo de una metodología

aplicable a la propagación de Amburana cearensis y Centrolobium tomentosum. Para ello, se

estudiaron variantes de medios de cultivo y manejo de los explantes en la fase de establecimiento.

Los explantes de yemas axilares y apicales de plantas juveniles se establecieron en medio

Murashige y Skoog (MS) suplementado con AG3/KIN, AG3/BAP, IBA/BAP para el roble y

BAP/AG3 para tejeyeque.

Los explantes no sobrevivieron en todos los tratamientos, este es el caso del roble (Amburana

cearensis). Las pruebas de establecimiento de roble presentaron dificultades por ser esta especie

de crecimiento lento además de su alta tasa de contaminación y fenolización en laboratorio. Sin

embargo, los resultados mostraron que con el BAP y AG3 en el medio de cultivo, en

concentraciones de 0.5/0.5 respectivamente, fue posible lograr una alta regeneración y

crecimiento de los segmentos apicales del tejeyeque (Centrolobium tomentosum).

Palabras clave: in vitro, fase de establecimiento, roble, tejeyeque, fenolización.

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1. Introducción

La reducida población en el bosque causada por el aprovechamiento selectivo de especies de

mara (Swietenia macrophylla), cedro (Cedrela fissilis) y roble (Amburana cearensis) que se

realizaba anteriormente ha causado una marcada reducción y degradación de las especies

mencionadas, además de daños al bosque residual (Gullison et al. 1996).

El roble (Amburana cearensis) es una de las especies que se han visto afectadas por la

deforestación debido a su madera de alta calidad y valor comercial, esta especie, es de gran

interés. Pero existen problemas particularmente agudos en la regeneración de las especies

maderables valiosas. Los problemas de regeneración parecen ser más serios para las especies

maderables heliófitas y moderadamente esciófitas (Mostacedo y Fredericksen 2000). Dicha

especie debido a su fenología, no fructifica y produce semillas anualmente.

De la misma manera, se presenta en el tejeyeque (Centrolobium tomentosum) que es una especie

nativa del ecosistema amazónico con un gran valor comercial y que presenta problemas de

propagación vía esquejes y reproducción vía semilla, al ser esta recalcitrante (Villarroel et al.

2007). Tiene gran demanda pero poca posibilidad de conservar la semilla.

No obstante, a través de métodos de propagación tradicional aún existen limitaciones y

dificultades importantes, tales como lentitud en el proceso de germinación, irregularidad en la

obtención de plántulas para formar una población homogénea, en cuanto edad y tamaño,

obtención de semillas a intervalos irregulares y con escasa viabilidad. (Uribe-Moraga y Cifuentes

2004).

Frente a este hecho, es necesario usar técnicas alternativas para generar un sistema de

multiplicación y regeneración de explantes de forma masiva. Por esta razón se piensa en la

biotecnología como herramienta eficaz que, a través del cultivo in vitro, permite propagar

asexualmente y cultivar individuos seleccionados además de conseguir plantas de alta calidad,

ahorrar tiempo y dinero.

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El objetivo del estudio fue desarrollar una metodología alternativa de regeneración en las

especies Amburana cearensis y Centrolobium tomentosum, utilizando la técnica del cultivo in

vitro y micropropagación. Para ello se evaluaron los explantes con mayor regeneración en medios

de cultivo MS (Murashige y Skoog 1962) con diferentes concentraciones de hormonas, con el fin

de producir gran cantidad de plántulas que puedan compensar la baja regeneración de dichas

especies.

2. Materiales y métodos

2.1. Material de estudio

El presente estudio se realizó en el laboratorio de biotecnología BIOFAN ubicado en la Facultad

de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma Gabriel René Moreno (UAGRM). Asimismo,

el material vegetal utilizado consistió en:

- Yemas axilares y apicales de plantas juveniles de roble (Amburana cearensis)

provenientes de plántulas germinadas en el vivero del municipio de San Miguel de

Velasco a cargo de la Unidad Forestal Municipal (UFM).

- Yemas apicales de plantas juveniles de tejeyeque (Centrolobium tomentosum)

provenientes del chapare, donadas por la empresa Bosques Tropicales Bolivia S.A.

Todos los instrumentos utilizados en la manipulación del material vegetal fueron esterilizados en

una estufa a una temperatura de 180ºC, durante dos horas antes de cada sesión de trabajo;

realizándose todas las operaciones de disección y transferencias en la cámara flujo laminar

horizontal, el cual fue esterilizado con alcohol previamente.

El roble es un árbol grande caduco de 15-25 m de altura, con un DAP de 40-110 cm. La copa es

redondeada y ancha, con follaje verde oscuro (Figura 1). El tronco es cilíndrico y poco tortuoso.

La corteza externa es de color castaño – anaranjado y lisa, con lenticelas abundantes. Se

desprende por grietas longitudinales, en forma de descamaciones pequeñas con textura de papel.

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Las hojas son alternas, pinnadas, de 6-20 cm de largo, hay de 7– 10 foliolos alternos y elípticos

de 2-5 cm de largo por 1,5-3 cm de ancho, con ápice redondeado, base roma y borde entero

(Figura 2).

Figura 1: Copa y fuste del roble

Fuente: Mostacedo et al. (2003)

El fruto es una vaina oblonga dura de 5-8 cm de largo por 1-2 cm de ancho, de color castaño

oscuro. Hay una semilla ovoide castaña de 4-6 cm de largo, incluyendo un ala larga. La

inflorescencia es un racimo terminal o axilar, y las flores presentan un pétalo redondeado y

blanco. Hermafroditas, zigomorfas, cáliz unido, con 5 lóbulos; pétalos 5, libres, blancos,

amariposados; estambres libres 10; ovario súpero largamente estipitado, con estilo corto. Florece

de marzo a mayo y los frutos maduran entre julio y septiembre; las semillas son dispersadas por

el viento.

Las plántulas presentan hojas de similares características a las de los árboles adultos, éstas tienen

las hojas compuestas, los foliolos alternos, oblongos, el borde entero, la base redondeada y el

envés blanquecino. Tienen un olor característico cuando se las estruja.

Se encuentra distribuido ampliamente en los departamentos de Pando, Beni, La Paz y Santa Cruz

desde 200 a los 1200 msnm (Mostacedo et al. 2003). El roble es perseguido por el gran valor

comercial de su madera. Prefiere los suelos arcillo - arenosos. Crece en los bosques semideciduos

bien drenados, y es común cerca de afloramientos rocosos. Es una especie heliófita de

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crecimiento moderado, aunque tiene un crecimiento inicial lento. Su población de por si no es

numerosa y se va reduciendo aún más por la excesiva explotación.

Además, es una especie que posee semillas utilizadas comercialmente para la perfumería. La

cáscara del tallo presenta propiedades terapéuticas, comprobadas científicamente, contra

afecciones respiratorias. Por lo tanto, debido a su intensa explotación económica, esta especie se

encuentra amenazada de extinción (Bezerra et al. 2004).

En la amazonía se encuentra A. cearensis var. acreana, mientras que en el centro y sur del país se

encuentra A. cearensis var. cearensis. La corteza de la variedad acreana es más rugosa y de color

más oscuro que la variedad cearensis. Algunos autores reconocen a éstas dos variedades como

dos especies distintas.

Figura 2. Características morfológicas de la especie Amburana cearensis

Fuente: Mostacedo et al. (2003)

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Por otro lado, el Tejeyeque es un arbol semi-decíduo a decíduo. Los árboles mayores alcanzan

dimensiones próximas a 35 m de altura y 100 cm de DAP (Figura 3).

Figura 3: Características de la especie Centrolobium tomentosum

Fuente: Ramalho y Botosso (2005)

El tronco es cilíndrico, recto. Las hojas son compuestas, imparipinadas, alternas, con 19 folíolos

irregularmente opuestos o alternos, ovado-lanceolados, base redonda u oblicua; ápice agudo a

obtuso, asimétrico y piloso ambos lados, siendo la cara inferior cubierta de pelos ferrugíneos

presentando puntuaciones resinífieras (Ramalho 2005).

Las flores tienen el cáliz castaño-oscuro-tormentoso y corola amarillo-anaranjada reunídas en

panícula terminal. La epidermis externa del ovario es uniseriada presentando tricomas secretores

y tectores (Siqueira y Oliveira 2000).

Fruto sámara; núcleo seminífero con acúleos tormentosos (Lima 1989, Vidal 1978). La

dispersión es anemócora. Los frutos portadores de frágiles espinos sobre el núcleo seminífero son

ocasionalmente transportados por pequeños roedores, que parecen apenas actuar como

predadores (Lima 1989). La geminación se desenvuelve más o menos sin presencia de luz.

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2.2. Desinfeccion del material vegetal

Explantes constituidos de segmentos nodales, provenientes de plántulas germinadas en el vivero

del municipio de San Miguel de Velasco a cargo de la Unidad Forestal de dicho municipio,

fueron introducidos a laboratorio. Todos los instrumentos utilizados para la manipulación del

material vegetal fueron esterilizados en una estufa a una temperatura de 180ºC, durante dos horas

y manteniendo la asepsia.

Los fragmentos de tallo fueron cortados midiendo aproximadamente 3 cm cada uno, portando

una sola yema axilar o apical. Seguidamente, se sometieron durante 30 minutos a un proceso de

desinfección con Benomyl a una concentración de 2 g/l y en agitación contínua. Inmediatamente,

y después de realizar tres enjuagues con agua destilada estéril, se sumergieron durante 60

segundos en etanol al 80%. Finalmente, los trozos de tallo se desinfectaron con hipoclorito de

sodio (NaClO) a una concentración de 2% durante 30 minutos, concluido el tiempo de inmersión

el material vegetal se lavó tres veces sucesivas con agua destilada estéril para luego ser

sumergidas en Gentamicina dentro de la cámara flujo laminar.

2.3. Pruebas de propagacion in vitro

Los experimentos estuvieron compuestos por las sales inorgánicas del medio basal propuesto por

Murashige y Skoog (MS, 1962) suplementado con relaciones de 0/0, 0/0.5, 0/1, 0.5/0 de Ácido

Giberélico (AG3) y Bencilaminopurina (BAP) respectivamente, Sacarosa al 3% y Ácido Cítrico

20ml/L. Luego de preparar la solución, el pH del medio de cultivo se ajustó a 5,6 (con KOH) una

vez agregando 10 ml a cada frasco y cubiertos con papel aluminio fueron al autoclave a 120ºC,

por 20 minutos para su esterilización.

En la cámara flujo laminar, en condiciones de asepsia, los explantes fueron seccionados a

aproximadamente 0.5 cm y sembrados in vitro en el medio basal líquido contenido en los frascos

y llevados al agitador a 78 rev/mit, con temperatura de 25 oC, fotoperiodo de 16 horas luz diarias

a una intensidad de 600 lux.

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Dos días después de la siembra del material y luego de cada 3 días, se efectuaron las evaluaciones

de los explantes hasta su cambio a medio fresco. Se evaluó mortandad (%), contaminación (%),

crecimiento del explante (expresado en mm y medido desde la base y el extremo del primordio

foliar más largo).

En todos los experimentos se realizó un diseño totalmente al azar, considerándose homogéneas

las condiciones del cultivo dentro del laboratorio, siendo los tratamientos la única fuente de

variación.

2.4. Determinacion del efecto de las fitohormonas en el crecimiento y desarrollo de las yemas de roble

2.4.1. Efecto del AG3 y Kinetin Utilizando el medio basal MS se realizaron los tratamientos con acido giberélico y Kinetin en

concentraciones de 0/0 (T1), 0/0.5 (T2), 0/1 (T3) y 0.5/0 (T4) respectivamente (Cuadro 1).

Cuadro 1: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con Kinetin

KIN

AG3

0 ppm

0.5 ppm

1 ppm

0 ppm T1 T2 T3

0.5 ppm T4

El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 4 tratamientos y 10 repeticiones,

siendo cada unidad experimental constituida de un frasco.

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2.4.2. Efecto del AG3 y BAP

Utilizando el medio basal MS se realizaron tratamientos con ácido giberélico (AG3) y

Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de 0/0 (Go), 0/0.5 (G1), 0/1 (G2), 0.1/0 (G3),

0.1/0.5 (G4), 0.1/1 (G5), 0.5/0 (G6), 0.5/0.5 (G7), 0.5/1 (G8) respectivamente (Cuadro 2).

Cuadro 2: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con BAP BAP

AG3

0 ppm

0.5 ppm

1 ppm

0 ppm Go G1 G2

0.1 ppm G3 G4 G5

0.5 ppm G6 G7 G8

El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 10 tratamientos y 4 repeticiones.

Cada frasco constituye una unidad experimental.

2.4.3. Efecto del IBA y BAP

Utilizando el medio basal MS se realizaron tratamientos con ácido indol-3-butírico (IBA) y

Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de 0/0 (Bo), 0.01/0.5 (B1), 0.1/0 (B2), 0.1/0.5

(B3), 0.1/2 (B4) respectivamente (Cuadro 3).

Cuadro 3: Ensayos de diferentes niveles de IBA con BAP

BAP

IBA

0 ppm

0.5 ppm

2 ppm

0 ppm Bo

0.01 ppm B1

0.1 ppm B2 B3 B4

1.5 ppm B5

El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 6 tratamientos y 10 repeticiones.

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2.5. Determinación del efecto de las fitohormonas en el crecimiento y desarrollo de las yemas de tejeyeque

Utilizando el medio basal MS, suplementado con 30 g de sacarosa y 6 g/l de agar, se realizaron

los tratamientos con ácido giberélico (AG3) y Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de

0/0 (Mo), 0/0.1 (M1), 0/0.5 (M2), 0.3/0 (M3), 0.3/0.1 (M4), 0.3/0.5 (M5), 0.5/0 (M6), 0.5/0.1

(M7), 0.5/0.5 (M8) respectivamente (Cuadro 4).

Cuadro 4: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con BAP BAP

AG3

0 ppm

0.1 ppm

0.5 ppm

0 ppm Mo M1 M2

0.3 ppm M3 M4 M5

0.5 ppm M6 M7 M8

Después de 55 días se tomaron datos de las variables altura de la planta (cm), número de hojas,

número de brotes y supervivencia (%). Se realizó en total 14 evaluaciones con intervalos de 4

días.

2.6. Multiplicación

A partir de los explantes más sanos y vigorosos, después de 55 días, se seleccionaron para luego

llevarlos a la cámara flujo laminar y ser seccionados nuevamente y sembrados en medios de

cultivo usando como gelificante agar (sigma chemical, Co.) a razón de 6 g/l. En esta fase se

realizaron nuevamente diferentes pruebas para determinar el medio adecuado.

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2.7. Análisis estadístico

En la totalidad de los experimentos se aplicó un diseño completamente al azar, para la lectura y la

evaluación de las variables, considerándose homogéneas las condiciones del cultivo dentro del

laboratorio y como única fuente de variación los tratamientos.

El análisis estadístico de los datos en las diferentes variables consistió en el análisis de varianza

(SC tipo III). Para detectar las diferencias significativas los análisis están con un alfa de 0.05

usando el comparador SNK.

El número de repeticiones utilizadas en cada experimento in vitro fue variable en cada grupo de

tratamientos según la combinación de hormonas a evaluar.

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3. Resultados y discusión

3.1. Fase de Introducción del roble (Amburana cearensis)

Debido a la alta tasa de contaminación de los explantes los tratamientos con suplementos de

IBA/BAP y AG3/BAP no fueron evaluados. La alta tasa de mortalidad obtenida se asocia a la

fenolización y a la actividad de agentes fúngicos y bacterianos. Las yemas apicales y axiales

mostraron ser muy vulnerables a la contaminación de virus y hongos debido al tamaño de los

explantes y al excesivo manipuleo en cámara (las ramas de las plántulas) son lignificadas y por lo

tanto de difícil corte.

Aunque al final de la evaluación no se obtuvieron explantes vivos se evaluó el porcentaje de

mortandad a los 129 días donde concluyó la evaluación. El tratamiento T1 con 0/0 de AG3/KIN

obtuvo un porcentaje de 78% de mortandad conteniendo esta cifra ya a los 90 días de evaluación;

el T2 con 0/0,5 de AG3/KIN con 90% de mortandad; el T3 con 0/1 de AG3/KIN con 55% de

mortandad a los 122 días y finalmente T4 con 0,5/0 de AG3/KIN con 89% de mortandad. La alta

tasa de mortandad se debió principalmente a la fenolización de los explantes (Figura 4).

(%) M ortandad

0

10

2030

40

5060

70

8090

100

3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129

Dias de evaluación

Mor

tand

ad (%

)

T1% T2% T3% T4%

Figura 4: Porcentaje de mortandad del roble en relación a los días de evaluación de los

tratamientos

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La contaminación de hongos se pudo observar a partir del tercer día de introducción. Teniendo

T1 el 22% de contaminación, T2 con 10%, T3 con 45% y T4 con 11%. La contaminación con

bacterias no se presentó en ninguno de los tratamientos (Figura 5). La contaminación a causa de

hongos se debió principalmente al tamaño del explante el cual presentó dificultad en la incisión

por la dureza de la epidermis.

Porcentaje de Contaminación

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129

Dias de evaluacion

Con

tam

inac

ion

(%)

T1% T2% T3% T4%

Figura 5: Porcentaje de contaminación del roble en relación a los días de evaluación de los

tratamientos

Hernández (1997) encontró que el estado de desarrollo de la planta madre y la edad fisiológica

del explante, así como su tamaño, son de gran influencia en el éxito del cultivo in vitro. Mientras

más pequeño es el explante menor el riesgo de contaminación. Este principio ha sido utilizado

para la obtención de plantas libres de enfermedades. Pero esto se dificulta al proceder con la

incisión de las yemas debido a que las ramas del roble (Amburana cearensis) se lignifican desde

temprana edad y por lo tanto presentan consistencia dura.

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Por otro lado, la mayor parte de la muerte de los explantes fue, en su mayor parte, a causa de la

fenolización de los explantes. En la figura 6 se puede observar que el tratamiento T1 obtuvo 78%

de fenolización, T2 con 90%, T3 con 27% y T4 con 33% de fenolización. Cabe resaltar que

aunque algunos explantes mostraron síntomas de fenolización continuaron mostrando

crecimiento en los brotes, alcanzando un tamaño de aproximadamente 1,5 cm (Figura 1A). A

pesar de que el tratamiento T2 obtuvo el mayor porcentaje, los explantes del mismo se

mantuvieron vivos por más días.

Porcentaje de Fenolización

010

2030

405060

7080

90100

3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129

Días de evaluación

Feno

lizac

ión

(%)

T1% T2% T3% T4%

Figura 6: Porcentaje de fenolización del roble en relación a los días de evaluación de los

tratamientos

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3.2. Fase de establecimiento del tejeyeque (Centrolobium tomentosum)

Después de introducir en medio líquido, las yemas de tejeyeque fueron cultivadas in vitro

durante 55 días; los tratamientos M1 (0,1/0 de BAP/AG3), M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), M6 (0/0,5

de BAP/AG3), M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), y M8 (0,5/0,5 de BAP/AG3) presentaron crecimiento

de hasta 3 centímetros, el resto no mostró reacción a las hormonas (Cuadro 5).

Cuadro 5: Altura y número de hojas de los explantes cultivados en medio líquido

Tratamiento

Repetición

Altura de la

planta (cm)

Número de

hojas

M1 4 0,5 1

M4 2 1,2 1

M4 4 2,1 2

M6 1 1,9

M7 1 1 2

M8 2 3 2

Se puede observar un rápido crecimiento de la especie en los medios de cultivo. Este

comportamiento puede estar dado a que en el medio líquido es más fácil la absorción de los

nutrientes, hay una oxigenación constante y mejor intercambio gaseoso (Grapin 1998). En la

Figura 7 se describe el comportamiento de los explantes de tejeyeque, la velocidad de

crecimiento y el tiempo que tardaron en mostrar reacción a las hormonas.

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Figura 7: Crecimiento de los explantes durante los días de cultivo en medio líquido

Como se mencionó anteriormente, el mejor tratamiento es el M8 (0.5/0.5 de BAP/AG3) ya que

los explantes presentaron mayor crecimiento y vigorosidad. Este está seguido por el M4 (0,1/0,3

de BAP/AG3) y M6 (0/0,5 de BAP/AG3).

Figura 8: Desarrollo del tejeyeque en medio sólido

Se seleccionaron los explantes que

presentaron mayor tamaño y se

transplantaron a medio sólido (ver Figura 8),

donde no mostraron crecimiento significativo

excepto el tratamiento M8 (0.5/0.5 de

BAP/AG3) el cual presentó un brote de 4,5

centímetros de altura.

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En el análisis de Varianza (SC tipo III) de la contaminación de los medios, se encontró que no

hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye que el tratamiento M6 (0/0,5

de BAP/AG3). M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), y M8 (0.5/0.5 de BAP/G3) son los que resultaron

menos contaminados, seguido de los tratamientos Mo (0/0 de BAP/AG3), (M1 (0,1/0 de

BAP/AG3) y M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), siendo el tratamiento M3 (0/0,3 de BAP/AG3), el

tratamiento más contaminado (Figura 9).

Porcentaje de Contaminación

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 4 11 13 15 18 25 28 33 35 40 42 47

Días

Porc

enta

je (%

)

M0 M1 M2 M3 M4 M6 M7 M8Tratamientos:

Figura 9: Porcentaje de contaminación del tejeyeque en relación a los días de evaluación de los

tratamientos

La contaminación por hongos se debió principalmente por el tamaño del explante y por el

excesivo manipuleo dentro de la cámara flujo laminar. De acuerdo con Villalobos (1982), el

tamaño del explante es un factor importante que influye en la desinfección y regeneración de

plantas, a medida que el explante es más pequeño es menor el riesgo de contaminación y mas

fácil la regeneración, medidas que con el aumento del tamaño del explante es mayor el peligro de

contaminación y mas rápido el crecimiento y la regeneración de la planta.

En el análisis de Varianza (SC tipo III) de la fenolización de los explantes, se encontró que no

hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye que los tratamientos M6

(0/0,5 de BAP/AG3). M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), M8 (0.5/0.5 de BAP/AG3), M2 (0,5/0 de

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BAP/AG3), M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), no presentaron fenolización; por el contrario, M3 (0/0,3

de BAP/AG3), mostró fenolización de los explantes, siendo los tratamientos Mo (0/0 de

BAP/AG3) y M1 (0,1/0 de BAP/AG3) los que presentaron mayor porcentaje (40%), como se

puede observar en la Figura 10.

Porcentaje de Fenolización

05

1015202530354045

0 1 4 11 13 15 18 25 28 33 35 40 42 47 50 55

Días

Por

cent

aje

(%)

M0 M1 M2 M3 M4 M6 M7 M8Tratamientos:

Figura 10: Porcentaje de fenolización del tejeyeque en relación a los días de evaluación de los

tratamientos

Otro factor que influyó en el desarrollo de los explantes fue el desarrollo de callos en la parte

basal, es decir, donde se produjo la incisión para introducirlos en los medios de cultivo. En el

análisis de Varianza (SC tipo III), y de acuerdo a la Figura 11, de la formación de callos en los

explantes, se encontró que no hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye

que los tratamientos M6 (0/0,5 de BAP/AG3) y Mo (0/0 de BAP/AG3) no presentaron formación

de callos; por el contrario, el resto de los explantes presentaron callos en un rango de porcentaje

de 20% a 60% siendo el mayor del tratamiento M1 (0,1/0 de BAP/AG3).

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Figura 11: Porcentaje de formación de callos del tejeyeque en relación a los días de evaluación de

los tratamientos

Al finalizar la evaluación se observó gran desarrollo de dichos callos, midiendo así cada uno

hasta aproximadamente 0,8 mm de grosor. Luego de ser evaluados los explantes fueron

transplantados a medios de cultivo sólido para continuar con su desarrollo. Después de 31 días de

cultivo se midió la altura, número de hojas y número y altura de brotes según se observa en el

Cuadro 6.

Cuadro 6: Altura y número de hojas de los explantes cultivados en medio sólido

Tratamiento

Repetición

Altura de la

planta (cm)

Número de

hojas

Número de

brotes

Altura del

brote (cm)

M4 4 0,9 Brote

M6 1 1,9 1

M7 1 1,3 1

M8 2 5,7 6 1 4,5

Finalmente, con respecto al factor medio de cultivo (composición y suplementos de hormonas)

para el establecimiento in vitro, el análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre

los tratamientos. Sin embargo, señala las combinaciones hormonales de las cuales se obtuvieron

mejores resultados, siendo la más efectiva la combinación 0,5/0,5 mg/l de BAP y AG3 logrando

incrementos de hasta 5,7 cm (Figura 2A).

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4. Conclusiones

No se obtuvieron los resultados esperados en el establecimiento in vitro de Amburana cearensis

pues éste se dificulta por presentar crecimiento lento y alta tasa de contaminación y fenolización.

Por otro lado, se logró el establecimiento in vitro de Centrolobium tomentosum con

concentraciones de 0.5/0.5 de BAP y AG3 respectivamente, es decir el tratamiento M8.

El protocolo permite propagar tejeyeque a través del cultivo in vitro mediante segmentos nodales

con yemas apicales, siendo esta un medio útil para multiplicar la especie.

Los resultados demuestran que las yemas apicales de tejeyeque (Centrolobium tomentosum)

mostraron mayor crecimiento y menor porcentaje de contaminación. Por otro lado, se observó

que al introducir yemas axilares para el roble (Amburana cearensis) se obtuvieron mejores

resultados pues las yemas apicales demostraron ser sensibles a los tratamientos de desinfección y

posterior muerte en de los medios de cultivo durante la fase de establecimiento.

Las fases siguientes se encuentran siendo evaluadas en el laboratorio.

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Agradecimientos Agradezco el apoyo financiero de FOMABO para la realización del presente estudio.

Al laboratorio de biotecnología BIOFAN, a la empresa Bosques Tropicales Bolivia S.A y a todas

las personas que hicieron posible la obtención del material vegetal para realizar la investigación.

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ANEXOS

Figura 1A: Tamaño de los explantes fenolizados de Amburana cearensis, roble

Figura 2A: Tamaño de los explantes después de 31 de ser cultivados en el tratamientos T6

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Instrucciones para los autores de “Documento Científico” Proyecto FOMABO-PROINFOR El Documento Científico publica trabajos de investigación científico en español o inglés dentro de las áreas de manejo forestal y recursos naturales en general. Los trabajos necesitan ser realizados con docentes o/y estudiantes de ingeniería, postgrado, maestría o doctorado de las tres instituciones académicas involucradas: La Carrera de Ingeniería Forestal (UAGRM), La Escuela de Ciencias Forestales - ESFOR (UMSS) y La División Bosques y Paisaje (KU). Los trabajos que se presentan deben estar escritos a espacio y medio, en hojas tamaño carta (21 x 28 cm) con márgenes 2.5 cm en todos los lados, con justificación izquierda y usando una sola cara del papel. El trabajo no deben exceder 10.000 palabras (todo incluido). Los nombres científicos desde el rango de género deben ir con letra cursiva. Cada hoja presentada (incluyendo cuadros y figuras), debe numerarse en forma correlativa junto al nombre del autor en el margen superior derecho (tres o más autores figuran con “et al.” a continuación del primer autor). Las figuras, cuadros y leyendas respectivas deberán presentarse en hoja aparte al final del manuscrito; las fotografías deberán ser nítidas y de contraste; no deben exceder a 20 x 12 cm. Las unidades internacionalmente aceptadas son %, °C, mm, cm, ml, l, m, km, mg, g, kg, s, min, h, ha; para la referencia altitudinal se asigna m (p.e. 2.300 m). Serán rechazados los trabajos con excesivas faltas ortográficas y gramaticales así como con gráficos y mapas de baja resolución. Debe enviarse por correo electrónico una copia del texto y figuras/cuadros en formato Word para Windows o Excel. Estructura del Manuscrito para Artículo a) Primera página: Incluye título, nombre de los autores e institución(es) a la que pertenecían durante la realización el

trabajo y direcciones actuales (incluyendo fax y e-mail). El título debe ser informativo y preciso en relación al contenido del trabajo. Los autores que deseen utilizar apellidos paterno y materno, deberán unir ambos por un guión. Si hay varios autores, las direcciones respectivas son referidas por números correlativos indicados como superíndice al final de cada nombre. Debe indicarse a quien se enviará la correspondencia a través de un asterisco en superíndice (*).

Por ejemplo:

E. Ponce1,2,* y F. Helles1 1, *La División Bosques y Paisaje, Universidad de Copenhague, Rolighedsvej 23, DK-1958 Frederiksberg C., Dinamarca. Telf.: +45 3528 1754, Fax: +45 35282671, E-mail: [email protected] 2 Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR), Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno (UAGRM), El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia: E-mail: [email protected]

b) Resumen: Debe ser un informe conciso (no más de 300 palabras) de resultados y no una lista de temas cubiertos; por

lo que se recomienda incluir referencias cuantitativas de los resultados (porcentaje, rangos, entre otros) para ilustrar la generación de los resultados. Al pie de cada resumen deberán enunciarse hasta cinco palabras claves.

c) Abstract: Incluir el resumen del trabajo en inglés o (español si el trabajo está en inglés), además del título y cinco palabras clave.

d) Introducción: Debe presentar el problema dentro de un marco teórico y/o revisión bibliográfica que acompañe a la(s) hipótesis y/o objetivos(s) del trabajo. En este capitulo se realizara una síntesis e interpretación de la literatura relacionada directamente con el titulo y objetivos del trabajo.

e) Materiales y métodos: Debe describir el sitio de estudio. Puede incluirse aspectos relevantes de historia natural de las especies en estudio, si corresponde. Asimismo, debe incluir una descripción concisa, pero lo suficientemente clara como para permitir replicar el estudio. En los métodos empleados se deberá señalar claramente el procedimiento experimental o de recolección de datos y los métodos estadísticos.

g) Resultados y discusión: Se pueden presentar en texto, cuadros y/o figuras. En el texto debe indicarse la ubicación de los cuadros y figuras. Se deberá evitar tanto la repetición de detalles dados en otros capítulos, como la descripción de aquello que sea evidente al examinar los cuadros o figuras que se presenten. Por otro lado, se debe incluir la

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interpretación de los resultados y su relación con otros trabajos publicados similares. En realidad, es un análisis crítico de los resultados de acuerdo con los objetivos y la hipótesis, si fuera el caso.

i) Conclusiones: Cada conclusión debe expresarse como una oración corta y clara. Deben dar respuesta a las hipótesis y/o a los objetivos planteados en la introducción.

j) Agradecimientos: Deben ser breves. Incluir a personas o instituciones, que contribuyeron con financiamiento u otro tipo e colaboración.

k) Referencias: Deben incluir sólo aquellas citadas en el manuscrito. Toda referencia bibliográfica es listada en orden alfabético (luego cronológico), como sigue:

Artículos en revistas Sekher, M., 2001. Organized participatory resource management: insights from community forestry practices in India.

Forestry Policy and Economics 3: 137-154. Gasana, J.K., 2002. The good and bad of projects. Tropical Forest Update. International Tropical Timber Organization

(ITTO). 12(2): 9-11. Libros, informes, tesis Pacheco, P., 2001. The role of forestry in poverty alleviation BOLIVIA. Forestry Department of the Food and

Agricultural Organization of the United Nations (FAO), La Paz, Bolivia. 55 p. Hansen, J.N. and Iversen, J.C., 2004. National forest law and indigenous forest management in the lowland of Bolivia.

Forest Management of Timber and Non-Timber Products in the Tropical Lowland of Bolivia (FOMABO), Santa Cruz, Bolivia. 16 p.

Artículos dentro un libro Oehlerich, A., 2000. Avances y propuestas para garantizar los derechos intelectuales de los pueblos indígenas. En: CPTI-

CIDOB, Atlas territorios indígenas en Bolivia, situación de las tierras comunitarias de origen y proceso de titulación. Centro de Planificación Territorial Indígena, Confederación de Pueblos Indígenas de Bolivia, Santa Cruz, Bolivia. p. 203-206.

Para citar las referencias en el texto, seguir en orden cronológico, como los siguientes ejemplos: … como lo sugieren varios autores (Pérez, 1983; Autino, 1994; Mendoza, 1994) … como lo indican Tarifa (1993), Acevedo & Ruiz (1995) y Pinto et al. (1996) … como fue confirmado recientemente por Pacheco & Pérez (1996), Zalles et al. (1999) … contrariamente a lo encontrado por Menotti (1978a, 1978b, 1998) … sin embargo, Beck & García (en prensa) … pero en algunos años florece en octubre (C. Mayto, 1996, com. pers.) Cada autor de correspondencia recibirá en archivo PDF la versión final publicada de su contribución. En el caso que los autores envíen manuscritos basados en tesis de grado, se recomienda que soliciten a PROINFOR instrucciones específicas y previas a su edición en formato de la Revista. Mayores informaciones: Responsable de la Editorial Juan Edgar Ponce C. Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR) Carrera de Ingeniería Forestal UAGRM El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5 Casilla Postal 6025, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591-3.3434363 E-mail: [email protected]

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¿Que es PROINFOR?

El programa de investigaciones forestales (PROINFOR) se constituye en el brazo impulsor de la investigación en la Carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad

Autónoma Gabriel Rene Moreno, para generar conocimientos científicos mediante la participación de docentes y estudiantes de la UAGRM y contribuir al alivio de la

pobreza y promover el desarrollo sostenible de los recursos forestales del país y de la región. Los objetivos de PROINFOR son: (1) Desarrollar programas de investigación

que contribuyan al conocimiento científico y tecnológico de los diferentes componentes, productos y utilización de recursos forestales, (2) Contribuir en el

manejo sostenible de los recursos forestales en todos los niveles de usuarios (comunidades rurales, empresas, pequeños, medianos y grandes propietarios de tierras forestales), (3) Difundir los resultados de la investigación y la puesta en conocimiento

para el desarrollo del sector, (4) Intercambiar el conocimiento científico con otros institutos de investigación en el ámbito regional, nacional e internacional, así como

con organizaciones interesadas en estos conocimientos. Las prioridades de investigación identificados por la Carrera de Ingeniería Forestal son: (1) Ecología

forestal, (2) Silvicultura y manejo de bosques naturales y plantaciones, (3) Forestería social, (4) Socio-economía forestal, (5) Productos de la madera, (6) Tecnología de

maderas, (7) Tecnología de accesorios, dispositivos y maquinaria forestal, (8) Manejo de cuencas hidrográficas, y (9) Difusión forestal

Contactos PROINFOR Universidad Autónoma “Gabriel René Moreno” (UAGRM) Facultad de Ciencias Agrícolas Carrera de Ingeniería Forestal “Vallecito”, Carretera al Norte Km. 8.5, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591 3 344 2553 E-mail: [email protected]

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¿Que es el proyecto FOMABO?

El proyecto de mejoramiento de la capacidad de investigación “Manejo de bosques en Bolivia” (FOMABO) es una colaboración entre la UAGRM (Santa Cruz, Bolivia), la UMSS (Cochabamba, Bolivia) y la KU (Copenhague, Dinamarca). En su tercera fase (2007-2009), el proyecto esta operando con el objetivo de desarrollo de apoyar a la investigación y formación académica universitaria, enfocando en las necesidades de

desarrollo del sector forestal de Bolivia concernientes a manejo y planificación forestal. El trabajo esta organizado en tres componentes: (1) Fortalecimiento institucional y organizacional, (2) Colaboración en investigación científica, y (3) fortalecimiento

educacional. La visión de largo plazo del proyecto durante este periodo de 12 años es la de crear las capacidades necesarias de investigación y formación concernientes al manejo y planificación forestal sostenible, especialmente en relación con formas de manejo basadas en comunidades rurales locales y la utilización de especies arbóreas

valiosas produciendo madera y productos no maderables en áreas de manejo forestal natural, agroforestería y reforestación de áreas degradadas.

Contactos FOMABO-UAGRM Universidad Autónoma “Gabriel René Moreno” (UAGRM) Facultad de Ciencias Agrícolas Carrera de Ingeniería Forestal “Vallecito”, Carretera al Norte Km. 8.5, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591 3 344 2553 E-mail: [email protected]

FOMABO-UMSS Universidad Mayor de San Simón (UMSS) Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuarias (FCA y P) Escuela de Ciencias Forestales (ESFOR) Av. Atahuallpa (Final), Zona Temporal, Barrio Prefectural, Casilla 447, Cochabamba, Bolivia Telf./fax: +591-4 4451203 E-mail: [email protected]

FOMABO-KVL Universidad Real de Veterinaria y Agricultura (KVL) Centro Danés de Bosque, Paisaje y Manejo Rolighedsvej 23, 1958 Frederiksberg C., Copenhague, Dinamarca Telf.: +45 35 28 17 66 Fax: +45 35 28 15 08 E-mail: [email protected]

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Publicaciones en la serie “Documento Científico” Proyecto FOMABO

2005 No 1. Ponce, E., 2005. Valoración de niveles de participación de las comunidades de la TCO

”Guarayos”, Bolivia, en actividades de manejo forestal sostenible. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 1 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.

No 2. Ponce, E., 2005. El proceso de desarrollo curricular en la carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad Autónoma “Gabriel Rene Moreno” Santa Cruz, Bolivia. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 2 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.

No 3. Ponce, E., 2005. Análisis multicriterio para la planificación de caminos de bajo impacto en la concesión forestal “Lago Rey” Santa Cruz, Bolivia. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 3 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.

2006 No 1. Ponce, E., 2006. Sostenibilidad del manejo de los bosques secos tropicales de Bolivia

aplicando múltiples objetivos. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 1 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.

No 2. Sandoval, E., 2006. Ensayo de longevidad de semillas de quebracho blanco. Documento

Científico Proyecto FOMABO no. 2 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia. No 3. Sandoval, E., 2006. Consideraciones económicas sobre plantaciones de Serebó. Documento

Científico Proyecto FOMABO no. 3 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.