dna mikroarrayler: snp analizleri - ozdaglab.comozdaglab.com/styled-21/downloads-4/files/hafta...

DNA Mikroarrayler: SNP analizleri

Hafta IX

Genombilimde Mikrodizin Uygulamaları ve Biyoinformatik Analiz

SNP analizleri

Doç. Dr. Hilâl Özdağ

DNA Mikrodizin

Genomik

Dizi

5´ 3´SNP

T / G

SNP

Allel ‘A’

prob = 25 baz

Perfect Match

Mismatch

Perfect Match

MismatchAllel ‘B’

DNA Mikrodizin

TAGCCATCGGTA N

SNP

C / A

GTA C TCAATGATCAGCTTAGCCATCGGTA N GTA C TCAATGATCAGCT

ATCGGTAGCCAT G

ATCGGTAGCCAT TATCGGTAGCCAT A

ATCGGTAGCCAT CCAT G AGTTACTACAT G AGTTACTA

CAT G AGTTACTACAT G AGTTACTA

PM Allel

MM Allel

PM Allel

MM Allel

A

A

B

B

DNA Mikrodizin

• 7 Prob Çift Seti (Kuartet)• SNP başına 56 olasılık• Oryantasyon başına 28• Dağıtılmış yerleşim

-4 4

PMA

-1-2 1 30

Düz zincir

Ters zincir

Düz zincir

Ters zincir

5’ 3’5’ 3’

3’ 5’3’ 5’

B

MM

PM

MM

PMA

A

B

MM

B

PM

MM

PMA

A

B

DNA Mikrodizin

1 2 3 4 5 6 7

PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA

MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA

PMB PMB PMB PMB PMB PMB PMBPMB PMB PMB PMB PMB PMB PMB

MMB MMB MMB MMB MMB MMB MMB

• 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP’yitemsil etmek üzere seçilir.

• Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP’nin varlığını hem düzhem de ters zincirde inceler.

• Tek bir TNP’yi sorgulamak üzere toplam 40 probkullanılmaktadır.

Tek Primer Amplifikasyonu ile Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması

DNA Mikrodizin

250 ng Genomik DNA

RE muamelesiXba XbaXba

Adaptörün

bağlanmasıbağlanmasıTek primer ile

amplifikasyon

4 PCR Reaksiyonu

Fragmentasyon

ve işaretleme

Hibridizasyon

Ve Tarama

DNA Mikrodizin

Mikrosatellit 10K

# Marker 400 10,000

Çözünürlülük 10 cM (10 MB) 1 cM (1 MB) *

# PCR Reak/örnek 200 (2x multipleks) 4# PCR Reak/örnek

# PCR Primer/örnek

200 (2x multipleks)

800

4

1

Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta

Belirteç başına DNA

Deney başına DNA

40 ng

16,000 ng

.025 ng

250 ng

DNA MikrodizinFarklılıklar 100k 10K

Dizin sayısı 2 1

Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba

Başlangıç DNA miktarı 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng

PCR Amplifikasyon Boyutu 250-2000bp 250-1000bp

Fragmente edilecek miktar 40ug 20ugFragmente edilecek miktar 40ug 20ug

TaramaYüksek çözünülürlüklü

tarama Rutin tarama

Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu 0.06U/uL 0.048U/uL

Algoritma ve yazılım DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0

Ana uygulama alanı Asosiyasyon çalışmaları Bağlantı

TNP’ler Perlegen ve KamuKamu

DNA Mikrodizin

DNA Mikrodizin

<> <>

Resequencing Tiling

Strategy

ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA

ATCGGTAGCCATCCATGAGTTACTA

ATCGGTAGCCATTCATGAGTTACTA

ATCGGTAGCCATACATGAGTTACTA

AAAA

TTTT

CCCC

GGGG12 bases


TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT


TAGCCATCGGTAGGTACTCAATGAT

CAGCT

GTCGA


TAGCCATCGGTATGTACTCAATGAT

TAGCCATCGGTAAGTACTCAATGAT

GGGG

AAAA

TTTT

CCCC

GGGG

Resequencing Tiling Strategy

TCGGTAGCCATGTATGAGTTACTAC

TCGGTAGCCATGGATGAGTTACTAC

TCGGTAGCCATGCATGAGTTACTAC

TCGGTAGCCATGAATGAGTTACTAC



TCGGTAGCCATGTATGAGTTACTAC

AGCCATCGGTAGATACTCAATGATG

CAGCT

GTCGA

AGCCATCGGTAGCTACTCAATGATG

AGCCATCGGTAGGTACTCAATGATG

AGCCATCGGTAGTTACTCAATGATG


CGGTAGCCATGCTTGAGTTACTACA

CGGTAGCCATGCGTGAGTTACTACA

CGGTAGCCATGCCTGAGTTACTACA

CGGTAGCCATGCATGAGTTACTACA



CGGTAGCCATGCTTGAGTTACTACA

GCCATCGGTACGAACTCAATGATGT

CAGCT

GTCGA

GCCATCGGTACGCACTCAATGATGT

GCCATCGGTACGGACTCAATGATGT

GCCATCGGTACGTACTCAATGATGT


GGTAGCCATGCATGAGTTACTACAG

GGTAGCCATGCAGGAGTTACTACAG

GGTAGCCATGCACGAGTTACTACAG

GGTAGCCATGCAAGAGTTACTACAG



GGTAGCCATGCATGAGTTACTACAG

CCATCGGTACGTACTCAATGATGTC

CAGCT

GTCGA

CCATCGGTACGTCCTCAATGATGTC

CCATCGGTACGTGCTCAATGATGTC

CCATCGGTACGTTCTCAATGATGTC


GTAGCCATGCATTAGTTACTACAGC

GTAGCCATGCATGAGTTACTACAGC

GTAGCCATGCATCAGTTACTACAGC

GTAGCCATGCATAAGTTACTACAGC



GTAGCCATGCATTAGTTACTACAGC

CATCGGTACGTAATCAATGATGTCG

CAGCT

GTCGA

CATCGGTACGTACTCAATGATGTCG

CATCGGTACGTAGTCAATGATGTCG

CATCGGTACGTATTCAATGATGTCG


TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT

TAGCCATGCATGGGTTACTACAGCT

TAGCCATGCATGCGTTACTACAGCT

TAGCCATGCATGAGTTACTACAGCT



TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT

ATCGGTACGTACACAATGATGTCGA

CAGCT

GTCGA

ATCGGTACGTACCCAATGATGTCGA

ATCGGTACGTACGCAATGATGTCGA

ATCGGTACGTATTCAATGATGTCGA

A

C

GDüz zincirDüz zincir G

TT C G C A

ACGT

AGCGT

CustomSeq™ Resequencing Dizinleri

ACCGT

• Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb.

ACGT

CustomSeq™ Deney Protokolü

Genomik DNA

Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR

Kontrol

Kalıp/Primerler

Miktar tayini-Örneklerin Karıştırılması

Fragment

Đşaret

Hibridizasyon

Veri analizi

Fragmentasyon

reaktifi

Hibridizasyon için

oligo kontrolleri

Deney Akışı

Đlgilenilen Đlgilenilen genlerin genlerin belirlenmesibelirlenmesi

GenomiGenomikk

Karıştırma veKarıştırma veFragmentFragmentasyonasyon

PCR PCR ÜrünleriÜrünleri

DNA fragmentDNA fragmentlerileri

Yıkama ĐstasyonuYıkama Đstasyonu::Yıkama/BoyamaYıkama/Boyama

TaramaTarama Sondan işaretli fragmentlerSondan işaretli fragmentler

ĐşaretlemeĐşaretlemeGenomiGenomikkDNADNA

PCR PCR ÜrünleriÜrünleri

BB

BBBB

BB

BB

BB

BB

Geceboyu hibridizasyon

>chr21:29595444-29636248

gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc

cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaat

tttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtc

tcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgctg

ggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaaa

aggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgggt

caataccagaattgggtgggggtcttcagctcacccctaaactcatca

ttgataagcagaatgaatgaccatggctggtttagaca……….

Affymetrix CustomSeq™ Arrays

Biological

Sample

2.5 Days2.5 Days

ScanWash &

Stain

ProbeProbeArrayArray

~30 Kb

DNA Analiz Yazılımı

Cihaz Kontrolü

.DAT dosyasının oluşturulması GCOS

.CEL dosyasının oluşturulması

.CHP dosyasının oluşturulması

.CHP veri karşılaştırılması

GeneChip DNA

Analysis Software 2.0

(GDAS)

dna mikroarrayler: snp analizleri - ozdaglab.comozdaglab.com/styled-21/downloads-4/files/hafta...

Documents