dna 抽取和质粒 dna 制备
DESCRIPTION
DNA 抽取和质粒 DNA 制备. 提取 DNA 总的原则. 1 保证核酸一级结构的完整性; 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度; 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子; 4 其他核酸分子,如 RNA, 也应尽量去除。. 核酸分子抽提的技术设计. 核酸的释放: 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法(非机械法中 溶胞法 是应 用最广泛的方法) 核酸的分离与纯化: 将含有核酸分子复杂复合物中,将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物(蛋白质、多糖和脂 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
提取 DNA 总的原则1 保证核酸一级结构的完整性;2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的
污染应降低到最低程度;3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶
剂和过高浓度的金属离子;4 其他核酸分子,如 RNA ,也应尽量去除。
核酸分子抽提的技术设计核酸的释放: 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法(非机械法中溶胞法是应 用最广泛的
方法)核酸的分离与纯化: 将含有核酸分子复杂复合物中,将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物(蛋白质、多糖和脂 类分子)、非需要的核酸分子、试剂和溶液
浓度鉴定1 紫外分光光度法:测定 DNA 在 A260nm 的光吸收值。 如计算 DNA 浓度
A260×稀释倍数 ×50 = μg/ml
紫外分光光度法只用于测定浓度大于 0.25ug/ml 的核酸溶液。
(A 值等于 1 时,相当于 50μg/ml 双链 DNA , 40μg/ml 单链 DNA或 RNA , 33 μg/ml 单链寡核苷酸)
纯度鉴定1 紫外分光光度法:
在 260nm 和 280nm 处测定 DAN 溶液的光吸收,纯的
DNA ,低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此
值表明有 RNA 的残留量。
A260与 A280 之比应在 1.80 ;纯的 RNA A260与 A280 之比
应在 2.0 。
A260/A280 比值是纯度检测的重要指标。
完整性鉴定凝胶电泳法: 基因组 DNA 电泳,在电场中泳动慢,如果发生降解,
可出现电泳图谱脱尾现象;
总 RNA 电泳,观测各条带的含量,提示是否存在RNA 降解;如加样槽中存在条带,可能是 DNA 污染。
核酸的贮存—— DNA 保存 1 、短期贮存:
4℃ 或 -20℃ 存放于 TE ( tris 和 EDTA )缓冲液中。
TE 缓冲液的 PH 与 DNA 贮存有关, PH 为 8 时,可减少DNA 脱氨反应, PH 低于 7.0 时 DNA 容易变性。
2 、长期贮存:
TE 缓冲液中 -70℃ 保存数年;在 DNA 溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。
核酸的贮存—— RNA 保存• RNA 可溶于 0.3mol/L 的醋酸钠溶液或双蒸水,
在 -70℃ 保存。
• RNA 可溶于 70% 的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶
液中,可在 -20 ℃ 保存。
• RNA 如果以 DEPC (焦碳酸二乙酯)可以抑制
RNA 酶对 RNA 的降解
DNA 提取
1 酚抽提法:
先用 EDTA 、 SDS 、蛋白酶 K 破碎细胞,消化蛋白,然后用 pH8 的 Tris饱和酚或酚 - 氯仿抽提 DNA ,最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获 DNA 大小为 100- 150kb 。
SDS 的作用:1 溶解膜蛋白和脂肪,从而是细胞膜破裂;
2 溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸
释放出来;
3 对 RNA 、 DNA 酶有抑制作用;
4 与蛋白质形成 R-O-SO3 ….R 蛋白质复合物,使蛋白质变性。
• 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制 DNA 酶活性。• PH8.0 的 Tris 溶液可以似的抽提出的 DNA
进入水相,减少在蛋白质层滞留。• 在酚或酚 - 氯仿中加入少许的异戊醇,是可以
减少实验中的气泡的产生,而且利于分相,保持分相的稳定性。
• 2 甲酰胺解聚法:
• 破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与 DNA
的结合,再透析获得DNA 。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白
质与 DNA 的复合物,可以使蛋白质变性。减少了酚多次
抽提的步骤
• 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的 DNA 样品。
可得DNA 200kb左右。
• 4 异丙醇沉淀法:基本同 1 法,仅用二倍容积异丙醇替
代乙醇,可去除小分子 RNA (在异丙醇中可溶状态)。
• 5 表面活性剂快速制备法:用 Triton X-100 或 NP40
表面活性剂破碎细胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,
乙醇沉淀或透析。
琼脂糖含量%(W/V) 线性 DNA分离范围( Kb)
0.3 5 - 60
0.6 1 - 20
0.7 0.8 - 10
0.9 0.5 - 7
1.2 0.4 - 6
1.5 0.2 - 3
2.0 0.1 – 2
DNA 的浓缩
• 1 、 固体聚乙二醇( PEG )浓缩:用透析袋外敷 PEG至合适量。
• 2 、 丁醇抽提浓缩: DNA 溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但 DNA 不会。因此重复几次可显著减少 DNA体积。
DNA 的检测
溴乙锭染色 :在 254nm 紫外光下检测,如需回收
最好在 300nm 紫外光下割胶,否则易使嘌呤断链,在 1cm宽带上可检到 10ng DNA 。
银染法 : Ag+ 与 DNA形成复合物,在甲醛还原下
可染成黑褐色,灵敏度高 200 倍,但不能回收。
电泳到 DEAE-纤维素膜 :
DEAE 是一种阴离子交换纤维素,可以吸附带有负电荷的 DNA 分子。
在所需条带前插入DEAT-纤维素膜,继续电泳至条带 DNA都到膜上,取出
洗下。
500bp-5kb的DNA片段回收率较好,纯度高。但不适用于分子量超过 10kb
和单链DNA。