DNA DİZİ ANALİZLERİ VE KLONLAMA

DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır.

Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.

Bir genomun tamamlanan nükleotit dizisi, nihai haritası demektir.Genomların çok uzun DNA moleküllerinin dizi analizini olası hale getiren DNA fragmentlerinin klonlanması için kullanılan teknolojidir.

Kısa bir DNA fragmentinin çok sayıda kopyasının bulundugu saf bir preparasyonla başlayarak, bir dizi analizi yapan aletle bu fragmentin nükleotit dizisi belirlenebilir.

DNA Dizi Analiz Yöntemleri

DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nın nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir.

İlk dizi analiz çalışmaları 1960’lı yılların başında 75-80 nükleotitlik tRNA’larla başlanmıştır.

DNA dizi analizleri yada sekanslama DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Analiz bir nükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonuna dayanır.

Bu hibridizasyon sırasında radyoaktif ya da radyoaktif olmayan maddelerle işaretleme yapılır. Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.) tespiti yada rekombinant DNA oluşum yapılarının tayininde kullanılır.

.

Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek embriyolarından alınan DNA’lar bu yöntemle analiz edilerek taşıyıcı embriyolar elenip genetik hastalık taşımayanların doğması sağlanmaktadır.

Yine aynı şekilde doku uygunluğu saptanmış embriyolardan sağlıklı doğacaklardan elde edilen kordon kanı ve kemik iliği hasta kardeşlerin tedavisinde kullanılmaktadır.

Nükleotit dizilerinin belirlenmesinde iki temel teknik kullanılmaktadır.

• Sanger dideoksi yöntemi

• Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemi

Her iki teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır.

• DNA’nın hazırlanması

• Reaksiyonlar

• Yüksek voltajlı jel elektroforezi

Her iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçaları hazırlanır.DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temel fark DNA fragmentlerinin üretilme biçiminden kaynaklanır.

Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNA moleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta da kullanılır.

Sanger Dizi Analiz Yöntemi

Dideoksi yada zincir sonlanması reaksiyonları olarak da bilinir. Tehlikeli kimyasallardan uzak ve daha hızlı bir yöntem olduğundan Maxam-Gilbert yöntemine tercih edilir.

Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.

Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.

Bu yöntem için:

Tek iplikli kalıp DNA’ya

dNTP’lere

ddNTP

DNA polimeraz

Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır

İŞLEYİŞProsedür PCR nın işleyişine benzer•DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol miktarda dört çeşit normal nükleotid

dATP dGTP dCTP dTTP bulunur.

•Karışımda aynı zamanda diziyi rastgele sonlandırmak için farklı renkte flouresan kimyasallarla işaretlenmiş dideoxynukleotidler vardır.

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP

•DNA polymerase I ise sentezde zincirin uzaması aşamasında gereklidir.

ddNTP ’ ler dideoksinükleosittrifosfatlardır. OH grubu taşımayan modifiye nükleotit substratlardır.

Bunlar riboz şekerinin ikinci karbon atomuna ek olarak üçüncü karbon atomunda da deoksi halde olduğundan fosfodiester bağının oluşumu engellenir yeni nükleotitler yapıya katılmaz. DNA zincir uzaması sonlanır.

İlk olarak reaksiyon sonunda oluşacak ürünlerin rahat görüntülenebilmesi için DNA molekülü işaretlenir. İşaretleme işlemi için genelde

• S35• P33 • P32 kullanılır.

İşaretleme ya gama pozisyonunda yapısında bulunduran nükleotitleri kullanarak yada alfa pozisyonunda işaretli dNTP’leri kullanarak yapılır.

DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’ler ortama konulup işaretli nükleotitin yapıya katılması sağlanır.

Kullanılan ddNTP’lerin konsantrasyonu diğer maddelerden daha düşük olmalıdır.

İşaretleme primere de yapılabilir. İşaretlemeden sonra zincir sonlanması reaksiyonlarına geçilir.

Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Her tüpe gerekli enzim faktörleriyle birlikte düşük derişimli farklı ddNTP’ler konulur ve inkübe edilir.

ddNTP’ler ve dNTP’ler aynı karışıma konduğunda aralarında bir yarışma olur.substrat olarak dNTP’ler kullanıldığı sürece uzama devam eder. Sentezin herhangi bir noktasında yapıya dideoksi girdiğinde reaksiyon durur.

Her tüpte aynı anda birbirinden bağımsız birçok reaksiyon olmuştur.

Sonuçta primer sonundan başlayıp pramatüre sonlanmaların olduğu bölgelere kadar çeşitli uzunlukta DNA parçaları oluşur.

Oluşan ürünlerin ayrıştırılabilmesi için yüksek rezülasyonlu denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi kullanılır.

Elektroforez sonunda jel kurutularak otoradyografi ile fotoğrafı çekilir.

Otoradyogramdan elde edilen basamak şeklindeki bantlar radyoaktif izotop taşıyan tek zincirli DNA moleküllerine aittir. Birbirine en yakın iki bant arasında tek bir nükleotitlik fark vardır.

Makromoleküllerin jel elektroforezi

Elektroforezde mobilitesi en hızlı olan bant primere en yakındır yani radyoaktif elemente en yakın bant en küçük DNA fragmentidir. Bu fragment hangi ddNTP ile oluşturulmuş ise işaretten sonra gelen ilk bazdır.

Her baz için ayrı fluoresans boya ile işaretlenmiş olan ddNTP’ler kullanılır.

DNA parçacıkları jelde ilerlerken bir lazerin yanından geçerler. Lazerle karşılaşan floresans boyanın yaptığı ışıma dedektör aracılığı ile okunur.

İNCELENEN BİR DNA BÖLGESİNİN DİZİ ANALİZİ SONUCU

İlk bantta en yakın ikinci bazı verir. Böylece aşağıdan yukarı doğru çıktıkça hareketi azalan bantların hangi ddNTP ile oluşturulduğu belirlenir.

Sonuçta otoradyogramda ki bu bant verilerden yararlanılarak 53 yönüne doğru olan baz dizilimi saptanmış olur.

FRAGMENTLERİN OTOMATİK ELEKTROKİNETİK ENJEKSİYONLA BOYLARINA GÖRE SIRALANMASI

DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, terstranskriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.

DNA Dizi Analizinde Kullanılan Enzimler

DNA dizi analizinde çeşitli polimerazlar kullanılabilmektedir:

• Klenow Fragment/E.Coli DNA polimeraz• Reverse Transkriptaz• Bakteriofaj T7 DNA polimeraz• Taq DNA polimeraz• Sequenazlar

Kalıp DNA

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır.

PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).

Enzimler

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipde DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.

E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I

İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır.

Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir.

Bu enzim standart olarak 250-300 nükleotitlik bir dizi analizi edebilir çok uzun zincirlerde etkisini gösteremez,

İkincisi Homopolimerik bölgeleri etkin olarak çoğaltamaz (Homopolimer DNA segmentlerinin uçlarına ilave edilen poli A, poli T’lerden) İkincil yapının olması durumunda da etkili değillerdir (Dyad simetri)

Ters Transkriptaz

Ters transkriptaz (Reverse transcriptase) enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. Homopolimerik bölgeler (A/T veya G/T ) bakımından zenginse tercih edilmektedir.

Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır .

Sekuenaz Enzimleri

Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7 bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. Bu özelliği ddNTP’lerin bağlanmasını kolaylaştırdığından çoklukla tercih edilmektedir.

İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır.

(Bu enzimin tamamiyle modifiye bir formu olan Sequenaz ver 2’de üç kat daha fazla aktivitesi olan bir enzimdir. Plimerizasyon oranı 300 dür. Bir reaksiyonda yaklaşık 3000 nükleotit sentezi yapılabilmektedir. Burada sınırlayıcılar poliakrilamid jellerdir. Bu avantajlardan yararlanabilmek için iki kademeli dizilenme reaksiyonu yapılır.) Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir .

Taq DNA Polimeraz

Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür.

Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir .

Tag polimeraz Klenow’un yapamadığı tüm işlevleri yapabilmektedir ve özellikle G/C bakımından zengin bölgelerde daha etkindir.

Maxam –Gilbert Kimyasal Degredasyon Yöntemi

Çok yönlü sekans olarak da bilinen bu yöntem de bazı kimyasallarla DNA özgül baz dizilerinden kesilerek değişik uzunlukta fragmentler elde edilir. Bu metotta bir sekans jelinden kırk klon analizi yapılabilmektedir.

Yine de çok fazla tercih edilmeyen metottur. Ana mantık DNA’daki bazların tahrip edilip hasar görmüş bölgelerden piperidin ile fosfodiester bağlarının kırılmasıdır.

İlk olarak DNA parçası bir ucundan işaretlenir. İşaretleme sonrası DNA dört parçaya ayrılır.

Her bir örneğe bazlardan birini tahrip edilebilecek kimyasallar eklenir. Genelde ilk pürin ve pürimidinlerin ayrımı ardından bazların ayrımı şeklinde olur. Dimetilsülfat ile müdahale pürünlerin hydrozin ile müdahale de pürimidinlerin arasındaki glikozit bağlarının kırılması sağlanır.

Piperidin de fosfodiester bağlarının kırınımını katalizler. Dimetilsülfat, piperidine guanini bağlarken Dimetil sülfat, piperidine formikasit guainin ve adenini bağlıyor Hidrozin ve piperidin birlikte timin ve sitozini bağlarken Hidrozin piperidin ve 1.5 M‘lık NaCl yalnızca sitozini bağlar.

Yukarıdaki kimyasalların uygulanmasıyla oluşan çeşitli uzunluktaki fragmentler yüksek voltajlı elektroforez sonunda X-ray duyarlı film ile k kaplanarak otoradyograma alınır. otoradyografik bantlar 5>3 yönünde en alttan en üste doğru okunduğunda bize 5>3 yönündeki baz dizilimini verir.

MİKROARRAY GÖRÜNTÜSÜ

Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar ve Primerler

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.

Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.

Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır.

Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur .

Kulanım alanları1. Hastalığa yatkınlığın önceden belirlenmesi2. Kişiye özel ilaç tasarımlarının yapılabilmesi.3. Gen tedavisi ve gene özgü ilaç üretimi4. Yeni enerji kaynaklarının bulunması5. Adli tıp çalışmalarında kullanılması6. Genetik testlerde kullanılması7. Tarımda sağlıklı ve çok daha verimli çiftlik hayvanlarının geliştirilmesi8. Besin değeri yüksek ürünler geliştirilmesi9. Islah çalışmalarında zaman kazanılması vb. birçok uygulama alanı vardır.

KLONLAMA

Klonlama temelde üç ana başlığa ayrılarak incelenebilir:

•Moleküler klonlama•Çoğaltımsal klonlama•Terapi Amaçlı klonlama

Gen klonlaması çalışmaları bugün çok çeşitli amaçlar için genetik ve biyolojik araştırmalarda kullanılmaktadır.

Bir genin vektöre yerleştirilmesi ve bu vektörün bakteri hücrelerine transformasyonu sonucunda hücrelerin bölünmesi sırasında vektörün deiçerdiği genin birçok kopyasını oluşturması işlemine gen klonlaması adı verilmektedir.

Moleküler klonlama

Bu teknik, herhangi bir DNA parçasının, plazmid ya da fajmid gibi kendini eşleme yeteneği olan bir başka DNA parçası içine vektör yerleştirilmesi ve bu bileşimin vektörün çoğaltılması işlemlerini içerir. Bu teknik, biyoloji biliminin neredeyse her alanında çok önemli kullanım alanına sahiptir.

Klonlamada;virus ve bakteriler, bakteriofajlar, plazmitler, nadiren de kozmid ve mayalar vektör olarak kullanılmaktadır.

Plazmitler, bakteri ve diğer organizmalarda bulunan, konak hücre kromozomundan bağımsız olarak çoğalan küçük, yuvarlak yapılı kromozom dışı DNA’lardır.

Gen klonlaması çalışmalarında plazmitler kullanıldığında, klasik olarak genler genomik DNA veya mRNA’dan izole edilerek Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmakta, gen ve genin yerleştirileceği plazmit bir veya daha fazla enzimle kesilerek in vitro şartlarda genin plazmite yerleştirilmesi sağlanmaktadır.

Araştırıcılara bir çok avantaj sağlayan plazmit ve klonlama kitleri firmalar tarafından üretilmektedirler.

Bunlar yardımıyla çok kısa sürede ve çok etkin bir şekilde gen klonlaması yapılabilmektedir.

Araştırıcıların biyoteknolojik gelişimi takip ederek gen klonlaması ve sonrasındaki çalışmalar için kullanacakları en uygun plazmiti; plazmitin kullanım özellikleri, maliyet ve zamangibi faktörlerin yanı sıra kendi laboratuvar olanaklarını da göz önünde bulundurarak seçmeleri gerekmektedir.

Günümüzde gen klonlaması çalışmaları Gen izolasyonu, Gen bankalarının oluşturulması,

DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması,

DNA aşılarının oluşturulması ve rekombinant

Genlerin güvenlik altına alınarak onların yapı ve fonksiyonları üzerinde araştırmalar yapılması,

Klonlanan genlerin üzerinde mutasyonlar yapılarak fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi,

Proteinlerin açıklatılması

gibi amaçlarla yapılmaktadır . Bir genin vektöre yerleştirilmesi ve bu vektörün bakteri hücrelerine transformasyonu sonucunda hücrelerin bölünmesi sırasında vektörün de içerdiği genin birçok kopyasını oluşturması işlemine “gen klonlaması” adı verilmektedir

Gen klonlamasının temel ilkeleri. Konakçıdan elde edilen DNA ve plazmit aynı restriksiyon enzimleriyle kesilerek, DNA’nın plazmite yerleştirilmesi sağlandıktan sonra oluşan rekombinant DNA,E.coli hücrelerine transforme edilmektedir.