• DNA 변형과 조작 – 유전자 클로닝

• 제한효소(Restriction enzyme)와 연결효소(DNA ligase)

• 역전사효소, 벡터

• DNA 증폭 – 중합효소 연쇄반응 (PCR)

• DNA 분리 및 분석

• 젤 전기영동법 (Gel electrophoresis)

• DNA footprinting (DNA 지문)

• DNA 염기서열분석 – Sanger method

• DNA 재조합 기술 (Recombinant DNA technology)

• 형질전환기술 (Transgenic technology)

• 유전자치료법 (Gene therapy), DNA microarray

• 유전자 억제 – Antisense, Knock-out

유전공학

1. Restriction Enzymes 제한효소

• 특정서열(역상보성 염기서열)을 인식하고

DNA를 자른다. 점착성 말단을 만든다

Recognize specific sequences of DNA

(usually palindromes) and make cuts.

• These cuts usually produce “sticky ends”

• 제한효소는 주로 세균이 갖고 있는 DNA를 자를

수 있는 효소(endonuclease). 이는 세균이 외부

DNA(virus)를 제거하기 위한 수단으로 만드는 것.

세균 자신의 DNA는 methyl화시켜 보호.

DNA 변형과 조작

EcoRI

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어떤 경우에 다른 DNA 밴드패턴을 보게 되는가?

2. DNA ligase 연결효소

• DNA 연결효소는 DNA 조각들을 서로 붙인다. Used to remove segments of DNA which can be “pasted” into another piece of DNA.

DNA 변형과 조작

원래의 DNA 조각을 제거한 후, 다른 조각의 DNA를 연결

3. Reverse Transcriptase 역전사효소

• 레트로바이러스에서 만들어지는 효소 An enzyme produced by retroviruses

• RNA를 주형으로 이중가닥 DNA를 합성 Creates a double stranded DNA molecule from an RNA template

• mRNA로 부터 DNA를 합성 – 상보적 DNA Complementary DNA (cDNA) is produced when reverse transcriptase creates DNA from purified mRNA

• 인트론이 없음 cDNA lacks introns

DNA 변형과 조작

4. Vectors 벡터

• 원하는 DNA를 세포 속으로 전달해주는 물질

Molecules that maintain a DNA molecule of

interest and carry it into a cell

• 박테리아에서 발견된 플라스미드와 레트로바

이러스 게놈이 일반적인 벡터로 쓰임

Plasmids (extra pieces of DNA found in bacteria)

and retroviruses are common vectors.

DNA 변형과 조작

1. Polymerase chain reaction (PCR)

짧은 시간 내에 원하는 DNA를 수백만 벌 복제 Used to produce millions of copies of a

target DNA sequence within hours

• 가열하고, 식히는 PCR 반응에 필요한 것 Requires the following items which are subjected

to cycles of heating and cooling:

• A target DNA sequence 원하는 DNA 서열 (주형)

• Primers 프라이머

• DNA nucleotides (dNTPs; dA, dG, dC, dT)

• Heat stable DNA polymerase (Taq) 내열성 중합효소

DNA 증폭 (DNA Amplification)

Polymerase chain reaction (PCR)

중합효소 연쇄 반응

1983년 뮬리스

세포의 복제 도구를 이용해서 DNA의 특정부위를 단시간에 수백 만배로 증폭 합석하는 기술.

극소량의 DNA나 RNA를 대량으로 증폭 가능

PCR 반응에 필요한 것 :

• 염기서열 일부를 알고 있는 표적 DNA

• 시발자로 불리는 단일가닥 짧은 DNA 2개. 이 염기서열은 표적 DNA의 양끝과 상보적.

• 다량의 4종류의 DNA 뉴클레오타이드 단위 분자들

• TaqI, 온천에 서식하는 미생물의 DNA 중합효소. 열에 강함.

1. Gel electrophoresis 젤 전기영동

• 여러 길이의 DNA 조각을 아가로스 젤에 놓고

전류공급

DNA fragments of various sizes are loaded into an

agarose gel where an electrical current is applied.

• DNA는 음전하를 띠므로 양극으로 이동

DNA has a negative charge and migrates towards a

positive charge.

• 작은 길이의 DNA 조각이 긴 것보다 빠르게 이동

• 염색 후, 밴드 양상을 확인

DNA의 분리 및 분석

2. DNA Fingerprints (DNA 지문법)

제한효소에 의해 잘린 DNA 조각의 패턴이 매우 특이적 Patterns produced when DNA is cut by restriction enzymes

Produced by looking at:

• 단일염기다형 – 개인간의 차이가 높은 지역 SNPs (single nucleotide polymorphisms) - highly variable regions of genomes which vary from one individual to the next

개개인간의 다른 길이의 DNA 조각

DNA의 분리 및 분석

• 반복서열의 비교 Comparison of repeated DNA sequences

반복서열을 가지고 있는 염색체의 특정지역. 반복서열의 숫자가 개인마다 다르다. Certain areas in the chromosomes have repeated DNA sequences. The number of these sequences varies from one individual to the next.

제한효소로 자르면 반복서열의 수에 따라 다른 길이의 DNA 조각으로 Cutting with restriction enzymes will produce different sized fragments depending on the number of repeats.

DNA 분리 및 분석

3. Hybridization 핵산혼성화

겔 상에서 무수히 많은 DNA 밴드로부터 특정 DNA를 식별 Used to detect a particular DNA segment from multiple bands within a gel

• 써던블롯팅은 DNA 밴드를 나일론 막에 옮긴 후 탐지자에 노출 In Southern blotting, DNA bands can be transferred from a gel to a nylon membrane and then exposed to a probe.

특정 탐지자는 원하는 DNA에 상보적으로 결합 - 핵산혼성화 Specific probes will base pair to the DNA if interest (=hybridization)

DNA 분리 및 분석

DNA분자의 염기서열을 결정하는 방법 The technique used for reading the sequence of a DNA molecule

The Sanger Method 생어법

ddNTP를 이용한 방법

Sequencing on DNA microarrays

DNA 염기서열분석 (DNA sequencing)

•하나의 유전자를 단일세포에 주입한다유전자 형

질전환 기술

•관심 유전자를 배우자나 수정란에 주입, 이로부터

발생되는 모든 세포에 지니게 된다.

•프로모터에 따라 적절한 조직에서 발현.

유전자 운반 방법:

전기충격,

DNA 총

지방 방울인 리포좀안에 넣어 보내는 방법

바이러스에 감염시켜 넣는 방법

유전자 재조합 기술

전기충격법 (Electroporation): 전기를 순간적으로 흘려주면 세포가 일시적으로 세포막 구멍을 열어 DNA를 받아들인다.

Transgenic organisms 형질전환 생명체 Carry foreign genes 외부유전자를 가짐 칼시토닌: 뼈를 파괴시키는 파골 세포(Osteoclast)의 활동을 억제 골다공증 치료효과 페튜니아와 세균으로부터 얻은 베타카로틴 (비타민 A 전구체)과 철을 생산하는 유전자를 포함, 영양결핍을 방지하는데 중요한 역할 가능

DNA 재조합 기술의 응용

Transgenic technology 형질전환 기술

모델동물을 이용해서 형질전환. 질환증세 요인 등을 연구 의약품제조: 형질전환 동물의 우유나 정자에서 사람의 단백질을 분비하게 하여 다량의 정제된 약제를 얻을 수 있다. -형질전환 염소는 응고촉진제인 인간 플라즈미노겐을 생산한다. 농작물: 병충해에 저항, 형광식물, 헤모글로빈 생산, 금쌀 (비타민 A전구체)

유전자 재조합 기술

Gene therapy 유전자치료법

• 선천적 유전병을 치료하기 위해 체세포의 비정상 유전자를 대체 Replacement of a nonfunctioning gene in somatic cells in an attempt to fix an inborn genetic error.

Monitoring gene expression 유전자 발현 탐지

• DNA 칩은 세포 조직이나 다른 조건에서 유전자 발현 양상을 탐지 DNA chips can be used to monitor gene expression in different cell types or under different conditions.

DNA 재조합 기술의 응용

DNA 칩 또는 마이크로어레이는 작은 조각의

유리, 나일론, 실리콘 또는 실리카 위에 정해진

위치에 심은 유전자 집합

혈액과 같은 조직에서 DNA추출 후 형광물질

로 표지, 칩과 반응 시키면 일치 DNA 가 있을

경우 형광이 변하거나 나타난다.

DNA 마이크로어레이 (Microarray)

DNA 칩 또는 마이크로어레이는 작은 조각의 유리, 나일론, 실리콘 또는 실리카 위에 정해진 위치에 심은 유전자 집합 혈액과 같은 조직에서 DNA추출 후 형광물질로 표지, 칩과 반응 시키면 일치 DNA 가 있을 경우 형광이 변하거나 나타난다.

여러 유전자를 한번에 분석하거나 특정 유전자의 다양한 발현을 여러 조직에서 동시에 분석 유전체학

(Genomics) 기능 유전체학 (Functional genomics) 독성 유전체학 (Toxicogenomics) 약제 유전체학 (Pharmacogenomics) 구조 유전체학 (Structural genomics)

DNA 마이크로어레이 (Microarray)

여러 유전자를 한번에 분석하거나 특정 유전자의 다양한 발현을 여러 조직에서 동시에 분석 유전체학 기능 유전체학 독성 유전체학 약제 유전체학 구조 유전체학

DNA 마이크로어레이 (Microarray)

특정유전자를 제거함으로써 유전자의 기능을 규명 Blocking the expression of a particular gene to look for missing functions that correspond to that gene.

Antisense technology 안티센스 기술

• mRNA를 억제하여 단백질 합성을 저해 blocks mRNA which prevents protein synthesis

Knockout technology 유전자 제거 기술

• 상동재조합을 이용하여 유전자 억제 uses homologous recombination to swap a disabled form of a gene for a natural form of the gene

유전자 억제 (Gene Silencing)