저 시-비 리- 경 지 2.0 한민

는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게

l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.

다 과 같 조건 라야 합니다:

l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.

l 저 터 허가를 면 러한 조건들 적 되지 않습니다.

저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.

것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.

Disclaimer

저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.

비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.

경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.

공 사 논

Metabolic engineering of

Saccharomyces cerevisiae for

glycolic acid production

리 산 생산 효모 사공 연구

2016 8 월

울 원

공과 생 공 부

권 지

i

국

리 산 각질 거 용도 미용 산업에

리 이용 며, PGA 같 생분해 고분자 질 단량체

사용 어 산업 가 가 높 약 산 일종이다. 본 연구에 는

미생 통 이 매스 리 산 생산 여 사

공 인 법 이용 여 높 효 리 산 생산 있도

개량 Saccharomyces cerevisiae 효모 균주를 작 다.

효모에 리 산 생산 리 실산 회 간 산 인

리 실산 원 통 여 이루어진다. 본 연구에 는 장균 래

리 실산 원 효소 자 ycdW를 도입 효모에 공

리 산 생산 있 인 며, 리 실산 원 경쟁

인 말산 합 매개 는 MLS1 거 고 ycdW 자를

삽입 여 0.1 M 인산 포함 는 충 지에 20 g/L

포도당 부 1 g/L 리 산 생산 는 돌연변이 균주

mls1Δ::ycdW를 작 다. 이에 리 실산 생 매개 는

이소시트르산 분해 효소 자 ICL1 과 여 리 산 생산량

증가를 인 고, 여 에 추가 리 실산 생

부산 인 신산 살 아 트산 여 리 실산 회 에

재 용 는 경 에 여 는 자들 함께 과 mls1Δ::ycdW

ICL1 SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS 에 종 1.52 g/L

ii

리 산 생산 있었다.

주요어 : 효모, 사공 , 리 산, 리 실산 회

번 : 2013 – 23158

iii

Contents

국 ......................................................................................................................

Contents ..................................................................................................................... iii

List of Figures ............................................................................................................. v

List of Tables ............................................................................................................. vi

Chapter 1. .......................................................................................................... 1

1.1. 개요 ........................................................................................................................... 1

1.1.1. 리 산.................................................................................... 1

1.1.2. Saccharomyces cerevisiae 를 이용 리 산 생산............ 4

1.1.3. 리 산 생산 연구 동향 ...................................................... 7

1.2. 실험 목 ................................................................................................................ 11

Chapter 2. 재료 법 ......................................................................................... 13

2.1. 사용 균주 지 조건 ........................................................................................ 13

2.2. 결손 균주 작 ....................................................................................................... 15

2.3. 라스미드 작 ...................................................................................................... 18

2.4. 양 조건과 시료 채취 검출 법 .................................................................... 22

Chapter 3. 결과 토 ......................................................................................... 23

3.1. 장균 래 리 실산 원 효소 도입 ............................................................... 23

3.2. 리 산 생산 지 충 .................................................................................... 25

3.3. 말산 합 효소 결손 효모 균주 작 .................................................................. 28

3.4. 양 지에 른 효 양상 인 ......................................................................... 31

3.5. 자 과 통 리 산 생산 증진 ........................................................... 35

iv

3.5.1. 리 실산 회 상 효소 자 과 ........................... 35

3.5.2. 신산 살 아 트산 경 자 과 ......... 38

Chapter 4. 결 고찰 ......................................................................................... 41

References ............................................................................................................... 45

Abstract ................................................................................................................... 48

v

List of Figures

Figure 1. Structure of glycolic acid ................................................................................... 3

Figure 2. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid

biosynthesis from glucose in Saccharomyces cerevisiae .............................. 6

Figure 3. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid

biosynthesis from glucose in engineered S. cerevisiae ................................ 26

Figure 4. The effect of E. coli glyoxylate reductase gene ycdW and

0.1 M phosphate buffered media .................................................................... 27

Figure 5. The effect of deleting malate synthase in glycolic acid

production.......................................................................................................... 30

Figure 6. The effect of fermentation medium ................................................................ 34

Figure 7. The effects of overexpression enzymes involved in

glyoxylate biosynthesis .................................................................................... 37

Figure 8. The effects of overexpression enzymes involved in

succinate recycling pathway ............................................................................ 40

vi

List of Tables

Table 1. Overview of studies for glycolic acid production ............................................ 10

Table 2. Strains used in this study .................................................................................. 17

Table 3. Plasmids used in this study .............................................................................. 20

Table 4. Primers used in this study ................................................................................ 21

1

Chapter 1.

1.1. 개요

1.1.1. 리 산

리 산 (glycolic acid) pKa 3.83 알 - 이드 시산 (α-

hydroxy acid, AHA) 일종인 약 산이다. 리 산 탄소 2개를 지니

는 가장 작 단 AHA (Figure 1) 부 과 이 우 여 각질

거, , 미, 주근깨 등 색소 침착 거 등 목

장품 재료 미용 산업에 리 이용 다 [1]. 리 산 생분해

고분자 합 단량체 사용 다. 리 산 합 통해 합

폴리 리 산 (poly glycolic acid, PGA) 료 소재 분야에 용

합사 용도 상용 어 있 며, 산소 차단 이 높 특 지 식

료 포장재 용도 망 다 [2]. 리 산과 산 공 합체인

폴리 락트산- - 리 산 (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)는 료 소재

분야에 약 달에 용 다 [3]. 이러 생분해 고분자들

고갈, 경 염과 같 통 인 계 고분자 산업 단 보

있어 많 심 고 있다.

2011 여, 계 미 9천 3 만불, 40 킬

톤 규모 리 산 시장이 어 있 며 2018 에는 시장 규모가 2

억 3 만불에 달 것 망 다 [4]. 통 인 리 산 생산 포

2

름알데히드를 고 과 고압 에 매 통해 카르보닐 는

합 법 통해 이루어지나 [5], 이 법 원료인 포름알데히드

독 이 높다는 단 지닌다. 리 산 생산에 있어 상 합

법 외 미생 래 니트릴라아 를 통 리 산니트릴 가 분해

[6], 는 에틸 리 산 [7] 등 법들이 시 나 이들 역시 원

료 부산 독 이 강 고 래 합 다는 에

독 질 잔 가능 , 자원 고갈, 경 염 에 자 롭지

못 다. 이에, 보다 풍부 이 매스 래 탄소원 여 미

생 효를 통해 리 산 생산 고자 는 연구들이 계

게 이루어지고 있다.

3

Figure 1. Structure of glycolic acid

Glycolic acid is the organic compound with the formula HOCH2COOH.

4

1.1.2. Saccharomyces cerevisiae를 이용 리 산 생산

효모에 리 산 생산 리 실산 회 를 통 여 이루어

질 있다. 리 실산 회 는 일부 리아, 균 , 식 종에 존재

는 사 회 , 주 능 에탄 이나 아 트산과 같 C2 합

사 여 신산과 같 C4 합 합 는 것이다 [8]. 본 인

이 매스 단당 인 포도당 질 에 S. cerevisiae에 는

알 효 경 가 크게 어 높 효 고농도 에탄 생

산 다. 리 실산 회 는 포도당에 해 억 고 있 며 포도당이 소

모 후 어 생산 에탄 사 다 [8].

리 실산 회 는 다 과 같 들 구 다 (Figure 2).

C2 합 부 생 아 틸-CoA가 시트르산 합 효소 (citrate

synthase) 작용 통해 살 아 트산과 결합 여 시트르산 다.

효모 내에는 3종 시트르산 합 효소가 존재 는데, 이 Cit1과

Cit3는 미토 드리아 내 TCA 회 에 작용 며, 리 실산 회 에

는 퍼 시좀 내에 존재 는 Cit2가 작용 는 것 알 있다. 생산

시트르산 아 니타아 (aconitase) Aco1에 해 이소시트르산

다. 이소시트르산이 이소시트르산 분해 효소 (isocitrate lyase) Icl1

에 해 신산과 리 실산 분해 고 리 실산 1 분자 아

틸-CoA 함께 말산 합 효소 (malate synthase) Mls1에 여 말산

다. 말산 말산 탈 소효소 (malate dehydrogenase) Mdh2에

해 다시 살 아 트산 변 어 회 가 다 [8]. 이러

5

리 실산 회 에 간 산 생 는 리 실산 리 실산

원효소 (glyoxylate reductase) 통해 원시 리 산 생산

는 것이 가능 다.

S. cerevisiae에 이 인 리 실산 효소는 GOR1

자에 해 암 어 있 며, 식 리 실산 원 효소 마찬

가지 효모에 리 실산 해독 작용 담당 는 것 추 다

[18]. 그러나 효모 리 실산 원효소는 리 실산에 이

낮 며 [9], 존 연구에 GOR1 과 경우에도 효모에

리 산 생산 찰 지 않았 이 있다 [4].

그러나 S. cerevisiae 효모는 진핵 생 모델 생체 연구

어 생 종 생 지식과 보가 잘 알 있

며, 공 연구를 법이 다양 게 개 어 있어 인

면에 자 조작이 용이 에 사 공 용 여 리

산 생산량 향상시킨 생산용 균주를 개 있는 여지

가 충분 다 [10]. , 효모는 인 역사상 랫동안 용 질 생산

에 이용 어 종 그 안 이 증명 어 있어 재도 산업 분야

에 게 이용 고 있고, 특히 산업 인 효 경에 잘 자라

고 낮 pH에 항 이 높아 리 산과 같 산 생산에 있

어 여타 원핵 미생 에 해 잠재 우 를 다는 장

지닌다 [11].

6

Figure 2. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid

biosynthesis from glucose in Saccharomyces cerevisiae

Ethanol produced by ethanol fermentation of glucose is converted to acetyl-CoA,

and acetyla-CoA is utilized in glyoxylate cycle. Glycolic acid is produced through

reduction of glyoxylate, an intermidiate of glyoxylate cycle.

Pyruvate Glucose G3P Acetaldehyde

Acetate Acetyl-CoA

Ethanol

Acetaldehyde

Glycolysis Ethanol

Fermentation

Glyoxylate

Oxaloacetate

Malate

Citrate

Acetyl-

Isocitrat

Mdh2

Mls1/Dal7

Glycolic acid

NADPH + H+

NADP+

NADH + H+

NAD+

Succinate

Glyoxylate Cycle

Cit2

Aco1

Icl1

Glyoxylate Reduction

NADH + H+

NAD+

PDC ADH

ADH

ALD ACS

Gor1

NADH + H+

NAD+

NADH + H+ NAD

+ ADP ATP

7

1.1.3. 리 산 생산 연구 동향

사 공 인 법 이용 여 자 재조합 미생 균주

부 리 산 생산 고자 연구들이 계 각지에 이루어지고

있다. 재 장균 통 리 산 생산에 연구가 여러 차 보

고 어 있 며, 이외에 Corynebacterium glutamicum, 효모 등 다양

미생 리 산 생산 균주 개 시도들이 이루어 있다

(Table 1).

미국 사추 공과 Prather 그룹에 는 장균 부

3-hydroxy-γ-butyrolactone (3-HBL)과 3,4-dihydroxybutyricacid (3,4-

DHBA) 생산 목 , 3-HBL과 3,4-DHBA 합 시작

질이 는 리 산 포도당 부 합 있는 장균 균주

를 개 다. 이 연구에 는 리 실산 원효소 YcdW 이소시트

르산 분해효소 AceA, 이소시트르산 분해효소 인산 효소 (Isocitrate

dehydrogenase kinase/phosphatase) AceK 과 통해 10 g/L 포

도당 질 여 1.4 g/L 리 산 생산 다 [12].

국 장난 Deng 그룹에 는 리 산 생산용 장균 균

주 개 해 말산 합 효소 AceB를 거 고, 장균 다

른 말산 합 효소인 GlcB를 거 고 YcdW AceA-AceK 체

다. 이에 진 법 사용 여 장 속도를 향상시킨 균주를

별 결과, 종 개 균주에 회분식 양 식

8.96 g/L, 가식 양 식 는 56.44 g/L 리 산 생산

8

여 2016 생산량 다 [13].

미국 사추 공과 Stephanopoulos 그룹에 는 장균

통해 5탄당 부 용 2탄소 합 인 에틸 리 과 리

산 생산 는 연구를 다. 이 연구에 는 자일룰 스 인

산 효소 (Xylulose kinase) XylB, 리 산 산 효소 (Glycolate oxidase)

리 실산 카르보연결효소 (glyoxylate carboligase) Gcl, GlcD, AceB,

GlcB를 거 균주에 장균에는 존재 지 않는 효소인

Pseudomonas cichorii D-타가토 스3-에 효소 (D-tagatose 3-

epimerase) Dte를 도입 고 YcdW, AceA, AceK, L-푸쿨 스 인산

알돌 효소 (L-fuculose phosphate aldolase) FucA, L-푸쿨 스 인산

효소 (L-fuculokinase) FucK, 락트알데히드 탈 소효소 (lactaldehyde

dehydrogenase) AldA 과 함 5탄당인 D-자일 스 부

높 효 2탄소 합 인 리 산 생산 있는 새 운 경

를 계 다. 결과 상 새 운 경 부 D-자일

스 63.5 g/L 부 리 산 40 g/L가 생산 었다 [14].

장균 이외 미생 이용 경우 독일 펠트

Wendisch 그룹에 자 재조합 C. glutamicum 부 리 산

생산 연구가 있다. 이 연구에 는 장균 래 YcdW를 도입 고,

AceB 거 시작 돈 체를 통 여 이소시트르산 탈 소효소

감소시키는 조작 가 C. glutamicum 작 며, 포도당

과 아 트산 각 12 g/L, 17.6 g/L 합 여 질 사용 여 5.3

9

g/L 리 산 생산 다 [15].

진핵 미생 부 리 산 생산 2013 에 처 보고 었

다. 란드 VTT 연구소 Koivistoinen 그룹에 는 S. cerevisiae

Kluyveromyces lactis 효모를 이용 여 리 산 생산 는 연구를

다. 이 연구에 는 자일 스를 사 있도 개 S.

cerevisiae 균주에 추가 말산 합 효소 Mls1과 Dal7, 이소시트

르산 탈 소효소 (isocitrate dehydrogenase) Idp2, 단 질 인산 효소

Glc1 조 인자 Reg1 거 고, 애 장 래 리 실산

원효소인 Glyr1 도입 고 이소시트르산 분해효소 Icl1 과

여 리 산 생산용 S. cerevisiae 균주를 개 다. 이D-자일 스

에탄 각각 20 g/L씩 합 지에 라스크 양 통해

개 효모 부 0.91 g/L 리 산이 생산 었다. 이 연구에

는 Mls1과 Idp2를 거 고 애 장 Glyr1 도입 리

산 생산용 K. lactis 균주를 개 며, 결과 개 K. lactis

부 회분식 양 2 g/L, 가식 양 15 g/L

리 산 생산 다 [4].

10

Table 1. Overview of studies for glycolic acid production

Strain Substrate Description Type of

cultivation Titer (g/L)

Yield (g/g)

Productivity (g/L/h)

References

Escherichia coli

MG0-GP Glucose Overexpression of ycdW and aceA-aceK Batch 1.4 0.14 0.02 [12]

EYX-2 Glucose Deletion of aceB and glcB, overexpression of ycdW and aceA-aceK, adaptively

evolved

Batch 9.0 0.48 0.36 [13]

Fed-batch 56.4 0.52 0.47

GA-10 D-xylose Deletion of xylB, gcl glcD, aceB and glcB, overexpression of ycdW, aceA-aceK, fucA,

fucK, aldA and Pc.dte

Batch 40 0.63 0.48 [14]

Corynebacterium glutamicum

ΔaceB icdGTG Glucose+Acetate Deletion of aceB, Reducing icd activity by replacing the translational start codon,

overexpression of ycdW

Batch 5.3 0.18 0.1 [15]

Kluyveromyces lactis

H3986 Xylose+Ethanol Deletion of MLS1 and IDP2, overexpression of Arabidopsis thaliana GLYR1

Batch 2 0.05 0.02 [4]

Fed-batch 15 0.28 0.09

Saccharomyces cerevisiae

H3994 Xylose+Ethanol Deletion of MLS1, DAL7 IDP2 and REG1, overexpression of ICL1 and xylose

assimilating enzymes XYL1, XYL2, XYS1 and Arabidopsis thaliana GLYR1

Batch 0.9 0.02 0.01 [4]

11

1.2. 실험 목

원 가격 불안 과 경 염에 처, 원료 존

도 축소 요 이 높아짐에 라 미생 이용 생 합 법

에 심이 높아지고 있는 실 이다. 이러 경에 라

질 리 산 합 법 체 여 미생 부 생

리 산 생산 고자 는 연구들이 계 각지에 이루어지고

있다.

리 산 장품, 료 재료, 식 료 포장재 같이 인체 직

맞닿는 용도에 사용 에, 존 법 생산

리 산과 달리 생 인 법 생산 는 리 산 독 지닌

부산 이 합 가능 이 낮다는 에 시장에 우 를 있는

여지가 많다. , PGA 같이 다용도 용 있는 잠재 지닌

생분해 고분자 단량체 원료 사용 써 존 고분

자를 체 여 경에 부담 크게 감시킬 있다는 이 이 존

재 다. 포름알데히드 같 래 원료를 사용 는 여 지구

상에 풍부 탄소원인 이 매스를 에 지속 가능

생산 인 견지에 리 다는 장 지닌다.

이러 이 에 힘입어 본 연구에 는 S. cerevisiae 효모 부

이 매스 리 산 생산 는 것 목 는 이다. 효모는 산

업 용함이 증명 어 있 며 산 효에 있어 리 다는 장

지니나 자연 리 산 생산 지 않는다. 라 본 연구에

12

는 사 공 인 근법 통해 사 경 차단, 외부 자 삽입,

자 과 등 다양 자 재조합 용 여 고농도, 고

효 리 산 생산 가능 효모 균주를 개 고자 다.

13

Chapter 2. 재료 법

2.1. 사용 균주 지 조건

본 연구는 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C (MATa ura3-

52 trp1-289 leu2-3, 112 his3 1 MAL2-8C SUC2)를 모균주 여 실험

진행 며, 실험에 사용 효모는 20 g/L glucose 20 g/L ethanol

첨가 synthetic complete (SC) 지 (6.7 g/L yeast nitrogen base

without amino acids, 18 mg/L adenine, 8 mg/L para-aminobenzoic acid,

380 mg/L leucine, 76 mg/L 이외 amino acids) yeast extract peptone

(YP) 지 (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone) 에 양 었다.

질 효모를 별 해 는 해당 아미노산 별 인

SC 지를 사용 다. 인산 충 지를 사용 실험 경우 상

SC 지에 각 0.05 M (2.7 g/L Na2HPO4, 4.3 g/L NaH2PO4·H2O), 0.1 M

(5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4·H2O) 0.15 M (8.1 g/L Na2HPO4, 12.9

g/L NaH2PO4·H2O) 인산나트륨 첨가 다. 모든 실험 6 mL 는

10 mL 는 30 mL SC 지 는 10 mL YP 지에 1차 종

여 양 후, 20 mL 는 500 mL SC 는 충 SC 지 10 mL

YP 지에 2차 종 여 시행 다.

본 연구에 시행 자 조작 Escherichia coli DH5α [F–

φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rK–mK+)

phoAsupE44λ–thi-1 glnV44 thi-1 gyrA96 relA1] 사용 여 행 었 며,

14

Amphicillin 50 µg/ml 를 첨가 Luria-Bertani (LB) 지 (10 g/L tryptone, 5

g/L yeast extract, 10 g/L NaCl) 에 E. coli를 양 다.

15

2.2. 결손 균주 작

S. cerevisiae CEN.PK2-1C 균주를 모균주 여, loxP/cre

recombination 법 이용 여 MLS1 자 결손 균주 MLS1 결손

ycdW 자 삽입 균주를 작 다.

HIS5를 marker 지니는 pUG27 라스미드를 주 여,

mls1_deletion_F mls1_deletion_R 라이 를 사용 PCR 통해

mls1::loxP-HIS5-loxP 결손 cassette를 증폭 다. 이를 모균주

CEN.PK2-1C에 질 여 MLS1 자 결손 균주를 작 고

Cre recombinase 도입 통해 HIS5 marker를 거 다. MLS1 결손

ycdW 자 삽입 균주를 작함에 있어, p415TEF-ycdW 부 PCR

통해 PTEF-ycdW-TCYC1를 증폭 후, 이를 NpUG27MCS 라스미드에 삽

입 여 NpUG27MCS-ycdW 라스미드를 작 다. 이에

MLS1_deletion_F MLS1_deletion_R 라이 를 사용 PCR 통해

mls1Δ::PTEF-ycdW-TCYC1-LoxP-HIS5-LoxP 결손 cassette를 증폭 다. 이

를 모균주 CEN.PK2-1C에 질 여 MLS1 자 결손 ycdW

자 삽입 균주를 작 고 Cre recombinase 도입 통해 HIS5

marker를 거 다. 본 연구에 사용 균주를 Table 2에 나타내었다.

결손 균주 작에 있어 모든 질 리튬 아 트산법

(Lithium acetate method) 이용 여 행 었 며, 질 체를 별

해 는 해당 아미노산 별 인 SC 지를 사용 다.

결손 균주 작 과 에 사용 라스미드 라이 는 각 Table 3과

16

Table 4에 나타내었다.

17

Table 2. Strains used in this study

Strain Genotype Reference

Escherichia coli

DH5α F–φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rK–mK+) phoAsupE44λ–thi-1 glnV44 thi-1 gyrA96 relA1

Saccharomyces cerevisiae

CEN.PK2-1C MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3, 112 his3 1 MAL2-8C SUC2

mls1Δ CEN.PK2-1C mls1Δ::loxp This study

mls1Δ::ycdw CEN.PK2-1C mls1Δ::PTEF-ycdW-TCYC1 This study

18

2.3. 라스미드 작

ycdW 자는 E. coli DH5α 체 DNA를 주 PCR

행 며, ACO1ΔMTS, CIT2ΔPTS, ICL1, SFC1, FUM1ΔMTS,

MDH1ΔMTS 자는 S. cerevisiae CEN.PK2-1C 체 DNA를 주

PCR 행 여 얻었다.

증폭 ycdW 자 단편 BamH1과 Xho1 효소 처리

여 pRS415TEF 벡 에 클 닝 여 p415TEF-ycdW를 작 다. ycdW

체에 삽입 벡 NpUG27M-ycdW를 작 는 데에 있

어, p415TEF-ycdW를 효소 처리 여 얻어진 PTEF-ycdW-TCYC1

pUG27에 추가 인 cloning site 라이 결합 부 를 삽입

NpUG27M 라스미드에 클 닝 다. ACO1ΔMTS 자 단편

BamH1과 Xho1 효소 처리해 여러 자를 나 벡

시킬 있도 구축 p413-alsD 벡 [16]에 alsD 자를 체 여

클 닝 여 p413-ACO1ΔMTS 라스미드를 작 다. CIT2ΔPTS

자 단편 BamH1과 Xho1 효소 처리해 pRS414PGK1 벡 에 클

닝 여 p414PGK1-CIT2ΔPTS 라스미드를 작 며, ICL1

자 단편 Spe1과 Xho1 효소 처리해 pRS416GPD 벡 에 클

닝 여 p416GPD-ICL1 라스미드를 작 다. SFC1 자 단편

BamH1과 Xho1 효소 처리해 여러 자를 나 벡

시킬 있도 구축 p414-alsD 벡 에 alsD 자를 체 여 클

닝 여 p414-SFC1 라스미드를 작 다. FUM1ΔMTS 자 단

19

편 Spe1과 Xho1 효소 처리해 pRS415GPD 벡 에 클 닝 여

p415GPD-FUM1ΔMTS 라스미드를 작 다. MDH1ΔMTS 자 단

편 BamH1과 Xho1 효소 처리해 pRS414PGK1 벡 에 클 닝

여 p414PGK1-MDH1ΔMTS 라스미드를 작 후, 이 부 얻어진

PPGK1-MDH1ΔMTS-TCYC1 자 단편 Sac1과 Mlu1 효소 처리해

pRS416GPD 벡 에 클 닝 여 p416PGK1-MDH1ΔMTS 라스미드를

작 다.

라스미드를 효모에 질 는 모든 실험 리튬 아 트산

법 (Lithium acetate method) 이용 여 행 었 며, 질 체를

별 해 는 해당 아미노산이 결 별 인 SC 지를 사용

다. 본 연구에 사용 라스미드 라이 는 각 Table 3 Table 4

에 나타내었다.

20

Table 3. Plasmids used in this study

Plasmid Description

pUG27 Plasmid containing loxP-his5+-loxP deletion cassette

pUG27MCS Plasmid containing loxP-his5+-loxP deletion cassette contaning additional restriction enzyme sites

NpUG27MCS Plasmid containing loxP-his5+-loxP deletion cassette contaning additional restriction enzyme sites and mls1_deletion_F, mls1_deletion_R primer annealing sites

p414GPD-Cre CEN/ARS, TRP1, PTDH3-cre-TCYC1

pRS415TEF CEN/ARS, LEU2, PTEF1, TCYC1

p413-alsD CEN/ARS, HIS3, PTDH3-alsD-TGPM1

p414-alsD CEN/ARS, TRP1, PTDH3-alsD-TGPM1

pRS413GPD CEN/ARS, HIS3, PTDH3, TCYC1

pRS414PGK1 CEN/ARS, TRP1, PPGK1, TPGK1

pRS415GPD CEN/ARS, LEU2, PTDH3, TCYC1

pRS416GPD CEN/ARS, URA3, PTDH3, TCYC1

NpUG27MCS-ycdW NpUG27MCS plasmid carrying PTEF1-ycdW-TCYC1

p415T-ycdW CEN/ARS, LEU2, PTEF1-ycdW-TCYC1

p413-ACO1ΔMTS CEN/ARS, HIS3, PTDH3-ACO1ΔMTS-TGPM1

p414P-CIT2ΔPTS CEN/ARS, TRP1, PPGK1-CIT2ΔPTS-TPGK1

p416G-ICL1 CEN/ARS, URA3, PTDH3-ICL1-TCYC1

p413G-ICL1 CEN/ARS, HIS3, PTDH3-ICL1-TCYC1

p414-SFC1 CEN/ARS, TRP1, PTDH3-SFC1-TGPM1

p415G-FUM1ΔMTS CEN/ARS, LEU2, PTDH3-FUM1ΔMTS-TCYC1

p414P-MDH1ΔMTS CEN/ARS, TRP1, PPGK1-MDH1ΔMTS-TPGK1

p416P-MDH1ΔMTS CEN/ARS, URA3, PPGK1-MDH1ΔMTS-TPGK1

21

Table 4. Primers used in this study

Target DNA Primer Sequence (5’-3’) Restriction enzymes

Primers for deletion strain construction

MLS1 mls1_deletion_F AACTAAACAAAGTAGTAAAAGCACATAAAAGAATTAAGAAACAGCTGAAGCTTCGTACGC

mls1_deletion_R TGAATATATTTTTATATATGTGTACACTGGGGCAAGGGAGAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

Primers for plasmid construction

CIT2ΔPTS CIT2-cloning_F GGCGGGATCCATGACAGTTCCTTATCTAAATTCA

BamH1

CIT2R-cloning_R GCG CTCGAGCTATTCAATGTTTTTGACCAATTCC

Xho1

ACO1ΔMTS ACO1R-cloning_F GGCGGGATCCATGGTCTCCAACTTGACTAGAGA

BamH1

ACO1-cloning_R GGCGCTCGAGTTATTTCTTCTCATCGGCCT Xho1

ICL1 ICL1-cloning_F GCGACTAGTATGCCTATCCCCGTTGGA Spe1

ICL1-cloning_R GCGCTCGAGCTATTTCTTTACGCCATTTTCTT

Xho1

SFC1 SFC1-cloning_F GCGGGATCCATGTCTCAAAAAAAGAAGGCTTC

BamH1

SFC1-cloning_R GCGCTCGAGCTACTTTAATGGCTTTGGCTTTG

Xho1

FUM1ΔMTS FUM1R-cloning_F GCGACTAGTATGAACTCCTCGTTCAGAAC Spe1

FUM1-cloning_R GCGCTCGAGTTATTTAGGACCTAGCATGTGTTC

Xho1

MDH1ΔMTS MDH1R-cloning_F GCGGGATCCATGTATAAAGTGACTGTTTTGGGTG

BamH1

MDH1-cloning_R GCGCTCGAGCTATTTACTAGCAACAAAGTTGAC

Xho1

ycdW ycdW-cloning_F GCGGGATCCATGGATATCATCTTTTATCACCCA

BamH1

ycdW-cloning_R GCGCTCGAGTTAGTAGCCGCGTGCGCG Xho1

22

2.4. 양 조건과 시료 채취 검출 법

본 연구에 는 SC 지 는 YP 지에 효모를 1차 종

후에 이를 분 도계 (Cary 50 Conc. Varian)를 이용 여 600 nm 장

에 optical density (OD600) 1 재 종 여 도 30℃, 170 rpm 회

분식 양 다.

상 조건에 효모를 양 며 각 시간마다 830 µl 양액

채취 며, 이 30 µl 양액 포 장 계 OD600

에 사용 었고 800 µl 양액 사 질 검출에 사용 다.

사 질 검출 여 양액에 원심 분리 를 사용해 포를 가라앉

분리 상등액 0.22 µm 주사 를 통해 여과 다. 여과 상

등액 포도당, 아 트산, 리 산, 에탄 농도는 고 능 액체 크 마

토그래 UltiMate 3000 HPLC system (Thermo Scientific, Dionex) 통해

분 다. HPLC 컬럼 Aminex HPX-87H column (300 nm X 7.8 mm, 5

µm, Bio-Rad) 60℃ 지 었고 5 mM H2SO4를 이동상 여 0.6

mL/min 속도 주었다. HPLC 분 에 사용 RI 검출 는 35℃

도 지 었다.

23

Chapter 3. 결과 토

3.1. 장균 래 리 실산 원 효소 도입

본 연구에 는 사 경 차단, 외부 자 삽입, 생산 경

자 과 사 공 법 이용 여 리 산 생산용 효모 균주를

개 며, 본 연구에 리 산 생산에 사 경 를 도식

시 다 (Figure 3).

S. cerevisiae 효모는 자체 리 실산 원 효소 Gor1를 지니

나 그 능이 크게 떨어 자연 리 산 생산 지 않 이 존

연구 부 알 있다. 라 본 연구에 는, 보다 높 효

지니는 외부 종 래 리 실산 원 효소를 도입 고자 고 장

균 래 리 실산 원 효소 YcdW를 용 고자 다. YcdW

Km 0.6 mM, kcat 70.6 s-1이며 [17], YcdW를 사용 여 공

리 산 생산 있 이 E. coli C. glutamicum에 보고 어 있다

[12,13,15]. 이에 본 실험에 는 장균 부 얻 ycdW 자를

라스미드 벡 를 통해 효모에 시 리 산 생산에 이용 고자

다.

야생 효모 균주를 WT, p415T-ycdW 라스미드를 통해 ycdW

자를 도 효모 균주를 WT+ p415T-ycdW 며,

이를 포도당 2% (w/v) 를 함 SC 지에 양 면 생산 사

산 양 다 (Figure 3, ○ and △).

24

WT과 WT+p415T-ycdW 균주 모 12시간 양 동안

20 g/L 포도당 부 에탄 8.5 g/L 가량 생산 다. WT 부 는

리 산 생산이 찰 지 않 면, WT+p415T-ycdW 에 는

리 산 생산이 찰 었 나 생산량이 0.04 g/L에 그쳐 미량에

불과 다. 이는 리 산 생산이 에탄 이 리 실산 회 를 통해

사 는 과 에 이루어지나, ycdW를 효모 경우 에탄

소모 효 이 매우 떨어지 인 것 단 었다. 포도당 효를

통해 생산 에탄 (8.5 g/L) WT 경우 96시간에 모 소모 나,

WT+p415T-ycdW 는 3 g/L만 소모 다. WT 경우 포도당 모

소진 12시간 이후에도 에탄 사 면 포가 장 여 OD600

값이 24에 도달 나 WT+p415T-ycdW 균주 경우 OD600

값이 15 가량에 그쳤다 (Figure 4B).

라 본 실험 통해 장균 래 리 실산 원 효소

YcdW를 이용 여 효모에 리 산 생산이 가능 다는 것 인

나, 리 산 생산 효 증진시키 해 는 ycdW 효모

인 에탄 소모 능 개 요가 있었다.

25

3.2. 리 산 생산 지 충

YcdW 효모가 포도당 효를 통해 생산 에탄 원

게 소모 여 효 리 산 생산 있도 고자 다.

앞 단락에 사용 것과 동일 WT과 WT+p415T-ycdW 를 포도당 2 %

(w/v) 인산 0.1 M 첨가 충 SC 지에 96시간 동안 양 면

생산 사 산 양 다. (Figure 4, ● and ▲).

인산 0.1 M 첨가 충 지 pH는 양 동안 6 후

지 었 며, 면 일 지 pH는 양 진행함에 라 4.4에 2.5

지 감소 다. WT에 는 충 SC 지에 양 종

OD600 29 일 SC 지에 보다 높 포 장 보이나, 일 지

에 마찬가지 리 산 생산 지 않았다. WT+p415T-ycdW

에 는 일 SC 지에 조 에탄 소모를 보인 면 충 SC 지

에 생산 에탄 96시간 이내에 모 소모 고 diauxic shift 이후

포 장 원 게 이루어 야생 과 사 양상 보 다.

이에 라 충 SC 지에 WT+p415T-ycdW 는 0.24 g/L 리

산 생산 며, 이는 일 SC 지에 0.04 g/L 리 산 생

산 데에 해 약 6 가량 증가 값이다.

결과 본 실험 통 여 인산 충 0.1 M 첨가 SC

지 사용이 YcdW 균주에 에탄 소모 효 증진과 그에

른 리 산 생산량 향상에 큰 향 끼침 인 다.

26

Figure 3. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid

biosynthesis from glucose in engineered S. cerevisiae

Ethanol produced by ethanol fermentation of glucose is converted to acetyl-CoA,

and acetyl-CoA is utilized in glyoxylate cycle. Glycolic acid is produced through

reduction of glyoxylate, an intermediate of glyoxylate cycle

ycdW

Glucose

Acetate

Ethanol Acetaldehyde

Glyoxylate

Oxaloacetate Malate

Citrate

Acetyl-CoA

Isocitrate

Mdh1

Mls1

Glycolic acid

Succinate

Cit2

Aco1 Icl1

ALD

NADH + H+

NAD+

ADP

ATP

Succinate

Fumarate

Glyoxylate Cycle

TCA Cycle

Fum1

Sfc1

Malate

Oxaloacetate

Pyruvate Acetaldehyde PDC ADH ADH

ACS NADH + H

+

NAD+

Acetyl-CoA

NADH

+ H+

NAD+

Mdh1 Fum1

SDH

NADH +

H+

NAD+

NADH + H+

NAD+

NAD+ NADH + H

+

Mitochondria

27

Figure 4. The effect of E. coli glyoxylate reductase gene ycdW and

0.1 M phosphate buffered media

WT and WT+p415T-ycdW were incubated in the SC-Leu medium with 2% glucose

and the SC-Leu medium with 2% glucose and 0.1 M phosphates. A) Ethanol, B)

cell growth, C) pH, D) glycolic acid were measured. Error bars indicate standard

deviations of two independent experiments.

0

2

4

6

8

10

0 20 40 60 80 100

Eth

anol (g

/L)

Time (h)

1

10

100

0 20 40 60 80 100

OD

600

Time (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 20 40 60 80 100

pH

Time (h)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0 20 40 60 80 100

Gly

colic

acid

(g/L

)

Time (h)

A B

C D

WT+p415T-ycdW (0.1 M phosphate)

WT

WT+p415T-ycdW

WT (0.1 M phosphate)

28

3.3. 말산 합 효소 결손 효모 균주 작

효모에 리 실산 회 를 통 리 산 생산 구체

인 리 실산 가용 과 직 연 다. 리 실산 회 내에

리 실산이 Mls1에 해 말산 는 이 리 실산

리 산 원 에 경쟁 작용 므 , 이를

거 고자 MLS1 자가 결손 균주를 작 다. loxP/cre 재조합

법 통해 효모 염색체 DNA 상 MLS1 ORF를 거 균주 (mls1Δ)를

작 고, 같 법 MLS1 ORF를 ycdW 여 말산 합 효

소를 결손시킴과 동시에 TEF 모 ycdW를 도 작 균

주 (mls1Δ::ycdW)도 함께 작 다.

야생 효모 균주 WT, MLS1 결손 효모 균주 mls1Δ, 그리고

MLS1이 ycdW 효모 균주 mls1Δ::ycdW 균주 , 각각에

ycdW 자를 라스미드 벡 를 통해 도 균주들 포도당

2% (w/v) 인산 0.1 M 포함 는 충 SC 지에 96시간 동안 양

다. MLS1이 결손 균주들 경우 야생 과 마찬가지 포도당

부 생산 에탄 부 상 소모 에도 불구 고

diauxic shift 이후 포 장이 나타나지 않았다 (Figure 5A). 이는 본래

C2 탄소원 사 작용 담당 는 리 실산 회 능이 일부 결

여 에 라 에탄 이용 포 장에 이상이 생 것 사료

다. 리 산 생산량에 있어, 야생 효모가 리 산 생산

지 못 는 데에 해 mls1Δ 균주는 0.1 g/L 리 산 생산 있

29

었다. 야생 과 mls1Δ 균주에 ycdW를 시킨 경우 각각 0.26 g/L,

1.03 g/L 리 산 생산량 보여 MLS1 자 거에 약 4

가량 리 산 생산량 증가 효과가 나타났다. ycdW 자가 염색체

에 삽입 어 도 작 균주 mls1Δ::ycdW는 mls1Δ에 라스

미드 벡 ycdW를 시킨 경우 사 1 g/L 리 산 생산

며, mls1Δ::ycdW에 라스미드 벡 를 통해 ycdW를 추가

는 경우 리 산 생산량 1.02 g/L 미 도 생산량

증가 효과는 찰 지 않았다 (Figure 5B).

종합 자면 효모에 MLS1 결손과 ycdW 도입 통해 포도

당 2% (w/v) 인산 0.1M 포함 는 충 SC 지에 1 g/L 리

산 생산 있 인 며, 라 이후 이루어진 리 산

생산 연구에 는 mls1Δ::ycdW를 모균주 여 추가 인 실험 진행

도 다.

30

Figure 5. The effect of deleting malate synthase in glycolic acid

production

WT, mls1Δ, mls1Δ::ycdW were transformed with pRS415GPD or p415T-ycdW. All

the cells were incubated in the SC-Leu medium with 2% glucose, 0.1 M

phosphates. A) Cell growth and B) glycolic acid at 48 h fermentation are indicated.

Error bars indicate standard deviations of three independent experiments.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

EV ycdW EV ycdW EV ycdW

WT mls1Δ mls1Δ::ycdW

Gly

colic

acid

(g/L

)

EV EV EV

WT

A

1

10

100

0 20 40 60 80 100

OD

60

0

Time (h)

B

WT

mls1Δ

WT + p415T-ycdW

mls1Δ + p415T-ycdW

mls1Δ::ycdW

mls1Δ::ycdW + p415T-ycdW

31

3.4. 양 지에 른 효 양상 인

효모를 이용 리 산 생산에 있어 지 pH 조 여

첨가 인산이 큰 향 끼쳤 인 데에 이어, 본 실험에 는

양 지 조 이 리 산 생산에 끼 는 향 탐구해 보고자 다.

이에 앞 작 리 산 생산용 균주 mls1Δ::ycdW를 , 포도

당 2% (w/v) 를 포함 는 YP 지 포도당 2% (w/v), 인산 0.1 M 포

함 는 SC 지에 양 여 지 조 에 른 효 양상 차이를

다 (Figurer 6A, B). 추가 , 에탄 탄소원 직 공

경우 리 산 생산 양상 인 고자 는 실험 함께 행 다.

이를 여, 앞 작 리 산 생산용 효모 균주 mls1Δ::ycdW를

에탄 2% (w/v) 를 포함 는 YP 지 에탄 2% (w/v), 인산 0.1 M

포함 는 SC 지에 양 여 지 조 에 른 효 양상 차이를

다 (Figurer 6C, D).

포도당 탄소원 는 경우 YP 지 SC 지 양쪽 모

에 12시간 내 모든 포도당 소모 며, YP 지에 는 diauxic

shift 이후 에탄 소모 며 포 장이 계속 어 OD600가 28에 도달

나, SC 지에 는 에탄 소모 며 포 장이 이루어지지 않아

OD600 15 가량에 그쳤다. 리 산 YP 지에 1.4 g/L, SC

지에 1 g/L가 생산 었다.

에탄 탄소원 는 경우, 말산 합 효소 결손 균주가 에

탄 탄소원 여 SC 지에 거 장 지 못 다는 것 고

32

여, 포도당 포함 는 지에 포를 높 농도 양 후 에

탄 포함 는 지에 OD600 5 높 포 농도 종 여 양

다. SC 지에 는 96시간 동안 에탄 20 g/L 13 g/L를 소모 여

1.7 g/L 리 산 생산 다. YP 지에 는 72시간 만에 20 g/L

에탄 부 소모 며, OD600 18 지 포가 장 고 4.7 g/L

리 산 생산 다.

결과 YP 지에 mls1Δ::ycdW 효모가 높 리 산

생산량 나타냄 인 다. 지만 이후 진행 자 과 실험

에 , 라스미드 벡 질 포를 별 여 아미노산

결손 지를 사용해야 요가 있었 므 YP 지 사용 불가

다. 이에 본 연구에 는 포도당 포함 는 충 SC 지에

과 리 산 생산량 증가에 효 자를 규명 고, 그

이후 효 자를 효모 염색체 DNA에 삽입 는 조작 통해 결손

지가 요 없는 균주를 작 여 YP 지에 리 산 생산 극

를 꾀 있 염 에 도 다.

본 실험에 mls1Δ::ycdW 효모 균주는 YP 지에 공 탄

소원에 라 에탄 20 g/L 부 4.7 g/L, 포도당 20 g/L 부 1.4 g/L

리 산 생산 다. 그러나 포도당 가격 $ 0.5/kg, 에탄 가

격 $ 1.5/kg 이상 원료 가격 경쟁 에 차이가 존재 며, 에

탄 탄소원 에 포도당 부 포를 높 농도 양

는 과 이 행 었 고 , 에탄 부 생산이 포도

33

당 부 생산에 해 효 면에 우 에 있다고 단 없었

므 본 연구는 포도당 부 리 산 생산에 연구를 속행

도 다.

34

Figure 6. The effect of fermentation medium

mls1Δ::ycdW was incubated in the A) YP medium with 2% glucose, B) SC medium

with 2% glucose and 0.1 M phosphates, C) YP medium with 2% ethanol, B) SC

medium with 2% ethanol and 0.1 M phosphates.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100 Gly

colic

acid

(g/L

), A

ceta

te (

g/L

)

OD

600,

Glu

cose (

g/L

), E

thanol (g

/L)

Time(h)

YPD

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 Gly

colic

acid

(g/L

), A

ceta

te (

g/L

)

OD

600,

Eth

anol (g

/L)

Time(h)

YPE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 Gly

colic

acid

(g/L

), A

ceta

te (

g/L

)

OD

600,

Glu

cose (

g/L

), E

thanol (g

/L)

Time(h)

SCD

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 Gly

colic

acid

(g/L

), A

ceta

te (

g/L

)

OD

600,

Eth

anol (g

/L)

Time(h)

SCE

A B

C D

OD600 Glycolic acid Glucose Ethanol Acetate

35

3.5. 자 과 통 리 산 생산 증진

3.5.1. 리 실산 회 상 효소 자 과

리 실산 회 상에 아 틸-CoA 부 리 실산 합 경

에 작용 는 효소 Cit2, Aco1, Icl1 강 함 써 리 실

산 합 이 진 여 종 생산 인 리 산 생산 증진시키고자

는 실험 진행 다. 이 , 포 소 내에 존재 는 효소 타겟

신 조 통해 효소 이 포질에 작용 도 여, 포 소

내외 질 이동 요 임 써 이 효 일어

나도 다. 이를 해 Cit2를 퍼 시좀 타겟 신 인 C- 미

린-라이신- 신 아미노산 거 태 (Cit2ΔPTS) 시 다. Aco1

미토 드리아 퍼 시좀 포 소 에 존재 나 부분이 미

토 드리아에 있는 것 알 있어 N 미 미토 드리아 타겟

신 를 거 태 시키며, 이를 Aco1ΔMTS 다.

앞 단락에 작 리 산 생산 균주 mls1Δ::ycdW를 탕

여 CIT2ΔPTS, ACO1ΔMTS, ICL1 나씩 과 거나,

자를 함께 과 후 생산 리 산 양 다. 모든

균주는 포도당 2% (w/v) 인산 0.1 M 포함 는 충 SC 지에

양 었다 자 과 에 포 장 변 는 뚜 히 나타난

없 며 (Figure 7A), 리 산 경우 mls1Δ::ycdW에 ICL1 과

경우 종 생산량 0.95 g/L에 1.14 g/L 약 19% 증가 다. 면

36

CIT2ΔPTS ACO1ΔMTS 과 경우 리 산 생산량 각각

0.98 g/L 1.05 g/L 탕 균주에 생산량과 여 뚜 증가

를 보이지 않았 며. CIT2ΔPTS, ACO1ΔMTS, ICL1 자를 부

과 생산량 1.15 g/L ICL1만 과 경우 거

차이가 없었다 (Figure 7B, C).

라 , 리 실산 회 에 여 는 자들 CIT2ΔPTS

ACO1ΔMTS 과 리 실산 생산에 향이 없 며, 리 실산

합 에 직 여 는 이소시트르산 분해 효소 자 ICL1

과 만이 리 산 생산량 증가에 여 다는 것 인 다.

37

Figure 7. The effects of overexpression enzymes involved in

glyoxylate biosynthesis

All the cells were incubated in the SC-His, Trp, Leu, Ura medium with 2% glucose,

0.1 M phosphates for 72 h. A) Cell growth and B, C) glycolic acid production for 72

hours fermentation are indicated. Error bars indicate standard deviations of three

independent experiments.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 20 40 60 80

Gly

colic

acid

(g/L

)

Time (h)

1

10

100

0 20 40 60 80

OD

600

Time (h)

A B

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Gly

colic

acid

(g/L

)

mls1Δ::ycdW

mls1Δ::ycdW ACO1ΔMTS

mls1Δ::ycdW CIT2ΔPTS

mls1Δ::ycdW ICL1

mls1Δ::ycdW CIT2ΔPTS ACO1ΔMTS ICL1

C

38

3.5.2. 신산 살 아 트산 경 자 과

이소시트르산 분해 에 리 실산과 함께 생산 는 신

산 살 아 트산 여 리 실산 회 에 용 있도

는 경 를 도 여, 리 실산 회 질 공 원 히

고 리 산 생산 효 높이고자 다.

이를 여 , 포질 신산 미토 드리아 내부 운

고 미토 드리아 내 푸마르산 포질 내보내는 능 가진

신산-푸마르산 운 단 질 (succinate-fumarate carrier) Sfc1 과

다. 이 함께 푸마라아 (fumarase) Fum1를 N 미 미토 드리

아 타겟 신 를 거 태 (Fum1ΔMTS) 시 미토 트리아

포질 내에 작용 도 여 Sfc1 통해 포질 운 푸마르

산이 말산 도 다. 마지막 , 효모에 존재 는 말산

탈 소효소 가장 말산에 도가 높 며 살 아 트산 생

에 이 높 미토 드리아 말산 탈 소효소 Mdh1 마찬가

지 미토 드리아 타겟 신 를 거 태 (Mdh1ΔMTS) 시

포질에 말산 부 살 아 트산 생 도 다 (Figure

3).

앞 단락에 효과를 인 있는 ICL1 과 에 리

산 생산량 증가에 여, SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS ICL1과

합동 과 통해 추가 인 생산량 증가 여부를 인 고자 는 실

험 행 다. 리 산 생산 균주 mls1Δ::ycdW를 탕 여,

39

ICL1 과 함께 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 과 후 생산

리 산 양 다 (Figure 8). 모든 균주는 포도당 2% (w/v)

인산 0.1 M 포함 는 충 SC 지에 양 었다. 96시간 양

결과 ICL1과 함께 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 과 경우

생산량 각각 0.99 g/L, 1.28 g/L, 1.06 g/L ICL1 단독 과

경우 리 산 생산량인 1.29 g/L 사 거나 히 리 산

생산량이 감소 는 결과가 나타났다. 단, SFC1, FUM1ΔMTS,

MDH1ΔMTS 모 를 ICL1과 함께 과 경우 리 산 생산

량 1.52 g/L 탕 균주에 해 63%, ICL1만 과 경우에 해

18% 증가 생산량 보여 상 경 에 리 산 생산

량 추가 인 증가를 인 가 있었다.

40

Figure 8. The effects of overexpression enzymes involved in

succinate recycling pathway

All the cells were incubated in the SC-His, Trp, Leu, Ura medium with 2% glucose,

0.1 M phosphates for 96 h. Error bars indicate standard deviations of three

independent experiments.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100

Gly

colic

acid

(g/L

)

Time (h)

A

B

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Gly

colic

acid

(g/L

)mls1Δ::ycdW mls1Δ::ycdW ICL1 mls1Δ::ycdW ICL1 SFC1 mls1Δ::ycdW ICL1 FUM1ΔMTS mls1Δ::ycdW ICL1 MDH1ΔMTS mls1Δ::ycdW ICL1 SFC1

FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS

mls1Δ::ycdW mls1Δ::ycdW ICL1 mls1Δ::ycdW ICL1 SFC1 mls1Δ::ycdW ICL1 FUM1ΔMTS mls1Δ::ycdW ICL1 MDH1ΔMTS mls1Δ::ycdW ICL1 SFC1

FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS

41

Chapter 4. 결 고찰

리 산 각질 거 등 목 장품 원료

리 사용 는 질일 뿐 아니라, 생분해 고분자 합 단량체

용도가 주목 아 높 잠재 가 를 지니는 질이다. 경 염과

연료 고갈 에 안 요 이 높아짐에 라, 통 인

원료 합 법 신 재생 가능 이 매스 자원

부 미생 이용 여 리 산 생 합 고자 는 연구

들에 심이 높아지고 있다. 특히, 인체 직 맞닿는 용도에 사

용 는 특 상 생 합 리 산 시장에 여지

가 크다.

효모는 통 인 생산 균주 히 사용 는 생 종 , 산

업 인 효 경에 잘 자라며 특히 낮 pH에 항 이 높아

리 산과 같 산 생산 균주 이 지닌다. 지만 리 산

생합 매개 는 효소 낮 인해 효모는 자연 인 상

태에 리 산 생산 지 않는다. 라 본 연구에 는 외부 자

도입과 존 생산 경 자 과 , 자 결손 등 조작 통해

리 산 고농도, 고효 생산 가능 효모 균주를 작 고자

다.

, 리 실산 리 산 원 증진시키

여, 이 낮 효모 자체 리 실산 효소 Gor1를 체

있도 보다 높 지니는 장균 래 리 실산 원효소인

42

YcdW를 도입 다. 이에 해 효모에 리 산 공 생산

가능 며, 0.1 M 인산 첨가 충 지에 양 0.24

g/L 리 산 생산 다.

, 리 실산이 리 실산 회 내에 말산 는

이 리 산 생합 경쟁 작용 므 , 말산 합

매개 는 효모 말산 합 효소 Mls1 거 균주를 작

다. MLS1 자가 결손 고 ycdW 자가 삽입 효모 균주

mls1::ycdW에 1 g/L 리 산 생산 며, 야생 에 ycdW

자를 시킨 경우 여 볼 MLS1 결손 통 여 리 산

생산량이 약 4 증가 다.

추가 인 리 산 생산량 증가를 여 리 실산 회 내에

리 실산 생산경 에 여 는 효소 자들 , 이소시트르산

분해 에 여 는 ICL1 과 는 것이 리 산 생산량 증진에

효과가 있 인 며, 이소시트르산 분해 에 해 리

실산과 함께 부산 생 는 신산 살 아 트산

여 리 실산 회 에 재 용 있도 도 는 경 에 포함

는 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS ICL1과 함께 과 는 것

리 산 추가 인 생산량 증가에 여함 인 다.

결과 본 연구에 는 자연 리 산 생산 지 못

는 야생 효모 사 공 조작 통 여 리 산 생산용 효모

균주를 개 다. 종 작 효모 균주 mls1Δ::ycdW ICL1

43

SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS 96시간 동안 20 g/L 포도당 부

1.52 g/L 리 산 생산 며 이 0.08 g/g 포도당,

생산 0.016 g/(L·h)이었다. 본 연구에 양 지에 른 리 산

생산량 해 본 , 상 과 자들 효모 염색체 자

에 삽입 는 조작 통해 YP 지에 양 경 를 이루었

욱이 효모에 리 산 생산량과 생산 효 증가시킬 있

것 사료 다.

본 연구에 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 과 효과를

인함에 있어 자 각각 과 시에는 효과가 없

나 부를 함께 과 시 ICL1과 합동 과 에 상승 효

과를 보 에 라, 리 실산 회 에 여 는 CIT2ΔPTS,

ACO1ΔMTS, ICL1를 부 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS과 함께 합동

여 과 시 추가 상승 효과가 존재 는지 여부를 시험해 볼

여지가 있다고 여겨진다.

이외, 추가 인 리 산 생산 증 를 여 아 틸-CoA

합 효소 (acetyl-CoA synthase, ACS) 아 트알데히드를 ATP 소

모 없이 아 틸-CoA 는 장균 래 EutE 과 통

해 리 실산 회 아 틸-CoA 공 효 높이는 것 시도해

볼 있다. , 리 실산 회 에 살 아 트산 공 증가시

키 여 루 산 이산 탄소 결합 여 살 아 트산

는 루 산 카르복시 효소 (pyruvate carboxylase)를 암 는

44

자 PYC1, PYC2 를 과 는 것 역시 추가 인 생산량 증가 효과

를 보 여 시도해 볼 있다.

이 본 연구는 효모를 이용 생 리 산 산업

생산에 여 있 것 보이며, 뿐만 아니라 리 산 이외 리

실산 회 에 는 다양 용 산 생산 연구에도 용이 가능

것 상 다.

45

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48

Abstract

Metabolic engineering of

Saccharomyces cerevisiae for

glycolic acid production

Jisoo Kwon

School of Chemical and Biological Engineering

The Graduate School

Seoul National University

Glycolic acid is an industrially valuable organic acid used for skin

care products in cosmetic industry and used as a monomer in the

preparation of biodegradable polymers such as polyglycolic acid. In this

study, we metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae yeast for

efficient biomass-based glycolic acid production.

Glycolic acid can be produced in S. cerevisiae by reduction of

glyoxylate, an intermediate of the glyoxylate cycle. In this study, the

expression of glyoxylate reductase YcdW from E. coli enabled glycolic acid

production in S. cerevisiae. We constructed the engineered yeast strain

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mls1Δ::ycdW by deleting malate synthase gene MLS1 and integrating

ycdW. mls1Δ::ycdW produced 1 g/L of glycolic acid from 20 g/L of glucose

in SC media buffered with phosphate. Additional overexpression of

isocitrate lyase gene ICL1 in glyoxylate cycle and SFC1, FUM1ΔMTS,

MDH1ΔMTS genes in succinate recycling pathway led to further

improvement of glycolic acid production. As a result, mls1Δ::ycdW ICL1

SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS produced 1.52 g/L of glycolic acid from 20

g/L of glucose.

Keywords : Saccharomyces cerevisiae, Metabolic engineering,

Glycolic acid, Glyoxylate cycle

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Student Number : 2013-23158