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Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als

Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems

Einfluss der VEGF-C-Applikationsparameter auf die Regeneration und den

Wiederanschluss der Transplantate

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades

einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Lia Schindewolffs

Rendsburg

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves

Physiologisches Institut


Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst

Institut für Immunmorphologie

Medizinische Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves

Physiologisches Institut


Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst

Institut für Immunmorphologie

Medizinische Hochschule Hannover

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Christiane Pfarrer

Anatomisches Institut


Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2012

Meiner Familie und Christoph

Die Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form von Postern auf folgenden

Fachtagungen präsentiert:

17th

IVBM 2012 – International Vascular Biology Meeting, Wiesbaden:

VEGF-C application pattern improves the regeneration of autotransplanted lymph node fragments

and the reconnection with the lymphatic system

Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst

38th

ESL 2012 - European Congress of Lymphology in Berlin:

VEGF-C-application and the regeneration and reconnection of autotransplanted lymph node

fragments in rats: the effects of time point, location and dosage

Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ......................................................................................................................... 1

2. LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................................ 5

2.1. Aufgaben des Lymphsystems ................................................... ............................................. 5

2.1.1. Immunabwehr .................................................. ................................................... ........ 5

2.1.2. Transport im Fettstoffwechsel .................................................. ................................. 6

2.2. Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems ................................. 6

2.3. Anatomischer Aufbau des Lymphknotens .................................................. ......................... 9

2.4. Entstehung des Lymphsystems .................................................. .......................................... 11

2.4.1. VEGF-C und VEGF-R3 .................................................. ...............................................11

2.5. Pathologie .................................................. ................................................... .......................... 12

2.5.1. Das primäre Lymphödem .................................................. ........................................12

2.5.2. Das sekundäre Lymphödem .................................................. ....................................13

2.5.2.1. Filariose .................................................. ................................................... .....13

2.5.2.2. Lymphangitis .................................................. ................................................14

2.5.2.3. Brustkrebstherapie .................................................. ......................................14

2.5.2.4. Folgen eines sekundären Lymphödems .................................................. .....15

2.5.2.5. Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems ............................16

2.5.2.6. Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems .............................16

2.6. Ziel dieser Arbeit .................................................. ................................................... ...............19

3. MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 20

3.1. Allgemeines .................................................. ................................................... ....................20

3.2. Vorversuch .................................................. ................................................... .........................20

3.3. Tiere .................................................. ................................................... .................................... 20

Inhaltsverzeichnis

3.4. Gruppengröße .................................................. ................................................... . ..................21

3.5. Haltung .................................................. ................................................... ............................... 21

3.6. Präoperative Versorgung .................................................. ................................................... .21

3.7. Chirurgie .................................................. ................................................... ............................. 22

3.7.1. chirurgische Modifikationen .................................................. ...................................22

3.7.2. Operationsabschluss .................................................. ................................................23

3.8. Postoperative Versorgung .................................................. .................................................. 23

3.9. Die Gruppen .................................................. ................................................... .......................24

3.10. Transplantat-Entnahme .................................................. ................................................... ...26

3.11. Makroskopische Untersuchung und Auswertung .................................................. ............26

3.12. Technische Aufbereitung der Proben .................................................. ................................ 27

3.13. Mikroskopische Untersuchung und Färbung .................................................. ....................27

3.13.1. Lichtmikroskopische Untersuchung .................................................. .......................27

2.13.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung .................................................. ...........28

3.14. Statistik .................................................. ................................................... .............................. 31

3.14.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ................32

3.14.2. Lokalisation .................................................. ................................................... ............33

3.14.3. Dosis .................................................. ................................................... .......................34

4. ERGEBNISSE ....................................................................................................................... 35

4.1. Vorversuch .................................................. ................................................... .........................35

4.2. Chirurgische Modifikation .................................................. ................................................... 35

4.3. Makroskopisch .................................................. ................................................... ..................37

4.3.1. Statistik .................................................. ................................................... ..................40

4.3.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..40

4.3.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................41

4.3.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........42

Inhaltsverzeichnis

4.4. Mikroskopisch .................................................. ................................................... . ..................43

4.4.1. Statistik .................................................. ................................................... ..................49

4.4.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..49

4.4.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................50

4.4.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........51

5. DISKUSSION ....................................................................................................................... 52

5.1. Die Modifikation der Methode .................................................. ...........................................53

5.2. Die Parameter: Zeitpunkt, Lokalisation, Dosis .................................................. ..................54

5.2.1. Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem .....................55

5.2.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..55

5.2.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................56

5.2.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........57

5.2.2. Die Regeneration der Transplantate ................................................... ......................58

5.2.2.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..58

5.2.2.2. Lokalisation .................................................. .................................................58

5.2.2.3. Dosis .................................................. ................................................... .........59

5.2.3. Résumé: Einfluss der Parameter auf die Transplantate ..........................................59

5.3. Aussichten und Diskussion von Material und Methoden .................................................. 60

5.4. Schlussfolgerung .................................................. ................................................... ...............65

6. ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 66

7. SUMMARY ......................................................................................................................... 69

Inhaltsverzeichnis

8. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................... 72

9. ANHANG ............................................................................................................................ 80

9.1. Verzeichnis verwendeter Abkürzungen .................................................. .............................80

9.2. Verzeichnis verwendeter Abbildungen .................................................. .............................82

9.3. Verzeichnis verwendeter Tabellen .................................................. .....................................85

9.4. Details zur Statistik .................................................. ................................................... ...........87

9.4.1. Ergebnisse zum Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphgefäßsystem ... 87

9.4.2. Ergebnisse zur Regeneration der Transplantate .................................................. ....94

10. DANKSAGUNGEN ............................................................................................................ 101

Einleitung

1

1. Einleitung

Das Lymphsystem übernimmt im Körper verschiedene essentielle Aufgaben. Diese bestehen

nicht nur in der Steuerung der Immunabwehr und der Produktion lebenswichtiger

Antikörper (TAMMELA et al. 2010), sondern ebenso aus seiner Beteiligung am

Fettmetabolismus (OHTANI u. OHTANI 2008 A) und der Erhaltung der Homöostase von

Körperflüssigkeiten (TAMMELA et al. 2010).

Wird dieses System gestört, kommt es zu einer pathologischen Akkumulation proteinreicher

Flüssigkeiten im Gewebe, dem Lymphödem. Dieses kann primären oder sekundären

Ursprungs sein.

Primäre Lymphödeme sind angeboren und entstehen z.B. durch genetische Defekte wie bei

der Milroy Disease (BUTLER et al. 2007) oder durch Mutationen von Transkriptionsfaktoren

wie bei dem Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom (IRRTHUM et al. 2003). Sie

sind seltener als das sekundäre Lymphödem, das durch äußere Einflüsse und somit erst nach

der Geburt erworben wird.

Weltweit ist die häufigste Ursache für ein sekundäres Lymphödem eine Infektion mit

Fadenwürmern, die Filariose (PFARR et al. 2009). Das Lymphödem manifestiert sich bei

dieser Erkrankung hauptsächlich an den unteren Extremitäten.

In den Industrienationen ist dagegen eine andere Ursache für das sekundäre Lymphödem

vorherrschend: die Krebstherapie (ALITALO et al. 2005). Insbesondere die Therapie von

Brustkrebs kann eine Lymphödementstehung auslösen. Doch auch die Therapie anderer

Krebsarten, wie Zervikal- und Vulvakarzinome, Hautkrebs oder Peniskarzinome können ein

sekundäres Lymphödem verursachen.

Bei der Brustkrebstherapie stehen heutzutage wesentlich differenziertere Methoden als

noch vor einigen Jahren zur Verfügung. Während früher eine komplette Ausräumung der

Achsellymphknoten, die Axilladissektion, oder gar die Abnahme der Brust, die Mastektomie,

als die Therapien der Wahl bei Brustkrebs galten, wird heute zu weniger radikal-invasiven

Mitteln gegriffen, sofern dies das Krankheitsstadium erlaubt. Nach dem Fund von

tumorösem Drüsengewebe wird in der Regel eine Entfernung des Tumors und des

Wächterlymphknotens (engl.: Sentinel Lymph Node, SLN) vorgenommen. Sollten sich in

Einleitung

2

diesem Lymphknoten keine Metastasen befinden, folgt keine weitere chirurgische

Intervention. Zusätzliche Maßnahmen werden erst erforderlich, sollte die histologische

Untersuchung des SLN Metastasen aufweisen. Nach einem solchen Fund werden

anschließend alle axillären Lymphknoten der betroffenen Körperseite entfernt. Allerdings

besteht unabhängig von der Methode, aufgrund der Störung des Lymphgefäßsystems, für

die Patientinnen die Gefahr ein ipsilaterales Lymphödem auszubilden.

Ein Lymphödem birgt für die Patientinnen eine Vielzahl von Risiken und einen

mannigfaltigen Leidensdruck. Diese Probleme können psychischer Natur sein wie Angst vor

der Rückkehr des Krebses, ein negatives Körpergefühl und Frustration (MORGAN et al 2005).

Sie können sich aber auch physisch auswirken. Durch Umbauprozesse des Gewebes bei

einem chronischen Lymphödem (MORGAN et al. 2005) kann es zu einer Verschlechterung

der Hautqualität kommen, wodurch langanhaltende und schlecht heilende Wundinfektionen

auftreten können.

Die derzeitige Lymphödemtherapie ist rein symptomorientiert und besteht aus einer

Kombination von manueller Entstauungstherapie -der Lymphdrainage- und körperlicher

Aktivität wie beispielsweise Schwimmeinheiten, sowie dem Tragen von Bandagen.

Diese Behandlungen können den Patientinnen zwar für kurze Zeit Linderung verschaffen,

bieten aber keine Möglichkeit einer dauerhaften Minderung oder gar Ausheilung des

Ödems.

Nachhaltig wirkungsvolle chirurgische Therapieansätze gibt es momentan keine (MEHRARA

et al. 2011).

In den letzten Jahren haben sich einige Arbeitsgruppen damit beschäftigt, autologe

Lymphknotenfragmente avaskulär, also ohne direkte chirurgische Verbindung der

verbleibenden Blut- und Lymphgefäße an das Lymphknotenfragment, subkutan zu

transplantieren. Dies wurde bereits beim Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u.

ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), der Maus (TAMMELA et

al. 2007) und der Ratte (BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al. 2012 B)

erfolgreich durchgeführt.

Um den Wiederanschluss der Transplantate zu fördern, wurde dabei z.B. das Platelet Rich

Plasma (PRP) nach der Transplantation injiziert. PRP besteht neben Blutplättchen auch aus

einer Reihe von Wachstumsfaktoren, die sich auf die Gefäßneubildung (Angiogenese)

auswirken. Einer dieser Faktoren ist der Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C).

Einleitung

3

TAMMELA et al. (2007) haben im Zusammenhang mit der avaskulären Transplantation

autologer Lymphknotenfragmente einen positiven Effekt des VEGF-C auf das

Lymphgefäßwachstum feststellen können.

Kürzlich haben auch SOMMER et al. (2012 B) ihre Ergebnisse der autologen, avaskulären

Transplantation von Lymphknotenfragmenten in Kombination mit der Injektion von VEGF-C

veröffentlicht. Die Versuche wurden hierbei an weiblichen Lewis Ratten durchgeführt, denen

avaskulär autologe Lymphknotenfragmente in die rechte Leiste transplantiert wurden.

Anschließend wurde den Tieren in der ersten Woche an 3 Tagen intradermal 6,67µg VEGF-C

pro Tier in die unmittelbare Nähe der Transplantate injiziert. Die Tiere bekamen eine

Ruhephase von 4 Wochen bevor die Transplantate entnommen und histologisch sowie

immunhistochemisch untersucht wurden.

Mit dieser Methode wurde ein positiver Einfluss von VEGF-C auf sowohl die

Lymphangiogenese als auch auf die Regeneration der Lymphknotenfragmente gezeigt

(SOMMER et al. 2012 B).

In diesen Experimenten wurde allerdings nicht untersucht, welche Auswirkungen eine

Veränderung der VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ auf

die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate hat.

Primäres Ziel dieser Arbeit war es daher, die Grundlagen und Methoden der Arbeit von

SOMMER et al. (2012 B) aufzugreifen und die VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“,

„Lokalisation“ und „Dosis“ auf ihre Einflüsse auf d ie Regeneration und den Wiederanschluss

der Transplantate zu untersuchen.

In Form eines Vorversuches wurde dabei ebenfalls untersucht, ob die Länge der Ruhephase,

die bei SOMMER et al. (2012 B) mit 4 Wochen angegeben ist, Einfluss auf die Regeneration

der Lymphknotenfragmente hat. Eine 8 wöchige Ruhephase wurde erprobt.

In diesem Zusammenhang wurden Probleme durch die von SOMMER et al. (2008 B)

verwendete Technik der Lymphknoten-Fixierung entdeckt, die sich bei der Entnahme der

Lymphknotenfragmente äußerten. Eine Entfernung der Transplantate war in den meisten

Fällen mit Substanzverlusten dieser verbunden, da es in der Ruhephase zu Verwachsungen

der transplantierten Lymphknotenfragmente mit dem Knoten des nicht resorbierbaren

Nahtmaterials kam.

Zunächst bestand das Ziel dieser Arbeit somit darin, die Methodik der avaskulären

Transplantation autologer Lymphknotenfragmente dahingehend zu modifizieren, dass ihre

substanzverlustfreie Entnahme durchgeführt werden kann.

Einleitung

4

Insgesamt sollte so eine möglichst effektive und zuverlässige avaskuläre Transplantation und

Entfernung autologer Lymphknotenfragmente ermöglicht und damit die Regenerations- und

Wiederanschlussraten der Transplantate verbessert werden.

Insbesondere in Hinblick auf eine Prävention des sekundären Lymphödems, wie es z.B. nach

einer Brustkrebstherapie entsteht, könnte eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation

dienen.

Literaturübersicht

5

2. Literaturübersicht

2.1. Aufgaben des Lymphsystems

Das Lymphsystem ist an vielen lebenswichtigen Funktionen des Körpers beteiligt.

So spielt es unter anderem im Immunsystem eine zentrale Rolle. Nach dem Eindringen von

Antigenen in den Körper starten zwei Immunmechanismen. Zum einen die unspezifische,

zum anderen die spezifische Immunabwehr. Insbesondere die spezifische Immunabwehr ist

eng mit dem Lymphsystem verbunden; transportiert dieses doch die Immunzellen und stellt

mit seinen Lymphknoten einen essentiellen Part für die Entstehung spezifischer

Abwehrzellen sowie den Austausch dieser untereinander dar.

2.1.1. Immunabwehr

Die Vorgänge der Immunabwehr werden in zahlreichen Übersichten in der Literatur

beschrieben, so u.a. auch von STEINIGER (2008):

Im unspezifischen Teil spielen vor allem die Monozyten, Makrophagen und Granulozyten

eine zentrale Rolle, die durch die Abgabe bakterizider Substanzen und der Phagozytose eine

erste Barriere für eindringende Antigene darstellen. Dieses System startet zwar schnell, stellt

jedoch eine nicht so effiziente Abwehr bei Wiederkontakt wie das spezifische Immunsystem

dar. Zudem gelingt es einigen Erregern sich dieser ersten Abwehr zu entziehen, so dass

spezifischere Mechanismen notwendig werden.

Die Produktion und Sekretion von Immunglobulinen durch Plasmazellen bilden den

humoralen Teil der spezifischen Immunabwehr, während die Aktivierung von T-Lymphozyten

die wesentliche Komponente des zellulären Teils darstellt.

Die B- und T-Lymphozyten tragen Antigenrezeptoren, die immer nur kleine und spezielle

Abschnitte eines Antigens, das sogenannte Epitop, erkennen. Sobald ein B-Lymphozyt

Kontakt mit einem solchen Epitop hatte, ist er aktiviert und wandelt sich zu einer

Plasmazelle um. Diese wiederum produziert Immunglobuline. Neben dem Blutsystem dient

insbesondere das Lymphsystem dazu diese im Körper zu verteilen.

Die Aufgabe von T-Lymphozyten in der zellulären Abwehr besteht darin, nach

Antigenkontakt z.B. Virus-infizierte Zellen zum Absterben zu bringen.

Literaturübersicht

6

Eine Sonderstellung in diesem System aus unspezifischer und spezifischer Abwehr nehmen

die dendritischen Zellen (DC) ein. Sie lassen sich zu keiner der beiden Einheiten eindeutig

zuordnen.

Dendritische Zellen sind sehr effektive antigenpräsentierende Zellen, die als einzige in der

Lage sind CD4-positive T-Lymphozyten zu stimulieren und ihnen Antigene zu präsentieren.

Sie werden mit der Lymphe in die regionären Lymphknoten transportiert und verbleiben

dann im Paracortex, einer T-Lymphozyten-reichen Region im Lymphknoten. Hier wandeln sie

sich vermutlich zu interdigitierenden DCs (IDC) um.

Ähnlich benannte, aber dennoch grundverschiedene Zellen sind die ortsständigen und nicht

wandernden follikulär dendritischen Zellen (FDC). Sie sind in den Follikeln von Tonsillen,

Lymphknoten und anderen sekundären lymphatischen Organen beherbergt. FDCs sind

essentiell für wandernde B-Lymphozyten, die in den Keimzentren der Follikel ausreifen und

nur durch den Kontakt mit den FDCs überleben.

Somit stellen die sekundär lymphatischen Organe und das Lymphsystem wichtige Pfeiler für

die Abwehr dar.

2.1.2. Transport im Fettstoffwechsel

Auch im Fettstoffwechsel ist das Lymphsystem als Transportmedium beteiligt. So werden

Lipide und die fettlöslichen Vitamine E, D, K und A nach ihrer Resorption aus dem Darmtrakt

über das Lymphsystem transportiert (OHTANI u. OHTANI 2008 A). Sind die Lipide in die

Lymphe aufgenommen, stellt sich diese milchig dar.

2.2. Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems

Nicht nur Fettbestandteile und Immunzellen werden über die Lymphe transportiert, sondern

insbesondere beträchtliche Mengen an Gewebsflüssigkeit.

Bei einem erwachsenen Menschen werden pro Minute durchschnittlich 4-6 Liter Blut durch

das Kapillarsystem gepumpt. Dabei wird das Blut über das arterielle System zu den feinen

Kapillaren transportiert und ein Teil der darin enthaltenen Flüssigkeit gelangt in das

Interstitium (v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN 2008). Der andere Teil wird von den feinen

Literaturübersicht

7

Venulen des Blutsystems aufgenommen und überschüssige Flüssigkeit wird über die Niere

ausgeschieden. Damit schließt sich über das venöse System der Blutkreislauf.

Der im Interstitium verbliebene Teil wird vom Lymphsystem aufgenommen. Einzelheiten

zum Aufbau des Lymphsystems und der Verteilung der Immunzellen wurden von

v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN (2008) beschrieben und hier im Folgenden

zusammengefasst.

Die in der Regel parallel zu den Venen laufenden Lymphgefäße finden ihren Ursprung in

einem blind beginnenden kleinen Lymphkapillarnetz, dem Rete lymphocapillare.

Das Endothel in diesem Bereich ist, im Gegensatz zu den kontinuierlichen Zellverbindungen

der Blutgefäße, diskontinuierlich. Diese Verbindungen des Lymphendothels werden als

button like junctions bezeichnet (BALUK et al. 2007). Die Lymphendothelzellen überlappen

einander und bilden mäanderförmige Intrazellularspalte. Diese Spalte, im Zusammenhang

mit einer fehlenden Basallamina und einem ausgeklügelten Filamentbündel-System,

ermöglichen die Aufnahme von Gewebsflüssigkeit und deren Bestandteilen, ohne dass bei

erhöhtem interstitiellen Flüssigkeitsdruck die Lymphkapillaren kollabieren.

Der Einstrom von Flüssigkeit in die Kapillaren ist ein durch den Druck bestimmter

Mechanismus. Steigt der Gewebsdruck, wird die Flüssigkeit durch die Spalten der

Lymphendothelzellen hindurchgedrückt. Die Einflussventile klappen dabei nach innen und

bieten dem Einstrom Platz. Sobald der Druck in den Lymphkapillaren den Gewebsdruck

übersteigt werden die Intrazellularspalte durch das Hochdrücken der Einflussventile wieder

verschlossen.

Die aufgenommene Flüssigkeit wird über Präkollektoren weiter transportiert. Im Gegensatz

zu den Kapillaren besitzen die Präkollektoren nun Klappen, die die Lymphe daran hindern

retrograd zu fließen. Die Präkollektoren münden in die größeren Kollektoren, welche nicht

nur die Klappen im Inneren besitzen, sondern außerdem mit einer feinen Muskelschicht aus

glatten Myozyten umhüllt sind.

Ein Abschnitt von Klappe zu Klappe innerhalb der Kollektoren wird als Lymphangiom

bezeichnet. Lymphangiome kontrahieren, induziert durch die Schrittmacherfunktion der

Muskelzellen (Myozyten) (OHTANI u. OHTANI 2008 A).

Während der Transport von Lymphe grundsätzlich durch Körperposition, Atembewegung

und nicht gefäßassoziierter Muskelaktivität gestaltet wird (FOLDI u. FOLDI 2006), bieten die

Myozyten der Kollektoren in Kombination mit den Klappen, die den Lymphrückfluss

verhindern, eine eigene, zusätzliche Komponente zum gerichteten Lymphtransport, der

Lymphpropulsion.

Die Kollektoren unterteilen sich in afferente und efferente Kollektoren. Die afferenten sind

die pränodalen Lymphgefäße, die die Lymphe zu den Lymphknoten hin leiten. Die efferenten

Literaturübersicht

8

leiten die Lymphe von den Lymphknoten weg; sie sind somit postnodal. Zwischen ihnen

liegen die Lymphknoten. Bei zwei nacheinander geschalteten Lymphknoten ist das efferente

Gefäß gleichzeitig das afferent des nachfolgenden Knotens.

Die efferenten Kollektoren leiten die Lymphe weiter in die großen Lymphstämme, die Trunci

lymphatici.

Die Lymphstämme schließen sich ihrerseits zu Lymphgängen (Ductus lymphatici), zu welchen

auch der Milchbrustgang (Ductus thoracicus) gehört, zusammen und münden in den rechten

und linken Venenwinkel.

Der linke Venenwinkel nimmt die Lymphe aus der linken Körperhälfte, den Beinen und aller

Bauchorgane und somit den größeren Teil der Lymphe auf (FOLDI u. FOLDI 2006).

Die Lymphe aus der oberen rechten Körperhälfte und den Organen der rechten Brusthöhle

(zusammen der sogenannte rechte obere Körperquadrant) fließt in den rechten Venenwinkel

und anschließend über das Blutgefäßsystem ab.

Im Ductus thoracicus kommen von den im Interstitium anfallenden Flüssigkeitsmengen nur

ca. 2-3 Liter pro Tag an, denn auf ihrem Weg über das Lymphsystem wird der Lymphe an

verschiedenen Stellen des Lymphsystems Wasser entzogen. Eine Station dafür sind die

initialen Lymphgefäße (Kapillaren und Präkollektoren). Eine andere Station ist der

Lymphknoten. Hier lässt sich feststellen, dass die Osmolarität der Lymphe vor dem Eintritt in

den Lymphknoten geringer ist als nach ihrem Austritt, was zu dem Schluss führt, dass ca.

35% des Wassers und der Elektrolyte aus der afferenten Lymphe im Lymphknoten an das

Blutplasma zurückgegeben werden (OHTANI et al. 2003). Über den genauen

Transportmechanismus und die daran beteiligten Strukturen ist noch vieles unklar (OHTANI

u. OHTANI 2008 B). Da jedoch festgestellt werden konnte, dass der Membrankanal

Aquaporin-1 (AQP-1) vielzählig an Blutgefäßen, initialen Lymphgefäßen und innerhalb des

Lymphknotens an speziellen postkapillären Venulen (HEV) exprimiert wird, geht man von

einer Beteiligung von AQP-1 am Lymph-Plasma-Strom aus (OHTANI et al. 2003).

Der Lymphknoten wird somit sowohl durch seinen Beitrag zum Immunsystem als auch durch

seine Fähigkeiten zur Wasserresorption zum Schlüsselelement des Lymphgefäßsystems.

Literaturübersicht

9

2.3. Anatomischer Aufbau des Lymphknotens

Der anatomische Aufbau des Lymphknotens gliedert sich in verschiedene Segmente. Ein

Segment stellt eine funktionelle Einheit des Lymphknotens dar, wobei ein Lymphknoten aus

nur einem oder vielen Segmenten bestehen kann (WILLARD-MACK 2006). Umhüllt wird der

Lymphknoten durch eine bindegewebige Kapsel, von der aus feine Trennwände, die

Trabekel, in das Innere des Lymphknotens und zwischen die einzelnen Segmente ziehen.

Einzelheiten zum anatomischen Aufbau und die Verteilung der Immunzellen können bei

PABST (2008) nachgelesen werden. Es folgt eine Zusammenfassung.

In den Lymphknoten hinein münden die afferenten Lymphgefäße, die die Lymphe in die

Randsinus leiten. Die lymphatischen Sinus umgeben und durchziehen die einzelnen

Segmente.

Sie werden, je nach Literatur, unterteilt in Randsinus, Intermediärsinus und Marksinus, oder

in subkapsulären, trabekullären, transversen und medullären Sinus (WILLARD-MACK 2006).

Über dieses System wird die Lymphe aus ihren Drainagegebieten in den Lymphknoten

transportiert und optimal verteilt. Einen Abfluss findet die Lymphe über efferente

Lymphgefäße, die wie Vene und Arterie über den Hilus des Lymphknotens in ihn eintreten.

Während viele afferente Lymphgefäße in den Lymphknoten münden, führt in der Regel nur

ein einziges Lymphgefäß vom Lymphknoten weg (WILLARD-MACK 2006).

Ein Segment lässt sich vom Rand zum Hilium in 3 Zonen aufteilen: Cortex, Paracortex und

Medulla.

Lymphozyten sind im Cortex zu Follikeln angesammelt, sogenannten Noduli lymphoidei. Man

kann diese Follikel wiederum in Primär- und Sekundärfollikel unterteilen. Primärfollikel

bestehen nur aus einer Lymphozytenart.

Sekundärfollikel unterteilen sich in eine Corona und ein Keimzentrum. Im Keimzentrum

findet die Differenzierung vom B-Lymphozyten statt.

Follikel sind reich an FDCs und B-Lymphozyten. Dagegen sind T-Lymphozyten hier nur in

geringer Zahl aufzufinden. Diese sind größtenteils in dem Paracortex beheimatet. Hier

können auch die IDCs aufgefunden werden.

Im Bereich der Medulla sind wenige Lymphozyten sowie Plasmazellen, die als Antikörper-

Produzenten dienen, vorhanden.

Der Paracortex beinhaltet neben den zahlreichen T-Lymphozyten noch spezialisierte

postkapilläre Venulen. Diese besitzen bei den meisten Spezies ein kubisches Endothel,

weshalb sie als hochendotheliale Venulen (HEV) bezeichnet werden. Es ist bekannt, dass

Lymphozyten über die HEVs in den Lymphknoten eintreten können (OHTANI u. OHTANI

Literaturübersicht

10

2008), dass sie über diesen Weg auch wieder aus dem Lymphknoten austreten können, ist

bisher nur für das Schwein nachgewiesen (BINNS et al. 1985).

Abbildung 1.: „Schema der Kompartimentierung des Lymphknotens“ PABST (2008):

Die Abbildung stellt die Aufteilung in Cortex, Paracortex und Medulla, den Blut- und Lymphfluss, sowie die

verschiedenen Zellen des Lymphknotens dar.

Literaturübersicht

11

2.4. Entstehung des Lymphsystems

Die Entstehung des Lymphsystems ist ein Prozess, der noch nicht vollends geklärt ist.

ALITALO u. CARMELIET (2002) haben in ihrem Review zu den molekularen Mechanismen der

Lymphangiogenese die wichtigsten Thesen und Tatsachen zusammengefasst.

Es wird beschrieben, dass 1902 Sabin die Theorie begründete, dass aus embryonalen Venen

Endothelzellen knospen und sich daraus ein primitiver Lymphsack bildet. Das periphere

Lymphsystem soll nach seiner Theorie von diesem primären Lymphsack sprießen und sich zu

Lymphkapillaren ausbilden.

Weiterhin wird in dem Review auf heutige genetische Studien verwiesen, die zeigen, dass

sich venöse Endothelzellen, angeregt durch bislang unbekannte Signale, zu lymphatischen

Endothelzellen differenzieren und so Lymphgefäße sprießen.

Außerdem beschreiben sie als eine weitere These die Entstehung des Lymphsackes aus dem

Mesenchym durch Vorläuferzellen, den Lymphangioblasten. Der initiale Lymphsack hat

zunächst keine Gefäßverbindung. Diese entwickelt sich erst im weiteren Verlauf.

ALITALO u. CARMELIET (2002) gehen von einer Kombination dieser beiden Thesen zur

Entstehung des Lymphsystems aus.

Gesichert ist, dass das primitive Blutgefäßsystem aus Vorläuferzellen, den Angioblasten,

entsteht. Der Prozess wird als Vaskulogenese bezeichnet (ALITALO u. CARMELIET 2002). Im

weiteren Verlauf verfeinern und differenzieren sich diese Strukturen zusehends und man

spricht von der Angiogenese (ALITALO u. CARMELIET 2002). Die Entstehung des

Lymphgefäßsystems, die Lymphangiogenese, schließt sich unmittelbar an (ALITALO u.

CARMELIET 2002). Die Wachstumsfaktoren aus der VEGF-Familie spielen bei der Stimulation

und Lenkung der Angiogenese und insbesondere der Lymphangiogenese eine zentrale Rolle

(ALITALO u. CARMELIET 2002).

2.4.1. VEGF-C und VEGF-R3

ALITALO u. CARMELIET (2002) beschreiben weiter, dass der Vascular Endothelial Growth

Factor Rezeptor-3 (VEGFCR-3) zunächst in Blutendothelzellen exprimiert wird und nach

Differenzierung zu Lymphendothelzellen auch an diesen zu finden ist. VEGFCR-3 ist ein

Rezeptor für den Wachstumsfaktor Vascular Endothelial Growth Factor - C (VEGF-C). Dieser

Rezeptor wurde neben Lymphatic Vessel Hyaluronan Receptor - 1 (LYVE-1) und Prospero-

Related Homeobox Transcprition Factor - 1 (Prox-1) in der Arbeit von TAMMELA u. ALITALO

von 2010 an allen sich entwickelnden Lymphgefäßen detektiert. Im ausgereiften Zustand

Literaturübersicht

12

werden diese Rezeptoren an den einzelnen Lymphgefäßabschnitten jedoch unterschiedlich

stark exprimiert (TAMMELA u. ALITALO 2010).

VEGF-C und VEGFCR-3 sind also immer dort zu finden, wo neue Lymphgefäße sprießen,

sowohl im Embryo als auch bei Regenerationen während eines Krankheitsprozesses

(ALITALO u. CARMELIET 2002). VEGF-C fungiert dabei als Stimulator für das Wachstum, die

Migration und das Überleben von Lymphendothelzellen (ALITALO u. CARMELIET 2002). Auf

die Stimulation von VEGF-C auf die Lymphangiogenese wird in weiteren Übersichten in der

Literatur verwiesen. In dem Review von LOHELA et al. (2003) wird die Bedeutung von VEGF-C

für die Lymphangiogenese deutlich. Auch NORRMEN et al. (2011) beschreiben kürzlich, dass

VEGF-C der einzige Wachstumsfaktor ist, der spezifisch auf die Entwicklung von

Lymphgefäßen gerichtet ist. Wie fatal das Fehlen von VEGF-C ist, führen ALITALO et al.

(2005) in einem weiteren Review aus. Hier wird beschrieben, dass das Fehlen von VEGF-C in

Mäuse-Embryonen zu einer kompletten Abwesenheit von Lymphgefäßen führt.

2.5. Pathologie

Wird die Integrität des Lymphsystem gestört, hat dies weitreichende Folgen für den

Organismus, insbesondere bezogen auf den Flüssigkeitshaushalt. Es bildet sich ein

Lymphödem aus. Diese pathologische Akkumulation von Gewebswasser resultiert aus einem

gestörten Gleichgewicht zwischen lymphatischen Lasten und der lymphatischen

Transportkapazität (ROCKSON 2010).

Störungen können primärer oder sekundärer Natur sein. Ihre Einteilung erfolgt daher auch in

„primäres Lymphödem“ und „sekundäres Lymphödem“.

2.5.1. Das primäre Lymphödem

Insbesondere kongenital hereditäre Erkrankungen, wie beispielsweise die Krankheit Milroy

Disease oder das Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom, führen zu einem

primären Lymphödem.

Milroy Disease ist eine autosomal dominant vererbbare Krankheit, die zu einem primären

Lymphödem insbesondere in den Beinen führt (BUTLER et al. 2007). Sie kann bereits bei der

Geburt ausgebildet sein oder nach 2 Lebensjahren in Erscheinung treten (WARREN et al.

Literaturübersicht

13

2007). Ursache für die Krankheit ist eine Mutation des Gens „flt 4“. Dieses kodiert für den

VEGF-Rezeptor-3 (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008). Defekte dieses Rezeptors führen zu

einer fehlerhaften Entwicklung oder gar einer Aplasie der peripheren Lymphkanäle

(RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).

Beim Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom steht als Auslöser eine Mutation

des Transkriptionsfaktor-Gens SOX18 in Verdacht (IRRTHUM et al. 2003). Auch bei dieser

Erkrankung ist ein Lymphödem insbesondere in den Beinen zu beobachten (IRRTHUM et al.

2003).

Primäre Lymphödeme sind sehr selten. Deutlich häufiger treten sekundäre Lymphödem auf.

Sie entstehen immer dann, wenn durch äußere Einflüsse das Lymphsystem gestört wird.

2.5.2. Das sekundäre Lymphödem

An der Spitze der Ursachen eines sekundären Lymphödems steht eine Infektion mit

Parasiten. Weltweit waren 2009 schätzungsweise 120 Millionen Menschen mit

Fadenwürmern infiziert (PFARR et al. 2009).

2.5.2.1. Filariose

Die sogenannte Filariose ist die häufigste Erkrankung nach Malaria und Tuberkulose

(RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008) und somit ein beträchtliches Problem auf der Welt. In

der Regel findet eine Infektion mit den Nematoden (Fadenwürmern) „Wuchereria

bancrofti“, „Brugia malayi“ und „Brugia timori“ statt (PFARR et al. 2009). Nach ihrer Invasion

in den Körper, gelangen diese in das Lymphgefäßsystem. Es entstehen Granulome um die

Würmer, was zu einer retrograden Lymphangitis und Lymphadenitis führt (PFARR et al.

2009). Es schließt sich eine Dilatation der Gefäße an, die in einer verminderten Effektivität

des Lymphtransportes resultiert (PFARR et al. 2009). Ein Lymphödem ist eine typische

klinische Präsentation der Infektion (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).

Literaturübersicht

14

2.5.2.2. Lymphangitis

Auch eine Lymphangitis kann zu einem sekundären Lymphödem führen. Sie wird verursacht

durch eine Entzündung von Lymphgefäßen während einer Infektion mit beispielsweise

Bakterien, Viren oder Pilzen (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).

2.5.2.3. Brustkrebstherapie

Auch wenn die Filariose die weltweit häufigste Ursache eines sekundären Lymphödems ist,

so ist sich in den Industrienationen eine ganz andere vorherrschend: die Brustkrebstherapie

(ALITALO et al. 2005).

Auch andere sekundäre Faktoren, wie Unfälle, bei denen die Lymphknoten geschädigt

werden, oder auch weitere Krebsarten wie Vulva-, Zervix- oder Peniskarzinome so wie

Hautkrebs können zu sekundären Lymphödemen führen.

Insbesondere wird im Folgenden aber auf die Brustkrebstherapie eingegangen, da

Brustkrebs die häufigste Krebserkrankung der Frau ist.

Die geschätzten jährlichen Brustkrebsneuerkrankungen lagen 2009 in den USA bei 27%

(JEMAL et al. 2009) aller bösartigen Tumoren und führten die Liste der

Krebsneuerkrankungen bei Frauen an.

Die Problematik des Brustkrebses liegt in der Metastasierung. Einzelne Zellen lösen sich vom

Tumor ab und wandern über afferente Lymphgefäße in den drainierenden Lymphknoten.

Sind regionäre Lymphknoten in der Achsel betroffen, müssen diese entfernt werden. Das

chirurgische Entfernen von Lymphknoten führt zu einem Trauma des Lymphgefäßsystems

und damit zu einem gestörten Transport von Gewebswasser. Das Resultat kann ein

sekundäres Lymphödem im ipsilateralen Arm sein. Die Inzidenz eines Armlymphödems nach

Brustkrebstherapie liegt bei bis zu 30% (WILLIAMS et al. 2005).

Die Rate für Lymphödeme nach einer kompletten Ausräumung der Achsel in Kombination

mit einer Entfernung der Brust (Mastektomie) liegt zwischen 24% und 49% (WARREN et al.

2007).

Auch bei anderen Krebsarten, wie beispielsweise Vulva- oder Zervixkarzinomen, müssen bei

Befall regionäre Lymphknoten ausgeräumt werden. Die Entfernung der inguinalen

Lymphknoten kann ebenfalls zu einem Lymphödem führen. Die Inzidenz liegt hierbei nach

einigen Studien sogar bei 40% (WILLIAMS et al. 2005).

Literaturübersicht

15

Die Behandlung von Brustkrebs hat sich im Laufe der Zeit gewandelt. Hat man früher oft

direkt nach Brustkrebserkennung eine Mastektomie vollzogen, so ist man im Laufe der Zeit

dazu übergegangen, den Tumor und die regionalen Lymphknoten auszuräumen und das

restliche Brustgewebe zu erhalten.

Heutzutage bedient man sich einer Methode, bei der nach Tumordiagnose und unter der

Entfernung des Tumorgewebes eine Sentinel Lymph Node (SLN, Wächterlymphknoten)

Biopsy durchgeführt wird.

Der Wächterlymphknoten ist der erste Lymphknoten, der das Tumorgebiet drainiert. Er wird

unter einer SLN Biopsie entnommen und auf Metastasen untersucht. Sollten histologisch

keine Metastasen auffindbar sein, wird nicht weiter interveniert (GIULIANO et al. 2011). Sind

Metastasen vorhanden, müssen regionäre Lymphknoten entfernt werden (GIULIANO et al.

2011). Man erhofft sich durch die Methode eine minimale Morbidität (GOLDBERG et al.

2011). Trotz verbesserter Inzidenz für ein Lymphödem, erkranken allerdings auch unter der

Methode der SLN Biopsie weiterhin bis zu 22% (GOLDBERG et al. 2011). Die meisten Quellen

geben eine Inzidenz von 3-7% an (GOLDBERG et al. 2011).

Bei einer lokalen Bestrahlung des Gewebes, wie es häufig zusätzlich notwendig ist, steigt die

Inzidenz noch weiter.

2.5.2.4. Folgen eines sekundären Lymphödems

Die Folgen eines sekundären Lymphödems sind für die betroffenen Frauen weitreichend. Sie

äußern sich in psychischen Beschwerden wie ein negatives Körpergefühl, das Gefühl der

Isolation, Traurigkeit, Hilflosigkeit und Ängsten (MORGAN et al. 2005), aber auch in

physischem Leiden wie Schmerzen (MORGAN et al. 2005). Die Mobilität der Gliedmaße wird

zudem eingeschränkt, so dass alltägliche Arbeiten zum Teil nicht mehr möglich werden

(MORGAN et al. 2005). Die Schwellung hat weiter zur Folge, dass die Hautqualität

verschlechtert wird (MORGAN et al. 2005) und dadurch schlecht heilende Infektionen mit

Bakterien und Pilzen möglich werden.

In besonders schlimmen, aber seltenen, Fällen kann ein chronisches Lymphödem zu einer

Ausbildung des Stewart-Treves-Syndroms (STS) führen. Das STS ist ein aggressives

Lymphangiosarkom der oberen Extremitäten (CHUNG et al. 2000). Die Überlebenszeit der

Patientinnen nach Diagnose eines STS liegt zwischen nur 8 und 15 Monaten (CHUNG et al.

2000).

Literaturübersicht

16

2.5.2.5. Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems

Die Therapie von sekundären Lymphödemen erfolgt nahezu ausschließlich

symptomorientiert. Sie basiert hauptsächlich auf einer Kompression des Ödemgebietes von

peripher nach zentral. So werden unter anderem viellagige unelastische Bandagen benutzt,

welche um die Gliedmaße gewickelt werden oder es wird eine kontrollierte

Kompressionstherapie verfolgt, in der die Größe der Kompressionsstrümpfe nach und nach

reduziert wird (WARREN et al. 2007). Auch eine entstauende manuelle Lymphdrainage wird

in Verbindung mit Hauthygiene und körperlicher Aktivität durchgeführt (WARREN et al.

2007). Diese Art der Therapie führt zu einer Volumenabnahme der betroffenen Gliedmaße

zwischen 40 und 60% (WARREN et al. 2007). Allerdings müssen diese Therapiemaßnahmen

ein Leben lang und zum Teil mehrmals pro Woche durchgeführt werden. Dies bedeutet für

die Patientinnen einen kaum zu bewältigenden Aufwand.

2.5.2.6. Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems

Eine adäquate chirurgische Therapie für das sekundäre Lymphödem fehlt bisher (MEHRARA

et al. 2011).

Aus dieser Problematik heraus wurden in der Vergangenheit viele unterschiedliche

Methoden untersucht.

In der Arbeit von MEHRARA et al. (2011) wurde kürzlich eine Übersicht verschiedener

chirurgischer Therapieansätze dargestellt. Hier wurden die Methoden in reduktive und

physiologische Methoden eingeteilt.

Zu den reduktiven Methoden zählen die direkte Exzision und die Liposuktion. Bei der

direkten Exzision wird das ödematöse Gewebe großzügig chirurgisch entfernt und eine

Verbindung des oberflächlichen Lymphsystems mit dem tiefen geschaffen. Die Ergebnisse

sind nicht dokumentiert. Eine Problematik der Wundheilung sowie Infektionen und

Schmerzen werden vermutet.

Die Liposuktion ist das Absaugen von Fettgewebe. Durch den reduzierten Umfang der

betroffenen Gliedmaße empfinden die meisten Patientinnen nach diesem Eingriff zunächst

eine Linderung der Symptome. Die Re-Akkumulation von Gewebsflüssigkeit findet jedoch

sehr schnell statt.

Zu den physiologischen Methoden zählt z.B. der lymphatische Bypass. Beim lymphatisch-

lymphatischen Bypass werden die beschädigten Lymphgefäße mit gesunden Lymphgefäßen

einer anderen Körperregion chirurgisch verbunden. Beim lymphatikovenösen Bypass wird

ein Lymphgefäß mit einer oberflächlichen Vene verbunden. Die Ergebnisse einer

Literaturübersicht

17

lymphatischen Bypass-Operation waren bisher sehr unstet und variierten zwischen keiner

Verbesserung des Lymphödems bis hin zu einer moderaten Reduktion.

Auch eine Flap interposition, also eine Eingliederung eines Gewebssegmentes mit intakter

Vaskularisation, wird beschrieben. Es wird hierbei ein Teil eines gesunden, subkutanen

Gewebes chirurgisch entfernt und in eine geschädigte Körperregion transplantiert. Diese

Prozedur wird aufgrund ihrer schlechten Ergebnisse nur noch sehr selten durchgeführt.

Als eine weitere physiologische Methode führen MEHRARA et al. (2011) die

Lymphknotentransplantation auf.

Die Basis der Lymphknotentransplantation ist das chirurgische Entfernen eines intakten

Lymphknotens aus einer gesunden Körperregion und sein anschließendes Verbringen in das

geschädigte Areal.

Aktueller Bestandteil der Forschung ist die avaskuläre Transplantation von

Lymphknotenfragmenten.

Bereits am Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u. ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER

u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), an der Maus (TAMMELA et al. 2007) und an der Ratte

(BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al. 2012 B) wurde gezeigt, dass

diese Methode möglich ist.

Neben der alleinigen Transplantation von Lymphknotenfragmenten kam bei HADAMITZKY et

al. (2008) die Gabe von Platelet Rich Plasma (PRP) zur Anwendung. PRP ist Plasma mit vielen

Blutplättchen, welches durch ein mehrschrittiges Verfahren aus dem Blut gewonnen wurde.

Es enthält Wachstumsfaktoren wie transforming growth factor – beta, platelet-derived

epidermal growth factor und die vaskulär endothelialen Wachstumsfaktoren C und D. Das

PRP wurde den Tieren in das Drainagegebiet der Transplantate injiziert. Es konnte ein

positiver Effekt auf die Regeneration der transplantierten Lymphknotenfragmente gezeigt

werden.

In der Praxis gestaltet sich die Herstellung von PRP als sehr aufwendig und könnte im

Zusammenhang mit einer klinischen Verwendung nur in bestimmten dafür ausgestatteten

medizinischen Stätten durchgeführt werden.

Eine andere Methode ist es, direkt einen bei der Lymphangiogenese beteiligten vaskulär

endothelialen Wachstumsfaktor zu verwenden. TAMMELA et al. (2001) haben dahingehend

Versuche an Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie haben gezeigt, dass sich eine

Therapie mit Wachstumsfaktoren positiv auf die Regeneration von Lymphgefäßen auswirkt.

Um eine Therapiemöglichkeit für das Lymphödem zu ergründen, muss ein adäquates

Tiermodell geschaffen werden, das die Konditionen unter einer Lymphknotenentfernung

widerspiegelt und zu einer Ödembildung führt. Die Notwendigkeit eines geeigneten Modells

Literaturübersicht

18

haben HADAMITZKY et al. (2008) zusammengefasst. Zwar gibt es bereits Modelle für Hunde

(CHEN et al. 1989) und Kaninchen (CASLEY-SMITH et al. 1977), sowie Großtiermodelle für

Schafe (TOBBIA et al. 2009); ein Tier-Modell für die Ratte fehlte bislang jedoch gänzlich.

SOMMER et al. (2012 A) haben nun ihre Erfolge bei der Findung eines solchen Modells

veröffentlicht.

Auf der Basis dieses Tiermodells wurde die avaskuläre Transplantation autologer

Lymphknotenfragmente in Kombination mit der Gabe von VEGF-C durchgeführt (SOMMER et

al. 2012 B).

Es erfolgte nach der Entfernung der Lymphknoten aus der rechten Leiste eine Bestrahlung

des Gebietes. Anschließend wurde eine avaskuläre Transplantation von autologen

Lymphknotenfragmenten aus der linken in die rechte Leiste vorgenommen. Jedes der Tiere

erhielt 6,67 µg VEGF-C an den postoperativen Tagen 1, 2 und 5. Ein positiver Effekt der

Verwendung von VEGF-C auf die Lymphknotenregeneration und den Wiederanschluss an das

Lymphgefäßsystem im Drainagegebiet konnte nachgewiesen werden (SOMMER et al.

2012 B).

Literaturübersicht

19

2.6. Ziel dieser Arbeit

Die Durchführbarkeit einer avaskulären autologen Lymphknotentransplantation wurde

durch die oben genannten Arbeiten bestätigt. Die Gabe von VEGF-C hat sich dabei als positiv

herausgestellt.

Parameter, wie Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation der VEGF-C Applikation sind jedoch bislang

noch nicht untersucht worden.

Ziel dieser Arbeit war es, auf der Basis des etablierten Tiermodells von SOMMER et al.

(2012 B) ein Applikationsschema mit Fokus auf Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation, für VEGF-C

zu entwickeln um verbesserte Raten im Bereich der Lymphknotenregeneration, sowie des

Wiederanschlusses des Lymphgefäßsystems zu erzielen.

Eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation würde vor allem der Prävention von

sekundären Lymphödemen z.B. nach Brustkrebsbehandlung dienen.

Material und Methoden

20

3. Material und Methoden

3.1. Allgemeines

Alle folgenden Untersuchungen und Versuchstechniken wurden dem Niedersächsischen

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Sitz Oldenburg) unter

der Antragsnummer 33.94502-04-07/1420 angezeigt und von diesem genehmigt.

3.2. Vorversuch

Der Vorversuch wurde mit 7 Ratten durchgeführt. Informationen zu den Tieren, der Haltung,

prä- und postoperativen Versorgung sowie der Chirurgie und anschließenden Methode zur

Aufbereitung der Proben sowie den Auswertungskriterien können aus den Kapiteln 3.3.-

3.13.1. entnommen werden. Die Tiere wurden wie die Kontrollgruppe (Gruppe E) behandelt

und bekamen daher kein VEGF-C. Außerdem unterschied sich die Vorversuchsgruppe durch

eine achtwöchige Ruhephase von der Kontrollgruppe (4 Wochen Ruhephase) und ihre

Proben wurden ausschließlich lichtmikroskopisch untersucht.

3.3. Tiere

Für die Versuchsreihen wurden insgesamt 90 junge, erwachsene und gesunde weibliche

Lewis Ratten von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet.

Jedes Tier wog im Schnitt 200g und hatte somit ein Alter von 8 bis 12 Wochen erreicht.


21

3.4. Gruppengröße

Die Tiere wurden in 5 Gruppen eingeteilt. Gruppe A bestand aus 10 Tieren und die

Gruppen B bis E aus je 20 Tieren. In Gruppe B wurde eine Ratte wegen des andauernden und

hochgradigen autoaggressiven Verhaltens nach Verletzung der distalen und medialen

Phalanx des 3. Digitus der linken Vorderpfote frühzeitig aus dem Versuch genommen. Sie

wurde mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Gruppe B dezimierte sich somit auf 19

Tiere.

3.5. Haltung

Die Tiere wurden nach ihrer Ankunft zu fünft in Spezifiziert Pathogen Frei – Haltung

(SPF-Haltung) im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover untergebracht

und mit standardisiertem Total Pathogen Frei – Futter (TPF-Futter) und Osmose Filter

gereinigtem Wasser ad libitum versorgt. Sie wurden in 4S-Käfigen (Höhe 21cm, Grundfläche

1370 cm2) gehalten. Die Hell-Dunkel-Phasen waren so eingestellt, dass in den Räumen

14 Stunden Helligkeit und 10 Stunden Dunkelheit herrschte.

Alle Ratten erhielten vor Versuchsbeginn eine einwöchige Eingewöhnungszeit um den Stress

für die Tiergruppen zu minimieren.

3.6. Präoperative Versorgung

Am Operationstag wurde jedem Tier mindestens 30 Minuten und maximal 1,5 Stunden vor

dem Eingriff eine Dosis von 5mg/kg Carprofen (Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin, Deutschland)

subkutan injiziert.

Die Tiere wurden vom Operationsgeschehen mit einem Tuch über dem Käfig abgeschirmt

und so weit wie möglich vom OP-Tisch entfernt untergebracht. Dies diente dazu möglichst

standardisierte Bedingungen für das Einzeltier zu schaffen und Stress und Aufregung

möglichst gering zu halten.


22

3.7. Chirurgie

Die Operation erfolgte im Prinzip wie in der Veröffentlichung von SOMMER et al. (2012 B)

beschrieben.

Alle 89 Ratten wurden zur Narkoseeinleitung in eine mit 4-5%igem Isofluran (Isofluran

Baxter, Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) geflutete Kammer

verbracht. Nach Rasur der rechten Leisten- und Kniekehlregion wurde die Inhalationsnarkose

über eine Maske bei 1,5-2,5%igem Isofluran aufrechterhalten.

Das Einzeltier wurde zunächst in Bauchlage gelagert. Anschließend wurde die OP Region in

der Kniekehle mit Softasept Spray (Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland)

desinfiziert. Es folgte ein ca. 1cm kurzer Hautschnitt in der Fossa poplitea und die

Freipräparation der Muskulatur. Zwischen den Muskelsträngen wurden die

Kniekehllymphknoten, die Lymphonodi poplitei, aufgesucht und stumpf entfernt. Die

Entfernung diente dazu, die Möglichkeit einer Übernahme der Drainage durch die

Kniekehllymphknoten zu verhindern und zu gewährleisten, dass ausschließlich afferente und

damit unfiltrierte Lymphe im Bereich der Transplantation ankommt. Nach Stillung

eventueller Blutungen wurde der Hautschnitt subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial

(Marlin violett, Catgut GmbH, Markneukirchen, Germany) der Stärke 5-0 verschlossen.

Zusätzlich wurden, ebenfalls mit dem resorbierbaren Nahtmaterial der Stärke 5-0,

Einzelhautnähte zum Verschluss der Wunde verwendet.

Anschließend wurde die Ratte in Rückenlage gelagert und es wurde nach einer

Hautdesinfektion mit Softasept Spray ein knapp 1cm kurzer Hautschnitt in der rechten

Leistengegend vollzogen. Nach Freipräparation des subkutanen Fettgewebes wurden die

Leistenlymphknoten, die Lymphonodi inguinales, aufgesucht und stumpf entfernt.

Drei der Lymphknoten wurden von verbleibendem Fettgewebe und Lymphgefäßresten

befreit und jeweils einer der Pole wurde entfernt (BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al.

2012 B). Es folgte eine Modifikation zu der Methode von SOMMER et al. (2012 B) (Kapitel

3.7.1.).

3.7.1. chirurgische Modifikationen

Nach der Polentfernung, schloss sich nun eine modifizierte Variante zu der von SOMMER et

al. (2012 B) verwandten Technik an. Im Gegensatz zu einer einfachen Schlinge aus nicht

resorbierbarem Nahtmaterial, auf die die Transplantate aufgefädelt wurden und die an dem

subkutanen Fettgewebe befestigt wurde, wurde hier mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial

(Prolene, Ethicon GmbH, Norderstedt, Germany) der Stärke 5-0 ein Teil des subkutanen


23

Fettgewebes zunächst nur einmal durchstochen. Anschließend wurden die drei

fragmentierten Lymphknoten aufgefädelt, das Fettgewebe erneut durchstochen und das

Nahtmaterial somit auf der gegenüberliegenden Seite der Transplantate verknotet. Dies

diente dazu, die Transplantate vor mechanischen Einflüssen des Knotens zu schonen.

Verschlossen wurde das Transplantationsgebiet subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial

und zusätzlichen Hautnähten.

3.7.2. Operationsabschluss

Das Wundareal wurde sowohl in der Kniekehle als auch in der Leiste mit Aluminium Spray

(MeproVet, Mepro Dr. Jäger&Bergmann GmbH, Vechta Deutschland) versorgt und die Tiere

wachten unter meiner tierärztlichen Beobachtung in einem separaten Käfig mit einer

Wärmequelle (Rotlichtlampe) auf. Das Erwachen dauerte je nach Individuum etwa

2-5 Minuten.

Im Anschluss an die Operation und nach vollständigem Erwachen (ca. 30 Minuten) aus der

Narkose wurden die Tiere wieder in ihre ursprünglichen Gruppen zurückgeführt.

3.8. Postoperative Versorgung

An den darauf folgenden 3 Tagen erhielten alle Tiere unabhängig von ihrer

Gruppenzugehörigkeit subkutan eine Analgesie (5mg/kg Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin,

Deutschland) zur Linderung des postoperativen Schmerzes und es erfolgte eine regelmäßige

Visite der Tiere durch mich über die komplette Versuchslaufzeit.


24

3.9. Die Gruppen

Für die Versuchsgruppen wurde VEGF-C (VEGF-C rr, ReliaTech GmbH, Wolfenbüttel,

Deutschland) in sterilem Phosphate Buffered Saline (PBS) gelöst. Für eine Ampulle à 100µg

VEGF-C wurden 1700µl steriles PBS verwendet.

In Gruppe A (n=10) erhielt jedes Tiere eine Dosis von 6,67µg VEGF-C (120µg der VEGF-C/PBS-

Lösung) intradermal in die Bauchwand der rechten Körperhälfte in die unmittelbare Nähe

des Transplantationsgebietes an den postoperativen Tagen 1, 2 und 3 (Abb.2.).

Die Tiere aus Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C und zum gleichen Zeitpunkt

wie Gruppe A; einziger Unterschied war die Lokalisation. Die Injektion erfolgte intradermal in

die mediale Seite des rechten Oberschenkels (Abb.2.).

Den Ratten aus Gruppe C (n=20) wurde die gleiche Dosis VEGF-C an der gleichen Lokalisation

wie in Gruppe B intradermal injiziert, doch die Injektion erfolgte zu einem anderen

Zeitpunkt, nämlich an den Tagen 14, 15 und 16 post OP (Abb.2.).

Die Injektionsparameter „ Zeitpunkt“ und „Lokalisation“ in Gruppe D (n=20) waren die

gleichen wie in Gruppe B. Die Dosis und damit auch die Injektionsmenge der

VEGF-C/PBS-Lösung war in Gruppe D verdoppelt worden. Jedes Tier erhielt in dieser Gruppe

eine Dosis von 13,34µg VEGF-C (Abb.2.) und damit ein Injektionsvolumen von 240µl der

Lösung.

Hinweis: Im Verlauf der Färbeverfahren konnten aus technischen Gründen die Proben eines

Tieres aus dieser Gruppe wohl lichtmikroskopisch, jedoch nicht weiter immunhistochemisch

untersucht werden. Das Tier wurde in dem immunhistochemischen Teil der Auswertung

nicht berücksichtigt, so dass sich hierbei die Anzahl der Gruppe auf n=19 reduzierte.

Die Gruppe E (n=20) diente als Kontrollgruppe und wurde neben der, für alle Versuchstiere

gleichen, Analgesie-Verabreichung und der regelmäßigen Visite keiner weiteren Intervention

unterzogen (Abb.2.).

Die Gruppen A-C und die Gruppe E wurden verblindet ausgewertet. Die Verblindung, bei der

die Tiere randomisierte Nummern zugeteilt bekamen, diente dazu, möglichst

unvoreingenommene Bedingungen für die Auswertung zu schaffen.


25

Abbildung 2.: Übersicht über die Versuchsgruppen.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Gruppe An = 10

Gruppe Bn = 19

Gruppe Cn = 20

Gruppe Dn = 20

Gruppe En = 20

Tage

Gruppenübersicht

Ruhephase

Applikation Bauchwand,6,67µg VEGF-C

Applikation Oberschenkelmedial, 6,67µg VEGF-C

Applikation Oberschenkelmedial, 13,34µg VEGF-C


26

3.10. Transplantat-Entnahme

Nach einer Versuchslaufzeit (inkl. Ruhephase, siehe Abb. 2.) von insgesamt 4 Wochen wurde

allen Tieren eine Injektionsnarkose, bestehend aus 90mg/kg Ketamin (Ketamin Gräub,

Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) und 10mg/kg Xylazin (Rompun, Bayer Health Care,

Leverkusen, Deutschland), intraperitoneal verabreicht.

Nach Eintritt der Narkosewirkung wurde der Farbstoff Patent Blau (Patentblau V, Gerbet

GmbH, Sulzbach, Deutschland) intradermal in die mediale Seite des rechten Oberschenkels

injiziert.

Der Abfluss des Patentblaus wurde durch das Beugen und Strecken der rechten

Hintergliedmaße im Zeitraum von 1-2 Minuten angeregt. Im Anschluss an diese Prozedur

wurden die Ratten mittels zervikaler Dislokation getötet.

Um eine Übersicht über die Verteilung der Lymphgefäße und einer eventuellen Färbung der

Transplantate und damit die Bestätigung eines Wiederanschlusses an das

Lymphgefäßsystem zu erhalten, wurde die Haut großflächig von der Oberschenkelinnenseite

bis hinauf an das Sternum von der Bauchwand abpräpariert und makroskopisch inspiziert.

3.11. Makroskopische Untersuchung und Auswertung

Die makroskopische Untersuchung des Transplantationsgebietes diente zur Beurteilung des

Wiederanschlusses der Lymphgefäße an das Transplantat und damit der Integrität des

Lymphgefäßsystems.

Die Verwendung des nicht resorbierbaren Nahtmaterials zur Fixierung der Transplantate

unter der Operation, sollte nicht nur eine mögliche Migration der Transplantate verhindern;

es sollte auch die Transplantate markieren.

Die Identifikation der Transplantate wurde also durch das nicht resorbierbare Nahtmaterial

vereinfacht.

Durch die Verteilung des Patentblaus über die Lymphgefäße des superfiziellen Systems

wurden die Lymphgefäße identifiziert und bei Färbung des Transplantates der

Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystems als erfolgreich bewertet.

Alle Tiere mit einem Transplantat-Wiederanschluss wurden in „Ratte mit Transplantat-

Wiederanschluss“ eingeordnet.


27

Anschließend fand eine großzügige Exzision der Transplantate statt. Diese wurden von

Fettgewebe und anhängenden Lymphgefäßen befreit und umgehend in flüssigem Stickstoff

gefroren. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -80°C.

3.12. Technische Aufbereitung der Proben

Nach dem Gefrieren der Proben wurden diese unter Verwendung eines Leica CM3050S

Kryostats (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar, Deutschland) geschnitten. Dazu

wurden die Proben in der Kryostat-eigenen Kammer, die auf eine konstante Temperatur von

-20°C eingestellt wurde, mit Tissue Tek (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude,

Niederlande) aufgeblockt und in dieser Kammer geschnitten. Für die mikroskopische

Untersuchung wurden von allen entnommenen Proben 5µm dünne Schnitte angefertigt.

3.13. Mikroskopische Untersuchung und Färbung

3.13.1. Lichtmikroskopische Untersuchung

Von jeder Probe wurden in regelmäßigen Abständen Schnitte Hämatoxylin-Eosin (HE)

gefärbt.

Hierbei wurden die auserwählten Schnitte zunächst 10 Minuten in PBS verbracht und

anschließend 10 Minuten in Hämalaun (Mayers Hämalaunlösung, Merck AGaA, Darmstadt,

Deutschland) gefärbt. Nach dem Bläuen mit Leitungswasser kam der Farbstoff Eosin

(Certistain Eosin G, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), welcher nur 2 Minuten einwirkte,

hinzu. Es schlossen sich Alkoholbäder mit steigender Prozentzahl an, an deren Ende

100%iger Alkohol stand. Nach einem Bad in Xylol für etwa 10 Minuten wurden die Schnitte

anschließend mit Roti-Histokitt II (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, Deutschland)

eingedeckt.

Die mikroskopischen Beurteilung der HE gefärbten Schnitte diente einer ersten Beurteilung

der Probe und zur Einordnung, ob das vorliegende Gewebe ein potentiell regeneriertes

Lymphknotenfragment war. Alle Schnitte, die potentiell regenerierte

Lymphknotenfragmente aufwiesen, wurden in die Kategorie „vorläufig als regeneriert


28

eingestuft“ eingestuft. Es wurde bei der histologischen Begutachtung insbesondere auf die

Dichte und Form des vorliegenden Gewebes geachtet. Zusätzlich wurde für die Zuordnung

das Vorhandensein so wie die physiologische Verteilung von Lymphozyten, HEVs,

Lymphsinus und einer bindegewebigen Kapsel berücksichtigt.

Alle in „vorläufig als regeneriert“ eingestuften Proben wurden in der IHC-Färbung auf ihren

Regenerationsstatus hin untersucht.

2.13.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung

Im Anschluss an diese lichtmikroskopische Untersuchung folgte für alle ausgewählten

Proben, die sich zuvor als potentielles Regenerat auszeichneten, eine immunhistochemische

Färbung (IHC-Färbung).

Ziel dieser Färbung war es, mittels spezieller primärer und sekundärer Antikörper (AK)

zunächst B-Lymphozyten und T-Lymphozyten durch Fluoreszenz sichtbar zu machen und

somit ihre im Lymphknoten typische Verteilung zu beurteilen. Das bedeutet, dass sich

B-Lymphozyten im Randgebiet, dem Cortex des Lymphknotens, befinden sollten. Außerdem

sollte eine Anordnung zu Follikeln erkennbar sein. T-Lymphozyten sollten vermehrt in den

parakortikalen Teilen des Transplantates aufzufinden sein. Sowohl T-Lymphozyten-, als auch

B-Lymphozyten-Bereiche mussten auffindbar sein; fehlte einer der Bereiche gänzlich, wurde

die Regeneration als nicht erfolgreich bewertet.

Die IHC-Färbung erfolgte in einer Doppelmarkierung, d.h. B- und T-Zellen konnten auf einem

Schnitt zusammen angefärbt werden.

Hierzu wurden die Objektträger mit den ungefärbten Schnitten zunächst bei -20°C

10 Minuten in Aceton getaucht und anschließend 3 mal 5 Minuten mit PBS gespült. Zum

Puffern möglicher Fehlbindungen der Antikörper wurden die Schnitte mit Swine Serum

(DakoCytomation, Glostrup, Dänemark) in einer Verdünnung von 1:10 benetzt. Nach

30 Minuten wurde für die B-Lymphozyten-Färbung der primäre AK BM 4013 (Tab. 1.) in einer

Verdünnung von 1:500 aufgetragen und nach einer 60 minütigen Einwirkzeit mit 3 mal

5 minütigen Spülgängen PBS abgespült. Es schloss sich das Aufbringen des sekundären AK

AF 546 (Tab.1.) in einer Verdünnung von ebenfalls 1:500 an, welcher nach 30 Minuten

ebenfalls mit 3 mal 5 minütigen Spülgängen PBS abgespült wurde.

Zum Zwecke der T-Lymphozyten-Färbung wurde sich des Antikörpers R73 FITC (Tab. 1.)

bedient, welcher sowohl die Bindung an die T-Lymphozyten als auch die Fluoreszenz

kombiniert und damit primären und sekundären AK in einem darstellte.

Abschließend wurde nach einem weiteren 3 mal 5 minütigen Spülgang eine Zellkernfärbung

mit DAPI (SIGMA, Missouri, USA) in der Verdünnung von 1:1000 durchgeführt.


29

Die IHC-Färbung wurde mit einem letzten 3 mal 5 minütigen Spülgang und der Eindeckung

der Schnitte abgeschlossen. Als Kontrollfärbung wurden außerdem zwei Schnitte eines

inguinalen Lymphknotens einer Ratte in der gleichen Weise gefärbt, allerdings wurde einer

statt der Antikörper nur mit PBS benetzt. So konnte der direkte Vergleich zwischen

erfolgreicher AK-Färbung des einen Schnittes und der erfolgreichen Nichtfärbung des

anderen gezogen werden.

Die Verteilung der T- und B-Lymphozyten wurde am Fluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die

Proben wurden abhängig von dem Vorhandensein einer physiologischen Verteilung dieser

Zellen vorläufig in „Ratte mit regenerierten Transplantaten“ und „Ratte ohne regenerierte

Transplantate“ eingestuft.

Zur weiteren Abklärung des Vorhandenseins einer Regeneration wurde zusätzlich bei allen

mit „Ratte mit regenerierten Transplantaten“ eingestuften Proben eine weitere IHC-Färbung

zur Feststellung von HEVs und Lymphendothel durchgeführt.

Das Färbeprotokoll las sich ähnlich wie das für die B- und T-Lymphozyten-Färbung und auch

die Kontrollfärbungen wurden in gleicher Weise vollzogen. Es wurde neben den vielzähligen

Spülgängen ebenso Swine Serum, wie auch DAPI verwendet. Zur Detektion der HEVs wurde

der primäre AK HIS 52 (Tab. 1.), zum Zwecke der Lymphendotheldarstellung der primäre AK

LYVE-1 (Tab. 1.) verwendet.

Bei beiden primären Antikörpern wurde als sekundärer AK CY™ 3 (Tab. 1.) verwendet.

Stellten sich HEVs und Lymphendothel dar, wurde die Probe endgültig in „Ratte mit

regenerierten Transplantaten“ eingestuft.


30

Primäre AK Firma Spezies monoklonal polyklonal

BM 4013

Acris antibodies,

Herford,

Deutschland

Mouse X

R73 FITC

(inkl. sek. AK)

AbD serotec,

Düsseldorf,

Deutschland

Mouse X

LYVE-1

Relia Tech GmbH,

Wolfenbüttel,

Deutschland

Rabbit X

HIS 52

Abcam,

Cambrige,

USA

Mouse X

Sekundäre AK Firma Spezies monoklonal polyklonal

CY™3

Dianova GmbH,

Hamburg,

Deutschland

Goat anti Rabbit

X

AF 546

Invitrogen

GmbH,

Darmstadt,

Deutschland

Goat anti Mouse

X

Tabelle 1.: Liste der primären und sekundären Antikörper (AK) und ihrer Herkunft.


31

3.14. Statistik

Im Anschluss an die makroskopische und die mikroskopische Auswertung folgte die

statistische Auswertung.

Zur Verarbeitung der Daten wurde mit dem Programm GraphPad Prism (Version 5.02, Firma

GraphPad Software, USA) gearbeitet. Aufgrund der geringen Stichprobengröße pro Gruppe

wurde der Fisher‘s exact test durchgeführt.

Hierbei ergaben sich folgende Signifikanzstufen für die Irrtumswahrscheinlichkeit p (Tab. 2.):

p-Wert Bezeichnung Symbol

0,05 ≤ p ≤ 0,10 Tendenz (*)

< 0,05 signifikant *

< 0,01 hoch signifikant **

<0,001 höchst signifikant ***

Tabelle 2.: Übersicht über die Signifikanzstufen

Zur Untersuchung der Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ wurden

unterschiedliche Gruppen-Konstellationen gewählt und diese statistisch miteinander

verglichen.


32

3.14.1. Zeitpunkt

Zur Untersuchung des Zeitpunktes wurden folgende Gruppen miteinander verglichen

(Abb.3.):

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B mit dem Zeitpunkt „Tag 1,2,3 post

OP“

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe C mit dem Zeitpunkt „Tag 14,15,16

post OP“

• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe B mit Gruppe C) um einen

Unterschied zu Gunsten einer der Gruppen zu ermitteln

Abbildung 3.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Zeitpunkt“ miteinander verglichen wurden.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 151617 181920 21222324 252627 28

Gruppe Bn = 19

Gruppe Cn = 20

Gruppe En = 20

Gruppen Parameter "Zeitpunkt"

Ruhephase

Applikation

Oberschenkel medial,

6,67µg VEGF-C

Tage


33

3.14.2. Lokalisation

Um die Lokalisation für eine VEGF-C Applikation zu bestimmen, wurden folgende Gruppen

miteinander verglichen (Abb.4.):

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe A mit der intradermalen Applikation in

die Bauchwand

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B, in der den Ratten in die mediale

Seite des Oberschenkels VEGF-C intradermal injiziert wurde

• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe A mit Gruppe B) um einen


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 1516 171819 2021 2223 2425 2627 28

Gruppe An = 10

Gruppe Bn = 19

Gruppe En = 20

Gruppen Parameter "Lokalisation"

Ruhephase

Applikation Bauchwand,

6,67µg VEGF-C

Applikation


6,67µg VEGF-C

Tage

Abbildung 4.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Lokalisation“ miteinander verglichen wurden.


34

3.14.3. Dosis

Die Dosis-Untersuchung erfolgte mit dem Vergleich folgender Gruppen (Abb. 5.):

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B, in der jeder Ratte 6,67µg VEGF-C

injiziert wurde

• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe D, in der jede Ratte 13,34µg VEGF-C

erhielt

• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe B mit Gruppe D) um einen


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Gruppe Bn = 19

Gruppe Dn = 20

Gruppe En = 20

Gruppen Parameter "Dosis"

Ruhephase

Applikation


6,67µg VEGF-C

Applikation


13,34µg VEGF-C

TageTage

Abbildung 5.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Dosis“ miteinander verglichen wurden.

Ergebnisse

35

4. Ergebnisse

4.1. Vorversuch

Bei der HE Auswertung der Schnitte aus dem Vorversuch hat sich ergeben, dass nach

8 Wochen Ruhephase 57% (4 aus 7 Tieren) der Tiere potentiell regenerierte

Lymphknotenfragmente besaßen.

Die Kontrollgruppe (Gruppe E), die nur eine vierwöchige Ruhephase bekommen hat, wies

nach der immunhistochemischen Auswertung 70% (14 aus 20 Tieren) der Tiere mit

regenerierten Lymphknotenfragmenten auf.

4.2. Chirurgische Modifikation

Die Modifikation bezüglich der Transplantation ist in der Abb.6. a-f veranschaulicht.

Die Lymphknotenfragmente befanden sich bei der Entnahme bei 88 der 90 Versuchstiere

(98%) noch immer an dem nicht resorbierten Nahtmaterial.

Die Entfernung des Transplantats war nach Öffnung der Nahtschlinge und dem

anschließenden Herausziehen des Fadens ohne Schwierigkeiten möglich. Es befand sich bei

keinem der 90 Versuchstiere Gewebereste am Nahtmaterial in Bereich der identifizierten

Transplantate.

Ergebnisse

36

Abbildung 6.: Transplantationsvorgang: Aufsuchen des subkutanen Fettgewebes in der Leiste (a), Durchstechen

des Fettposters mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (b), Auffädeln der Lymphknotenfragmente (c), erneutes

Durchstechen des Fettpolsters (d), Verknoten des Nahtmaterials (e) und Verschließen der Wunde mit

resorbierbarem Nahtmaterial (f).

Ergebnisse

37

Abbildung 7.: Position der Patentblau-Applikation in die mediale Seite des

Oberschenkels und Verteilung des Farbstoffes über das superfizielle Lymphsystem.

4.3. Makroskopisch

In der Kontrollgruppe (Gruppe E) konnte bei 3 von 20 Ratten ein Wiederanschluss der

Transplantate an das Lymphsystem (Abb. 7. bis 9.) nachgewiesen werden. Es ergibt sich

damit eine Rate von 15%.

Eine Applikation in die Bauchwand, wie sie die Tiere in Gruppe A erhielten, hatte eine

Erfolgsrate von 50%. Es konnten 5 Tiere von 10 mit einem Wiederanschluss gefunden

werden.

In der Gruppe B, die VEGF-C zu dem Zeitpunkt „Tag 1, 2, 3 post OP“ in die rechte

Oberschenkelinnenseite gespritzt bekommen hat, beläuft sich die Wiederanschlussrate auf

53%. Das heißt 10 von 19 Tieren wiesen eine Blaufärbung des Transplantats (Abb.9.) und der

Lymphgefäßen auf.

In Gruppe C war der Wiederanschluss bei 7 von 20 Tieren erfolgreich. Die Rate einer VEGF-C

Applikation an den Tagen 14, 15 und 16 post OP liegt damit bei 35%.

In der Gruppe D mit einer VEGF-C Dosis von 13,34µg wiesen 17 aus 20 Tieren gefärbte

Transplantate auf. Damit ließ sich in der Gruppe D mit 85% die höchste Transplantat-

Wiederanschlussrate detektieren.

Ein Übersicht über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen bieten die

Abbildungen 10. und 11..

Ergebnisse

38

Abbildung 9.: Darstellung eines entnommenen und angefärbten

Transplantats

Abbildung 8.: Darstellung eines Transplantats mit Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem.

Erkennbar sind zu- und ableitendes Lymphgefäß (schwarzer Pfeil) sowie die Fixierung des

Transplantats mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (weißer Pfeil). Das Transplantat ist eingebettet

in Fettgewebe und noch nicht frei präpariert.

2mm

Ergebnisse

39

5

9

13

3

175

10

7

17

3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D Gruppe E

Ra

tte

n

Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem

Ratten mit Transplantat-

Wiederanschluss

Ratten ohne Transplantat-

Wiederanschluss

Abbildung 10.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen.

Abbildung 11.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen in Prozent.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


50% 47%

65%

15%

85%

50% 53%

35%

85%

15%

Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem prozentual

mit Wiederanschluss

ohne Wiederanschluss

Ergebnisse

40

4.3.1. Statistik

4.3.1.1. Zeitpunkt

Zunächst wurde die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B verglichen. In Gruppe B

bekamen die Tiere eine Dosis von 6,67µg VEGF-C in die Oberschenkelinnenseite zum

Zeitpunkt „Tag 1, 2 und 3 post OP“ injiziert. Die Analyse mit dem Fisher’s Exact Test ergab

einen p-Wert von 0,0187. Es konnte somit eine statistische Signifikanz nachgewiesen werden

(Abb. 12.).

Ein weiterer Vergleich wurde zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe C

gezogen. Die Tiere in Gruppe C erhielten eine Dosis von 6,67µg VEGF-C zu dem Zeitpunkt

„Tag 14, 15 und 16 post OP“ in die rechte Oberschenkelinnenseite. Der p-Wert beträgt hier

0,2733. Eine Signifikanz konnte somit nicht nachgewiesen werden (Abb.12.).

Ein Vergleich der beiden Versuchsgruppen zueinander ergab mit einem p-Wert von 0,3406

keine statistische Signifikanz (Abb.12.).

17

9

13

3

10

7

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe E Gruppe B Gruppe C

Ra

tte

n

Transplantat-Wiederanschluss

Ratte mit Transplantat-

Wiederanschluss

Ratte ohne Transplatat-

Wiederanschluss

*

Abbildung 12.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten

Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen auf den Transplantat-

Wiederanschluss.

* p < 0,05

Ergebnisse

41

4.3.1.2. Lokalisation

Der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe A ergab mit einem

p-Wert 0,0778 zwar eine statistische Tendenz (Abb 13.), jedoch keine Signifikanz.

Die statistische Signifikanz und der p-Wert beim Vergleich zwischen der Kontrollgruppe

(Gruppe E) und der Gruppe B ist bereits bei dem Kapitel 4.3.1.1. beschrieben worden

(p-Wert = 0,0187) (Abb. 13.).

Ein Vergleich zwischen beiden Versuchsgruppen Gruppe A und Gruppe B führte zu einem

p-Wert von 1 und ist somit statistisch nicht signifikant (Abb. 13.).

17

5

9

3

5

10

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe E Gruppe A Gruppe B

Ra

tte

n


Ratte mitTransplantat-

Wiederanschluss


Wiederanschluss

(*)

*


Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“ bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.

* p< 0,05

(*) 0,05<p<0,10

Ergebnisse

42

4.3.1.3. Dosis

Zur Ermittlung des Parameters „Dosis“ ist zunächst die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der

Gruppe D, in der jedes Tier eine Dosis von 13,34µg VEGF-C in die Oberschenkelinnenseite

injiziert bekam, verglichen worden.

Der p-Wert bei dem Vergleich lag bei <0,0001 und ist damit statistisch höchst signifikant

(Abb. 14.).

Die statistische Signifikanz und der p-Wert beim Vergleich zwischen der Kontrollgruppe

(Gruppe E) und der Gruppe B ist bereits bei dem Kapitel 4.3.1.1. beschrieben worden

(p-Wert = 0,0187) (Abb. 14.).

Der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen, Gruppe B und Gruppe D, ergab einen

p-Wert 0,0407. Damit ist eine statistische Signifikanz zugunsten der Gruppe D nachgewiesen

(Abb. 14.).

17

9

3

3

10

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe E Gruppe B Gruppe D

Ra

tte

n


Ratte mit Transplantat-

Wiederanschluss


Wiederanschluss

***

**


Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.

* p< 0,05

*** p< 0,001

Ergebnisse

43

4.4. Mikroskopisch

Zunächst erfolgte eine erste Vorauswahl der gefärbten HE Präparate in potentiell

regenerierte und nekrotisierte Transplantate (Abb. 15), erst danach erfolgte die

Immunhistochemie, um die Proben auf ihren Regenerationsstatus hin zu beurteilen.

Unter Berücksichtigung der im Kapitel 3. (Material und Methoden) genannten Parameter

wurden in der Kontrollgruppe E eine Regenerationsrate von 70% erreicht. Es wiesen also 14

von 20 Ratten regenerierte Lymphknotenfragmente (Abb. 16., 19., 21.)auf.

In Gruppe A konnten bei 8 (80%) von 10 Tieren regenerierte Lymphknotenfragmente

detektiert werden. In der Gruppe B waren es 17 (89%) aus 19 Tieren und in Gruppe C

17 (85%) aus 20 Tieren.

Die Gruppe D erwies sich auch hier als die Gruppe mit der höchsten Rate. Bei 95% (18 aus 19

Tieren) der Ratten konnte hier die Einstufung in „Ratte mit regenerierten Transplantaten“

erfolgen.

Eine Übersicht über den Regenerationsstatus (Abb. 16.-21.) und die Ergebnisse in den

einzelnen Gruppen (Abb.: 22. Und 23.) bieten die folgenden Abbildungen:

Abbildung 15.: a. HE-Färbung eines nekrotisierten Transplantats in der Vergrößerung: 5x; b. HE-Färbung eines

potentiellen Regenerats in der Vergrößerung: 5x

Ergebnisse

44

Abbildung 16.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a. Die Zellkernfärbung

(DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich im parakortikalen Bereich des

Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2. Ak AF 564) sind randständig. d. Zusammengefügte

Darstellung der B- und T-Zellen (d). Vergrößerung (a-d): 5x.

Ergebnisse

45

Abbildung 17.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a. die Zellkernfärbung

(DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich zwar vorwiegend, jedoch nicht deutlich abgegrenzt,

im parakortikalen Bereich des Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2.Ak AF 564) sind zudem nicht

randständig angeordnet, sondern diffus auch über den kortikalen Bereich hinaus verteilt. d. zusammengefügte

Darstellung der B- und T-Zellen. Vergrößerung (a-d): 5x.

Ergebnisse

46

Abbildung 19.: Regenerierte Lymphknotenfragmente. a. HEVs

(1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) in der Vergrößerung 10x; b. in der Vergrößerung 40x

nach der Immunhistochemie.

Abbildung 18.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a.

Zellkernfärbung (DAPI); b. HEV-Färbung (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) mittels

Immunhistochemie. Vergrößerung 5x (a,b).

Ergebnisse

47

Abbildung 21.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) in der

Vergrößerung 5x und b. in der Vergrößerung 40x (b).

Abbildung 20.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Zellkern-Färbung

(DAPI); b. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) mittels Immunhistochemie

in der Vergrößerung 5x (a,b).

Ergebnisse

48

2 2 31

6

8

1717

18

14

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20


An

zah

l R

att

en

Regeneration

Ratte mit regenerierten

Transplantaten

Ratte ohne regenerierte

Transplantate

Abbildung 22.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen.

Abbildung 23.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen in Prozent.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


20%11% 15%

5%

30%

80%89% 85%

95%

70%

Regerneration prozentual

Ratte mit regenerierte

Transplantate

Ratte ohne regenerierten

Transplantaten

Ergebnisse

49

4.4.1. Statistik

4.4.1.1. Zeitpunkt

Der Vergleich zwischen den Gruppen: Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe B, in der

jeder Ratte 6,67µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3 post OP in die rechte

Oberschenkelinnenseite injiziert wurde, ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine statistische

Signifikanz (Abb. 24.).

Auch der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Versuchsgruppe C

(6,67µg VEGF-C in die rechte Oberschenkelinnenseite, Tag 14, 15, 16 post OP) ergab keine

statistische Signifikanz und wies einen p-Wert von 0,4506 auf (Abb. 24.).

Die Gruppen untereinander wiesen mit einem p-Wert von 1 ebenfalls keine statistische

Signifikanz auf (Abb. 24.).


Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.

6

2 3

14

1717

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe E Gruppe B Gruppe C

Ra

tte

n

Regeneration


Transplantaten


Transplantate

Ergebnisse

50


Der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe A, in der jeder Ratte

6,67µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3 post OP in die Bauchwand injiziert wurde, ergab

einen p-Wert von 0,6821 und ist damit nicht signifikant (Abb. 25.).

Der Vergleich zwischen den Gruppen „Kontrollgruppe“ (Gruppe E) und der „Gruppe B“

wurde bereits in dem Kapitel 4.4.1.1. beschrieben und ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine

statistische Signifikanz (Abb. 25.).

Auch der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen Gruppe A und Gruppe B ergibt

keine Signifikanz. Der p-Wert liegt bei 0,592 (Abb. 25.).


Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.

6

2 2

14

8

17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Gruppe E Gruppe A Gruppe B

Ra

tte

n

Regeneration


Transplantaten


Transplantate

Ergebnisse

51

4.4.1.3. Dosis

Eine statistische Tendenz ergab der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und

der Gruppe D, in der den Ratten je eine Dosis von 13,34µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3

post OP in die Oberschenkelinnenseite injiziert wurde (Abb 26.). Der p-Wert lag bei 0,0915.

Der Vergleich zwischen den Gruppen „Kontrollgruppe“ (Gruppe E) und der „Gruppe B“

wurde bereits in Kapitel 4.4.1.1. beschrieben und ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine


Auch der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen ergab mit dem p-Wert 1 keine



Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.

62 1

14

17 18

02468

101214161820

Gruppe E Gruppe B Gruppe D

Ra

tte

n

Regeneration


Transplantaten


Transplantate

(*)

(*) 0,05<p<0,10

Diskussion

52

5. Diskussion

In den Industriestaaten ist die häufigste Ursache für ein sekundäres Lymphödem die

Brustkrebstherapie (ALITALO et al. 2005). Die Entfernung regionärer Lymphknoten führt zu

einem gestörten Gleichgewicht des Wasserhaushaltes. Daraus resultiert eine pathologische

Akkumulation von Gewebswasser im Interstitium und damit ein Ungleichgewicht zwischen

lymphatischen Lasten und der lymphatischen Transportkapazität (ROCKSON 2010).

Die Therapie eines sekundären Lymphödems besteht derzeit hauptsächlich aus manueller

Entstauungstherapie, unterstützt durch das Tragen von Kompressionsstrümpfen, und ist

damit primär symptomorientiert.

Zu einer Ausheilung des sekundären Lymphödems führen diese Maßnahmen in der Regel

nicht. Die Patientinnen sind somit auf eine z.T. lebenslange Therapie und medizinische

Nachsorge angewiesen.

Die Bemühungen eine chirurgische Therapie zu erarbeiten, waren bisher leider wenig

erfolgreich, wie in der Arbeit von MEHRARA et al. (2011) dargestellt. Die avaskuläre

Transplantation von Lymphknotenfragmenten hat sich in der Vergangenheit jedoch bereits

beim Schaf, Schwein, der Maus und Ratte als vielversprechend erwiesen (PABST u.

ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, TAMMELA et al. 2007, TOBBIA et al. 2009,

HADAMITZKY et al. 2009, BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al. 2012 B). In diesem

Zusammenhang veröffentlichten SOMMER et al. (2012 B) kürzlich ihre Ergebnisse darüber,

dass die Injektion mit VEGF-C dabei zu besseren Regenerationsraten der

Lymphknotenfragmente führt. Nicht untersucht wurde allerdings, wie sich unterschiedliche

Applikations-Parameter des Wachstumsfaktors VEGF-C auf die Ergebnisse auswirken.

In der hier vorliegenden Dissertation wurde sich, auf Grund der guten Ergebnisse, an dem

Tier-Modell und der chirurgischen Technik von SOMMER et al. (2012 B) orientiert und der

Wachstumsfaktor VEGF-C wurde bezüglich der Applikations-Parameter „Zeitpunkt“,

„Lokalisation“ und „Dosis“ auf seine Wirkung auf die Regeneration und den Wiederanschluss

der Transplantate hin untersucht.

Diskussion

53

5.1. Die Modifikation der Methode

Die Technik, die SOMMER et al. (2012 B) bei ihren Untersuchungen verwendet haben,

verursachte jedoch, wie bereits im Kapitel 1. (Einleitung) beschrieben, einige Schwierigkeiten

bei der Entnahme der Transplantate. Durch die Nähe der Transplantate zum Knoten des

Nahtmaterials, mit dem die Transplantate im subkutanen Fettgewebe fixiert wurden, war

eine Entfernung dieser vom Nahtmaterial in den meisten Fällen nur mit einem

Substanzverlust möglich.

Eine Änderung der Nahttechnik, wie in dem Kapitel 3.7.1. beschrieben, führte zu einer

substanzverlustfreien Entfernung der Transplantate vom Nahtmaterial bei allen Tieren.

Durch diese Technik ist außerdem eine zusätzliche Verminderung mechanischer Reize im

Bereich der Transplantate durch das starre, nicht resorbierbare Nahtmaterial auf Grund der

Barriere aus Fettgewebe, die hierbei entsteht, anzunehmen. Dies bietet insbesondere bei

Versuchen Vorteile, in denen die Masse der Transplantate untersucht werden soll.

Außerdem konnten die Vorteile der Migrationsverhinderung sowie einer leichten Auffindung

der Transplantate durch das nicht resorbierte Nahtmaterial mit der in dieser Arbeit

vorgenommenen chirurgischen Modifikation beibehalten werden. In nur 2% der Fälle waren

die Transplantate in der Umgebung des Transplantationsgebietes und nicht am Faden zu

finden.

Auch die Methode eines „free grafts“, also einer Transplantation ohne Fixierung der

Transplantate, ist gegeben und in der Arbeit von TOBBIA et al. (2009) beschrieben. Damit

wären Substanzverluste und mechanische Reizungen durch einen Knoten verhindert.

Möglicherweise wäre hierbei jedoch problematisch, dass die Transplantate durch ihre freie

Beweglichkeit im subkutanen Fettgewebe zur Migration neigen könnten. Außerdem ginge

bei dieser Methode der Vorteil einer leichten Auffindung der Transplantate verloren, welche

durch die Markierung des nicht resorbierten Nahtmaterials gegeben ist.

Weitere Details über die Fixierungs-Methoden sind in den zuvor genannten Arbeiten, die

sich ebenfalls mit der avaskulären Transplantation von Lymphknotenfragmenten

beschäftigen, leider nicht angegeben (BLUM et al. 2010, TAMMELA et al. 2007, TOBBIA et al.

2009, HADAMITZKY et al. 2009, BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al. 2012 B).

Nach Abwägung der Methoden von SOMMER et al. (2012 B), TOBBIA et al. (2009) und der in

dieser Dissertation modifizierten Technik nach SOMMER et al. (2012 B), wird deutlich, dass

nur mit der modifizierten Variante alle wichtigen Vorteile bei einer Entnahme der

Transplantate erhalten bleiben.

Die Modifikation behält zunächst einmal alle Vorteile durch das bereits von SOMMER et al.

(2012 B) verwendete nicht resorbierbare Nahtmaterial bei. Damit ist die langanhaltende

Diskussion

54

Fixierung der Lymphknotenfragmente im Transplantationsgebiet gesichert, eine Migration

also verhindert und eine Auffindung der Transplantate bei deren Entnahme leicht möglich.

Außerdem bietet die Modifikation aber auch noch zwei entscheidende Verbesserungen.

Zum einen wird bei dieser Technik das Nahtmaterial so verknotet, dass zwischen Knoten und

Transplantate eine Gewebsbrücke entsteht. Damit ist einer mechanischen Reizung der

Transplantate durch das nicht resorbierbare Nahtmaterial vorgebeugt. Zum anderen führt

diese Methode dazu, dass durch die Lage des Knotens Verwachsungen der Transplantate mit

dem Knoten ausgeschlossen sind und sie sich bei ihrer Entnahme leicht und

substanzverlustfrei vom Nahtmaterial entfernen lassen.

Unter diesen Aspekten hat sich eine Verwendung der in dieser Dissertation beschriebenen

modifizierten Methode bewährt.

In zukünftigen Tierversuchen sollte dennoch geklärt werden, ob eine Fixierung der

Lymphknotenfragmente mit Fibrinkleber möglich ist, denn die Verwendung von nicht

resorbierbarem Nahtmaterials wäre in der Klinik nicht sinnvoll und ein Wiederauffinden

wäre zudem nicht notwendig.

Diskussion

55

5.2. Die Parameter: Zeitpunkt, Lokalisation, Dosis

Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation haben zum einen gezeigt, dass eine avaskuläre

Transplantation von autologen Lymphknotenfragmenten verbessert werden kann.

Zum anderen haben sie auch bestätigt, dass sich VEGF-C, wie bereits von TAMMELA et al.

(2007) und SOMMER et al. (2012 B) beschrieben, dabei als förderlich erweist.

Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf den Untersuchungen der Applikations-Parameter des

VEGF-C, da in keiner der beschrieben Arbeiten diese bisher eingehend untersucht wurden

und Daten zu Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation unzureichend, oder nicht vorhanden waren

(TAMMELA et al. 2007 u. SOMMER et al. 2012 B). So beschreiben z.B. TAMMELA et al.

(2007), dass die Mäuse mit VEGF-C behandelt wurden. Der Versuchsansatz ist jedoch anders

als der, der der z.B. der SOMMER et al. (2008 B) zugrunde liegt. VEGF-C wird bei TAMMELA

et al. (2007) durch eine adenovirale Genexpression endogen in den Mäusen produziert.

Damit kommt es zu einer kontinuierlichen Abgabe von VEGF-C und die Dosierung kann somit

nicht bestimmt werden. Der Einsatz dieser Technik würde beim Menschen unter anderem

ethische Probleme auslösen.

In der Arbeit von SOMMER et al. (2012 B) wird VEGF-C intrakutan injiziert. Zwar sind hier

Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation beschrieben, die Einflüsse bei einer Veränderung der

Parameter wurden jedoch nicht näher untersucht.

In der hier vorliegenden Dissertation wurden deutliche Einflüsse dieser Applikations-

Parameter auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate gezeigt. Diese

sollen im Folgenden diskutiert werden.

5.2.1. Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem

Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystems wird durch VEGF-C in

besonderem Maße verbessert. Dabei hat sich VEGF-C auf alle drei der untersuchten

Parameter als förderlich heraus gestellt.

Diskussion

56

5.2.1.1. Zeitpunkt

Betrachtet man den Vergleich zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe B, die VEGF-C zu

einem frühen Zeitpunkt gespritzt bekam, so fördert diese frühe Applikation einen

Wiederanschluss signifikant

Ein späterer Zeitpunkt weist dagegen im Vergleich zu der Kontrollgruppe diesen Erfolg nicht

auf. Auch ein Vergleich der beiden Versuchsgruppen zueinander führte statistisch zu keinem

eindeutigen Unterschied zu Gunsten einer der beiden Gruppen.

Auf Grund der statistischen Einzelwerte ist aber festzuhalten, dass eine frühe Injektion des

Wachstumsfaktors VEGF-C mit den Tagen 1, 2 und 3 post OP nach einer

Lymphknotentransplantation zu besseren Wiederanschlussraten der

Lymphknotenfragmente mit dem Lymphsystem führt.

Es ist nachgewiesen, dass die Neovaskularisation nach einer Lymphknotenentfernung

innerhalb der ersten 7 Tage nach einer Lymphknotendissektion beginnt und nach 4 Wochen

abgeschlossen ist (Übersicht BUETTNER u. BODE 2012). Die vorliegenden Ergebnisse

bestätigen diese Aussage und zeigen, dass zu einem späteren Zeitpunkt eine Neubildung der

Gefäße immer unwahrscheinlicher wird.


Die Ergebnisse bei der statistischen Untersuchung zum Parameter Lokalisation zeigten, wie

bereits im Kapitel 3. (Material und Methoden) beschrieben, eindrucksvoll, dass sich die Wahl

der Lokalisation ebenfalls auf die Wiederanschlussrate auswirkt.

Zwar fördert eine intrakutane Applikation von VEGF-C in die Bauchwand im Vergleich zu der

Kontrollgruppe den Wiederanschluss statistisch tendenziell, eine Applikation in den

medialen Oberschenkel, fördert diesen jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe statistisch

signifikant.

Damit wird deutlich, dass sich zunächst einmal generell VEGF-C positiv auf den

Wiederanschluss auswirkt, denn bei beiden Versuchsgruppen ist ein statistisch belegbares

Ergebnis der Förderung von VEGF-C nachzuweisen.

Ein Unterschied zugunsten der einen oder anderen Versuchsgruppe ist, wie auch zwischen

den Versuchsgruppen der Zeitpunkt-Untersuchung, statistisch nicht auszumachen.

Dies mag in diesem Fall wie auch beim Zeitpunkt daran liegen, dass die Unterschiede

bezogen auf die Zahl der Tiere, die wiederangeschlossene Transplantate aufwiesen, zu

gering waren. Bei der Untersuchung der Lokalisation, wiesen in der Gruppe B

10 von 19 Tieren einen Wiederanschluss auf, in der Gruppe A 5 von 10 Tieren. Der

prozentuale Unterschied zwischen den beiden Gruppen beträgt damit nur 3%. Dass dies

Diskussion

57

statistisch nicht zu einem Ergebnis zu Gunsten der einen oder anderen Versuchsgruppe

führen kann, wird bei Betrachtung dieser Zahlen deutlich.

Aufgrund der besseren statistischen Einzelergebnisse ist aber dennoch eine Applikation

intrakutan in die Oberschenkelinnenseite empfehlenswert.

Eine mögliche Erklärung, warum sich eine Applikation in den Oberschenkel etwas besser auf

den Wiederanschluss der Transplantate auswirkt, könnte in der Anatomie zu finden sein.

Dabei sind zwei Aspekte bei der Überlegung wichtig:

1. Führt man eine Entfernung der Lymphknoten durch, so werden die afferenten und

efferenten Kollektoren durchtrennt.

2. Wenn man eine Substanz intrakutan appliziert, wird diese über das superfizielle

Lymphsystem aufgenommen und darüber in die regionären Lymphknoten transportiert.

Spritzt man nun nach einer Transplantation den Wachstumsfaktor VEGF-C in die Bauchwand

nahe dem Transplantationsgebiet, so wird diese Substanz auch vom superfiziellen System

aufgenommen, jedoch findet es in diesem Bereich keinen direkten Anschluss zu den

afferenten Kollektoren, die sich im weiteren Verlauf der Ruhephase mit den Transplantaten

verbinden sollen. Zwar gelangt der Wachstumsfaktor auch in das Gebiet und entfaltet dort

seine Wirkung, jedoch wird er nicht gezielt an den Ort geleitet, an dem er für die

Lymphangiogenese benötigt wird.

Spritzt man dagegen in den ipsilateralen Oberschenkel, befindet man sich anatomisch in

einem Bereich, in dem die afferenten Kollektoren noch teilweise intakt sind. Das VEGF-C

kann somit von ihnen aufgenommen werden und ein erneutes Gefäßwachstum ist gezielter

möglich.

5.2.1.3. Dosis

Besonders deutliche Unterschiede bei der Wiederanschlussrate finden sich bei der

Untersuchung des Parameters „Dosis“.

Wie bereits beschrieben, fördert eine geringe Dosis den Wiederanschluss an das

Lymphgefäßsystem signifikant. Wird jedoch eine Verdopplung der Dosis auf 13,34 µg

vorgenommen und diese bei gleichen Zeitpunkts- und Lokalisationsparametern injiziert, wird

der Wiederanschluss statistisch höchst signifikant gefördert.

Prozentual liegt der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen bei 38%. Damit ist

auch der Unterschied der beiden Gruppen untereinander deutlich. Statistisch konnte zudem

ein signifikanter Unterschied zu Gunsten der Gruppe mit der hohen Dosis nachgewiesen

werden.

Diskussion

58

Eine höhere Dosis von 13,34 µg ist somit also empfehlenswert.

Mit diesen statistischen Ergebnissen ist klar gezeigt worden, dass die Parameter einen

erheblichen Einfluss auf den Wiederanschluss der autologen Lymphknotenfragmente nach

avaskulärer Transplantation haben.

5.2.2. Die Regeneration der Transplantate

Die Regeneration der Transplantate wurde durch den vaskulär endothelialen

Wachstumsfaktor VEGF-C grundsätzlich weniger stark beeinflusst als ihr Wiederanschluss.

Ein Einfluss der Parameter auf die Regeneration konnte aber dennoch entdeckt werden.

5.2.2.1. Zeitpunkt

Betrachtet man den frühen Zeitpunkt der VEGF-C Applikation an den Tagen 1, 2 und 3 post

OP, scheint dieser etwas besser (p=0,2351) im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu sein, da

der p-Wert für den Vergleich zwischen der Gruppe mit dem späteren Zeitpunkt an den

Tagen 14, 15 und 16 post OP mit der Kontrollgruppe bereits bei 0,4506 liegt. Statistisch ist

jedoch keiner der beiden Applikationszeitpunkte für die Regeneration relevant. Auch der

versuchsgruppeninterne Vergleich weist keine statistischen Unterschiede auf.

Die Lokalisation ist somit für die Regeneration der Transplantate zwar nicht völlig außer Acht

zu lassen; die Statistik bietet aber bei den verwendeten Tierzahlen keinen Beweis für ihre

Wichtigkeit.


Ebenso wie bei dem Zeitpunkt, scheint auch bei der Lokalisation der p-Wert für die

Regeneration nicht ganz unbedeutend zu sein, denn die Lokalisation „Bauchwand“ weist

einen Wert von 0,6821 auf, während die Lokalisation „Oberschenkelinnenseite“ mit einem

Wert von 0,2351 einen augenscheinlich deutlich besseren p-Wert zeigt. Allerdings sind auch

diese Werte statistisch nicht relevant. Damit ist auch der Vergleich zwischen den beiden

Versuchsgruppen von keiner statistischen Relevanz.

Die p-Werte, die bei dem Vergleich der Versuchsgruppen mit der Kontrollgruppe entstanden

sind, lassen ebenso wie die des untersuchten Parameters „Zeitpunkt“ lediglich die

Diskussion

59

Vermutung zu, dass eine Applikation intrakutan in die Oberschenkelinnenseite, genau wie

beim Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem, vorteilhaft ist.

5.2.2.3. Dosis

Statistisch aussagekräftige Ergebnisse erbrachte bei der Untersuchung der Regeneration nur

der Parameter „Dosis“. Die Ergebnisse der Gruppenvergleiche zeigen, dass eine Veränderung

der Dosis auch auf die Regeneration einen positiven Einfluss hat.

Eine hohe Dosis fördert die Regeneration der transplantierten Lymphknotenfragmente

statistisch tendenziell, eine geringe Dosis hat mit einem p-Wert von 0,2351 dagegen keine

statistische Relevanz. Auch wenn der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen

statistisch nicht relevant zu Gunsten der höheren Dosis ausfällt, ist trotzdem zu vermerken,

dass auf Grund der Ergebnisse des Vergleichs mit der Kontrollgruppe, die Applikation einer

höheren Dosis erstrebenswert ist.

5.2.3. Résumé: Einfluss der Parameter auf die Transplantate

Übergreifend lässt sich also festhalten, dass vor allem die Dosis bezüglich der Regeneration

der Lymphknotenfragmente als auch des Transplantat-Wiederanschlusses einen Einfluss hat.

Insbesondere eine hohe Dosis fördert diese. Zeitpunkt und Lokalisation wirken sich

hauptsächlich auf den Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphsystem aus. Ein

früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie eine intrakutane Injektion des

Wachstumsfaktors VEGF-C in die mediale Seite des Oberschenkels wirken sich fördernd aus.

Diskussion

60

5.3. Aussichten und Diskussion von Material und Methoden

Um genauere Daten über die tatsächlich effektivste Dosis zu erhalten, müssten diesbezüglich

Untersuchungen vorgenommen werden. Hierbei sollte der Fokus nicht nur auf den Effekt der

VEGF-C Dosen auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate liegen,

sondern zusätzlich auf dem Einfluss hoher Dosen VEGF-C auf die Permeabilität der

Blutgefäße.

Es ist bekannt, dass eine zu hohe Dosis VEGF-C zu einer erhöhten Permeabilität und einem

gesteigerten Wachstum der Blutgefäße führt (LOHELA et al. 2003). Es scheint also ein

schmaler Grat zwischen den positiven Effekten einer hohen Dosis VEGF-C auf die

Regeneration der Lymphgefäße und den negativen Effekten dieser auf die Blutgefäße zu

liegen. Bei den in dieser Dissertation untersuchten Tieren konnten bei einer Dosis von

13,34 µg VEGF-C allerdings makroskopisch keine Auffälligkeiten der Blutgefäße festgestellt

werden. Auch Nebenwirkungen unter der Behandlung tauchten nicht auf. Um jedoch ein

Behandlungskonzept für die Klinik zu erarbeiten, müssen eine sichere Anwendung von

VEGF-C möglich und eventuelle Nebenwirkungen bekannt sein. Diesbezüglich ist es

unerlässlich VEGF-C weiteren Studien zu unterziehen.

Sollte sich VEGF-C dabei als geeignet erweisen, ist der Einsatz in der Klinik denkbar, auch

wenn eine hohe Dosis VEGF-C dabei zum gegenwärtigen Zeitpunkt einen enormen

Kostenfaktor darstellt.

Momentan beträgt der Preis für 100µg VEGF-C in der Wissenschaft 775€. Damit können bei

einer Dosis von 13,34 µg VEGF-C pro Ratte (200g) gerade einmal 2,5 Ratten diese Therapie

über 3 Tage erfahren. Hochgerechnet auf einen Menschen (durchschnittlich 70kg) fallen die

Zahlen selbstverständlich dementsprechend deutlich höher aus.

Wenn man sich jedoch die Kosten anschaut, die bei einem sekundären Lymphödem

entstehen, beinhalten diese, wie bereits QUIRION (2010) in einem Review dargestellt, z.B.

die Beträge für die ambulante Pflege, die Physiotherapie, die medizinische Nachsorge und

den Bedarf an Versorgungsgütern (Bsp. Stützstrümpfe und Bandagen). Eine Übersicht über

die entstehenden Kosten zur Behandlung eines durch die Brustkrebstherapie entstandenen

Lymphödems wurde z.B. von SHIH et al. (2009) veröffentlicht. In der Arbeit wird ein Betrag

von 14 877 $ bis 23 167 $ innerhalb von 2 Jahren bei Patientinnen mit einem

brustkrebsassoziierten Lymphödem angegeben (SHIH et al. 2009).

Betrachtet man nun also die Beiträge, die zur Therapie und Nachsorge des sekundären

Lymphödems entstehen, relativiert sich die Verhältnismäßigkeit der Aufwendungen.

Zudem ist anzunehmen, dass bei vermehrtem Einsatz von VEGF-C der Preis durch die

größeren Herstellungsmengen und die Konkurrenz unter den Herstellern sinken wird.

Diskussion

61

VEGF-C ist außerdem besser kontrolliert herzustellen als andere Mittel wie beispielsweise

das PRP.

Um PRP zu produzieren, bedarf es einer aufwendigen Aufreinigung unter sterilen, Good

Laboratory Praxis (GLP) - Bedingungen. Damit können nur spezielle medizinische Stätten, die

geeignete Einrichtungen besitzen, PRP herstellen.

Bei der Herstellung von VEGF-C entfällt dieser Aufwand durch die einzelne Klinik. Der

Wachstumsfaktor kann industriell hergestellt und vertrieben werden, so dass auch Kliniken

und Institute, die weniger aufwendig eingerichtet sind, das Mittel beziehen können.

Das in dieser Dissertation vorgestellte Modell beschäftigt sich mit einer Transplantation, die

am gesunden Tier durchgeführt wurde.

Klinisch wäre es interessant zu untersuchen, ob die guten Regenerations- und

Wiederanschluss-Raten der Transplantate auch in einem Tiermodell mit einem bereits

ausgebildeten, chronischen Lymphödem bestehen blieben, denn viele Patientinnen leiden

bereits an einem Armlymphödem und hoffen auf eine chirurgische Therapie.

Nur wenn die Lymphknotenfragmente auch in ödematösem Gewebe ihre Funktion

aufnehmen, wäre diesen Frauen chirurgisch zu helfen.

Dass ein gesundes Gewebe nicht mit dem eines bereits bestehenden Lymphödems zu

vergleichen ist, ist in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten belegt.

So beschreiben z.B. MORGAN et al. (2005), dass sich in ödematösem Gewebe, wenn es

unbehandelt bleibt, eine Fibrose entwickelt. Diese Fibrose besteht aus zwar verdicktem,

aber dennoch fragilem Gewebe (MORGAN et al. 2005).

Fibrotisches Gewebe birgt eine gravierende Problematik für das Vorhaben einer avaskulären

Transplantation: es hemmt die Lymphgefäßregeneration (AVRAHAM et al. 2009). Diese

äußert sich z.B. in der Entwicklung einer gestörten Proliferation der Lymphendothelzellen

und einer abnormalen lymphatischen Mikroarchitektur (AVRAHAM et al. 2009).

Es herrschen damit deutlich andere gewebsassoziierte Bedingungen bei einer Patientin mit

einem chronischen Lymphöden im Vergleich z.B. zu einer Patientin direkt nach einer

Axilladissektion vor.

Ein weiterer Faktor, der die erfolgreiche Transplantation und Funktionswiederaufnahme der

Lymphknotenfragmente in einem chronischen Lymphödem erschweren könnte, wurde

kürzlich von COUTO et al. (2011) beschrieben. Die Arbeit beschäftigt sich mit der

Problematik der Neovaskularisation in ödematösem Gewebe (COUTO et al. 2011).

Die Untersuchungen von COUTO et al. (2011) ergaben, dass eine Neovaskularisation in der

Pathogenese des Lymphödems unwahrscheinlich ist.

Diskussion

62

Dass die in der hier vorliegenden Dissertation beschriebenen Ergebnisse Wiederanschlüsse

der Transplantate und damit Gefäßbildungen, wenn auch in unterschiedlich ausgeprägtem

Maße, bei allen untersuchten Gruppen zeigen, mag daran liegen, dass die Transplantation an

gesunden Tieren stattfand. Ob VEGF-C eine Neovaskularisation auch in ödematösem

Gewebe zu stimulieren vermag, bleibt zu erforschen.

Die hier vorgestellte Methode der avaskulären, autologen Transplantation von

Lymphgefäßfragmenten würde sich zunächst einmal also hauptsächlich zur Prävention

eignen.

In der Klinik entwickeln ältere Frauen häufiger ein Lymphödem als junge. Dies wurde bereits

in den 80er Jahren von PEZNER et al. (1986) beschrieben. Die Rate für Frauen über 60 Jahre

liegt in der genannten Veröffentlichung bei 25%, die Rate für Frauen unter 60 Jahre liegt bei

nur 7%.

Die Tiere, die für die hier vorliegende Dissertation verwendet wurden, waren alle etwa 200g

schwer und damit im Durchschnitt 8-12Wochen alt. Es handelte sich also um zwar adulte,

aber junge Ratten.

Die Problematik, die im Alter entsteht, liegt in der Umstrukturierung der Lymphknoten. Die

Lymphknoten unterliegen im Laufe der Jahre histologischen Veränderungen (DENZ 1947 u.

HADAMITZKY et al. 2010). Diese bestehen beispielsweise aus unklar abgegrenzten B- und T-

Zellbereichen, dem Ersetzen lymphatischer Strukturen durch Bindegewebe und einer

generellen Degeneration (HADAMITZKY et al. 2010).

Aus diesem Wissen heraus müssten Studien vorgenommen werden, die sich mit den

histologischen Veränderungen von Ratten-Lymphknoten befassen und diese Veränderungen

mit den Ergebnissen aus der Studie von HADAMITZKY et al. (2010) vergleichen. Ziel wäre es,

ein Modell zu schaffen, das die alterstypischen Gewebsstrukturen abbildet und damit

klinikähnliche Bedingungen nachstellt.

Doch nicht nur das Alter hat einen Einfluss auf die Entstehung des Lymphödems, auch die

Zeitspanne zwischen der Brustkrebsbehandlung und dem Auftreten des Ödems ist nicht zu

vernachlässigen.

NORMAN et al. (2009) beschreiben, dass 80% der Patientinnen innerhalb der ersten 2 Jahre

nach der Axilladissektion on ein Lymphödem entwickeln. Wobei sich die Anzeichen eines

sekundären Lymphödems offenbar erst nach einigen Monaten entwickeln. Der Verlauf

dieser Entwicklung müsste aber erst noch weiter erforscht und mit Studien belegt werden.

Diskussion

63

Damit ein Tier in dieser Dissertation als „regeneriert“ eingestuft wurde, mussten seine

Transplantate bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung eine physiologische

Lymphknotenstruktur aufweisen. Damit ist anzunehmen, dass die transplantierten

Lymphknotenfragmente ihre drainierende Funktion wieder erfüllen können. Fraglich bleibt

jedoch, ob diese ihre Funktion auch über einen langen Zeitraum aufrechterhalten.

Alle Tiere bekamen in dieser Arbeit eine Ruhephase von 4 Wochen. Interessant, auch unter

dem Gesichtspunkt, den NORMAN et al. (2009) nannten, wäre die Überprüfung ob die

Verhinderung eines Ödems auch noch nach 4 Wochen besteht.

Eine Ödementwicklung bei Ratten zu detektieren und das Volumen zu messen, ist allerdings

problematisch. Dieser Problematik haben sich SOMMER et al. (2012 A) angenommen. Am

Menschen kommen i.d.R. das Maßband, die Wasserverdrängungs-Messung oder das

Perometer zum Einsatz. Diese Methoden sind, wie in der Veröffentlichung von SOMMER et

al. (2012 A) beschrieben, an der Ratte kaum durchzuführen. Die Untersuchungsergebnisse

aus der Arbeit zeigen, dass das Magnetic-Resonance-Imaging (MRI) eine geeignete Methode

ist, um auch bei kleinen Nagern eine Volumenmessung durchzuführen.

Der Aspekt der längeren Ruhephase ist insbesondere auch in Hinblick auf die Vorversuchs-

Ergebnisse nicht zu vernachlässigen. Die Regenerationsraten waren nach 8 Wochen (57% der

Tiere mit potentiell regenerierten Transplantaten) weniger erfolgversprechend als nach

4 Wochen (70% der Tiere mit regenerierten Transplantaten). Dies mag allerdings bei der

geringen Anzahl an Ratten (Vorversuch: 7 Tiere, Kontrollgruppe: 20 Tiere) noch nicht

aussagekräftig sein, denn statistisch wären diese feinen Unterschiede nicht zu belegen.

Dennoch sollte eine Untersuchung, wie sich die Zeit auf die Entwicklung der Transplantate

auswirkt, nicht ausbleiben.

Eine Möglichkeit, auch über einen längeren Zeitraum und zum wiederholten Mal an

demselben Tier den Lymphgefäßanschluss der Transplantate zu überprüfen, wäre die

intradermale Applikation eines Fluoreszenzfarbstoffes in die Oberschenkelinnenseite.

Die hier gewählte Methode des Patent-Blau-Spritzens bot sich deshalb an, weil damit eine

Euthanasie der Tiere und eine Transplantatentnahme verbunden waren. Die Tiere wurden

gespritzt, der Farbstoff verteilte sich über das superfizielle Lymphgefäßsystem und nach

zervikaler Dislokation und der Freipräparation des Gewebes konnten die angefärbten

lymphatischen Strukturen verfolgt werden.

Der Fluoreszenzfarbstoff Indocyanin Green (ICG) könnte hingegen auch am lebenden Tier

und wiederholt appliziert werden. Er wird, genau wie das Patent Blau, vom superfiziellen

Lymphsystem aufgenommen und über die afferenten Kollektoren auch zum Lymphknoten

geleitet und über die efferenten von ihm weg geleitet.

Bereits am Menschen ist diese Technik unter Operationen erprobt (OGATA et al. 2007 u.

POLOM et al. 2011). ICG ist in der Medizin bereits vielfach im Einsatz, z.B. bei der

Diskussion

64

SLN-Biopsie und Komplikationen bei der Gabe von ICG sind sehr selten (0,17%); können

jedoch bei Patienten, die allergische Reaktionen auf Jod aufweisen, auftreten (OGATA et al.

2007). Sie äußern sich in der Regel in Übelkeit und Fieber (OGATA et al. 2007).

Sichtbargemacht, wird der Farbstoff durch die Verwendung einer speziellen Apparatur, die

als Photodynamic Eye (PDE) bezeichnet wird. Das PDE wird von der Firma Hamamatsu (Sitz

Japan) hergestellt und besteht aus einer CCD-Kamera, die als Detektor fungiert, speziellen

lichtemittierenden Dioden (LED) und einem Lichtfilter (OGATA et al. 2007).

Strukturen können mit ICG durch Weichteilgewebe bis zu 1cm Tiefe mit dem PDE sichtbar

gemacht werden (POLOM et al. 2011). Auch bei der Ratte wurde ICG bereits in Verbindung

mit einem Rattenschwanz-Ödem-Modell eingesetzt und damit das Schwanzvolumen durch

die Intensität der Fluoreszenz bestimmt (SERIZAWA et al. 2011).

Da die Verwendung der Indocyaninmethode und des PDE im o.g. Ratten-Modell erst nach

Abschluss der Versuche dieser Dissertation veröffentlicht wurden, konnten sie hier noch

keine Anwendung finden. Bei zukünftigen Versuchen sollte eine Untersuchung mittels

Indocyanin und PDE aber angestrebt werden.

Ein sekundäres Lymphödem kann als Folge der Behandlung unterschiedlichster Krebsarten,

wie dem Hautkrebs, Vulva-, Zervix- oder Peniskarzinomen und dem Brustkrebs entstehen.

Die Therapie von Brustkrebs hat sich in den letzten Jahren sehr gewandelt. Doch trotz der

Verwendung von immer gering-invasiveren Methoden gelingt es bisher nicht, das Auftreten

eines sekundären Lymphödems zu verhindern. Bis zu 30% der Frauen leiden unter dieser

Krankheit nach einer Brustkrebstherapie mit Entfernung der Achsellymphknoten (WILLIAMS

et al. 2005). Doch auch nach der weniger invasiven SLN-Biopsie ohne weitere Intervention

bilden noch bis zu 22% der Patientinnen ein sekundäres Lymphödem aus (GOLDBERG et al.

2011).

Der chirurgische Eingriff scheint damit nicht allein ursächlich für die Entstehung des

Lymphödems und tatsächlich führen neueste Forschungsergebnisse auch noch eine weitere

Ursache für die Entstehung des sekundären Lymphödems an: ein Gendeffekt.

FINEGOLD et al. (2012) veröffentlichten kürzlich, dass Mutationen des Gens „Connexin 47“

das Risiko für ein sekundäres Lymphödem nach einer Brustkrebstherapie erhöht. Außerdem

vermuten FINEGOLD et al. (2012), dass dieser Gendeffekt erst dann zu einem sekundären

Lymphödem führt, wenn sich lokal die Bedingungen durch eine Behandlung für das Gewebe

ändern, wie also unter einer Axilladissektion, als auch unter einer SLN-Biopsie.

Diese Erkenntnis könnte dazu genutzt werden, in Zukunft diejenigen Frauen zu bestimmen,

welche besonders für ein sekundäres Lymphödem prädisponiert sind und insbesondere

Ihnen mit einem präventiven chirurgischen Eingriff zu helfen.

Diskussion

65

5.4. Schlussfolgerung

In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine avaskuläre Transplantation autologer

Lymphknotenfragmente möglich und die Modifikation der Operationstechnik auf Grund der

dadurch geringeren Substanzverluste des Transplantats und der Verhinderung mechanischer

Reize sinnvoll ist.

Außerdem wurde bestätigt, dass VEGF-C sowohl die Regeneration als auch den

Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem fördert.

Ein früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie eine intrakutane Applikation von

VEGF-C in die mediale Seite des Oberschenkels fördern dabei statistisch erwiesen

insbesondere den Transplantat-Wiederanschluss. Ein positiver Einfluss auf die Regeneration

der Transplantate ist auf Grund guter p-Werte anzunehmen, diese waren für den Nachweis

einer statistischen Signifikanz jedoch nicht ausreichend.

Besonders deutlich waren die Ergebnisse bei der Untersuchung des Einflusses der Dosis auf

den Wiederanschluss und die Regeneration der Transplantate.

Eine Dosis von 13,34 µg VEGF-C fördert beide Untersuchungs-Kriterien erheblich.

Durch die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse zu der Modifikation der

Operationstechnik unter einer avaskulären Transplantation wurde ein Tier-Modell für die

Untersuchung der transplantierten Lymphknotenfragmente geschaffen, das neben der

Verhinderung der Migration eine Unversehrtheit der Transplantate in Zukunft gewährleistet.

Die vorliegenden Ergebnisse der wissenschaftlichen Untersuchungen bestätigten außerdem

zum einen, dass der chirurgische Therapieansatz einer avaskulären Transplantation

autologer Lymphknotenfragment eines sekundären Lymphödems möglich ist.

Zum anderen zeigen sie eindrucksvoll, dass VEGF-C insbesondere den Wiederanschluss der

Regenerate, in einer hohen Dosis aber auch die Regeneration fördert und dass die

Applikation-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ einen vielfältigen Einfluss auf

den Wiederanschluss und die Regeneration haben. Durch diese Erkenntnisse rückt die

Möglichkeit eine avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente,

insbesondere in Zusammenhang mit einer Prävention des sekundären Lymphödems, auch in

klinischen Studien zu testen näher.

Eine präventive chirurgische Maßnahme zur Verhinderung eines sekundären Lymphödems

wäre für die Patientinnen unter Umständen die einzige Möglichkeit nicht lebenslang auf eine

symptomorientierte Therapie angewiesen zu sein.

Zusammenfassung

66

6. Zusammenfassung

Lia Schindewolffs:

Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des

sekundären Lymphödems

Einfluss der VEGF-C-Applikationsparameter auf die Regeneration und den

Wiederanschluss der Transplantate

Ein effektiver Transport von Körperflüssigkeiten ist nur durch ein funktionstüchtiges

Lymphsystem zu gewährleisten. Nach einer Entfernung der Lymphknoten in der Axilla im

Rahmen einer Brustkrebstherapie kann das Gleichgewicht aus anfallender Lymphflüssigkeit

und dem Abtransport dieser gestört sein. Dies resultiert in einem sekundären Lymphödem

bei etwa 30% der Patientinnen. Die Therapie für das sekundäre Lymphödem ist bisher rein

symptomorientiert.

Ein chirurgischer Therapieansatz ist die avaskuläre Transplantation autologer

Lymphknotenfragmente. Diese wurde in der Vergangenheit zur Prävention eines sekundären

Lymphödems an der Ratte erforscht. Dabei konnte ein positiver Effekt von VEGF-C

festgestellt werden.

Die VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ waren bislang

jedoch nicht untersucht worden.

Das Ziel der Arbeit war es, die Grundlagen und Methoden dieses Ratten-Modells

aufzugreifen und zu verbessern, indem die Applikations-Parameter auf ihre Einflüsse auf die

Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate untersucht wurden.

Außerdem wurden die Effekte einer längeren Ruhephase von 8 Wochen auf die

Regeneration der Transplantate wurden in Form einer Vorversuchsgruppe erforscht.

Die Operationstechnik des Ratten-Modells verursachte allerdings Probleme bei der

Entnahme der Transplantate. In den meisten Fällen verwuchsen diese während der

Ruhephase mit dem Knoten des Nahtmaterials, so dass ihre Entfernung nur unter

Substanzverlusten möglich wurde.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand somit darin, die chirurgische Technik dahingehend zu

modifizieren, dass eine substanzverlustfreie Entnahme der Transplantate durchgeführt

werden kann.

Zusammenfassung

67

Sechsundneunzig adulten, gesunden, weiblichen Lewis Ratten (durchschnittliches

Gewicht: 200g) wurden alle poplitealen und inguinalen Lymphknoten der rechten

Körperhälfte entfernt. Drei der inguinalen Lymphknoten wurden fragmentiert und subkutan

zurück in die rechte Leiste transplantiert. Dabei wurde die Operationstechnik dahingehend

modifiziert, dass eine Verwachsung der Transplantate mit dem Knoten verhindert wird.

Gruppe A (n=10) erhielt eine intradermale Injektion von 6,67 µg VEGF-C pro Ratte an den

Tagen 1, 2 und 3 post OP in Bauchwand nahe des Transplantationsgebietes.

Die Tiere in Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C zum gleichen Zeitpunkt wie

die Gruppe A, allerdings erfolgte die Injektion intrakutan in die mediale Seite des rechten

Oberschenkels. In der Gruppe C (n=20) wurden die Ratten wie die in Gruppe A behandelt,

erhielten VEGF-C jedoch an den Tagen 14, 15 und 16 post OP. Auch in Gruppe D (n=20)

wurden die gleichen Parameter wie in der Gruppe A gewählt, allerdings wurde die Dosis auf

13,34 µg VEGF-C verdoppelt. Die Gruppe E (n=20) fungierte als Kontrollgruppe und erhielt

keine VEGF-C-Applikation. Die Tiere in der Vorversuchsgruppe (n=7) bekamen wie die in der

Kontrollgruppe auch kein VEGF-C.

Nach entweder 4 (Gruppe A-E) oder 8 (Vorversuchsgruppe) Wochen Ruhephase wurde die

Verbindung der Transplantate mit dem Lymphsystem und die Lymphdrainage-Fähigkeit der

Transplantate überprüft. Zu diesem Zweck wurde Patent Blau intrakutan in den ipsilateralen

Oberschenkel injiziert. Die Verteilung des Farbstoffes wurde anschließend überprüft und die

Tiere wurden in „Ratte mit Transplantat-Wiederanschluss“ und „Ratte ohne Transplantat-

Wiederanschluss“ eingestuft. Anschließend wurden die Transplantate entnommen und es

erfolgte eine HE-Färbung (Vorversuchsgruppe, Gruppe A-E) und eine immunhistochemische

Färbung (Gruppe A-E), um die Regenerate auf ihre physiologische Verteilung von

B- und T-Lymphozyten, HEVs und Lymphendothelzellen zu überprüfen.

Die Tiere wurden nach der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung ihrer Transplantate in

„Ratte mit regenerierten Transplantaten“ oder „Ratte ohne regenerierte Transplantate“

eingestuft.

Vorversuch: Nach einer achtwöchigen Ruhephase waren bei 4 von 7 Tieren (57%) potentiell

regenerierte Transplantate festzustellen. In der Kontrollgruppe, in der die Tiere 4 Wochen

Ruhephase hatten, waren nach der Immunhistochemie bei 14 von 20 Tieren (70%)

regenerierte Transplantate vorhanden.

Chirurgische Modifikation: Bei keiner der Ratten kam es zu Verwachsungen der

Transplantate mit dem Knoten des Nahtmaterials und bei nur 2 der Ratten (2%) waren die

Transplantate bei der Entnahme nicht mehr am Nahtmaterial, sondern in der nahen

Umgebung des Transplantationsgebietes aufzufinden.

Zusammenfassung

68

Transplantat-Wiederanschluss mit dem Lymphsystem: In der Gruppe A konnte bei 5 von 10

Tieren (50%) ein Wiederanschluss beobachtet werden. In der Gruppe B waren es 10 von 19

(53%) und in der Gruppe C 7 von 20 (35%) Tieren. Die Gruppe D wies 17 von 20 Tieren (85%)

mit einem Wiederanschluss an das Lymphsystem auf; die Gruppe E nur 3 von 20 Tieren

(15%).

Regeneration der Transplantate: In der Gruppe A konnten bei 8 von 10 Tieren (80%)

regenerierte Transplantate festgestellt werden; in der Gruppe B waren es 17 von 19 Tieren

(89%). Bei der Gruppe C wiesen 17 von 20 Tieren (85%) regenerierte Lymphknotenfragmente

auf und bei der Gruppe D waren es 18 von 19 Tieren (95%). In der Kontrollgruppe (Gruppe E)

konnten dagegen nur 14 von 20 Ratten (70%) mit regenerierten Transplantaten gefunden

werden.

Die hier vorliegende Dissertation hat bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation

autologer Lymphknotenfragmente möglich ist und sich eine verlängerte Ruhephase von

8 Wochen nicht in besseren Regenerations-Raten der Transplantate widerspiegelt.

Eine Modifikation der Operationstechnik hat sich als sinnvoll erwiesen und führt zu einer

leichten Entnahme der Transplantate ohne Substanzverlust.

Darüber hinaus wurde eindrucksvoll gezeigt, dass sich die VEGF-C-Applikations-Parameter

unterschiedlich auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate auswirken

und VEGF-C diese beiden Untersuchungs-Fokusse generell fördert.

Ein früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie die intradermale Injektion von

VEGF-C in die mediale Oberschenkelseite stimulieren den Wiederanschluss der

Transplantate an das Lymphgefäßsystem. Eine Förderung der Regeneration konnte in

diesem Zusammenhang statistisch jedoch nicht erwiesen werden.

Nur die Dosis wirkt sich sowohl auf den Wiederanschluss als auch auf die Regeneration der

Transplantate statistisch relevant aus. Eine Dosis von 13,34 µg fördert eine Regeneration

statistisch tendenziell und einen Wiederanschluss statistisch höchst signifikant.

Diese Dissertation bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation autologer

Lymphknotenfragmente eine mögliche Therapie für das sekundäre Lymphödem ist.

Insbesondere in Form einer präventiven chirurgischen Maßnahme könnte diese Methode in

Zukunft bedeutsam sein.

Summary

69

7. Summary

Lia Schindewolffs (2012)

The transplantation of autologous lymph node fragments as a possible secondary

lymphedema therapy

Influence of the VEGF-C application parameters on the regeneration of the transplants and

the reconnection with the lymphatic system

An effective transport of body fluids is only guaranteed by a functional lymphatic

system. Within the context of an axillary dissection during breast cancer treatment this

balance can be disturbed, resulting in a secondary lymphedema in about 30% of the

patients. The therapy of secondary lymphedema is only symptomatical so far.

As a possible surgical therapy, fragments of autologous lymph nodes had been transplanted

to prevent lymphedema in rats. VEGF-C showed a beneficial effect in this context.

The VEGF-C application pattern with regards to the parameters “time point”, “location” and

“dosage” remained unexplored.

The aim of this study was to verify these parameters and determine their effects on the

regeneration and reconnection of the transplants by using this rat model.

In addition, the effects of an extended recovery period (8 weeks) on the regeneration of the

transplants were also investigated.

During the studies the surgical technique of this rat model caused difficulties regarding the

transplant removal. The transplants got attached to the node of the suture, thus the

sampling was only manageable with a loss of transplant substance.

Therefore, the secondary aim consisted in altering the technique so that a removal without

any loss of the substance is possible.

Summary

70

Ninety-six adult, healthy female Lewis rats (approximately 200g) underwent surgery,

in which all right popliteal and inguinal lymph nodes were removed. Three inguinal lymph

nodes of each rat were fragmented and transplanted back into the subcutaneous fat tissue

of their right groin by using the modified surgical procedure in which an attachment of the

transplants to the node was avoided.

The rats in group A (10 rats) were injected with 6.67µg VEGF-C per rat intradermally into the

right abdominal wall close to the transplantation area on day 1, 2, 3 post OP.

All animals in group B (19 rats) were given 6.67µg VEGF-C per rat intradermally in the medial

side of the right thigh on day 1, 2, 3 post OP. In group C all rats (20) were injected with the

same dosage of VEGF-C and at the same location as group B, but on day 14, 15, 16 post OP.

The rats in group D (20 rats) were injected 13.34µg VEGF-C per rat on the same time points

and location as group B.

In group E (20 rats) there was no further intervention after surgery, likewise in the pilot

group (7 rats).

After 4 weeks (group A-E) or 8 weeks (pilot group) the lymphatic drainage and the

connection of lymphatic vessels with the transplants were tested. Therefore, Patent Blue

was injected intradermally into the medial side of the right thigh. The distribution of the dye

was examined and graded as “rat with transplant reconnection” or “rat without transplant

reconnection”. Afterwards the transplants were prepared for HE staining (pilot group, group

A-E) and immunohistochemistry (group A-E) to detect T-lymphocytes, B-lymphocytes, HEVs

and lymphatic endothelial cells.

The rats were graded as “rat with regenerated transplants” or “rat without regenerated

transplants” due to the cell distribution detected by fluorescent immunohistochemistry.

Pilot Study: After a recovery period of 8 weeks 4 out of 7 (57%) rats showed possibly

regenerated lymph nodes. In group E 14 out of 20 (70%) of the animals revealed regenerated

lymph nodes after a recovery period of 4 weeks.

Surgery modification: The removed transplants showed no attachment to the node of the

suture and in only 2 of the rats (2%) were the transplants found in the close surrounding of

the transplantation area; they did not remain fixed to the non-absorbable suture.

Transplant reconnection with the lymphatic system: In group A 5 out of 10 rats (50%)

showed a reconnection of the transplants with the lymphatic system. In group B 10 out of 19

rats (53%) and in group C 7 out of 20 rats (35%) had a reconnection of the transplants. In

group D there were 17 out of 20 rats (85%) with a detectable transplant reconnection. The

control group (group E) showed a reconnection in only 3 out of 20 rats (15%).

Summary

71

Transplant regeneration: In group A 8 out of 10 rats (80%) and in group B 17 out of 19 rats

(89%) showed regenerated lymph nodes. In group C there were 17 out of 20 rats (85%) with

a successful regeneration of the transplants and in group D there were 18 out of 19 rats

(95%). The control group (group E) showed 14 out of 20 rats (70%) with regenerated lymph

nodes.

This work shows that an avascular transplantation of autologous lymph node

fragments is possible and that an extended recovery period does not result in better

regeneration rates. A change in the surgical procedure leads to an easier sampling while

avoiding loss of substance.

Furthermore, VEGF-C enhances the regeneration of the transplants and the reconnection of

lymph node fragments with the lymphatic system.

An early time point on days 1, 2 and 3 post OP and the intradermal injection into the medial

side of the thigh especially improve the reconnection of the transplants with the lymphatic

system. The modifications in both of the parameters do not affect the regeneration of the

transplants statistically.

Only the dosage shows an effect on the transplant reconnection as well as the transplant

regeneration. A dosage of 13.34 µg VEGF-C revealed a statistical tendency to improve

regeneration; it also enhances the reconnection extremely significantly.

This study confirms that the avascular transplantation of autologous lymph node

fragments is a possible therapy for secondary lymphedema, especially with respect to the

prevention after breast cancer treatment.

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Anhang

80

9. Anhang

9.1. Verzeichnis verwendeter Abkürzungen

AG Aktiengesellschaft

AK Antikörper

AQP-1 Aquaporin – 1

C Celsius

cm Zentimeter

DC Dendritic Cell, Dendritische Zellen

FDC Follicular Dendritic Cells

g Gramm

GLP Good Laboratory Praxis

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

HE Hämatoxylin-Eosin

HEV Hochendotheliale Venule

ICG Indocyanin Green

IDC Interdigitierende dendritische Zellen

IHC Immunhistochemie

kg Kilogramm

Anhang

81

LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und

Lebensmittelsicherheit

LED Lichtemittierende Dioden

Lnn. Lymphonodi

LYVE-1 Lymphatic Vessel Hyaluronan Receptor – 1

mm Millimeter

mg Milligramm

µ Mikro

MRI Magnet-Resonance-Imaging

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid

PBS Phosphate Buffered Saline

PDE Photodynamic Eye

Prox-1 Prospero-Related Homeobox Transcprition Factor – 1

SLN Sentinel Lymph Node, Wächterlymphknoten

STS Stewart-Treves-Syndrom

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGF-C Vascular Endothelial Growth Factor – C

VEGFR-3 Vascular Endtohelial Growth Factor Receptor – 3

Anhang

82

9.2. Verzeichnis verwendeter Abbildungen

Abbildung 1.: „Schema der Kompartimentierung des Lymphknotens“ PABST (2008):

Die Abbildung stellt die Aufteilung in Cortex, Paracortex und Medulla,

den Blut- und Lymphfluss, sowie die verschiedenen Zellen des

Lymphknotens dar.

Abbildung 2.: Übersicht über die Versuchsgruppen.

Abbildung 3.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters

„Zeitpunkt“ miteinander verglichen wurden.


„Lokalisation“ miteinander verglichen wurden.


„Dosis“ miteinander verglichen wurden.

Abbildung 6.: Transplantationsvorgang: Aufsuchen des subkutanen Fettgewebes in

der Leiste (a), Durchstechen des Fettposters mit nicht resorbierbarem

Nahtmaterial (b), Auffädeln der Lymphknotenfragmente (c), erneutes

Durchstechen des Fettpolsters (d), Verknoten des Nahtmaterials (e)

und Verschließen der Wunde mit resorbierbarem Nahtmaterial (f).

Abbildung 7.: Position der Patentblau-Applikation in die mediale Seite des

Oberschenkels und Verteilung des Farbstoffes über das superfizielle

Lymphsystem.

Abbildung 8.: Darstellung eines Transplantats mit Wiederanschluss an das

Lymphgefäßsystem. Erkennbar sind zu- und ableitendes Lymphgefäß

(schwarzer Pfeil) sowie die Fixierung des Transplantats mit nicht

resorbierbarem Nahtmaterial (weißer Pfeil). Das Transplantat ist

eingebettet in Fettgewebe und noch nicht frei präpariert.

Abbildung 9.: Darstellung eines entnommenen und angefärbten Transplantats

Abbildung 10.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen

Gruppen.

Anhang

83

Abbildung 11.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen

Gruppen in Prozent.

Abbildung 12.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer

ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen

auf den Transplantat-Wiederanschluss.


ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“

bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.


ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf

den Transplantat-Wiederanschluss.

Abbildung 15.: a. HE-Färbung eines nekrotisierten Transplantats in der Vergrößerung:

5x; b. HE-Färbung eines potentiellen Regenerats in der Vergrößerung:

5x

Abbildung 16.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a.

Die Zellkernfärbung (DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC)

befinden sich im parakortikalen Bereich des Lymphknotens; c. die B-

Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2. Ak AF 564) sind randständig. d.

Zusammengefügte Darstellung der B- und T-Zellen (d). Vergrößerung

(a-d): 5x.

Abbildung 17.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment nach

Immunhistochemie. a. die Zellkernfärbung (DAPI); b. die T-

Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich zwar vorwiegend,

jedoch nicht deutlich abgegrenzt, im parakortikalen Bereich des

Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2.Ak AF 564) sind

zudem nicht randständig angeordnet, sondern diffus auch über den

kortikalen Bereich hinaus verteilt. d. zusammengefügte Darstellung der

B- und T-Zellen. Vergrößerung (a-d): 5x.

Abbildung 18.: Ein nicht regeneriertes Transplantat. a. Zellkernfärbung (DAPI); b. HEV-

Färbung (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) mittels Immunhistochemie.

Vergrößerung 5x (a,b).

Abbildung 19.: Regenerierte Lymphknotenfragmente. a. HEVs (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3)

in der Vergrößerung 10x; b. in der Vergrößerung 40x nach der

Immunhistochemie.

Anhang

84

Abbildung 20.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Zellkern-Färbung

(DAPI); b. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) mittels

Immunhistochemie in der Vergrößerung 5x (a,b).

Abbildung 21.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Lymphendothel-

Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) in der Vergrößerung 5x und b. in der

Vergrößerung 40x (b).

Abbildung 22.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen.

Abbildung 23.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen

in Prozent.


ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen

auf die Transplantat-Regeneration.


ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“

bezogen auf die Transplantat-Regeneration.


ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf

die Transplantat-Regeneration.

Anhang

85

9.3. Verzeichnis verwendeter Tabellen

Tabelle 1.: Liste der primären und sekundären Antikörper (AK) und ihrer Herkunft.

Tabelle 2.: Übersicht über die Signifikanzstufen

Tabelle 3.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der

Gruppe E mit der Gruppe B.


Gruppe E mit der Gruppe C.


Gruppe B mit der Gruppe C.


Gruppe E mit der Gruppe A.


Gruppe A mit der Gruppe B.


Gruppe E mit der Gruppe D.


Gruppe B mit der Gruppe D.


Gruppe E mit der Gruppe B.


Gruppe E mit der Gruppe C.


Gruppe B mit der Gruppe C.


Gruppe E mit der Gruppe A.

Anhang

86


Gruppe A mit der Gruppe B.


Gruppe E mit der Gruppe D.


Gruppe B mit der Gruppe D.

Anhang

87

9.4. Details zur Statistik

Ergebnisse aus dem Programm PrismGraph 5.02, tabellarisch:

9.4.1. Ergebnisse zum Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphsystem

Table Analyzed

Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E

(Kontrolle) gegen Gruppe B (6,67µg VEGF-C und

Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)

Fisher's exact test

P value 0,0187

P value summary *

One- or two-sided Two-sided

Statistically significant?

(alpha<0.05) Yes

Strength of association

Odds ratio 6,296

95% confidence interval 1.373 to 28.87

Data analyzed Col A Col B Total

Row 1 17 9 26

Row 2 3 10 13

Total 20 19 39

Tabelle 3.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der

Gruppe B.

Anhang

88

Table Analyzed


(Kontrolle) gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C und


Fisher's exact test

P value 0,2733

P value summary ns



(alpha<0.05) No


Odds ratio 3,051

95% confidence interval 0.6583 to

14.14


Row 1 17 13 30

Row 2 3 7 10

Total 20 20 40


Gruppe C.

Anhang

89

Table Analyzed

Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe B (6,67µg

VEGF-C und Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)

gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C und Tag 14,15,16

Oberschenkelinnenseite)

Fisher's exact test

P value 0,3406

P value summary ns



(alpha<0.05) No


Odds ratio 0,4846


1.755


Row 1 9 13 22

Row 2 10 7 17

Total 19 20 39

Tabelle 5.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe B mit der

Gruppe C.

Anhang

90

Table Analyzed Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E (Kontrolle) gegen

Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3 Bauchwand)

Fisher's exact test

P value 0,0778

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 5,667

95% confidence

interval

0.9898 to

32.44


Row 1 17 5 22

Row 2 3 5 8

Total 20 10 30


Gruppe A.

Anhang

91

Table Analyzed

Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe A

(6,67µg VEGF-C Tag 1,2,3 Bauchwand) gegen

Gruppe B (6,67µg VEGF-C Tag 1,2,3


Fisher's exact test

P value 1

P value summary ns



(alpha<0.05) No


Odds ratio 1,111


5.144


Row 1 5 9 14

Row 2 5 10 15

Total 10 19 29

Tabelle 7.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe A mit der

Gruppe B.

Anhang

92

Table Analyzed


(Kontrolle) gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und


Fisher's exact test

P value P<0.0001

P value summary ***



(alpha<0.05) Yes


Odds ratio 22,67


117.5


Row 1 17 4 21

Row 2 3 16 19

Total 20 20 40


Gruppe D.

Anhang

93

Table Analyzed

Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe B (6,67µg


gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und Tag 1,2,3


Fisher's exact test

P value 0,0407

P value summary *



(alpha<0.05) Yes


Odds ratio 5,1


23.38


Row 1 9 3 12

Row 2 10 17 27

Total 19 20 39


Gruppe D.

Anhang

94

9.4.2. Ergebnisse zur Regeneration der Transplantate

Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe B (6,67µg


Fisher's exact test

P value 0,2351

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 3,643

95% confidence

interval

0.6330 to

20.97


Row 1 6 2 8

Row 2 14 17 31

Total 20 19 39


Gruppe B.

Anhang

95

Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe C (6,67µg


Fisher's exact test

P value 0,4506

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 2,429

95% confidence

interval

0.5122 to

11.52


Row 1 6 3 9

Row 2 14 17 31

Total 20 20 40


Gruppe C.

Anhang

96

Table Analyzed

Regeneration: Gruppe B (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3

Oberschenkelinnenseite) gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C

und Tag 14,15,16 Oberschenkelinnenseite)

Fisher's exact test

P value 1

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 0,6667

95% confidence

interval

0.09854 to

4.510


Row 1 2 3 5

Row 2 17 17 34

Total 19 20 39


Gruppe C.

Anhang

97

Table Analyzed

Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen

Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3

Bauchwand)

Fisher's exact test

P value 0,6821

P value summary ns



(alpha<0.05) No


Odds ratio 1,714


10.59


Row 1 6 2 8

Row 2 14 8 22

Total 20 10 30


Gruppe A.

Anhang

98

Table Analyzed

Regeneration: Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3

Bauchwand) gegen Gruppe B (6,67 µg VEGF-C und Tag 1,2,3


Fisher's exact test

P value 0,592

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 2,125

95% confidence

interval

0.2518 to

17.94


Row 1 2 2 4

Row 2 8 17 25

Total 10 19 29

Tabelle 14.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe A mit der

Gruppe B.

Anhang

99

Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe D (13,34µg


Fisher's exact test

P value 0,0915

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 7,714

95% confidence

interval

0.8297 to

71.73


Row 1 6 1 7

Row 2 14 18 32

Total 20 19 39


Gruppe D.

Anhang

100

Table Analyzed

Regernation: Gruppe B (6,67 µg VEGF-C und Tag 1,2,3

Oberschenkel) gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und Tag 1,2,3


Fisher's exact test

P value 1

P value summary ns


Statistically

significant?

(alpha<0.05)

No

Strength of

association

Odds ratio 2,118

95% confidence

interval

0.1754 to

25.56


Row 1 2 1 3

Row 2 17 18 35

Total 19 19 38


Gruppe D.

Danksagungen

101

10. Danksagungen

Mein besonderer Dank geht an Herrn Prof. Reinhard Pabst für die Überlassung eines so

interessanten Themas und die tolle Unterstützung und Beratung bei meinen Fragen, Ideen

und Vorhaben. Ich habe mich an Ihrem Institut immer wohl und sehr gut betreut gefühlt.

In diesem Zusammenhang möchte ich auch Herrn Prof. Gerhard Breves für seine

Unterstützung, Beratung und die Übernahme der Betreuung an der TiHo danken.

Den Mitarbeitern der Biometrie der MHH, insbesondere Frau Annika Müller-Heine und Frau

Stefanie Ernst, möchte ich meinen Dank für ihre Beratung bei der Versuchsplanung und den

Gruppenkonstellationen aussprechen.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (PA 240/10-1) und der Gesellschaft der Freunde der

MHH möchte ich für die finanzielle Unterstützung danken.

Herzlichen Dank auch an Cornelia Höpfel für ihre technische Assistenz, die vielen

gemeinsamen Stunden im OP, ihren Einsatz am Kryostat und das Lehren der Färbetechniken.

Dr. Manuela Büttner danke ich für ihre kompetente Beratung am Fluoreszenz-Mikroskop

und ihre stete Hilfsbereitschaft. In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei

Dr. Catarina Hadamitzky bedanken; trotz ihrer zahlreichen Dienste hatte sie immer ein

offenes Ohr: „Ich habe Dienst, aber du kannst mit mir laufen.“

Sheila Fryk und Sabine Buhmann danke ich für ihre Hilfe bei Bestellungen, Dienstreise-

Fragen (Danke Sheila) und anderen bürokratischen Herausforderungen. Auch noch mal

Danke Sheila, dass du meine Summary durchgesehen hast.

Nicht zu vergessen sind selbstverständlich alle Mitarbeiter des Instituts für Funktionelle und

Angewandte Anatomie der MHH. Ich möchte mich bei euch allen bedanken, dass ihr mich so

herzlich aufgenommen habt.

Auch den Tierpflegern des Zentralen Tierlabors der MHH möchte ich an dieser Stelle einmal

meinen Dank aussprechen. Sie haben mich immer auf dem Laufenden gehalten und einen

tollen Job gemacht.

Danksagungen

102

Meine Freunde verdienen ein großes Dankeschön für die tollen gemeinsamen Stunden und

dafür, dass sie medizinische Fachtermini über sich ergehen lassen, ganz gleich ob sie aus

dem Bereich kommen, oder nicht. Meikie, dir einen besonderen Dank.

Mein größter Dank gilt meiner Familie und Christoph.

Die Unterstützung, die meine Eltern mir nicht nur während der Doktorarbeit entgegen

gebracht haben, ist einfach wunderbar. Dafür danke ich euch sehr. Papa, dir noch einmal

einen riesigen Dank für deine Korrekturen und beratenden Worte. Meinen Geschwistern

danke ich für ihren Witz, den tollen Familiensinn und die besten Familienfeiertage.

Vielen Dank Christoph, dass du immer für mich da bist, mich unterstützt, mit mir lachst und

mich zwischendurch auf andere Gedanken bringst, das ist mir eine große Hilfe und bedeutet

mir sehr viel.

die transplantation autologer lymphknotenfragmente als ... · wird dieses system gestört, kommt es...

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