588 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

D I E R O L L E DES ACETATS I N D E R B I O S Y N T H E S E

D E R T R O P A N A L K A L O I D E

j . K A C Z K O W S K I , H. R. SCHI~TTE UND K. M O T H E S

Institut [i~r Biochemie der Pflanzen in Halle der Deutschen Akademie der Wissenscha/ten zu Berlin

und Institut [~r Biochemie und Biophysik der Polnischen Akademie der WissenschaJten, Warschau

(E ingegangen a m 4- A u g u s t 196o)

S U M M A R Y

The role of acetate in the biosynthesis of tropane-alkaloids

[iJ4C~acetate and [2-14Clacetate, fed to excised roots of Datura metel, are incorporated into their tropane-alkaloids. Degradation experiments with one of the alkaloids, hyoscyamine, show, that these two compounds are especially incorporated into the carbon atoms 2, 3 and 4 and that the carbon atom 3 is only labelled if [IJ4C;acetate is fed, whereas [2-~4Clacetate is not incorporated into this position. With reference to these results the biosynthesis of tropane-alkaloids is discussed.

EINLEITUNG

Die Herkunft des Pyrrolidinringes im Tropanskelett aus Ornithin wurde schon lange diskutiertl, 2 und von LEETE, MARION UND SPENCER 3 in Versuchen mit radioaktiv markier tem Ornithin bewiesen.

7 H 2 H~C - - - C C H 2

6 Ii I~

N - C H a C H O H

i~ L4 H ~ C - - C C H 2

H

Trop in

Die Herkunft der flbrigen drei Kohlenstoflatome des Tropanskeletts dagegen, n~im- lick die Kohlenstoffatome 2, 3 und 4 ist bis ietzt unsicher. ROBINSON 1 hat ange- nommen, dass diese Atome aus fi-Ketos~iuren stammen, die mit einem eventuell aus Ornithin s tammenden Pyrrolin-Derivat kondensieren. SCH6PF 2 hat 1938 eine Reihe solcher Kondensationen unter zellm6glichen Bedingungen durchgeffihrt, bei denen er alkaloidiihnliche Verbindungen gewann. Aber erst CLARKE UND MANN 4 haben der- artige Kondensationen zwischen fl-Ketos~turen, besonders Acetoacetat und ali- phatiscken Diaminen erhalten. Am besten verlief die Kondensation des Acetoacetats mit Diaminobutan (Putrescin) und Diaminopentan (Cadaverin). Bei diesen Kon- densationen haben die Autoren Norhygrin bzw. Isopelletierin bekommen und

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DIE ROLLE DES ACETATS IN DER BIOSYNTHESE DER TROPANALKALOIDE 5 8 9

nehmen an, dass solche Kondensationsreaktionen auch bei der Biosynthese der Tropan- und Isopelletierinalkaloide vorkommen.

Um die eventuelle Herkunft der Kohlenstoffatome 2, 3 und 4 des Tropanskeletts aus Acetat bzw. Acetoacetat zu beweisen, haben wir die Einbaum6glichkeiten der II-~4C~ - und I2-J~C]Acetate in das Hyoscyamin untersucht. Durch chemischen Abbau des gewonnenen radioaktiven Hyoscyamins konnte die Verteilung der Radioaktivit~t im Alkaloidmolekfll best immt werden.

METHODIK

Die Untersuchungen wurden an einem Klon isolierter, unter aseptischen Be- dingungen kuJtivierter Wurzeln von Datura metel durchgeftihrt (FrAulein Dr. L. ENGEL- BRECHT danken wir ftir die Anzucht der sterilen Wurzelkulturen).

Die Samen von Datura metel wurden teilweise von ihren harten Schalen mecha- nisch befreit und 20 Min in I ~oigem Bromwasser sterilisiert. Von keimenden Samen wurden 8 mm ]ange Wurzelspitzen isoliert und je 3 in Kolben mit 40 ml N~hrl6sung nach ROBBINS UND SCHMIDT 5 eingebracht. Eine dieser Wurzeln wurde nach ihrer Verzweigung durch wiederholte Spitzenpassagen verklont.

Die so erhaltenen Wurzeln haben wir ftir die Ffitterungsversuche mit radio- akt ivem Acetat verwendet. Dabei erwies sich eine viert~gige Inkubationszeit in Vor- versuchen als die gtinstigste, da in dieser Zeit die h6chste Hyoscyaminradioaktivit~tt auftrat.

Zu den Versuchen haben wir ~2-14C]Acetat mit der spezifischen Aktivit~tt o.132 mC/mMol und [i-~4ClAcetat mit der spezifischen Aktivit~t 0.64 mC/mMol verwendet. Ii-14ClAcetat wurde yon uns selbst nach Cox, TURNER END WARNE 6 fiber E14Cl - Kaliumcyanid synthetisiert.

Wir haben die 3-4 Wochen alten Wurzeln in folgender Weise mit radioaktivem Acetat geffittert: Die alte L6sung wurde unter aseptischen Bedingungen abgegossen und IO ml NAhrl6sung nach ROBBINS zugegeben, die jedoch nur I ~o Saccharose ent- hielt. Dazu wurde pro Wurzel je i ml einer L6sung gegeben, die das radioaktiv markierte Acetat sowie 40 ~g/ml Ornithin und 30 ~g/ml Tropas~ure enthielt. Die L6sung war vorher mit Natronlauge auf pH 8.8 gebracht und zweimal 45 Min im Dampftopf sterilisiert. Ornithin und Tropas~ure haben wir zugegeben, um die Einbau- m6glichkeiten des Acetats in diese Bausteine des Hyoscyamins zur~ckzudr~ngen.

Im Versuch I wurden 112 Wurzeln verwendet, denen wir IOO mg [I-14C]Acetat mit der Gesamtaktivit~tt 5.46.1o s Imp/Min (0. 9 mg Acetat und 4.87" lO 6 Imp/Min/ Wurzel) verabreicht haben.

I m Versuch 2 wurden an 172 Wurzeln 344 mg [2-14ClAcetat mit der Gesamt- aktivit~t 3.96. lO s Imp/Min (2 mg des Acetats und 2.3" lO 6 Imp/Min/Wurzel) verf~ttert.

Nach 4-t~giger Inkubationszeit wurden die Wurzeln sorgf~tltig mit Wasser ge- waschen und bei 5 °° im Trockenschrank getrocknet. Aus dem Versuch (I) erhielten wir 1.55 g trockenes Wurzelmaterial und aus dem Versuch (II) 3.95 g.

Die getrockneten Wurzeln wurden mit Natr iumcarbonat im M6rser zerkleinert und im Soxhlet tapparat 12 Stunden mit Chloroform extrahiert. Der Chloroform- extrakt wurde ersch6pfend mit o.I N Schwefels~ure ausgeschtittelt und wieder in Chloroform tiberffihrt. Den reinen Chloroformextrakt haben wir auf 5 ml eingedampft und mit Hilfe der Rundfilterchromatographie auf Whatman-Papier Nr. 3 getrennt.

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59 ° J. KACZKOWSKI, H. R. SCHUTTE, K. MOTHES

Das Papier (Durchmesser 18 cm) wurde mit Phosphatpuffer pH 6.9-7.0 nach S6rensen besprfiht und bei Zimmertemperatur getrocknet : Pro Rundfilter wurden etwa 25o ~g Alkaloidgemisch aufgetragen. Als mobile Phase haben wir nach ROMEIKE 7 wasserge- s~ittigtes Butanol verwendet; die Alkaloide wurden mit Dragendorffreagenz nach MUNIER s entwickelt.

Die gewonnenen Chromatogramme zeigten 6 Alkaloidflecke, die mit Hilfe von Vergleichssubstanzen als Kuskhygrin, zwei unbekannte Basen, Hyoscyamin, Meteloidin und Skopolamin identifiziert wurden. Die Hyoscyaminzonen wurden aus allen Chromatogrammen ausgeschnitten, zerkleinert, mit o.2 N Natronlauge alkali- siert und mehrmals mit Chloroform ausgeschtittelt. Der Chloroformextrakt wurde danach mit o.I N Schwefels~ture ausgeschfittelt, der saure Ext rakt mit Ammoniak alkalisiert und wieder mit Chloroform extrahiert. Diesen reinen Chloroformextrakt haben wir auf ein kleines Volumen eingedampft und noch einmal auf die oben be- schriebene Weise chromatographiert. Das zweimalig gereinigte Hyoscyamin wurde aus den Chromatogrammen eluiert, nach der Messung der Radioaktivit~tt mit in- akt ivem Atropin (racemisches Hyoscyamin) verdtinnt und umkristallisiert. Die in der Tabelle I I angegebenen Mengen des gewonnenen Hyoscyamins wurden durch Ver- gleich der Gr6sse und Intensit~it der Flecken gesch~itzt.

Es wurde der Schmelzpunkt und die spezifische Aktivit~it des mit Atropin ver- diinnten Hyoscyamins sowie aller seiner Abbauprodukte wie Tropin, Tropas~iure, N- Methylsuccinimid und Benzoes~ture bestimmt. Die Radioaktivit~iten wurden mit dem Methandurchflussz~ihler gemessen.

Da w~ihrend der Reinigung der Alkaloide aus dem Versuch mit I2A*ClAcetat ein Teil des Hyoscyamins zu Tropas~iure und Tropin hydrolysiert wurde, haben wir letzteres abgetrennt, mit inaktivem Tropin verdfinnt und zusammen zu N-Methyl- succinimid oxydiert. Das Tropin, das aus akt ivem verdfinnten Hyoscyamin ge- wonnen wurde, haben wir znr Eliminierung des Kohlenstoffatoms 3 im Tropinskelett verwendet.

Das verdiinnte radioaktive Hyoscyamin haben wir dem Abbau unterworfen, um auf diesem Wege zu kl~iren, in welchen Kohlenstoffatomen sich die h6chste Radio- aktivit~t befindet. Zu diesem Zweck wurde das Alkaloid nach LEETE et al. 9 hydroli- siert; aus dem alkalischen Hydrolysat wurde das Tropin durch zw61fstfindige kon- tinuierliche Extrakt ion mit Ather erhalten. Aus der w~ssrigen Phase konnte nach Ans~iuern und achtstiindiger Extrakt ion mit )kther Tropas~iure gewonnen werden. Von den gewonnenen ~itherischen L6sungen wurde nach dem Entw~issern mit Natriumsulfat das L6sungsmittel abgedampft und kristallines Tropin und Tropa- s~ture erhalten.

Einen Teil des radioaktiven Tropins (5oo mg) yon beiden Versuchen haben wir bis zum N-Methylsuccinimid abgebaut, um die spezifische Aktivit~t der Pyrrollidin- ringkohlenstoffatome (einschliesslich des N-Methylkohlenstoffs) zu bestimmen:

H ~ C - - - C H . . . . . CH,~

] c / 0 H H3C--N / b ~H

H2C-- CH-- CH 2

Tropin

Oxydation CrOa + H2SO4

H~C . . . . . . C=O

H 3 C - N /

i / H2C . . . . . C=O

N-Methylsuccinimid

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DIE ROLLE DES ACETATS IN DER BIOSYNTHESE DER TROPANALKALOIDE 591

Den zweiten Teil des radioaktiven Tropins verwendeten wir zur Eliminierung des Kohlenstoffatoms 3, was durch Umsatz mit Phenyllithium und anschliessender Oxydation zu Benzoesiiure durchzuffihren ist. Das Kohlenstoflatom 3 des Tropan- tinges findet sich wieder in der Carboxylgruppe der Benzoes~iure.

Zu diesem Zweck wurden 500 mg Tropin mit Chromoxyd und Essigsiiure zu Tropinon 1° oxydiert. Das gewonnene Tropinon wurde in ~itherischer L6sung zu einer nach ZIEGLER 11 erhaltenen ~itherischen L6sung von Lithiumphenylat eingetropft; dabei bildet sich 3-Phenyltropan-3-ol n, woraus durch Oxydation mit Kaliumpermanganat Benzoes~iure entsteht, deren Carboxylgruppe aus dem C-Atom 3 des Tropins stammt :

H~C CH CH z

HaC--N / !'\H H~C CH ---CH 2

Tropin

K o n d e n s a t i o n

LiC

O x y d a t i o n

CrO3 + C H s C O O H >

HaC-- CH \

HzC--N /

H2C CH

H2C . . . . CH \

H3C N /

H~C CH

Tropinon

CH 2

cI•OH __

i ~ \ CH, \ - - /

CH z

C = O ]

CH~

3-Phenyltropan-3-ol

Oxydat ion KMnO 4

COOH

.2.. I II

genzoes~ure

Die gewonnene Benzoes~iure wurde durch Sublimation gereinigt und zur Bestim- mung des Schmelzpunktes und der spezifischen Radioaktivit~it verwendet.

Die Schmelzpunkte des radioaktiven Atropins und der gewonnenen Abbauver- bindungen sowie die Literaturschmelzpunkte dieser Verbindungen sind in Tabelle I zusammengestellt.

Die in der Tabelle gezeigten Schmelzpunkte fiir die einzelnen Verbindungen

T A B E L L E I

D I E S C H M E L Z P U N K T E D E S A T R O P I N S U N D D E S S E N A B B A U P R O D U K T E

Verbindungen Schmelzpunkt nach Literatur Versuch r Versuch z

Atropin i 15 114 i i3. 5 Tropas~ture I 17.5 117 x 17 Tropin 63 54 55 3-Phenyl tropan-3-ol 162 158 159 Ben zoesiiure 1 2 2 1 2 2 1 2 I

N-Methylsuccinimid 66 64.5 63.5

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592 J. KACZKOWSKI , H. R. S C H U T T E , K. MOTHES

stimmen in den meisten F~illen mit denen der Literatur gut iiberein. Nur im Falle des Tropins wurde in beiden Versuchen ein niedrigerer Schmelzpunkt gewonnen, d iese Tatsache ist aber in der Literatur bekannt 12.

E R G E B N I S S E UND D I S K U S S I O N

Radioaktives Acetat wurde w~ihrend einer 4-t~igigen Inkubationszeit isolierter Wurzeln von Datura metel in bedeutender Menge in die Tropanalkaloide eingebaut. Der gereinigte Chloroformextrakt enthielt im Versuch I (LI-14ClAcetat) 4.4" IOB Imp/ Min, das sind o.8 ~/o der eingeftihrten Radioaktivit~it. Im Versuch 2 ([2-14ClAcetat) konnten im gereinigten Chloroformextrakt 2.6" lO 6 Imp/Min, also o.65 ~o der einge- ftihrten Radioaktivitii t wiedergefunden werden.

Auf Grund der eingebauten Radioaktivit~iten kann man annehmen, dass unter unseren Versuchsbedingungen in den Wurzeln von Datura metel eine sehr starke Bio- synthese der Tropanalkaloide stattfindet. Aus den spezifischen Einbauraten des radio- aktiven Acetats l~isst sich errechnen, dass in beiden Versuchen fiber 25 % des am Ende gefundenen Hyoscyamins w~ihrend der 4-t~igigen Inkubationszeit synthetisiert wurde. Das ist ein weiterer Beweis fiir die Biosynthesem6glichkeit der Tropanalkaloide in Datura-Wurzeln.

In der Tabelle I I sind die gesamte Radioaktivit~t und die spezifischen Aktivit~ten des eingefflhrten Acetats und des gewonnenen Hyoscyamins sowie die spezifischen Einbauraten angegeben.

T A B E L L E I I

RADIOAKTIVITATEN UND SPEZIFISCHE I~INBAURATEN DES GEWONNENEN HYOSCYAMINS

Versuch ± [z-~4C]Acetat)

Gesamte Spez. Spezifische Verbindung A ktivitgit A ktivitii~ Einbaurate Imp/ M in I mp[min/mMol

A c e t a t 5.46" IO s 3.2" IO s H y o s c y a m i n (2.5 mg)

0. 9 • i o s I .o. IO 8 3 i o~)

Versuch 2/[2-14CJA cetat)

A c e t a t 3 . 96 ' lO s 6 .8 . lO 7 H y o s c y a m i n (4.5 mg)

5 .46 ' lO 5 3.5" lO7 51 ~

Aus der Tabelle I I ist zu ersehen, dass Acetat in das Alkaloid in verla~iltnism~ssig grosser Menge eingebaut wird. Die spezifische Einbaurate des Acetats ist sehr hoch (ira Versuch I) 31% und (ira Versuch 2) 51%. Da die spezifische Einbaurate des Ver- suches mit ~2-14C~Acetat fast zweimal so gross ist wie die des Versuches mit [I-lacJ - Acetat, k6nnte man annehmen, dass yon dem [I-14Q?Acetat in das Alkaloidmolektil nur I radioaktives Kohlenstoffatom eingebaut wird, wiihrend von dem [2-14ClAcetat sich 2 radioaktive Kohlenstoffatome im Tropanskelett wiederfinden. Tabelle I I I zeigt die spezifischen Radioaktivit~iten des verdiinnten Hyoscyamins und dessen

B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 46 (1961) 5 8 8 -5 9 4

DIE ROLLE DES ACETATS IN DER BIOSYNTHESE DER TROPANALKALOIDE 593

A b b a u p r o d u k t e . Aus der Tabel le geht hervor , dass in be iden Versuchen die meis te Radioakt iv i t~ i t im Tropin te i l , n~mlich im Versuch i , 80 % und im Versuch 2, fiber 70 %, lokal i s ie r t ist .

TABELLE I I I

SPEZIFISCHE RADIOAKTIVITXTEN VON VERDLINNTEN HYOSCYAMIN

UND DESSEN ABBAUPRODUKTEN

Versuch r Ve*such 2 mit [x-l*C ]Acetat mit [2A*C ,TAcetat

Spezifische Radioaktivi/iit Spe~ifische Radioaktivitiit Verbindung Imp/Min/mMol Imp/Min/mMol

H yoscyamin 7.06.104 3.08" 104 TropasRure i .15 • lO 4 0.65 - lO 4 Tropin 5-97' lO4 2.36" IO 4

3.66" lO 4* Methylsuccinimid o. 94" 104 o.92" 104 13enzoes/~ure 4.91 • 104 Spuren

* Tropin aus zufRlliger Hydrolyse.

Der A b b a u des Tropins zu N-Methylsucc in imid , das nur die Kohlens tof fa tome des Pyr ro l id in r inges (einschliesslich N-Methylkohlenstoff) enth~lt , ha t gezeigt, dass der gr6sste Tei l der Rad ioak t iv i tXt in die Dreikohlenstoffeinhei t , Kohlens tof fa tome 2 3 und 4, e ingebau t ist , da die spezifische Rad ioak t iv i t i i t des gewonnenen Imids im Versuch I , 15 % und im Versuch 2, 25 % der spezifisehen Rad ioak t iv i t / i t des Tropins betr~igt. Man muss die res t l iehe Radioakt iv i t~t t (85 % bzw. 75 %) den abgespa l tenen Koblens to f fa tomen 2, 3 und 4 zuschreiben.

Diese re la t iv hohe A c e t a t i n k o r p o r a t i o n in die Kohlens tof fa tome 2, 3 und 4 des Trop inske le t t s l~isst den Schluss zu, dass die Essigs~ture verh~ltnism~issig spezifisch in dieses Alka lo idger i i s t e ingebau t wird. Bei der grossen Stoffwechselakt ivif i i t der Essig- s~ure kann die Rad ioak t i v i t i i t in der Tropas~iure und im Pyr ro l id in r ing des Tropins als sehr klein angesehen werden. Linen E i n b a u in diese Verb indungen haben wir fiber- dies durch Zugabe von Tropas i iure und Orni th in zu den Versuchsans~itzen zu ver- r ingern gesucht . Die Ergebnisse sprechen also ffir eine in vivo-Best~tigung der in vitro- Versuche von CLARKE UND MANN 4, SO dass man ftir die Biosynthese des Tropinr inges folgendes Schema vorschlagen k6nn te :

2 CH3-COOH ~ CH3-CO-CH2-COOH

COOH

CH CH + N \ ] Dehydrierung \ I

÷ NH CO -> N CO + Pyrrolin / ] Decarboxylierung /ff [

CH 3 - - CH 2

- - C H ~ Ringschluss l I I Methy l i erung

- - ~ , N H C O

CH 2

Reduktion

_ _ - - - C H 2

[ ! - -CH 3 !HOH

CH 2

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594 j . KACZKOWSKI, H. R. SCHUTTE, K. MOTHES

Bei diesem Biosyntheseschema ist es noch unklar, ob die Acetessigs~ture mit Pyrrolin oder einer Pyrrolincarbons~iure (entstanden aus Ornithin) reagiert bzw. wann die Deearboxylierung und die Reduktion zur Alkoholgruppe stattfinden. Letztere Fragen sind yon Bedeutung ffir die Biogenese des Ecgonins, das eine Tropin- carbons~iure darstellt, wobei nach obigem Schema keine Decarboxylierung eintreten sollte. Entsprechende Versuche sind in Arbeit.

Um die Radioaktivit~tsverteilung bei den einzelnen Versuchen in den Kohlen- stoffatomen 2, 3 und 4 zu untersuchen, haben wit ]eweils das Tropin mit Phenyl- lithium zu 3-Phenyl-Tropan-3-ol umgesetzt, das anschliessend zu Benzoes~iure oxydiert wurde. Diese Benzoes~iure enth~ilt das Kohlenstoffatom 3.

Im Versuch I ([i-14ClAcetat) haben wir dabei in dieser S~iure fast die gesamte Radioaktivit~it gefunden, die den Kohlenstoffatomen 2, 3 und 4 zuzuschreiben war. Die Benzoes~ure dagegen aus dem Versuch 2 (E2-14ClAcetat) zeigte nur Spuren yon Radioaktivit~it. Das bedeutet in l~bereinstimmung mit obiger Formelreihe, dass das Carboxylkohlenstoffatom des Acetats das Kohlenstoffatom 3 des Tropins bildet und dass dagegen die Kohlenstoffatome 2 und 4 aus den Methylkohlenstoffatomen der Essigs~iure entstehen.

Die Radioaktivit~it in der Tropas~ure sowie in den Kohlenstoffatomen des Pyrrolidinringes des Tropins ist sehr wahrscheinlich durch die immerhin lange In- kubationszeit der Wurzeln mit Acetat bedingt, da das Acetat sich dadurch in metabo- lischen Umwandlungen fiber Ornithin und andere Aminos~iuren in diesen Kohlenstoff- atomen lokalisieren konnte. Doch betr~igt die Radioaktivitiit im Versuch I nur ein Viertel, im Versuch 2 die H~ilfte dessen, was im Falle der Totalmarkierung des Tropins zu erwarten w~ire.

Z U SA MME N FA SSUNG

Isolierten Wurzeln von Datura metel gefiitterte [I-14C] und [2-14C]Acetate werden in die Tropanalkaloide dieser Wurzeln eingebaut. Abbau-Experimente mit einem dieser Alkaloide, Hyoscyamin, beweisen, dass diese zwei Verbindungen besonders in die Kohlenstoffatome 2, 3 und 4 aufgenommen werden, und dass das Kohlenstoffatom 3 nur bei Zufuhr von [I-14C]Acetat markier t wird, w~ihrend [2-~4C]Acetat an dieser Stelle nicht einverleibt wird. Die Biosynthese der Tropanalkaloide wird an der Hand dieser Ergebnisse besprochen.

L I T E R A T U R

1 R. ROBINSON, J. Chem. Soc., 111 (1917) 576. 2 CL. SCH6PF, Angew. Chem., 5 ° (1938) 779.

E. LEETE, L. MARION UND J. D. SPENCER, Can. J. Chem., 32 (1954) 1116. 4 A. J. CLARKE UND P. J. G. MANN, Biochem. J. , 71 (1959) 196. 5 W, J. ROBBINS UND M. A. BARTLEY-ScHMIDT, Botan. Gaz., 99 (1938) 671. s j . D. Cox, H. S. TURNER UND J. WARNE, J. Chem. Soc., (i95 o) I96.

A. ROMEIKE, Pharmazie, 7 (1952) 496. s R. MtYNIER UND M. MACHEBOEOF, Bull. soc. chim. biol., 33(1951) 846. 9 R. WILLST//,TTER, Chem. Bet., 29 (1896) 393.

10 K. ZIEGLER UND H. COLONIUS, Ann. Chem., Liebigs, 479 (193o) 135. Xl A. V. ROBERTSON UND L. MARION, Can. J. Chem., 38 (196o) 294. 12 T. ANEMOMIYA, Arch. Pharm., 24 ° (19o2) 498.

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