]32 M. SCHOO¢: Die Bestimmung der chemotherapeutisehen Aktivitat. Klinische Wochenschrif~

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DIE BESTIMMUNG DER CHEMOTHERAPEUTISCHEN AKTIVTT~T MITTELS POTENTIOMETRISCHER MESSUNG.

V o n

M. ScHool. Aus der Hautklinik der Universit4i~ K~iln (Leitung: Prof. Dr. VONI~ENN~I,).

Zur Beurteilung der chemotherapeutischen oder desinfizierenden Wirksamkeit einer Substanz in vitro ist es fiblieh, abfallende Verdfinnungsreihen in einem flfissigen oder festen Nahrmedium anzusetzen. Dabei

~v

120

8~

lConz~ntrat/on dot HC~ Abb. I. Potent,~ome~rische Werte einer mit nil00 HCI in fallender Kon- zent~ation versetzten i~hrbouillon. Abszisse = potentiometrischer Weft

der reinen Nghrbouillon.

wird als Grenzwert die Konzentration registriert, die des Waehstum des als Indicator benfitzten Bakterien- stammes gerade noeh hemmt. Die Ablesung erfolgt meist makroskopiseh, indem sehr gutes, mKl~iges, an-

%

50

3#

2#

# - log "~ 1000 1:10000 "1~20000 1.'50000 ~ lOOO00 "~200000

Konz~ntrotion Abb. 2. l t emmkurve der SubstanzB bei potentiometrischer Ablesung

in 2%iger Traubenzuckm%oaillon.

gedeutetes ~Vachstum oder tota]e I4emmung mit ver- sehiedenen Zeiehen belegt werden. Die Methodik gibt besonders beim Vergleich der Wirkung verschiedener Substanzen nur einen ungefiihren und unp]astischen Eindruck der ttemmwerte. Eine bessere Differen- zierung ermSglicht die Trfibungsmessung, bei der die dureh viele Bakterienarten in fliissigen l~hrmediea hervorgerufene Trfibung quantitativ bestimmt wird. Wir haben versueht, die dureh des BakterienwaehsSum bedingte pa-Versehiebung als Test nutzbar zu maehen.

Zur quantitativen Messung wahlten wir die poten- tiometrische Bestimmung mit der Glaselektrode. Ver- wendet wurde eine niederohmige Glaselektrode, die fiber eine Kaliumchloridbriieke mit der Kalomel- Vergleichselektrode verbunden ist. Die Potential- differenz, die zwisehen den beiden Elektroden in einem bestimmten Verhaltnis zur Ionenkonzentration d. h. zum p~ der Mel~lSsung steht, wird durch Vet- starker und mittels eines Kompensationsgeriites be- stimmt. Im biologischen Milieu ist wegen der An- wesenheit, yon Elektrodengiften die Glaselektrode anderen Elektroden vorzuziehen. Da die p~-Konzen- tration der unbesehickten N~hrlSsung in allen Prfif- rShrchen gleich bleibt, kann diese als Nullinie ange- sehen werden. Die Werte der das Chemotherapeuticum enthaltenden beimp]ten RShrchen sind um die p~- Werte der unbeimpften Eprouvetten gleieher Konzen- tration zu korrigieren. Dieses Vorgehen erfibrigt sich, wenn die Wasserstoffionenkonzentration der PrfiL substanz auch in starken Konzentrationen yon der des Ni~hrmediums (1000 rag-% ~ Verdfinnung 1 : 100) nur wenig divergiert. Aber aueh in Fallen, bei denen die pH-Werte der reinen und der mit Chemothera- peuticum in 1000 mg-%iger Konzentration versetzten Nabz'lSsung stark abweiehen, liel~ sieh feststellen, dab mit abnehmendem G e h a l t - etwa yon 10 -3 bis 10 -~ - - die Werte stark aneinander rfiekten, d. h., dab die Wasserstoffionenkonzentration des des Chemo- therapeutieum enthaltenden Nahrmediums sich dem dureh reine NahrlSsung definierten Nullpunkt n~her~e. Daraus ergibt sich, dab im Bereieh der hohen Ver- dfinnungen die p~-:~mderung dutch des Chemothera- peutienm vernaehlassigt werden kann. Ist eine Prii- lung aueh in starken Konzentrationen erforderlich, muB der Beeinflussung des Pn durch die Testsubstanz Reehnung getragen werden. Diese Situation zeigt Abb. 1 am Beispiel einer mit n/100 HC1 in fallender Konzentration besehiekten N~hrlSsung.

Bei diesen Modellversuehen ist zu bedenken, daI~ sich sehr stark saure oder alkalische Substanzen ~iir chemotherapeutisehe Resistenzversuche schlecht eig- nen, da in starken Konzentrationen der p~-Effekt des Ni~hrmediums eine vielleicht gar nieht vorhandene ehemotherapeutische AktivRat vort~uschen kann. Die Verdiinnungsreihe ffir die potentiometrisehe Mes- sung sollen Eprouve~ten mit totaler Wachstumshem- mung bis zu Proben mit 100%igem Wachstum urn- lessen, flit des die Eprouvette mit beimpfter Trguben-

Jg. 31, Kef t5 /6 ERNST TETZNEt¢: P o s i t i v e ABDEI~t tALDENsche A b b a u f e r m e n t r e M < t i o n . 133 1. Februar 1953

zuckerbouillon, jedoch ohne Zusatz der Prfifsubstanz, den MaBstab bildet. Hierdurch ist der Bereich yon 0 bis zum 100%igen Wachstum erfaBt. Da die Waehs- tumsvorg~nge pa-.~nderungen hervorrufen, die in entspreehenden Ablesungen am. Potentiometer ihren Ausdruek linden, kSnnen die ermittelten mV-Werte auf das prozentuale Wachstum umgerechnet werden. Diese Umreehnung ist zweeks Vereinheitliehung der Ergebnisse und zur ErmSgIiehung eines Vergleiches der Hemmkra f t versehiedener Substanzen zu emp- fehten. Die gefundenen Prozentwerte werden als Ordinate in ein Koordinatensystem mit dem nega- riven Logarithmus der Konzentrat ionen als Abszisse eingetragen. Der Vorteil der potentiometrisehen Me- rhode gegeniiber der makroskopisehen Ab]esung zeigt

die folgende Gegenfiberstellung der Prfifungsergeb- nisse der Substanz B auf einen Staph. aureus-Stamm bei makroskopischer und bei potentiometrischer Be- stimmung.

Hemmung der Substanz B bei makroskopischer A blesung : 1 : 10000 - - 1 : 100000 + 1 : 20000 -- 1:200000 + 1 : 50000 -t- 1:500000 -~-

. . . . . kein Wachs tum; ~ ~ ausgepri~gtes Waehstum.

Ein weiterer Vorteil der potentiometrischen Me- rhode gegenfiber der mal~'oskopischen oder nephe]o- metrischen ist gegeben, werm das unbeimpfte Nahr- medium allein durcK den Zusatz der Prfifsubstanz getriibt wird.

POSITIVE ABDERHALDENSCHE ABBAUFERMENTREAKTION (A. R.) BEI TUMORKRANKEN MIT EINEM SUBSTRAT AUS TIERTUMORGEWEBE*.

V o n

E ~ . N S T TETZNEI¢. Aus der Ineeren Abteilung des ~e i sk rankenhauses Scltau/tfan. (Leitender Oberarzt: Dr. reed. ERh~ST TETZNEI~),

Frag~tettung. E. ABDElCHaLDEI~ -1 hat in einer seiner letzten Vcr-

5ffent]ichungen h:ber die A. R. die Substratfrage als den ,,wmlden P u n k t " der Methode bezeiehnet. An anderer Stelte ~ schreibt er: , I c h zweifele nicht daran, dab es nur eine Frage des Substratmaterials ist, ob die Tumor- diagnose mi t Hilfe der A. I~. gelingt." Gerade bei der Anwendung der A. I~. fiir die Diagnose der Tumoren ist es sehr hinder]ich, dab die Herstelhmg einheitlicher Substrate in grSBeren Mengen ein noch ungelSstes Problem darstellt. Ich verweise auf die letzten Zu- sammenfassungen yon E. ABDEI~tt-hLDEN a, I~. ABDEI~- ~LDEN 4, t~. ME,TEN 5 und G. H A ~ E a ~. - - Wit sind in orientierenden Versuchen der wiehtigen Frage nach- gegangen, ob Substrate aus Tiertumorgewebe zur Tumordiagnostik beim Menschen mitte]s der A. t~. brauchbar sind. In der Literatur konnte ich darfiber keine Mitteilungen linden. E. ABDEtCtKALDEN 7 betont, da[~ eindeutige Untersuchungen in dieser Riehtung fehten. Er hat , wie auf dem Gebiet der Hormon- organe, offenbar auch die MSglichkeit eines Aus- tausches bei den Tumoren erwogen und orientierende Tierversuche zu dem Problem angestellt 2. Er land dabei nach Injekt ion yon Tiertumorsubstrat keine Mitreaktion yon Substraten aus Menschentumor- gewebe und nach Injekt ion yon menschliehem Tumor- substrat kam es zwar zu einer 3{itreaktion i~hnlicher, menschlicher Tumorsubstrate, ein ,,Ubergreifen" auf tierische Tumorsnbstrate aber xvurde night beobaehtet.

Zu beachten ist, dag bei diesen Versuchen Im.pf- tumoren benutzt ~-arden, das Substrat ~a rde auch den Kaninchen nut einmal injiziert; nach mehrfaeher Injektion w~re eine Mitreaktion zu erwai'ten gewesen. ~l tere Tierversuche zu diesem Problem s ergaben eben- falls eine ,,iiberraschend spezifische" Einstellung; sie wurden noch mit der Dialysiertectmik im tIunde- versuch durehgefiihrt; Ms Substrat wurde ebenfalls t in Impf tumor verwendet. Wir wissen heute, dab Impf tumoren und Spontantumoren biologiseh recht verschieden sind ~ und nahmen deshalb ~iir unsere orientierenden Versuche einen Mammaspontantumor

* Ftir die ~berlassung yon Tiertumorgewebe danke ich Herrn Dr. O. N20~I, BOCK vom Niederl~ndischen Krebsinst i tut in Amsterdam ver- bindlichst.

der Maus. - - Bei li~ngerer Beschi~ftigung mit der A. I~. ist man immer wieder iiberrascht, wie spezifiseh die Probe anzeigt. ])as gilt vor allem fiir den iibersieht- lichen Tierversuch bei Injekt ion nur geringer EiweiB- mengen 2. Andererseits beobaehtet man doch auch gar nicht selten - - besonders bei tIarnans~tzen yon Tumorkranken - - ein l~lbergreifen auf andere Tumor- substrateL I m Tierversach s und bei Untersuchung an sehwangeren t Ia rnen 1° win:de sogar Abbau bio- ]ogisch ganz fremder EiweiBstoffe gefunden. Bei jahrelanger Beseh~ftigung mi t der A. R. haben wir zahlreiche, ~hnliche Beobachtungen gemacht. So kann ich aueh der Ansicht K. H. BAVEns n nicht bei- treten, weleher die Friihdiagnostik eines lokalisatorisch noch unbekannten Tumors mittels der A. l~. wegen der weitgehenden Spezifit~t der Abbaufermente als yon vornherein ausgeschlossen bezeichnet.

Be/uncle. Ich bringe m m kurz unsere Versuchsergebnisse

mittels der A. R. bei Tumorkranken bei vergleichenden Ansatzen mi t einem Tiertumorsubstrat . Die A. t~. wurde als sog. Mikromethode unter Verwendung yon H a m angestellt. Beziiglieh der Einze]heiten der Technik verweise ich auf E. ABDElCI~ALDEN a. ])aS Tiertumorgewebe (Spontanmammacarcinom der 5[aus C 3H-Stature) wurde mir freundlicherweise yon Herrn Dr. O. M~LBOCK vom niederl~ndischen Krebsinst i tut in Amsterdam zur Verfiigung gestellt. Wir bereiteten uns aus dem in troekenem Kochsalz iibersand£en Gewebe ein Trockensubstrat und benutzten dann je Ansatzr6hrchen 10 rag. Natiirlich ~urde bei der Substratherstellung auf sorgi~ltige Befl'eiung yon Stoffen, dig mit Ninhydrin reagieren, geachtet. Ma- schengr6Be des Siebes 1600 M/cm ~. Fiir die Unter- suchung der Bebriitungsflfissigkeit verwendeten wit neben der Nhlhydrinprobe auch die Mikrokjeldahl- best immung und bezeichneten die A. IK Ms positiv, wenn dcr Unterschied zur Kontrolle mindestens 5 rag-% betrug. In gr61~eren I~eihenversuchen ergab die Mikrokjeldahlmethode nicht selten eine bessere ~bereinst immung mit dem klinischen Befund; der Ubersichtlichkeit wegen ffihren wit in diesem Zu- sammenhang nut die Werte der Stickstoffbestimmung