diagnosticul imunologic

8/3/2019 DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC

1/26

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC poate fi mprit n:

A. REACII ANTICORP-ANTIGENB. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNITII MEDIAT CELULAR

A. REACIILE ANTICORP-ANTIGEN

Reaciile antigenelor cu anticorpii prezint o mare specificitate. Un antigen vareaciona doar cu anticorpul a crui sintez a fost indus de el sau de un alt antigencu structur apropiat.Datorit gradului ridicat de specificitate, reaciile dintre antigene i anticorpi pot fiutilizate pentru identificarea unuia dintre componente. Exist dou situaii:1. Identificarea unui antigen (Ag) necunoscut izolat din proba de cercetat, folosindseruri standard (Ab) (care sunt seruri obinute de la animale imunizate cu antigenepurificate cunoscute).

Ag + Ac Ag Ac

2. Evidenierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utiliznd antigenelestandard (diagnosticul serologic).

Ag + Ab Ag - Ac

Antigene i anticorpi: definiii de baz

Antigenele sunt substane care pot fi recunoscute i dependente de sistemul imun,n timp ce imunogenii sunt molecule care induc un rspuns imun.n majoritatea cazurilor, antigenele sunt imunogene, astfel nct se utilizeaz ambiitermeni. ns, exist cteva excepii cu importan deosebit, cum sunt haptenele.O hapten este o molecul care nu e imunogen prin ea insi, dar poate reacionacu anticorpul specific.Un epitop (determinantul antigenic) este structur molecular care interacioneazpractic cu o singur molecul de anticorp. Antigenele i imunogenii conin de obicei,mai muli epitopi, fiecare dintre ei fiind capabil s se lege de o molecul de anticorpdiferit.

Anticorpii sunt imunoglobuline care reacioneaz specific cu antigenul care astimulat producerea lor. Ei reprezint 20% din proteinele plasmei sanguine.Anticorpii pot fi utilizai ca elemente sensibile i specifice pentru detectarea,identificarea i dozarea antigenelor.Anticorpii specifici pot fi obinui de la pacieni n perioada de convalescen aanumitor afeciuni (de exemplu, anticorpii antivirali) sau pot fi purificai de laanimale imunizate cu antigenul care ne intereseaz.Un tip special de anticorpi, utilizai n scopuri diagnostice, sunt anticorpiimonoclonali care recunoate un singur epitop, de aceea aceti anticorpi au o marespecificitate

Anticorpii monoclonali n special pentru antigenele de suprafa ale limfocitelor, seprepar pentru a fi comercializate. Datorit faptului c anticorpii monoclonali aurevoluionat att de profund metodele de detectare a antigenelor, producerea

1


2/26

acestor molecule va fi prezentat ulterior.Un alt tip de anticorpi, sunt anticorpii policlonali, care sunt preparate heterogene deanticorpi, capabili s recunoasc mai multe tipuri de epitopi ai unui antigen.

Reacii Ag Ac utilizate n diagnosticul imunologic

I. In vitro: 1. Reacia de aglutinare (n care antigenul este particulat)2. Reacia de precipitare (n care antigenul este solubil)3. Reacia de fixare a complementului4. Reacia de neutralizare5. Imunofluorescena (IF), testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),Radioimunotestarea (Radioimmunoassay RIA).

II. In vivo: Intradermoreacii (teste cutanate)1. Prick - testul cutanat

2. Patch - testul cutanat

I. In vitro

1. Reacia de aglutinare

n aceast reacie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) saueste o particul inert (de latex) nvelit cu un antigen.Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leag de particulele antigenice

multivalente i formeaz o reea, reacia de aglutinare devenind vizibil.Tehnica este sensibil i poate fi aplicat att pentru antigene dar i moleculele deanticorpi.

1.a Aglutinarea direct implic aglutinarea particulelor antigenice (cum suntbacteriile sau fungi) cu participarea anticorpilor specifici.

Determinarea antigenuluiBacteriile sunt identificate n mod obinuit, preparnd din cultura pur o suspensielichidian pe o lam de sticl sau n tuburi i urmrind dac acestea sunt aglutinate

sub forma unor agregate vizibile, n urma adugrii de antiseruri specifice care aufost obinute ca rspuns la antigene bacteriene cunoscute.

Determinarea anticorpuluiSuspensia de bacterii de aceast data cunoscute, poate fi utilizat invers, pentrudeterminarea i dozarea anticorpilor serici.Se efectueaz prin testarea pe o serie de diluii de ser a unei suspensie bacterianestandard i determinarea celei mai mari diluii de ser la care nc este prezentreacia de aglutinare (care reprezint titrul reaciei).Reacia de aglutinare are sensibilitate mai mare dect reacia de precipitare.

1b. Aglutinarea pasivn ceea ce privete aglutinarea pasiv, pot fi detectate antigenele sau anticorpii, n

2


3/26

funcie de reactantul legat de carrier.

Antigene cunoscute legate de carrier, pentru determinarea anticorpuluin aceast situaie, antigenul este particulat avnd astfel particularitatea de a fiaglutinabil. Legarea de carrier este posibil prin fixarea antigenelor solubile lasuprafaa unor particule care din punct de vedere immunologic sunt inerte.

De exemplu, numeroase polizaharide ader uor, dar ferm la suprafaa eritrocitelorsplate; numeroase antigene proteice ader n mod similar la hematii tratate cudiferii ageni, ori la particulele de polistiren, latex, bentonit, colodiu, crbune.Determinarea anticorpilor antivirus rubeolic prin reacia de aglutinare pe latex esterealizat prin amestecarea antigenelor imunodominante de rubella virus fixate peparticulele de latex, cu probe de ser i urmrirea apariiei reaciei de aglutinare (fig.38).

Fig. 38 - Detectarea anticorpilor de rubella prin aglutinare pe latex

Determinarea antigenului

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici sunt aglutinate n prezena unuiantigen omolog (fig. 39).n practic acest test este folosit pentru determinarea:- Factorului reumatoid (FR) care este o protein care apare n mod patologic, avndproprietile clasei IgM, care apare n serul pacienilor cu artrit reumatoid.Aceast protein mai poate apare i n cazul altor afeciuni: lupus eritematos,sindrom Sjgren, boli hepatice, tuberculoz, sifilis, infarct miocardic chiar i lapersoane sntoase (mai ales la vrstnici);- Proteina C reactiv (PCR) n serul persoanelor sntoase este prezent nconcentraii minime (foarte dificil de detectat prin tehnici obinuite). Proteina C

reactiv este una dintre proteinele de faz acut a crei concentraie crete ndecursul proceselor inflamatorii acute, n fazele de reactivare ale inflamaiilorcronice i n procesele necrotice (infarct miocardic, tumori maligne);- Determinarea direct a antigenului streptococului de grup A din tampoanelefaringiene este realizat prin tratarea probei fie la pH sczut (cu acid azotic) fie cudiferite enzime; ulterior se pune n contact lichidul extras, cu particule de latexacoperite cu anticorpi anti-streptococ de grup A.

Fig. 39 Detectarea antigenului prin aglutinarea pe latex

3


4/26

...

1c. Reacia de coaglutinarea este utilizat, n special n detectarea antigenelordiferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae,Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc.

Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezint unconinut ridicat de protein A de suprafa. Proteina A din peretele celular alstafilococului aureu se leag de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulin,lsnd liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibil astafilococilor reprezint un test pozitiv care indic legtura antigen-anticorp (fig.40).

Fig. 40 - Coaglutinarea

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici servesc ca baz pentru multesisteme disponibile n comer, folosite pentru detectarea direct a antigenelor

bacteriene. Una dintre aplicaiile importante este identificarea antigenelorcapsulare solubile n cazul mai multor ageni etiologici ai meningitei acute saucronice, i anume: Haemophylus influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis,streptococii de grup B, E.coli i Cryptococcus neoformans.

1d. Hemaglutinarea

Testul hemaglutinrii active identific anticorpii pentru antigenele eritrocitare.Anticorpul este diluat succesiv n ser fiziologic i apoi depus n godeurile plcii dehemaglutinare. Sunt utilizai ntotdeauna martori pozitivi i negativi.

Se adaug n fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care conine o protein ceprevene aglutinareai nespecific a hematiilor).n cazul n care exist suficieni anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibil (princross-reacii/reacii ncruciate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub formaunui covor neomogen.Daca anticorpii sunt insuficieni, celulele se vor rostogoli pe pereii oblici ai plcii,formnd un buton rou pe fundul godeului (fig. 41).

4


5/26

Fig. 41 Reacia de hemaglutinare

Unii anticorpi nu au capacitatea de a aglutina direct hematiile i pot fi detectainumai cu ajutorul testului de aglutinare indirect; aceast reacie are loc prinadugarea unui al doilea anticorp (cu proprieti hem-aglutinante) care se leag deanticorpul neaglutinant, atandu-l astfel (indirect) de eritrocit.

Factorul reumatoid (FR) poate fi evideniat n serul pacienilor folosind reacia dehemaglutinare: hematiile sensibilizate de berbec, sunt aglutinate n prezenafactorului reumatoid (reacia Waaler-Rose).

Reacia de hemaglutinarea cu participarea virusuri:Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul i virusulfebrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum i a eritrocitelorde coco, por de Guineea, oarece i alte animale.Aceast reacie este utilizat pentru detectarea i titrarea virusurilorhemaglutinante n materialele de cultur.

Pe de alt parte, inhibarea reaciei de hemaglutinare poate fi folosit pentrudecelarea anticorpilor n probele de ser. Aceasta este cunoscut ca testul inhibriihemaglutinrii virale (HAI).Prin legarea covalent sau necovalent de diferitele antigene de pe suprafaahematiei, utilitatea testului poate fi extins i la detectarea anticorpilor pentru alteantigene dect cele aflate pe hematii.

1e. Testul CoombsTestul Coombs mai este cunoscut ca testul antiglobulinic. n multe cazuri de anemiehemolitic (de exemplu n boala hemolitic a nou-nscutului /incompatibilitate de

Rh i anemii hemolitice determinate de medicamente) anticorpii sunt legai pesuprafaa eritrocitului. Aceste imunoglobuline pot fi evideniate prin testul Coombsantiglobulinic direct, n care antiserul anti-imunoglobulin uman este folosit pentruaglutinarea hematiilor de la pacient (fig. 42).

Fig. 42 Testul Coombs direct

5


6/26

n unele cazuri, cantitatea de anticorpi legai este prea mic pentru a fi detectaiprin testul Coombs direct i se recurge la testul antiglobulinic indirect pentruevidenierea anticorpilor n serul pacientului. n acest test, serul de la pacient este

amestecat cu eritrocite normale i se adaug antiser anti-imunoglobulin uman.Dac anticorpii sunt prezeni n ser, se produce reacia de aglutinarea (fig. 43).

Fig. 43 Testul Coombs indirect

2. Reacia de precipitare

n aceast reacie, antigenul se afl n soluie. Tehnicile de precipitare sunt bazatepe:- capacitatea majoritii anticorpilor de a interaciona cu mai mult de un epitop alunei proteine sau agent infecios- faptul c fiecare molecul de anticorp interacioneaz cu mai mult de un antigen(de exemplu, imunoglobulina G are dou domenii pentru legarea antigenului).ntre anumite limite ale concentraiei antigenului i anticorpului (zona deechivalen) anticorpul leag ncruciat antigenul ntr-un complex prea mare pentrua sta n soluie (suspensie) i, de aceea precipit, iar supernatantul nu conine n

exces nici anticorpi, nici antigene.n zona excesului de anticorpi, exist o cantitate prea mare de anticorpi pentruformarea eficient a unei reele de legturi, iar precipitarea este mai redus fa deintensitatea din zona de echivalen.

n zona excesului de antigene, toi anticorpii sunt combinai, dar precipitarea esteredus, deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, elermn solubile (fig. 44).

6


7/26

Fig. 44 Reacia de precipitare

Reaciile de precipitare pot avea loc n soluie sau n mediu semisolid (agar).

A. Precipitarea n soluie

a) Reacia de precipitare inelar

Antigenul i serul sunt puse n contact n tuburi capilare, astfel nct s nu seamestece, dar s se pstreze interfaa limpede. Rezultatul pozitiv este dat deapariia unui precipitat alb la nivelul interfeei, dup 15-20 minute (Figura 45).

Fig. 45 Reacia de precipitare inelar

Reacia poate fi utilizat n:

- industria alimentar la diferenierea originii crnii;- medicina legal la identificarea originii petelor de snge;- diagnosticul microbiologic:

pentru gruparea streptococilor;

reacia Ascoli folosit n diagnosticul retrospectiv al antraxului;

reacia Vincent-Bellot utilizat n diagnosticul infeciilor meningococice.

b) Precipitarea n tub capilar

Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46).7


8/26

Fig. 46 Reacia de precipitare n tub capilar

B. Precipitarea n gel de agar

Poate fi simpl sau dubl difuzie. De asemenea, poate avea loc n prezena unuicmp electric.

Difuzia simpl sau imunodifuzia radial (RID) este o metod cantitativ pentruantigene care pot precipita. n aceast tehnic, anticorpul este ncorporat ntr-unstrat subire de agaroz, n timp ce antigenul proteic difuzeaz din godeul n care afost inoculat.

Acolo unde concentraia antigenului este optim pentru a produce reacia deprecipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indic o concentraiecrescut de antigen.Aceasta este o metod destul de sensibil, putnd detecta 1 10 g de protein inu necesit antigen pur pentru determinarea concentraiei.Durata tehnicii este de 24 48 ore i indic doar prezena, nu i funcia proteinelor.Imunodifuzia radial este utilizat pentru msurarea IgA, IgM, IgG, componentelorcomplementului (C3), transferine i altor substane din ser (IgE nu pot fi msuratedeoarece concentraia lor este prea sczut) (fig. 47).

Fig. 47 Imunodifuzia radial simpl

8


9/26

Dubla difuzie metoda Ouchterlony

n aceast metod, antigenul i anticorpul sunt plasate n godeuri diferite efectuate

n gelul de agar; cele dou componente pot difuza unul spre cellalt, cu scopulstabilirii gradientului de concentraie a fiecruia.Acolo unde se atinge concentraia optim, apar liniile de precipitare. Pe bazamodelului liniilor de precipitare, acest test poate fi utilizat, de asemenea, pentru adetermina daca probele sunt identice, dac particip sau nu toi epitopii (identitateparial) sau dac probele sunt diferite (fig. 48).Aceast tehnic se folosete pentru detectarea: proteinei C reactive, antigenuluiHBs, antigenului carcino-embrionar (care apare n unele tipuri de cancer), produilorde degradare ai fibrinogenului, antigenelor fungice (de exemplu: Histoplasma spp.,Blastomyces spp., Coccidioides) etc.

Fig. 48 Imunodifuzia dubl

C. Precipitarea n gel de agar cu ajutorul cmpului electric

Electroforeza reprezint metoda de separare a proteinelor ntr-un cmp electric.Metoda este utilizat n laboratorul clinic pentru detectarea valorilor concentraieide imunoglobuline i a altor proteine serice.Cteva dintre bolile care pot fi diagnosticate, utiliznd aceast tehnic sunt:

mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrm i hipergamaglobulinemia. Deasemenea, electroforeza poate fi folosit pentru detectarea modificrilor ncompoziia lichidului cerebro-spinal al pacienilor cu scleroz multipl.

1. Imunoelectroforeza folosete att separarea electroforetic, ct i precipitareaproteinelor. Se poate utiliza att pentru proteinele specifice (identificare i dozare)din serul sanguin, ct i din urin sau alte lichide.Astfel, o prob de ser este plasat ntr-un godeu realizat n gelul de agar turnat pe olam de sticl. Un curent electric trece prin agar i proteinele se deplaseaz ncmpul electric, conform sarcinii electrice i dimensiunii lor.

Apoi, n gelul de agar se taie un an care se va umple cu anticorp. Deoareceantigenul i anticorpul difuzeaz unul spre cellalt, se vor forma o serie de arcuri deprecipitare (fig. 49).

9


10/26

Fig. 49 Imunoelectroforeza

Aceste arcuri permit caracterizarea proteinelor serice n funcie de:prezen/absen sau traiectul lor neobinuit (de exemplu, human myelomaprotein).Metoda este util pentru identificarea paraproteinelor cu lan greu i uor.Pot fi determinate de asemenea, scderea sau absena imunoglobulinelor n

imunodeficiene, iar originea monoclonal a proteinei Bence-Jones din mielom poatefi confirmat.Imunelectroforeza este o metod valoroas n studiul bolilor autoimune ineurologice.

2. Radioimunoelectroforeza este utilizat n primul rnd ca tehnic de cercetare,care combin imunoelectroforeza cu folosirea antigenelor marcate.Metoda folosete culturi de esuturi. Cnd antigenele marcate reacioneaz cuantiserurile antiumane i antiserurle ce conin lanuri grele i uoare, se confirmoriginea unei proteine specifice (de exemplu protein de: organ, esut sau populaie

celular crescut n cultur).

3. Contraimunoelectroforeza (CIE) sau electroimunodifuzia dubl combincaracteristicile imunodifuziei n gel i electroforezei.Probe din lichidele organismului n care se suspicioneaz prezena agenilormicrobieni sunt plasate n godeuri separate realizate ntr-un mediu de difuzietamponat (agaroz). Godeuri similare situate la 3 mm distan sunt umplute cuanticorpi cunoscui. Prin trecerea unui curent electric, antigenele polizaharidice careau tendina de a fi ncrcate negativ la pH neutru migreaz n direcia opus, sprecatod.

n 30 - 60 de minute antigenul i anticorpul se vor ntlni, se vor cupla n caz despecificitate structural formnd o linie de precipitare distinct. Principiul esteacelai ca la imuno-dubla-difuzie, dar sensibilitatea metodei este mai mare (de 10-20 de ori).CIE poate fi utilizat pentru identificarea att a antigenelor i a anticorpilornecunoscui, de exemplu Ag HBs, a-feto-proteina, polizaharidul pneumococic (nsngele unui pacient cu pneumonie sau n lichidul cefalorahidian al unuia cumeningit), criptococoz, meningit produs de Haemophylus influenzae,endocardit stafilococic (fig. 50).

10


11/26

Fig. 50 Contraimunoelectroforeza

4. Electroforeza n rachet sau electroimunodifuzia unidimensional implicelectroforeza antigenelor dintr-un godeu printr-un mediu de gel cu anticorp fixat.pH-ul gelului este ales n aa fel nct anticorpul s fie imobil, iar antigenul s aibsarcina negativ. Liniile de precipitare care rezult au forma de eap saurachet iar nlimea lor este proporional cu concentraia de antigen. Principalaaplicaie a acestei tehnici este determinarea cantitativ a antigenelor n lichidelebiologice (fig. 51).

Fig. 51 Electroforeza in racheta

3. Reacia de fixare a Complementului (RFC)

Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice careinteracioneaz ntre ele i cu membrana celular. Fiecare component proteictrebuie s fie activat secvenial n condiii potrivite pentru declanarea reaciei.Complexele antigen-anticorp se numr printre activatori i reactia de fixare acomplementului poate fi utilizat pentru identificarea unuia dintre ei, cnd cellalteste cunoscut.In situaia n care reacia de fixare a complementului urmrete detecia deanticorpi necunoscui, procedura este urmtoare:(1) Serul de testat (de la pacient) se titreaz n dubl diluie i se adaug o cantitate

stadardizat de antigen n fiecare tub sau godeu. Dac anticorpul specific esteprezent n serul de testat se vor forma complexele imune.(2) Apoi, la acest amestec se adaug complementul (de obicei, obinut de la porculde Guineea). Dac sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si lvor consuma.(3) n etapa final, este adugat sistemul indicator reprezentat de eritrocitesensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (n cantitatesubaglutinant) extrai din ser de iepure] (fig. 52).

.

11


12/26

Fig. 52 Reactia de fixare a complementului

Interpretarea rezultatului:

- dac anticorpul se potrivete antigenului n prima faz a reaciei, complementul afost fixat nemaifiind disponibil s se lege de hematiile sensibilizate; astfel,eritrocitele rmn nehemolizate testul fiind interpretat ca pozitiv (hematiile rmn

n dop la baza tubului de reacie);- dac anticorpul nu se potrivete cu antigenul (nu exist specificitate),complementul este liber i se leag la eritrocitele sensibilizate care vor fi lizate, iartestul va fi negativ (aspectul n tubul de reacie va fi de hemoliz/rou difuz).Folosind cantiti standardizate de anticorp cunoscut i eantion de antigen,

metoda poate fi utilizat pentru testarea antigenelor.Complementul trebuie standardizat cu grij, iar serul de testat trebuie prelucrat nvederea inactivrii oricrei activiti a complementului seric. Efectuareacontroalelor recomandate (martorii probei de reacie) este foarte important naceast tehnic deoarece anumite preparate de anticorpi folosesc complement fradugarea antigenului, de exemplu, dac este vorba de ser care conine dejacomplexe imune. De asemenea, unele antigene pot avea activitate anti-complement. De aceea, controlul trebuie s includ anticorp singur, respectivantigen singur, pentru a verifica dac nu cumva unul dintre acetia nu fixeazcomplementul fr intervenia celuilalt.

Exprimarea rezultatelor:

- concentraia anticorpilor este exprimat ca cea mai ridicat diluie a serului careindic fixarea complementului (diluie la care nu apare hemoliza)- concentraia de antigen este exprimat ca fiind titrul de antigen care limiteazaciunea hemolitic a complementului.

Reacia de fixarea a complementului este foarte mult utilizat n cercetare i nlaboratoarele clinice n scopul diagnosticrii infeciei cu M. pneumoniae, micozelor,

pentru identificarea paraziilor, virusurilor, a infeciei cu Treponema pallidum (testulWassermann).

4. Reacia de neutralizare

Aceast reacie se bazeaz pe capacitatea anticorpului de a bloca efectulantigenelor toxice, litice sau infectante prin combinaii specifice dintre antigen ianticorp in vivo sau in vitro.

Neutralizarea virusurilor

12


13/26

Neutralizarea activitii virale este cea mai sensibil i specific metod pentrudeterminarea identitii unui izolat i pentru determinarea anticorpilor specifici nserul pacientului.Dac anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iarinfectivitatea este blocat. O fraciune a virusului infectant poate rmne chiar i nprezena antiserului specific, astfel nct infecia poate fi mai degrab amnat,

dect blocat complet.Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitatecunoscut. Pentru testarea serologic, suspensia din virusurile de referin estetestat mpotriva serurilor de testat.Aceast reacie se poate folosi pentru evidenierea:- efectului citopatic (cel mai frecvent);- hemadsorbiei i hemaglutinrii pentru evidenierea orthomyxovirusurilor iparamyxovirusurilor;- inhibiiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu rou-fenol prindezvoltarea celulelor, dac replicarea virusurilor a fost neutralizat;

- reducerii plcii: celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectateaezarea monostratificat cu soluie de agar nutritiv, care conine un colorant vital,cum ar fi rou neutru; celulele infectate apar ca plci necolorate fa de fundalulrou format de celulele viabile; reducerea numrului de plci indic reacia deneutralizare.

Neutralizarea toxin-antitoxin

Cnd o toxin este pus n contact cu antitoxina corespunztoare, efectul toxic altoxinei este neutralizat. Se poate utiliza:

1) In vivo: testul Schick este folosit pentru determinarea susceptibilitii unui individla difterie. Prin injectarea intradermic a unei cantiti mici de exotoxin difteric,toxina este neutralizat de antitoxinele din ser dac individul respectiv este imun inu se produce nici o reacie. Situaia invers este apariia unei zone erimatoasenecrotice n cazul n care individul nu prezint antitoxine (individul este susceptibilla acest infecie).2) In vitro: testul ASLO (Antistreptolizin O) este o reacie de neutralizarefolosit pentru a msura titrul de antistreptolizin O= anticorp indui destreptolizina O un antigen virulent (hemolizina) al bacteriei Streptococcuspyogenes.

Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului defebr reumatic sau glomerulonefrit acut, situaii n care poate fi determinat,atunci cnd streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent.

Principiul

n acest test, diluia succesiv dublu seriale a unei probe de ser de la pacient estepus n contact cu o cantitate de streptolizin O standard (Ag) i, apoi, dup oscurt incubare necesar pentru combinarea specific, se adaug o suspensie de

eritrocite, ca sistem indicator.n tuburile (godeurile) n care diluiile de ser conin suficient streptolizin O(anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce nseamn lipsa hemolizei,

13


14/26

n timp ce n tuburile (godeurile) n care anticorpii nu sunt suficieni pentru aneutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezena hemolizei.

Titrul reaciei este dat de diluia din ultimul tub (godeu) n care nu se observhemoliza; valori normale: 166 250 U/ml.

Titruri crescute exist n boli streptococice i post-streptococice: angina, scarlatina,febra reumatic, glomerulonefrita acut.

5. Teste care utilizeaz antigene sau anticorpi marcai

Imunofluorescen (IF)

PrincipiulProteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marcai folosind colorani fluoresceni (deexemplu, fluoresceina si auramina) prin combinaii chimice, fr a altera ori ainterfera cu proprietile biologice sau imunologice ale proteinelor.

Apoi, aceste proteine pot fi observate n preparatele microscopice folosindmicroscopul cu fluorescen (n lumina ultraviolet).Astfel de anticorpi marcai pot fi utilizai pentru identificarea antigenelor pesuprafaa bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) n celule sau seciunihistologice ori n alte probe.Imunofluorescena este folosit frecvent pentru detectarea anticorpilor si aautoanticorpilor pentru antigenele tisulare i celulare (de exemplu, anticorpiantinucleari, anticorpi antimuchi netezi, anticorpi anticelule parietale).Autoanticorpii apar n bolile autoimune.Imunofluorescena poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o mas congelat de esut,

cu ajutorul criostatului, se realizeaz o seciune; aceasta confer sigurana cantigenele labile nu sunt distruse de substane fixatoare.Imunofluorescena (IF), (fig. 53) poate fi:

Fig. 53 Imunofluorescena direct i indirect

IMUNOFLUORESCEN DIRECTA, cnd anticorpul marcat cunoscut interacioneaz

14


15/26

direct cu un antigen necunoscut i se folosete, n mod obinuit, pentru detectareaantigenului.Anticorpul specific este conjugat cu un compus fluorescent (de obicei, izotiocianatde fluorescein), rezultnd un sistem trasor vizibil cu reactivitate imunologicnealterat.Serul conjugat este adugat la celule sau esuturi pe o lam i se fixeaz pe

antigen, formnd un complex imun stabil. Substanele care nu au participat lareacie sunt ndeprtate prin splare, apoi preparatul este colorat i examinat lamicroscopul cu fluorescen. Antigenul specific legat la anticorpul fluorescent poatefi observat ca un element strlucitor de culoare verde deschis sau galben-portocaliupe fond ntunecat, n funcie de fluorocrom i de filtrele utilizate. Aspectulfluorescenei este caracteristic pentru fiecare antigen tisular.

IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA. n acest test se folosete un proces cu douetape. Un antigen cunoscut se fixeaz pe lam, se adaug ser necunoscut, apoipreparatul este splat; dac anticorpul seric necunoscut corespunde antigenului, va

rmne fixat pe acesta pe lam i va putea fi detectat prin adugarea unui anticorpantiglobulin marcat fluorescent i examinarea cu ajutorul microscopului cufluorescen.Imunofluorescena indirect este de multe ori mai sensibil dect cea direct,deoarece pe locul antigenului ader mai muli anticorpi marcai. n plus,antiglobulina marcat devine un reactiv universal independent de antigenulutilizat, va intra n reacie cu toate imunoglobulinele G ale acelei specii.

Teste cu marcaj enzimatic (ELISA)

Exist multe variante ale acestei metode n funcie de legarea unei enzime deantigen sau anticorp. Enzima este detectat prin testarea activitii enzimatice cusubstratul su.Pentru msurarea anticorpului, se folosete metoda indirect: antigene cunoscutese fixeaz pe un suport solid (de exemplu, microplci din material plastic) seincubeaz cu diluii din serul de testat, se spal, apoi se reincubeaz cu o anti-imunoglobulin marcat cu o enzim (de exemplu, fosfataza alcalin, peroxidaza).Activitatea enzimatic este msurat prin adugarea unui substrat enzimatic, care-n general- determin formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual

sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reacie pozitiv indic faptul c anticorpul afost prezent n proba, iar intensitatea reaciei este proporional cu concentraia deanticorpi din produs (fig. 54).

Fig. 54. Testul ELISA metoda indirect1. Antigen adsorbit pe faza solida; 2. Anticorp de testat, in ser; 3,5. Spalare; 4.

Antiglobulina marcata enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

.

15


16/26

Pentru a msura un antigen se folosete metoda cu doi anticorpi, specifici unul fade altul.Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaug proba de testat careconine antigenul, iar excesul se spal. Se adaug un anticorp specific marcat

enzimatic.Dup o nou splare, se adaug un substrat i activitatea enzimatic este msuratcolorimetric i raportat la concentraia antigenului (fig. 55).

Fig. 55 Tehnica identificrii unui antigen test ELISA1. Anticorp adsorbit pe faza solida; 2. Antigen de testat; 3,5. Spalare; 4. Anticorpspecific marcat enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

Tehnica Western blot este o variant a metodei ELISA. n aceast tehnic,proteinele virale separate prin electroforez n funcie de greutatea lor molecular

sau sarcina electric sunt transferate (blotted) pe o hrtie de filtru (de exemplu,nitroceluloz, nylon). Cnd hrtia este expus serului unui pacient, proteineleimobilizate captureaz anticorpul viral specific i este vizualizat cu ajutorul unuianticorp antiuman legat enzimatic.

Tehnica Western blot este utilizat pentru a confirma rezultatele obinute prin ELISAla pacienii suspectai c ar fi infectai cu HIV, hepatite virale.

Radioimundozarea (Radio Immune Assay)

Principiul de baz al radioimunotestrii este similar celui prezentat la testul ELISA.

Diferena esenial este aceea c markerul utilizat la ELISA este o enzim, iar celfolosit n RIA este un izotop radioactiv (I125, P32). Etapa final a acestei metode oreprezint detectarea activitii radioactive cu ajutorul unui contor de scintilaie,care sesizeaz att emisiile , ct i pe cele .Dei are un grad ridicat de sensibilitate i specificitate, aceast metod prezintdezavantajul c este costisitoare, reactivii expir repede (short-life), iar n ceea ceprivete izotopul este necesar ndeplinirea unor condiii deosebite.Cele mai multe variante RIA folosesc un sistem de testare competitiv. n testulcantitativ pentru anticorpi, suportul solid este nti standardizat prin legarea unuiantigen nemarcat i o concentraie standard pentru anticorp care este marcat cu o

substan radioactiv.Proba (necunoscut) care conine anticorpul ce trebuie testat (i care estenemarcat) se adaug la mediul de reacie. Concentraia anticorpului n proba

16


17/26

necunoscut este determinat prin citirea comparativ a valorilor pe o curbstandard.Curba e funcie de gradul de inhibiie a legrii anticorpului marcat combinat cuvalorile diluiilor n serie ale cantitilor cunocute de anticorp nemarcat.Metoda de lucru este similar cnd antigenele sunt cele care se detecteaz, cuexcepia situaiei n care antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului

liber n prob.RIA se folosete pe scar larg n chimia clinic, endocrinologia clinic itoxicologie, dar nu reprezint un test de rutin n microbiologia clinic. n practicacurent, metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul,cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonulcorticostimulant, vasopresina).n unele laboratoare se mai utilizeaz metoda RIA pentru testarea markerilor pentruhepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, n genral, nlocuitde tehnica ELISA.

Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variant specializat a RIA, utilizatpentru a msura cantitatea de anticorpi IgE serici care reacioneaz cu un alergencunoscut (antigen).

II. in vivo

Intradermoreacia (test cutanat)

1. Prick test-ul este un test uor de efectuat i foarte eficient n diagnosticuldiferitelor alergii. Alergenii introdui la nivel tegumentar (de obicei la nivelulantebraului) n cteva minute induce eliberarea de mediatori preformai cecauzeaz secundar vasodilataie local, edem local i prurit. Acest tip de reaciecaracterizeaz hipersensibilitatea de tip I.

Testul este pozitiv la pacienii cu o varietate mare de tulburri atopice i de obiceise coreleaz cu testul RAST (Radioallergosorbent test) pozitiv pentru IgE seric

specific i testul de provocare cu alergeni specifici, pozitiv la nivelul mucoaseinazale sau bronice.Faptul c aceti pacieni cu tulburri atopice dezvolt o reacie imediat la locul deinoculare (prick test) demostreaz c molecule de IgE sunt fixate pe suprafaacelulelor mastocitare, chiar dac simptomatologia este nazal sau bronhial.

2. Patch test-ul implic aplicarea alergenului pe suprafaa normal tegumentartears n prealabil. De exemplu pacienii cu eczem atopic ce posed Ac specifici(IgE) fa de acarienii din praful de cas, vor dezvolta un patch test pozitiv.Este interesant c o parte din pacienii cu rinit alergic cauzat de praful de cas

(ce conine acarieni) dezvolt o reacie patch pozitiv la acest allergen, manifestatprintr-un infiltrat bazofilic local, sugernd faptul c infiltrarea nu este specificeczemei atopice.

17


18/26

Keratina de suprafa a unei zone neafectate este ndeprtat printr-o tergereuoar i extractul este plasat pe tegument, ntr-o manier ocluziv, pentru 48 deore, dup care urmeaz examinarea local. Leziunile ce apar sunt macroscopiceeczematoase, iar microscopic conin infiltrate de eozinofile i bazofile.

Metode de izolare a anticorpilor

Cercettorii imunologi au deseori nevoie de izolate pure de anticorpi, care pot fiimunoglobuline nespecifice sau antigen nespecifice.

Izolarea imunoglobulinelor nespecifice din ser, se poate obine prin fracionaresecvenial a proteinelor serice, etape ce includ :- precipitarea gama-globulinelor n soluie de 30-50% sulfat de amoniu- filtrarea gelului, pentru obinerea de molecule de dimensiuni corecte- cromatografie de schimb ionic pentru a izola moleculele care sunt ncrcate

pozitiv, la un pH neutru.- Cromatografia de afinitate pentru liganzii naturali ai imunoglobulinelor, cum suntproteina A (proteina A fiind un component al peretelui celular al Stafilococului, ceare capacitatea de a lega regiunile C2 i C3 a majoritii subclaselor de IgG, deexemplu: IgG1, IgG2 i IgG4).

Izolarea anticorpilor antigen-specifici se poate realiza prin cromatografia deafinitate, utilizndu-se antigenul cuplat cu Sepharoz ; anticorpul pur este izolatprin metoda imunoabsorbant.

Producerea de anticorpi monoclonali

Intenia tehnicilor serologice imunologice sunt de a reduce heterogenicitateaantiserurilor utilizate n terapie.Moleculele de antigen ce posed un singur epitop sunt rar ntlnite de-a lungul vieiiunui individ. Cele mai multe antigene, conin sute chiar mii de determinaniantigenici ce exis pe suprafaa celular sau n interiorul unor mixturi desubstane. Cnd aceti antigeni mixai sunt injectai unui animal, un numr egal declone limfocitare sunt stimulate. Chiar dac fiecare clon produce un anticorpspecific, rezultatul final este o mixtur heterogen de molecule de anticorpi, a crei

specificitate i afinitate este deseori necunoscut i dificil de a fi controlat.Cnd aceste seruri policlonale sunt utilizate n sistemele de testare bacteriene, potapare cross-reacii, fie din cauza determinanilor antigenici care se regsesc ladiferite specii sau din cauza mutaiilor care pot induce apariia unor epitopi suficientde apropiai ca specificitate pentru a produce reacii detectabile.Intenia de a produce antigene pure prin tehnici de absorbie au avut parte de unsucces parial.Cum tiina testrii serologice a evoluat, impresia a fost c disponibilitatea unuianticorp ce posed un grad nalt de heterogenicitate molecular cu o specificitate

ngust pentru un singur epitop antigenic, fr dezvoltarea unor cross-reacii, ar

putea rezolva multe din problemele cu care se confrunt utilizarea anticorpilormonoclonali.Specificitatea nalt a anticorpilor monoclonali, ca i produs al unei singure clone de

18


19/26

celule limfoide, s-a putut obine prin investigaii n fuziunea celular i tehnologiahibridoamelor, cercetri efectuate pe oarecei, de Kohler i Milstein.Prin descoperirile acestor 2 oameni de tiin, este acum posibil s se izoleze linii declone a unui singur limfocit care este capabil s produc un singur tip de moleculde anticorpi.

Cea mai mare realizare a fost nu numai izolarea unei singure linii celulare capabiles sintetizeze un singur tip de molecul de anticorp ci i fuzionarea acestor limfocitede oarece cu celule din mielomul de oarece, cu intenia reuit de a producecelule hibride (fig. 56) cu 2 caractere motenite importante:

- capacitatea de a produce anticorpi monospecifici (achiziionai de la limfociteleparentale) i- abilitatea de a crete continuu n cultur, caracter de imortalitate motenit de lalinia de celule mielomatoase.

Animalele (de obicei oareci sau obolani) sunt imunizai cu un antigen. Odat ceanimalele dezvolt un rspuns imun eficient, sunt splenectomizate i se prepar osuspensie celular (se utilizeaz de asemenea ganglionii limfatici).Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adiia de PEG(Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare.Numai o mic parte a acestor celule vor fuziona (frecvena este de 1/105 sau1/106).Mixtura fuzionat este transferat ntr-o cultur ce conine HAT care este omixtur de hipoxantin, aminopterin i timidin..n aceste condiii celulele splenice pot crete n mediul cu HAT, n timp ce celulele

mielomatoase mor n aceste condiii, din cauza defectului metabolic ce nu lepermite utilizarea acestor metabolii.Mediul cu HAT n acest moment conine: celule splenice, celule mielomatoase icelule fuzionate. Celulele splenice mor n acest mediu, n mod natural dup 1-2sptmni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezena HAT.Celulele fuzionate supravieuiesc oricum, din cauza imortalitii bodndite de lacelulele mielomatoase.Unele dintre aceste celule care supravieuiesc au capacitatea de a produceanticorpi la fel ca i celulele splenice.Prin tehnici imune, godeurile n care sunt culturile celulare, sunt testate n scopul

identificrii anticorpilor dorii. i dac se reuete identificarea, urmeaz clonareacelulei din godeul n care s-a identificat anticorpul dorit.Clona care rezult dintr-un singur progenitor, posed caracter de imortalitate i arecapacitatea de a produce anticorpi monoclonali.

19


20/26

Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali

B. Testele pentru evaluarea imunitii mediate celular

Evaluarea competenei imune

Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea funciei sistemului imun celular.Aceste teste include teste cutanate destinate identificrii Hipersensibilitii

ntrziate tip IV, evaluri ale funciei limfocitelor T i B, determinri ale funciilorlimfocitelor i neutrofilelor.Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilitii biologice astfel standardizarealor fiind dificil. Oricum evalurile furnizeaz date importante despre funciacelular n infeciile cu patogeni intracelulari, n imunologia tumorilor i rejetului detransplant.Evaluarea competenei celulelor T i B, ca i funcia celulelor fagocitare au o

importan primordial n determinarea statusului imun al unui individ cu infeciicronice, sindroame de imunodeficien sau pacieni cu terapii imunosupresive (npatologia malign).

1. Teste cutanate DTH (delayed T hypersensitivy)

Imunocompetena i expunerea la anumii ageni infecioi pot fi msurate printestul cutanat. Aceste proceduri sunt simplu de efectuat i dac sunt interpretatecorect, pot fi utilizate n practica medical.Exist 2 tehnici de testare cutanat: fie injectarea intradermic a antigenului, fie

testul prin contact direct. Aceste teste pot fi interpretate la 24-72 de ore de laefectuare.a. injectarea intradermic a antigenului s-a utilizat n special pentru evaluareastatusului imunocompetent i a contactului cu agentul etiologic n diferite infecii,cum sunt: tuberculoza, lepra, bruceloza, varicela, limfogranulomatoza venerian,psitacoza, bola hidatic, leishmanioza, afeciuni fungice.b. teste de contact sunt efectuate prin plasarea antigenului pe suprafaategumentar i acoperirea zonei cu un plasture; testul este util n determniareahipersensibilitii la diferite produse: cosmetice sau spunuri.

Interpretarea corect a rezultatelor este punctul critic al testelor cutanate.Indurarea n jurul locului de injectare, este rezultatul infiltratului mononuclear i aledemului. Aceast reacie apare la 24-48 de ore dup ce se efectueaz testul.

20


21/26

Diametrul zonei de indurare este un indicator al intensitii rspunsului imun celularmpotriva antigenului testat.Eritemul (bine delimitat) de la locul inoculrii este un indicator al hipersensibilitiiimediate. Deobicei dispare la 12-18 ore dar poate persista perioade mai lungi detimp. Reacia eritematoas nu ar trebui luat n considerare n interpretarea testuluicutanat.

n cazul copiilor testele au o valoare mai mic i nu sunt recomandate, mai ales ncursul primului an de via. Copiii probabil nu au fost ndeajuns de expui laantigene ct s-i dezvolte un rspuns adecvat, astfel putnd fi sensibilizai nmomentul injectrii antigenului.Pacienii imunosupresai cum sunt indivizii crora li s-a efectuat un transplant,deobicei sunt anergici i lipsete rspunsul la acest test.Reaciile adverse la testele cutanate pot apare la indivizi hipersensibilizai iimunizai. Reacii locale severe reprezentate de eritem, induraie i necroz se potde asemenea dezvolta. Simptomele sistemice cum sunt: febra i reacia anafilacticsunt rare.

2. Evaluarea limfocitelor

Identificarea i evaluarea funciei celulelor T i B la nivelul sngelui periferic estefoarte important n diagnosticarea bolilor nsoite de imunodeficiene, boliautoimune i n reacii imune n patologia tumoral.Metodele disponibile pentru separarea limfocitelor i a subpopulaiilor specificeinclud: separarea pe gradient de densitate, sortarea celulelor activate prin utilizareafluorescenei, panning-ul, rozetarea, separarea magnetic.

Separarea n gradient de densitate se bazeaz pe faptul c limfocitele sunt maipuin dense dect eritrocitele i granulocitele (fig. 57) i este utilizat pentru a izolamajoritatea limfocitelor sanguine.

Fig. 57. Separarea pe baza gradientului de densitate a limfocitelor

Sngele total este defibrinat prin agitare ntr-un recipient cu bile de sticl iarcheagul care rezult este ndeprtat. Apoi sngele este diluat ntr-un mediu decultur tisular i stratificat ntr-o eprubet plin pe jumtate cu soluie Ficoll. Ficollare o densitate mai mare dect cea a limfocitelor dar mai mic dect a eritrocitelori granulocitelor.Dup centrifugare eritrocitele i polimorfonuclearele neutrofile vor trece n parte

inferioar a poriunii cu Ficoll formnd un depozit la fundul eprubetei, n timp celimfocitele se aeaz la interfaa mediului cu Ficoll.Prepararea limfocitelor poate continua prin ndeprtarea macrofagelor i PMN

21


22/26

reziduale prin adiie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea findeprtate prin aciunea unui magnet.Macrofagele pot fi ndeprtate prin lsarea suspensiei celulare s se aeze pe unplatou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, n timp ce limfocitele vor puteafi ndeprtate prin splare.

Sortarea celulelor activate prin fluorescen

Disponibilitatea anticorpilor monoclonali fa de o multitudine de antigene idezvoltarea flow-citometriei a dus la apariia unei metode foarte eficiente de studiua clasificrii celulare.n aceast tehnic, recunoscut ca i sortarea celulelor activate prin fluorescen,anticorpii marcai cu substane fluorescente sunt incubai mai nti cu o populaiecelular.Celulele conin antigene specifice pe suprafaa lor i se vor lega de anticorpiimarcai; celulele sunt diluate excesiv nainte de a fi inoculate ntr-o singur pictur

celular; citometrul scaneaz fiecare pictur cu o excitaie intens tip laser.Fluxul celular ce traverseaz laser-ul are o rat de peste 5000 celule per minut iaranaliza se efectueaz electronic.Dac celula este marcat, va fi fluorescent i poate fi separat sau sortat prindeflecie electrostatic.Lumina ce rezult n cursul scanrii d informaii despre mrimea celulelor idensitatea antigenelor de suprafa.Citometrele cu fascicol dual, ofer informaii n plus prin scanarea a 2 antigenediferite sitate pe aceeai celul.Instrumentele utilizate sunt foarte sofisticate i necesit o mentenan foarte atent

pentru obinerea de rezultate optime (fig. 58).

Citometrul ofer informaii asupra lungimii vieii celulelor, n timp ce tehnicilemicroscopice necesit distrugerea i fixarea celulelor pe lame speciale care potaltera antigenele de suprafa.Oricum, antigene intracelulare trebuie s fie analizate cu metode microscopice. Sefac eforturi continue pentru a se mbunti calitatea anticorpilor monoclonalipentru a furniza informaii corecte despre histologia, structura celular i localizareaantigenelor.Flow citometria poate efectua o analiz difereniat a celulelor albe sanguine

furniznd informaii despre numrul celulelor B (cu CD19, CD 20 i HLA-DR pesuprafaa lor) celulelor T (CD3), celulelor Th (CD4) i limfocitelor Tc i Ts (CD8).Aceast tehnic este de asemenea util pentru analiza unor antigene prezente pecelulele maligne n anumite patologii hemoproliferative (fenotiparea celulelortumorale pentru diagnostic i clasificarea leucemiilor i limfoamelor, evaluarea iprognosticul unei boli maligne, determinarea aneuploidiei ADN-ului).

22


23/26

Fig. 58. Sortarea celulelor activate prin fluorescenta

Aceast metod mai ofer informaii despre numrul celulelor T, al raportuluiCD4/CD8 care este foarte important n sindroamele imunodeficienelor, dar mai ales

n SIDA.

Rozetarea

Se bazeaz pe faptul c unele populaii limfocitare au receptori pentru eritrocite.Celulele T umane au receptori pentru eritrocitele de oaie (E) reprezentate demoleculele CD2. Cnd sunt amestecate celulele T cu aceste eritrocite, se formeazrozete astfel se pot separa de limfocitele ce nu formeaz rozete, reprezentate delimfocitele B (fig. 59) pe gradient Ficoll.

Fig. 59.Izolarea subpopulaiilor limfocitare prin rozetare

O modificare adus acestei tehnici permite s se izoleze celulele cu ali receptori,de exemplu unele celule T (celulele T) au receptori pentru fragmentul Fc al IgG(Fc).

Aceste celule pot fi identificate i izolate prin rozetare cu eritrocite de bou,sensibilizate cu anticorpi anti eritrocite de bou.

Panning

Populaiile celulare pot fi separate pe platforme sensibilizate cu anticorpi. Anticorpiise leag non-covalent la suprafaa de plastic (ca n cazul unei tehnici imune pe fazsolid) i mixtura celular pe aplic pe platform.

Celulele antigen (+) se leag de anticorpi iar celulele antigen (-) pot fi ndeprtateprin splare.Prin schimbarea condiiilor de cultur sau prin digestie enzimatic celular pe

23


24/26

suprafaa platformei uneori este posibil s se recupereze celulele ce s-au fixat pesuprafa.Astfel, metoda este mult mai eficient pentru ndeprtarea unei subpopulaiicelulare, mai degrab dect izolarea ei.De exemplu se poate utiliza pentru separarea CD4 de CD8 i separarea Th de Tsprin utilizarea de anticorpi anti Ig care se leag la suprafaa anticorpului de pe

celula B.Prin sensibilizarea platformei cu molecule de antigen, celulele ce se vor lega deacesta pot fi separate dintre celulele care nu s-au legat de antigen (fig. 60).

Fig. 60.Iizolarea subpopulaiilor limfocitare prin metoda panning

Separarea magnetic

Aceast metod utilizeaz bile magnetice mbrcate n anticorpi specifici (de

exemplu anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu populaia celular i seleag de acelea care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi ndeprtate sauizolate prin aplicarea unui cmp magnetic.O alt metod util pentru ndeprtarea populaiilor celulare care nu reprezintinteres, se bazeaz pe anticorpi i pe sistemul Complement. Cnd un anticorpspecific (de exemplu CD8) este adugat la o mixtur celular, urmat de adugarede Complement, acea subpopulaie celular va fi lizat; n mod natural aceastmetod se aplic doar anticorpilor care fixeaz Complementul i unde populaiacelular int are suficiente antigene pentru a fixa Complementul n doz litic.

Evaluarea competenei celulelor T

Enumararea celulelor T1. enumerarea numrului total al celulelor T poate fi efectuat prin utilizareaanticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substane cu fluorescen. Celulele suntnumrate prin microscopie cu fluorescen sau prin flow citometrie; subsetulcelulelor T poate fi numrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali faa de CD4 sauCD8.

2. metoda rozetelor E poate fi utilizat pentru numrarea celulelor T: celulele T aureceptori pentru eritrocitele de oaie; dac limfocitele din sngele periferic suntamestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de

24


25/26

eritrocitele de oaie i vor forma rozete ce pot fi numrate la microscopia optic.

Evaluarea funciei celulelor TTransformarea limfoblasticn mod normal, celulele T funcionale se transform n celule blastice mari, cu o

intensificare a sintezei ADN-ului, cnd sunt expuse la fitohemaglutinin (o substanmitogenic) sau concavalina A (un extract de plante care stimuleaz n mod specificcelulele T). Gradul mitozei este msurat prin gradul de ncorporare a timidineitriturate la mediul de reacie, apoi se msoar prin scintilaie spectrometric.

Evaluarea competenei limfocitelor BEnumerarea limfocitelor B1. prin tehnici imunofluorecente prin utilizarea anticorpilor policlonali marcai cufluorescein sau prin flow citometrie

2. antiseruri monoclonale mpotriva lanurilor grele sau uoare, se pot utiliza pentruevaluarea subclaselor limfocitelor B3. rozete EA sau EAC: celulele B au receptori pentru C3 i Fc a moleculei deanticorpi astfel pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbricate cu anticorpii lor(EA); de asemenea pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbrcate cu anticorpi iComplement (EAC) i pot fi numrate la microscop.

Testele pentru evaluarea funciilor celulelor B2. transformarea limfocitar; n mod normal celulele B funcionale pot fi stimulates se transforme n celule blastice mari cu sintez crescut de ADN, cnd sunt

expuse la LPS (lipopolizaharid). Acesta poate fi msurat prin gradul de ncorporare atimidinei triturate adugate la mediul de reacie3. determinarea nivelului imunoglobulinelor prin electroforeza poteinelor; o scderesau o cretere a gamma-globulinelor poate atrage atenia asupra unei sintezeanormale de anticorpi4. cuantificarea diferitelor tipuri de imunoglobuline, prin diferite metode: RIA, ELISA,IF etc5. imunizarea activ poate fi utilizat in vivo, pentru a testa capacitatea de aproduce anticorpi. De exemplu, persoana este imunizat cu trivaccinul DiTePer (antidiftero-tetano-pertusis) apoi este testat prin testul Schick pentru a se evalua

dezoltarea imunitii antidifterice.

Evaluarea funciei fagocitare1. evaluarea chemotaxiei este efectuat prin testarea capacittii celulelorfagocitare de a migra prin membrane spre substana chemotactic2. evaluarea digestiei sau fagocitozei este efectuat prin vizualizare direct anumrului de particule ingerate utiliznd microscopul3. evaluarea ingestiei i/sau distrugerea intracelular prin utilizarea testului dereducere cu NBT (nitro blue tetrazolium). n mod normal celulele fagocitare cnd

sunt stimulate (de exemplu de endotoxin) inger colorantul i l reduce (virareaculorii din galben n albastru). n condiii anormale capacitatea de distrugeneintracelular este asociat cu scderea testului de reducere.

25


26/26

Evaluarea sistemului ComplementCea mai simpl msur a activitii Complementului este determinareaconcentraiei serice, care induce liza a 50% din preparatul standardizat de eritrocite

sensibilizate cu anticorpi (EA). Acest test se poate efectua n godeuri sau neprubete.Un sistem simplu care furnizeaz o msur a activitii Complementului estehemoliza radial. Tehnica este similar cu cea a imunodifuziei radiale, cu excepiafaptului c godeurile conin un ser test i gelul conine EA.O zon de hemoliz se dezvolt n jurul godeului i mrimea acestei zone esteproporional cu cantitatea de Complement din godeu. Aceast tehnic msoaractivitatea total a cilor clasic i litic (C1-C9) dar dac serul prezint o deficiena Complementului, nu se poate identifica care dintre proteine lipsete.Componentele individuale pot fi msurate separat pentru a determina fie nivelul

total fie nivelul funcional.Aceasta este o distincie foarte important att timp ct un component poate fiprezsent n cantiti normale dar nefuncional.Nivelul total al proteinelor sistemului Complement este deobicei msurat cu RIA(Radio Immune Assay) sau prin tehnica ELISA, prin utilizarea unui anticorp specificpentru proteina care este investigat.Nivelele funcionale sunt msurate pentru a detecta fiecare component proteic aComplementului, prin furnizarea unui cocktail de celule roii sensibilizate plus toatecomponentele necesare pentru liz, cu excepia celei care este investigat.

diagnosticul imunologic

Documents