diagnostica clinica e...
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DIAGNOSTICA CLINICA
E
MICROBIOLOGICA
Benedetta Cremonesi
DELEGAZIONE REGIONALE LOMBARDIA
CORSO DI PREPARAZIONE
ALL’ESAME DI STATO PER L’ABILITAZIONE
ALLA PROFESSIONE DI BIOLOGO (Sez.A-Sez.B))
IL BIOLOGO NEL SISTEMA SANITARIO NAZIONALE (SSN)
REQUISITI DI ACCESSO AL SSN
SERVIZIO DI MEDICINA DI LABORATORIO: ASPETTI
ORGANIZZATIVI E RUOLO DEL BIOLOGO
PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE NELLA DIAGNOSTICA
CLINICA E MICROBIOLOGICA
Il Biologo nel
Sistema Sanitario Nazionale
Benedetta Cremonesi
Link http://www.salute.gov.it/ temi e professioni
Esistono gli Ordini Professionali per:
Medici chirurghi e Odontoiatri, Veterinari, Farmacisti, Psicologi, Chimici e
Fisici, Biologi, Professioni infermieristiche, Ostetriche, Tecnici sanitari di
Radiologia medica e delle Professioni Sanitarie Tecniche, della
Riabilitazione e della Prevenzione
Lo stato italiano riconosce attualmente 30 professioni SANITARIE tra
cui quella di Biologo (L. 24.05.1967, n° 396)
Per l’esercizio di tali professioni è obbligatoria l’iscrizione ai rispettivi
ORDINI PROFESSIONALI che promuovono:
• autonomia delle professioni sanitarie
• qualità delle prestazioni
• principi etici dell'esercizio professionale indicati nei codici deontologici,
a garanzia della salute delle persone)
Circa 1,200,000 professionisti che operano in strutture sia pubbliche che
private
Figura professionale di Biologo istituita con la Legge 396/67Legge 24
Maggio 1967,
n.396
Ordinamento
della Professione
di Biologo
Legge 24
Maggio 1967,
n.396
Ordinamento
della Professione
di Biologo
[…]
Art. 15 (a). Disciplina della dirigenza del ruolo sanitario
Decreto
Legislativo
30 dicembre
1992,
n. 502
Riordino della
disciplina in
materia sanitaria
La collocazione dei dirigenti biologi nel SSN:rientra negli ambiti professionali riconosciuti dalla legislazione
La dirigenza del ruolo sanitario e' articolata in due livelli.
Al personale medico e delle altre professionalita' sanitarie del
primo livello sono attribuite le funzioni di supporto, di collaborazione
e corresponsabilita', con riconoscimento di precisi ambiti di
autonomia professionale, nella struttura di appartenenza, da attuarsi
nel rispetto delle direttive del responsabile.
Al personale medico e delle altre professionalita' sanitarie del
secondo livello sono attribuite funzioni di direzione ed
organizzazione della struttura da attuarsi anche mediante direttive
a tutto il personale operante nella stessa e l'adozione dei
provvedimenti relativi, necessari per il corretto espletamento del
servizio;
Al primo livello dirigenziale del ruolo sanitario si accede
attraverso concorso pubblico
Il secondo livello dirigenziale del ruolo sanitario viene conferito
come incarico
Decreto
Legislativo
19 giugno 1999,
n. 229
Norme per la
razionalizzazione
del SSN
Art. 13
(Modificazioni all'articolo 15 del D.L. 30 dicembre 1992, n.502)
L'articolo 15 del decreto legislativo 30 dicembre 1992, n.502,
e successive modificazioni, e' sostituito dai seguenti:
"Art. 15 (Disciplina della dirigenza medica e delle professioni
sanitarie)”
La dirigenza sanitaria e' collocata in un unico ruolo, distinto per profili
professionali, ed in un unico livello, articolato in relazione alle
diverse responsabilita' professionali e gestionali.
Alla dirigenza sanitaria si accede mediante concorso pubblico
per titoli ed esami, disciplinato ai sensi del D.P.R. 10 dicembre
1997, n.483.
Tutti i dirigenti – medici e non medici – ad eccezione di quelli
amministrativi, svolgono anzitutto un’attività professionale alla
quale può affiancarsi un incarico gestionale in senso proprio
Requisiti di accesso al
Sistema Sanitario Nazionale
Benedetta Cremonesi
D.P.R.
10 dicembre
1997,
n. 483
Regolamento
recante la
disciplina
concorsuale per il
personale
dirigenziale del
SSN
Accesso alla Sanità Pubblica
Requisito obbligatorio : iscrizione all’ordine professionale
D.P.R.
5 giugno 2001,
n. 328
Modifiche ed
integrazioni della
disciplina dei
requisiti per
l’ammissione
all’esame di Stato
e delle relative
prove per
l’esercizio di
talune
professioni,
nonché della
disciplina dei
relativi
ordinamenti
Art. 33 L'iscrizione nella sezione B è subordinata al
superamento di apposito esame di Stato.
Per l'ammissione all'esame di Stato è richiesto il possesso della
laurea in una delle seguenti classi:
a )Classe 12 - Scienze biologiche;
b )Classe 1 - Biotecnologie;
c) Classe 27 - Scienze e tecnologie per l'ambiente e la natura
art.32 L'iscrizione nella sezione A è subordinata al
superamento di apposito esame di Stato.
Per l'ammissione all'esame di Stato è richiesto il possesso della
laurea specialistica in una delle seguenti classi:
a) Classe 6/S - Biologia;
b) Classe 7/S - Biotecnologie agrarie
c) Classe 8/S - Biotecnologie industriali;
d) Classe 9/S - Biotecnologie mediche, veterinarie, e
farmaceutiche;
e) Classe 82/S - Scienze e tecnologie per l'ambiente e il
territorio;
f) Classe 69/S - Scienze della nutrizione umana.
D.P.R.
5 giugno 2001,
n. 328
D.P.R.
5 giugno 2001,
n. 328
DEFINIZIONE DELLE COMPETENZE PROFESSIONALI
Art. 31 (Attività professionali)
1. Formano oggetto dell'attività professionale degli iscritti nella sez. A
[…]
b)analisi biologiche (urine, essudati, escrementi, sangue),
sierologiche, immunologiche, istologiche, di gravidanza,
metaboliche e genetiche;
[…]
d) identificazione di agenti patogeni (infettanti ed infestanti)
dell'uomo […]
h) problemi di genetica dell'uomo […]
2. Formano oggetto dell'attività professionale degli iscritti nella sez. B
a) procedure analitico-strumentali connesse alle indagini
biologiche;
b) procedure tecnico-analitiche in ambito biotecnologico,
biomolecolare, biomedico anche finalizzate ad attività di ricerca;
[…]
d) procedure tecnico-analitiche in ambito chimico-fisico,
biochimico, microbiologico, tossicologico, farmacologico e di
genetica;
e) procedure di controllo di qualità.
[…]
Il laureato triennale iscritto all’Ordine dei Biologi sez.B in
applicazione all’Art.31 del DPR 328/01, può svolgere attività
professionale nel ruolo tecnico – esecutivo nei laboratori di
analisi del settore agro-alimentare,ambientale, della ricerca e
dell’industria del farmaco ecc…
D.P.R.
5 giugno 2001,
n. 328
Il lI laureato triennale iscritto all’Ordine dei Biologi nella Sez. B
non può firmare i referti o i rapporti di prova in quanto di
competenza del Dirigente (iscritto nella Sez. A).
Non nei laboratori di analisi cliniche, dove è prevista la figura del
tecnico di laboratorio biosanitario con laurea triennale
conseguita presso la facoltà di medicina.
L’Art .8 (norma transitoria) prevede che il Biologo Junior in
possesso del diploma universitario possa svolgere la sua attività
professionale nei laboratori di analisi cliniche.
Accesso alla Sanità Pubblica
elenco delle specializzazioni riconosciute dal Ministero della Salute
per l’accesso ai concorsi pubblici.
DMS 30/1/98 e DMS 31/1/98 e successive modifiche
Requisito obbligatorio : possesso della specializzazione
DMS
30 gennaio 1998
Tabelle relative
alle discipline
equipollenti
previste dalla
normativa
regolamentare
per l’accesso al
secondo livello
dirigenziale per il
personale del
ruolo sanitario del
SSN
AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI
ANATOMIA PATOLOGICA
BIOCHIMICA CLINICA
FARMACOLOGIA E TOSSICOLOGIA CLINICA
LABORATORIO DI GENETICA MEDICA
MEDICINA TRASFUSIONALE
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
PATOLOGIA CLINICA
(LABORATORIO DI ANALISI CHIMICO-CLINICHE E MICROBIOLOGIA)
Analisi chimico- cliniche Genetica
Radiommunologia, immunometria
Medicina trasfusionale
Procreazione Assistita
Igiene
Epidemiologia
Tossicologia
Biologia molecolare
Anatomia patologica
Nutrizione e alimenti
D.P.R.
10 dicembre
1997,
n. 484
Regolamento
recante la
determinazione
dei requisiti per
l’accesso alla
direzione
sanitaria
aziendale e dei
requisiti e dei
criteri per
l’accesso al
secondo livello
dirigenziale per il
personale del
ruolo sanitario del
SSN
Art. 4 Discipline
E) Categoria professionale dei biologi
Biochimica clinica
ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi
Laboratorio di genetica medica
ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi
Microbiologia e virologia
ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi
Patologia clinica
ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi
Igiene degli alimenti e della nutrizione
ricompresa nell’area di sanità pubblica
DMS
30 gennaio 1998
Tabelle relative
alle discipline
equipollenti
previste dalla
normativa
regolamentare
per l’accesso al
secondo livello
dirigenziale per il
personale del
ruolo sanitario del
SSN
DMS
23 Marzo 2018
Modifica al
decreto 30
gennaio 1998 e
successive
modificazioni
AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI
Esempio: Biochimica Clinica
SCUOLE EQUIPOLLENTI:
Chimica biologica o biochimica
Biochimica e chimica clinica
Biologia clinica
Semeiotica e diagnostica
di laboratorio
Medici laboratoristi
Settore laboratorista
Biochimica clinica - scuole
equipollenti:
Farmacologia medica;
Farmacologia e tossicologia
clinica;
Patologia clinica e biochimica
clinica
Settori e medici laboratoristi
ospedalieri
Analisi cliniche di laboratorio
Analisi chimico-cliniche
Patologia clinica
Biochimica analitica
Farmacologia
Farmacologia applicata
Allergologia e immunologia
clinica
Patologia generale
AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI
Scuola di Specializzazione patologia clinica e biochimica clinica
Obiettivi formativi di base
Acquisire le conoscenze generali anche di tipo metodologico di
chimica analitica, chimica biologica, biologia molecolare,
patologia generale e statistica sanitaria
Acquisire competenze nell'uso della biologia cellulare e
molecolare applicate ai sistemi automatizzati di biochimica
clinica e patologia diagnostica clinica
Acquisire competenze nell'ambito dell'oncologia, immunologia e
immunopatologia
Acquisire competenze teoriche pratiche e manageriali per
conseguire la capacità decisionali ed organizzative in medicina
di laboratorio
SERVIZIO DI
MEDICINA DI LABORATORIO:
Aspetti organizzativi
e ruolo del Biologo
SERVIZIO DI DIAGNOSTICA DI DI LABORATORIOD.P.C.M.
10 febbraio 1984
Indirizzo e
coordinamento
dell’attività
amministrativa
delle regioni in
materia di
requisiti minimi di
strutturazione, di
dotazione
strumentale e di
qualificazione
funzionale del
personale dei
presidi che
erogano
prestazioni di
diagnostica di
laboratorio
Art. 2. Identificazione delle strutture
I laboratori di analisi cliniche ai fini del presente provvedimento
sono:
1) i servizi di laboratorio degli ospedali pubblici [….], nonché
quelli degli istituti pubblici di ricovero e cura a carattere
scientifico […]
2) i servizi di laboratorio degli istituti universitari nonché quelli
degli ospedali policlinici universitari […]
3) i laboratori di analisi cliniche dei presidi territoriali delle
U.S.L. ivi compresi i laboratori dei presidi multizonali di
prevenzione che effettuano analisi cliniche;
4) i laboratori di analisi cliniche privati aperti al pubblico.
D.P.C.M.
10 febbraio 1984
Art. 3. Classificazione funzionale
I laboratori di analisi privati aperti al pubblico si distinguono in:
1) laboratori generali di base;
2) laboratori specializzati;
3) laboratori generali di base con settori specializzati.
I laboratori generali di base sono presidi pluridisciplinari che
svolgono indagini diagnostiche di biochimica clinica, di ematologia e
di microbiologia su campioni provenienti da escreti, secreti e prelievi
umani […]. Nei laboratori generali di base
non devono essere impiegate metodiche che utilizzino radioisotopi.
I laboratori specializzati sono strutture destinate a esplicare
indagini diagnostiche ad alto livello tecnologico e professionale nei
settori di: chimica clinica e tossicologica;ematologia;microbiologia e
sieroimmunologia;citoistopatologia;virologia; genetica medica.
SERVIZIO DI DIAGNOSTICA DI DI LABORATORIOD.P.C.M.
10 febbraio 1984
Art. 8. Organico e qualificazione funzionale del personale
L’organico minimo del personale dei laboratori generali di base è
costituito da:
1) un direttore medico o biologo. Entrambi devono essere iscritti
all’albo dell’ordine di appartenenza. essere in possesso della
laurea in medicina e chirurgia e della specializzazione [...] o della
laurea in scienze biologiche e della specializzazione […]
Nel caso che il direttore sia un biologo deve essere compreso tra i
collaboratori un laureato in medicina;
2) un collaboratore laureato in medicina, biologia o chimca;
3) un tecnico di laboratorio diplomato;
4) un ausiliario con mansioni esecutive;
5) un addetto alle attività amministrative.
D.P.C.M.
10 febbraio 1984
Art. 8. Organico e qualificazione funzionale del personale
L’organico minimo del personale dei laboratori specializzati è il
seguente:
a) per i laboratori di analisi chimico-cliniche e tossicologiche il
personale previsto è uguale a quello dei laboratori di base. Il direttore
può essere anche un laureato in chimica iscritto all’albo professionale
dei chimici.
Nel caso che il direttore sia un chimico o un biologo deve essere
compreso tra i collaboratori un laureato in medicina e chirurgia;
b) per i laboratori specializzati in microbiologia e
sieroimmunologia, ematologia e genetica medica, virologia, il
personale previsto è uguale a quello dei laboratori generali di base;
c) per i laboratori specializzati in citoistopatologia il personale
previsto è uguale a quello dei laboratori generali di base. Il direttore
responsabile deve essere un laureato in medicina e chirurgia […]
L’organico dei settori specializzati dei laboratori generali di base deve
prevedere almeno un laureato con i requisiti richiesti per la direzione
della relativa branca specialistica.
Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)
Direttore: biologo, chimico o medico con esperienza e formazione Manageriale
supervisione analisi, firma dei risultati e giudizi diagnostici
Registrazione e archiviazione degli esami
Gestione del personale e della sicurezza sul lavoro
Gestione economica
Scelta e approvazione dei sistemi diagnostici
Valutazione costi/benefici dell’aggiornamento tecnologico e/o metodologico
Supervisione del sistema gestione qualità
Dirigente: biologo, chimico o medico, ruolo clinico e manageriale;
Organizzazione attività di laboratorio del settore di competenza
Esecuzione di alcuni esami(es: lettura preparati e loro refertazione)
Verifica ed interpretazione risultati per corretta formulazione del referto
Interazione con il clinico per favorire interpretazione risultati e il loro corretto utilizzo
nel processo diagnostico terapeutico
Controllo e mantenimento della qualità (risultati e processi)
Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)
Tecnico sanitario di laboratorio biomedico (TSLB):
figura professionale disciplinata da legge n. 745/1994 (e successive modifiche);
laurea triennale con competenze relative a settori di biochimica, microbiologia,
immunologia, farmacotossicologia, biologia molecolare, ematologia...
funzioni:
Esecuzione delle analisi
Verifica correttezza dei risultati (in accordo con protocolli definiti dai dirigenti
responsabili)
Verifica corretto funzionamento degli strumenti utilizzati e manutenzione delle
apparecchiature
Responsabile esecuzione controlli qualità
Verifica della correttezza tecnica dei risultati forniti
Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)
Infermiere:
funzioni:
Esecuzione prelievo ematico
Raccolta campioni biologici
Ritiro e verifica idoneità dei campioni dei pazienti
Personale ausiliario e amministrativo:
funzioni:
Accettazione campioni
Controllo e trasposto campioni
Gestione e consegna referti
BIOSICUREZZA IN LABORATORIO
Manuale di biosicurezza pubblicato da OMS
Compendio di regole pratiche: manuale operativo di sicurezza che identifica i rischi
noti e potenziali e specifica le procedute da adottare per eliminare o ridurre tali rischi
Requisiti minimi per i laboratori a qualsiasi livello di biosicurezza,
diretti alla lavorazione con tutti i microrganismi
Responsabilità del Direttore e del Preposto a sicurezza del laboratorio
BIOSICUREZZA IN LABORATORIO
Manuale di biosicurezza pubblicato da OMS
Progettazione del laboratorio e attrezzature
Attrezzature di laboratorio (scelta attrezzature secondo criteri per eliminare o
ridurre contatto operatore e materiale biologico, rispondenti a requisiti
di resistenza strutturali..)
Sorveglianza sanitaria (prevenire e individuare malattie occupazionali)
Formazione e addestramento (su procedure e buona pratica di laboratorio;
rischi da inalazione per generazione aerosol da strisci, centrifugazione,
apertura contenitori, manipolazione campioni)
Trattamento dei rifiuti (smaltimento taglienti contaminati, rifiuti non contaminati)
Decontaminazione (sterilizzazione in autoclave a vapore)
Rischi da attrezzature, chimico, elettrico, da incendio e da radiazioni
Accesso al laboratorio (esporre simbolo di rischio biologico, vietare accesso a
non autorizzati)
Dispositivi individuali di protezione (camici, quanti, occhiali di sicurezza, visiere)
Procedure (per versamenti accidentali di liquidi, divieto di pipettare a bocca..)
Aree di lavoro (ordine e pulizia del laboratorio..)
Gestione della biosicurezza (il direttore ha responsabilità di assicurare l’adozione
del piano di sicurezza)
Il laboratorio esegue analisi cliniche
(biologiche,microbiologiche,sierologiche,
immunoematologiche, ematologiche, biofisiche, citologiche)
di materiale derivato dal corpo umano per:
ricavare informazioni per la diagnosi e la prevenzione e il
trattamento di patologie
Valutare lo stato di salute del paziente
spesso ordinate in pannelli o profili per una migliore valutazione dello
stato del paziente
Es: pannello epatico , pannello elettroliti, profilo lipidico...ecc
Le analisi comprendono le procedure per la determinazione, la misura o
la descrizione della presenza o assenza di varie sostanze o organismi
nel corpo
ESAMI DI LABORATORIO (esempi)
Pannello metabolico: valutazione stato generale del paziente
Funzionalità epatica (AST, ALT), renale, (creatinina) equilibrio elettrolitico (Na, Cl, K),
proteine (albumina), glicemia...
Biomarcatori neoplasia (informazioni clinicamente utili da associare ad altri
esami, per diagnosi, prognosi, monitoraggio terapie, eventuali recidive, es: PSA)
Valutazione funzione emostatica
(PT, PTT per la valutazione efficacia via estrinseca ed intrinseca della coagulazione)
Valutazione patologie ematologiche (esame emocromocitometrico ,diagnostica
anemie;)
Indagini colturali e sierologiche (diagnosi malattie infettive, virali (HIV, epatiti virali) e
batteriche (identificazione organismi patogeni nelle alte e basse vie respiratorie, vie
urinarie...)
Immunoematologia (determinazione gruppi sanguigni)
Diagnosi patologie autoimmuni (celiachia): ricerca auto-anticorpi (Ab anti endomisio)
Diagnosi malattie endocrine (squilibri o disfunzioni ormonali): dosaggi ormoni (TSH)
Norma ISO 15189
“ GESTIONE DELLA QUALITA’ NEI LABORATORI DI ANALISI CLINICHE”
TERMINI E DEFINIZIONI
Procedure pre-analitiche
fasi che comprendono, ordinate cronologicamente:
La richiesta clinica
l’accettazione delle analisi
La preparazione del paziente
La raccolta del campione primario
Trasposto al/in laboratorio
Inizio dei procedimenti di analisi
Procedure post-analitiche
fasi che comprendono, ordinate cronologicamente:
La stesura e l’interpretazione dei risultati delle analisi da parte del laboratorio clinico
La refertazione
La conservazione dei campioni
La trasmissione dei risultati delle analisi
l’eliminazione del campione primario
Procedura analitica
Serie di operazioni, descritte in maniera
specifica, utilizzate nell’esecuzione
di particolari analisi, in accordo ad un
metodo stabilito
FASE PREANALITICA:
Identificazione del
paziente
Valutazione della richiesta
delle analisi
Prelievo e raccolta del
materiale biologico
Trasporto del campione in
laboratorio
Accettazione del campione
Preparazione del
campione prima
dell’analisi
FASE ANALITICA:
Esecuzione delle analisi
Misura e calcolo dei risultati
FASE POSTANALITICA:
Validazione dei risultati
Analisi della loro coerenza
Refertazione
Invio del referto al medico richiedente
valutazione dell’idoneità del campione (raccolta, trasporto, corretta quantità)
60 -70% DEGLI ERRORI DI LABORATORIO
Fase critica:
PRELIEVO EMATICO: errori identificativi, campioni emolitici, insufficienti, coagulati,
non idonei per tipo o quantità
STATO DEL PAZIENTE: esercizio fisico, stress, dieta, effetti posturali, comorbidità...
FASE PREANALITICA
FASE ANALITICA
utilizzo di metodiche e strumentazioni adeguate al tipo di analisi richiesta
Performance o attendibilità di un metodo analitico: è la qualità che lo caratterizza
Determinata da:
precisione (concordanza tra i risultati di una serie di misure ottenute con stesso
metodo sullo stesso campione)
Accuratezza (grado di concordanza tra il valore medio trovato e il valore vero
(conosciuto)
Sensibilità (attitudine del metodo a dosare piccole quantità della sostanza)
Specificità (proprietà di un metodo solo e interamente la sostanza studiata)
Dipendono da esecuzione analitica
(organizzazione ed efficienza operativa del laboratorio)Dipendono da metodo
FASE ANALITICA
partecipazione a valutazioni inter-laboratorio o a valutazione esterne di Qualità (VEQ)
(determinazione dell’accuratezza delle procedure): analisi di campioni inviati da
laboratori esterni o da organismi regionali o internazionali
Sistema di controllo di qualità interno: SISTEMA OPERATIVO per individuare gli
errori in fase analitica (controlla l’attendibilità di un metodo)
taratura/calibrazione dei sistemi analitici e verifica della precisione
Errori sistemici: si ripetono quando si fa lo stesso tipo di analisi;
causa conosciuta o individuabile, eliminabile (scarsa sensibilità o specificità di un
metodo, manualità errata dell’operatore….)
Errori casuali: inevitabili, di piccola entità, imputabili a condizioni operative
FASE POSTANALITICA
deve contenere tutte le informazioni necessarie
(dati anagrafici paziente, data del prelievo, tipo di campione, tipo di esame, metodologia
diagnostica, risultati, valori di riferimento con esplicita unità di misura,
nome indirizzo e identificazione del laboratorio che ha eseguito il test)
Fase di refertazione dell’esito dell’analisi
Il biologo valuta tale esito in corrispondenza con i parametri riconosciuti come
standard e ne verifica la plausibilità clinica
Il referto risultante deve essere facilmente comprensibile e interpretabile
Il referto di laboratorio è caratterizzato da aspetti interpretativi, frutto di un complesso
processo che richiede competenze professionali sia tecniche che cliniche, in grado
fornire informazioni utili alla cura del paziente
eseguiti da laboratori di analisi, pubblici o privati, localizzati all’interno di
cliniche/ospedali o indipendenti. “In alcuni casi le analisi e le interpretazioni
possono provenire da laboratori esterni a quello che redige i referti e questa
informazione deve essere chiaramente riportata” (NORMA ISO15189)
FASE POSTANALITICA
Il referto deve essere consegnato all’utilizzatore nell’intervallo di tempo concordato
indicatore di qualità Turn Around Time (T.A.T.): tempo che intercorre dalla
richiesta dell’esame alla refertazione del risultato
può essere inteso come il tempo che intercorre dalla ricezione del campione da
parte del laboratorio alla refertazione dei risultati.
TAT rappresenta un metro di valutazione. Migliorare il tempo di risposta di alcuni
test chiave ha un impatto positivo sia sui pazienti che sul sistema sanitario
(diagnosi più rapida e la riduzione dei tempi di ospedalizzazione)
Eliminare o ridurre notevolmente la complessità delle fasi
delle attività di laboratorio per eliminare
o ridurre la possibilità di errore
eliminare un’ampia serie di operazioni ad elevato rischio
(d’errore e biologico), valorizzando le risorse umane
utilizzo di combinazioni di strumentazioni,
programmi informatici o altri processi atti sostituire,
affiancare o estendere il contributo e la capacità dell’uomo
di portare a termine un determinato processo,
al fine di incrementare la produttività e l’efficienza del servizio*.
*“L’automazione della fase preanalitica” G.Lippi et al., biochimica clinica, 2007, vol. 31, n. 2
AUTOMAZIONE DI LABORATORIO
Strumenti in grado di meccanizzare processi
di accettazione, separazione, aliquotazione, distribuzione
Sistemi di automazione:
Reattivi pronti all’uso (enzimi, coenzimi, tamponi): abbattimento del
lavoro manuale di preparazione
Analizzatori con hardware e software complessi;
(ampio pannello di esami su singola strumentazione analitica)
mini sistemi per determinazioni di base (ad es emogas) dirette a letto del
paziente definite “POCT” (“point-of-caretesting”)
da destinare all’emergenza ed in generale al di fuori del laboratorio
(in sala operatoria, in ambulatorio, in corsia,…);
settori manuali o solo parzialmente automatizzati
(anatomia-citologia, batteriologia,etc.)
automazione globale di tutti i processi analitici del laboratorio (fasi
pre-analitica, analitica, e post-analitica)
automazione modulare per singole aree analitiche o “isole”
Principali tecniche analitiche
nella diagnostica clinica e
microbiologica
Benedetta Cremonesi
le tecniche di Laboratorio si avvalgono delle più svariate proprietà chimiche,
fisiche e sono state sviluppate a scopo diagnostico presentando caratteristiche di
specificità e sensibilità
la scelta del tipo di analisi dipende dalle caratteristiche del campione e dell’analita
In campo clinico vengono utilizzate sia a scopo qualitativo che quantitativo per la
determinazione di microrganismi patogeni o molecole (ormoni, proteine,
oncoproteine, anticorpi, citochine e marcatori di danno d'organo, farmaci, droghe
d’abuso)
SPETTROFOTOMETRIA
La fotometria è il processo che determina la quantità di luce assorbita da
atomi, molecole e viene usata per la stima quantitativa di composti.
Spettrofotometro:
strumento basilare nella chimica clinica ; rileva l'effetto dell'energia raggiante
su atomi e molecole su lunghezze d'onda diverse da quelle rilevate dall'occhio
umano (400 -700 nm), per esempio U.V. (200 - 400 nm)
SPETTROFOTOMETRIA
monocromatore o dei filtri: seleziona la lunghezza d’onda desiderata (in base a
proprietà sostanza da misurare) diretta verso cuvetta del campione
fonte luminosa (lampada): genera luce con un ampia gamma di lunghezze d’onda
Cuvetta: contenitore in materiale trasparente che contiene le soluzioni da sottoporre
ad analisi con metodi ottici
Fotorilevatore: permette la misurazione della luce
SPETTROFOTOMETRIA
La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta nella soluzione (assorbanza)
diffusa o rifratta da particelle sospese nella soluzione (turbidimetria o nefelometria)
emessa da una sostanza che assorbe la luce su una lunghezza d'onda e l'emette su
un'altra lunghezza d'onda (fluorescenza)
la concentrazione di una determinata sostanza in soluzione,
partendo dai valori di assorbanza si ottiene applicando legge di Beer,
confrontando le letture dei campioni con letture di standard a
concentrazioni note o estrapolando la concentrazione da curve
di taratura ottenute con soluzioni di riferimento.
luce assorbita: differenza tra luce emessa
dalla fonte luminosa (lo) e luce che
raggiunge il fotorilevatore (ls).
I composti che non hanno una colorazione visibile
spesso assorbono la luce nella gamma dell'ultravioletto
Aumento quantità sostanza nella soluzione = riduzione quantità relativa di luce che
passa attraverso la soluzione e raggiunge il fotorilevatore. la riduzione è definita
assorbanza
Legge di Beer:
descrive la relazione
tra concentrazione e luce assorbita
lo
ls
ASSORBANZA
maggiore concentrazione dell'analita = maggior n° particelle che impediscono il
passaggio della luce attraverso la soluzione: aumenta la quantità di luce riflessa
Metodi basati sulla formazione di particelle non solubili che interferiscono con il
passaggio della luce attraverso la soluzione.
L'analita reagisce con un reagente aggiunto per produrre particelle non solubili,
sospese nella soluzione. Quando la luce colpisce tali particelle, una parte viene riflessa
in varie direzioni
In nefelometria, il rilevatore viene posizionato angolato rispetto al percorso del fascio
luminoso, per evitare il rilevamento della luce che passa attraverso il campione.
fotorilevatoreSorgente
luminosa
NEFELOMETRIA
Spesso questi metodi utilizzano anticorpi :
analisi immunometrica
(immunoturbidimetria e
immunonefelometria)
In turbidimetria, il rilevatore viene posizionato in asse con la luce incidente e la luce
rilevata diminuisce con l'aumentare delle particelle di analita presenti; viene rilevata la
luce diffusa dalle particelle.
Gli anticorpi presenti nei reagenti provocano la formazione di complessi o lattici
con le molecole dell'analita che migliorano la riflessione della luce, facendo
aumentare il segnale analitico misurato
I metodi turbidimetrico e nefelometrico impiegati nella misura di proteine
TURBIDIMETRIA
Alcuni tipi di strutture chimiche sono in grado di assorbire la luce su una lunghezza
d'onda e di emettere luce su un'altra lunghezza d'onda (fluorescenti o fluorofori);
la luce incidente è su una lunghezza d'onda più corta e a un'energia più elevata
della luce emessa.
rilevatore posizionato a un angolo di 90° rispetto alla luce incidente, rileva solo la luce
emessa; La concentrazione del composto fluorescente è direttamente proporzionale
alla quantità di luce emessa dal campione
Gli analiti di interesse in chimica clinica non sono fluorescenti per natura, per la
loro rilevazione vengono incorporate delle molecole fluorescenti come reagenti
E alta E bassa
λ minoreλ maggiore
Cuvetta con fluoroforo
FLUORESCENZA
per la determinazione di substrati
(glucosio, urea, colesterolo con la metodica definita“end point”
(che avvengono alla fine della reazione)
l'intera quantità di analita viene convertita in prodotto
indicate per le reazioni chimiche che si
completano in tempi relativamente brevi
Se il metodo misura la creazione di
un prodotto, l'assorbanza risulta
maggiore all'endpoint rispetto al
punto iniziale
La fotometria trova applicazione nei Laboratori di chimica clinica
enzima catalizza la conversione di reagenti (substrati) in prodotto: la quantità di
prodotto all'endpoint rifletterà la quantità di substrato presente
La metodologia cinetica si può anche
utilizzare per misurare analiti diversi dagli
enzimi (quando reazione raggiunge molto
lentamente l'endpoint)
Per la determinazione di enzimi quali transaminasi, fosfatasi alcalina, LDH …
con la metodica“rate” (che valuta le variazioni di assorbimento nell'unità di
tempo).
la misurazione della velocità del cambiamento nel tempo del prodotto che si
forma
l'attività di un enzima si determina misurando la cinetica della reazione invece della
reazione endpoint.
Esteri del colesterolo + H2O colesterolo + RCOOH
Colesterolo + O2 colest-4-en-3-one + H2O2
2 H2O2 + 4-AAP + fenolo colorante chinoneiminico + 4 H2O
ESEMPIO end point: DETERMINAZIONE COLESTEROLO
Metodo enzimatico colorimetrico
Gli esteri del colesterolo vengono dissociati per azione della colesterolo esterasi (CE),
formando colesterolo libero e acidi grassi.
la colesterolo ossidasi catalizza l'ossidazione del colesterolo, formando
colest-4-en-3-one e perossido d'idrogeno
In presenza di perossidasi, il perossido d’idrogeno formatosi influenza
sull’accoppiamento ossidativo del fenolo e del 4-aminofenazone, producendo un
colorante chinoneiminico rosso.
L’intensità di colore del colorante è direttamente proporzionale a concentrazione di
colesterolo. Viene determinata misurando l’aumento dell’assorbanza.
IMMUNODOSAGGI
tecniche di comune utilizzo sia in campo clinico che nella ricerca
Caratterizzate da elevata sensibilità e specificità
quantificazione della concentrazione di antigene
Costituenti degli immunodosaggi:
l'antigene (sostanza da misurare, calibratore..) il reattivo anticorpale
Il tracciante (segnala la reazione Ag-Ab grazie a legame con marcatore
(enzima, fluoroforo..)
curva standard (per attribuzione«quantità» al segnale emesso da tracciante)
metodo diretto : per quantificazione di un Ag (proteina plasmatica oppure
una componente microbica)
microbiologia clinica: valutazione siero-conversione o infezione pregressa
tecniche di immunofluorescenza o di ELISA
metodo indiretto: ricerca e la quantificazione degli Ab specifici
Immunodosaggi diretti e indiretti
metodi competitivi l'analita (Ag) compete con un tracciante costituito da un
antigene marcato (Ag*) per formare un immunocomplesso con un Ab specifico
presente in quantità limitata
La misura del segnale (Ab-Ag*) è in genere inversamente proporzionale
all'analita presente nel campione.
Immunodosaggi competitivi e non competitivi
metodi non competitivi: l'analita (Ag) dosato mediante l'utilizzo di
due diversi anticorpi, presenti in eccesso, specifici per due diversi epitopi
dello stesso antigene
Un anticorpo è marcato (Ab*) e l'altro è legato ad una“fase solida”
La misura del segnale (Ab*-Ag-Ab fase solida) è direttamente
proporzionale all'analita presente nel campione.
I metodi non competitivi sono più sensibili dei metodi competitivi poiché
in prossimità dello zero un piccolo incremento di segnale è più rilevabile
rispetto ad un piccolo decremento.
metodi “sandwich”: l'antigene è legato fra due anticorpi.
immunodosaggi omogenei ed eterogenei
Omogenei: non richiedono la separazione dell'immunocomplesso dalla
frazione non legata per la lettura del segnale; sono più semplici e veloci
utilizzati in genere per il dosaggio di piccole molecole come farmaci e droghe d'abuso
Eterogenei: richiedono la separazione dell'immunocomplesso ottenuta
con un Ab o Ag adeso ad una fase solida per lettura segnale
Alla separazione segue segue l'aggiunta del reagente
complementare incubazione blocco della reazione lettura.
utilizzato soprattutto in
sierologia infettiva ed autoimmunità
ELISAELISA o Enzyme Linked Immunosorbant Assay
tecnica molto utilizzata nella diagnostica di Laboratorio.
immunodosaggio eterogeneo, sandwich
o competitivo, in cui
un anticorpo o un antigene sono
immobilizzati ad una fase solida
(micropiastra)
elevata sensibilità: una sola molecola di enzima può reagire con numerose
molecole di substrato, determinando, in presenza di titoli anticorpali modesti,
una reazione colorimetrica amplificata.
Chemioluminescenza: emissione di luce che deriva da una reazione chimica
molecole che, a causa della propria struttura, quando reagiscono con altre
molecole producono luce invece che calore.
anni '80 e '90: notevoli progressi nella sensibilità, specificità dei dosaggi, nella
loro automazione con introduzione di altre tecnologie:
FIA (Fluorescent ImmunoAssay)
CLIA (ChemiLuminescent ImmunoAssay)
alcuni metodi immunologici utilizzano molecola chemiluminescente per la
determinazione di ormoni e marker tumorali
Elettrochemiluminescenza: tecnica variante con
generazione del segnale chemioluminescente mediante
pulsazioni trasmesse alla miscela con una corrente
elettrica, che sostituisce la reazione chimica.
1. Un Ab specifico si lega all’analita (Ag) presente nel campione
2. Rimozione degli Ab non legati ad Ag
3. Aggiunta di un secondo Ab specifico marcato con molecola chemiluminescente
4. Formazione legame con complesso creato dal primo Ab
5. Aggiunta alla miscela di reazione una sostanza chimica
6. Creazione di un segnale chemiluminescente proporzionale a quantità di Ag
Ab monoclonale specifico
biotinilato anti-TSH
Ab marcato con
complesso di
rutenio RuTSH
1a incubazione
ImmunoAssay in ElettroChemiLuminescenza “ECLIA”
Es:Dosaggio Ormone Tireostimolante (TSH)
complesso sandwich
Microparticelle
paramagnetiche coattate con
streptavidina
il complesso si lega alla fase solida mediante
l’interazione biotina-streptavidina.
2a incubazione
+-
Elettrodo e magnete
ECL
Luce prodotta direttamente proporzionale a concentrazione dell’analita
applicando una tensione all’elettrodo, si induce
emissione chemiluminescente che viene misurata
mediante fotomoltiplicatore.
miscela di reazione: aspirata nella cella di misura, le
microparticelle vengono attratte magneticamente alla
superficiedell’elettrodo
Segue rimozione delle molecole non legate
(soluzione di lavaggio)
I risultati vengono calcolati in base ad una curva di calibrazione
generata in modo specifico per lo strumento in uso
si utilizzano una serie di soluzioni che contengono l'analita in concentrazioni
note e si osserva il segnale prodotto a ogni livello di concentrazione
scopo curva di calibrazione:
stabilire relazione tra la concentrazione dell'analita e segnale misurato
METODICHE IMMUNOLOGICHE
Identificazione e quantificazione di Ag specifici da una soluzione
Agglutinazioneanticorpo è in grado di esplicare azione agglutinante quando Ag
è costituito da elementi corpuscolari(es. globuli rossi o batteri)
aggregazione e alla sedimentazione di un antigene dopo reazione con l’anticorpo
identificazione di varie specie batteriche e determinazione gruppi sanguigni
Metodo utilizzato per l’analisi delle proteine del siero
stadi successivi:
1) elettroforesi della miscela antigenica in un gel: separazione dei singoli componenti
in base a mobilità elettroforetica
2) deposito di un antisiero, specifico per alcune o tutte le componenti
proteiche, in una scanalatura laterale parallela alla direzione della migrazione
3) Diffusione dell’antisiero e formazione delle bande di precipitazione
METODICHE IMMUNOLOGICHE
Immunoelettroforesi
ricerca di anticorpi o di antigeni utilizzata in microbiologia
METODICHE IMMUNOLOGICHE
Fissazione del complemento
reazione immunologica basata su attivazione del complemento
Ia formazione di un immunocomplesso (ag e Ab (IgG o IgM) attiva cascata
enzimatica con formazione di proteina che lisa la cellula presentante Ag
Utilizzo di due sistemi:
1. ag noto + siero ignoto (ricerca di Ab specifici)
2. GR di montone e antisiero anti-GR di montone (sistema emolitico)
Formazione di
immunocomplesso Ag-Ab:
il sistema emolitico si deposita
su fondo provetta o micropiastra
(reazione positiva)
Assenza immunocomplesso Ag-Ab:
il complemento si lega al secondo
sistema aggiunto al termine 1^
incubazione,
con lisi dei GR e liberazione di Hb
ELETTROFORESI
tecnica analitica e separativa basata movimento di particelle (ioni, molecole)
immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una
coppia di elettrodi catodo (assume carica negativa) e anodo (carica positiva)
Utilizzo di tampone a pH alcalino che conferisce alle molecole proteiche una carica
negativa rendendole solubili senza sottoporle a denaturazione
le particelle si muovono verso l'elettrodo avente carica opposta rispetto alla
carica della particella
Velocità di migrazione (mobilità elettroforetica) legata a diversi fattori: massa,
dimensione,carica e forma delle particelle, natura del mezzo e da campo
elettrico applicato
-COOH + OH- → -COO- + H2O
Elettroforesi proteine del siero
iniezione del campione nei capillari è
effettuata all’anodo per aspirazione
la lettura diretta delle proteine viene
effettuata a 200 nm all’estremità catodica
del capillare
Vantaggio: automazione completa dell’analisi, separazioni rapide e buona risoluzione
metodologia intermedia tra l’elettroforesi zonale classica su supporto solido e la
cromatografia in fase liquida
la separazione in funzione del pH dell’elettrolita
e del flusso elettro endo-osmotico (fenomeno
dovuto a ionizzazione della silice del capillare).
Elettroforesi capillare
sviluppata parallelamente tecniche elettroforetiche su diversi supporti ( gel d’agarosio)
tecnica di separazione elettrocinetica effettuata in un capillare riempito con un
tampone composto da elettroliti.
l’ordine di migrazione delle proteine
sieriche è il seguente :
gamma globuline, beta-2 globuline, beta-1
globuline, alfa-2 globuline, alfa-1 globuline
e albumina.
CROMATOGRAFIA
tecnica separativa e analitica : i componenti di una miscela tendono a ripartirsi in
modo diverso tra due fasi, in funzione della loro affinità con ciascuna di esse
fase rimane fissa (la fase stazionaria) un solido o un gel
fase, liquida o gassosa, (la fase mobile) fluisce su fase fissa trascinando con sé
in quantità maggiore i componenti della miscela che più risultano affini ad essa.
il rivelatore posto in fondo all'apparecchio
registra il passaggio di una sostanza eluita,
elabora i dati su di un cromatogramma
Ogni volta che una sostanza viene
rivelata,il cromatogramma registra un
picco più o meno alto a seconda della sua
concentrazione.
Cromatografia liquida ad alta prestazione (High Performance Liquid
Chromatography, un tempo nota come high-pressure liquid chromatography) o HPLC
Alla fine della colonna è
applicato un rilevatore e un
calcolatore che permettono
un'analisi in continuo
dell'uscita della colonna
quantificazione e/o
identificazione di sostanze
iniettate tramite specifico
cromatogramma.
è un tipo di cromatografia liquida che rappresenta l'evoluzione strumentale della
cromatografia in fase liquida su colonna classica
Il campione iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove è "spinto"
attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell'ordine
delle centinaia di atmosfere
separazione e quantificazione emoglobina (es. dosaggio emoglobina glicata)
Le emoglobine a carica + sono
separate da una fase stazionaria a
carica –
nella colonna
I cationi nella fase mobile (tamponi
con incremento della forza ionica)
competono con le emoglobine
assorbite spingendole all’esterno
Le frazioni sono determinate
otticamente dal rilevatore
tecnologia che consente di rilevare, identificare e contare specifiche cellule
presenti nel circolo ematico, midollo osseo, fluidi corporei (CSF) o cellule tumorali.
CITOFLUORIMETRIA
Pretrattamento del campione
con coloranti specifici (fluorocromi legati ad
Ab monoclonali diretti contro particolari Ag
cellulari
nella camera di flusso le cellule risultano
organizzate in fila, una dietro l'altra.
Il flusso di cellule viene posto davanti ad un
rilevatore, che analizza ciascuna cellula ad
una velocità di centinaia a migliaia di cellule
per secondo
Il laser colpisce le cellule presenti nel
flusso, generando per ciascuna di esse
uno scatter caratteristico e dipendente
dalle caratteristiche della stessa.
Le caratteristiche possono essere fisiche (dimensione e complessità cellulare) o
possono dipendere dal segnale generato dal colorante (il fluorocromo) intercettato dal
laser.
La combinazione di queste informazioni genera un profilo
caratteristico per ciascuna cellula presente all'interno del campione
Il segnale rilevato dai rilevatori (o detector) viene amplificato (dai fotomoltiplicatori) e
inviato al computer. Qui viene convertito in formato digitale e mostrato sul computer o
stampato; i dati sono mostrati sotto forma di grafici (citogrammi)
Applicazione: esame emocromocitometrico differenziazione leucocitaria
Campione normale Leucemia mieloide acuta
Metodiche di BIOLOGIA MOLECOLARE
Il DNA e l'RNA rappresentano il genoma ed il trascrittoma degli organismi e la loro
manipolazione permette una precisa e rapida valutazione sia dei geni che della loro
espressione
Ibridazione Fluorescente in Situ (Fluorescence in situ hybridization; FISH)
test molecolare che utilizza delle sonde fluorescenti
per valutare i geni e/o il DNA nei cromosomi
Nella diagnostica prenatale: determinazione dell’assetto cromosomico di cellule
embrionali su nuclei interfasici (diagnosi di aneuoploidie)
nella diagnostica di Laboratorio in particolare nei campi della Genetica medica
e nella Microbiologia
La reazione a catena della polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction)
Le sonde si legano alle regioni cromosomiche per
cui presentano omologia, ed eccitate da lampade
che emettono luce a diverse lunghezze
d'onda, emettono un segnale osservabile al
microscopio a fluorescenza,
di colore diverso per ciascun marcatore
FISH
Cellule fissate su vetrini da microscopia
e fatte reagire con una soluzione
contenente una serie di sonde di DNA marcate
con fluorocromi diversi, con
sequenza complementare specifica alle regioni
cromosomiche di interesse
La sonda rileva la sequenza genica
anomala BCR-ABL 1 originata dalla
traslocazione di parte del cromosoma 22
(BCR, colore verde) e del cromosoma 9
(ABL1, colore rosso).
aree gialle: zone nelle quali è presente il
gene di fusione (il colore rosso e verde si
sovrappongono generando il colore giallo).
Identificazione di cromosomi sovrannumerari o mancanti, delezioni (sequenze
geniche perse) o traslocazioni (sequenze geniche spostate in altri cromosomi)
diagnosi di alcune patologie:
Sindrome di Down o trisomia 21 (presenza di cromosomi sovrannumerari )
Leucemia mieloide cronica (traslocazione)
ibridano le regioni adiacenti la sequenza da amplificare
costituiscono innesto per l'enzima DNA polimerasi
(estratto da batteri termofili, funziona ad alte T)
PCR
metodo semplice e rapido per copiare ed amplificare specifiche sequenze di DNA
è necessario conoscere la sequenza di una breve regione di DNA a ciascuna delle
estremità del tratto di interesse
vengono sintetizzati due piccole molecole di DNA complementari dette
primers
miscela di reazione contiene quantità appropriate di 4 deossinucleotidi trifosfati
(monomeri costituenti il DNA)
La reazione di PCR avviene all'interno di termociclatori e consiste nella successione di
più cicli a 3 fasi regolate dalla temperatura:
1. Denaturazione ad elevata temperatura
2. Appaiamento ai primers abbassando la temperatura
3. Sintesi di copie di DNA da parte della polimerasi che lega il DNA grazie
ai primers a partire dai deossinucleotidi liberi nella miscela di reazione.
Una reazione di 30 cicli è in grado di produrre circa un miliardo di copie
del DNA oggetto di studio che può così essere identificato anche se presente
in concentrazioni minime nel campione di partenza.
L'amplificato può essere rilevato tramite una separazione elettroforetica su
gel oppure attraverso sonde marcate
Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse varianti di PCR:
NESTED PCR
RT- PCR
MULTIPLEX
PCR
REAL TIME
PCRPCR
prima amplificazione: coppia di primers più esterni al frammento di DNA da
amplificare.
seconda amplificazione: coppia di primers che amplificano un frammento interno
a quello amplificato nella prima reazione
nella seconda PCR il numero di sequenze bersaglio è maggiore e il “background”
è significativamente ridotto.
destinata a ridurre o a eliminare eventuali prodotti aspecifici non desiderati
in seguito all’amplificazione di siti di legame di primer inaspettati ( primers
possono legarsi a regioni di DNA non corrette)
due reazioni successive dello stesso tratto DNA per ottenere sensibilità maggiore;
utilizzata in Microbiologia per dimostrare la presenza del genoma di virus presenti
in bassa concentrazione in un campione biologico.
NESTED PCR
reazione di amplificazione in cui una o più coppie di “primers” specifici per differenti
“target”, nella stesso tubo di reazione amplificazione di molteplici sequenze.
Rapida identificazione di delezioni o duplicazioni in un grande gene
Due coppie di sonde di ibridazione marcate
con un diverso colorante accettore che
emette la fluorescenza a differenti
lunghezze d’onda.
Il segnale emesso viene letto
simultaneamente attraverso canali di
rilevamento fluorimetrico.
MULTIPLEX PCR
amplificazione contemporanea di più segmenti; utile ad esempio per lo studio
delle varianti alleliche nella diagnosi di malattie genetiche.
amplificazione a scopo quantitativo. La miscela di reazione comprende sonde che
sono in grado di emettere segnali di fluorescenza dopo ciascuna amplificazione.
PCR quantitativa: viene utilizzata per quantificare gli acidi nucleici attraverso la
misura della fluorescenza emessa da un fluoroforo (molecola reporter);
amplificazione e quantificazione in unica reazione.
la fluorescenza aumenta in proporzione all’accumulo dei prodotti di PCR,
e si misura in tempo reale durante l’amplificazione (ad ogni ciclo )
REAL TIME PCR
è possibile convertire in DNA un intero trascrittoma (insieme di tutto il trascritto di
una cellula) di uno specifico tessuto di un individuo in una specifica fase del suo
sviluppo.
RNA totale (contenente anche RNA ribosomale) viene incubato con:
un enzima DNA polimerasi RNA-dipendente (trascrittasi inversa o retro-trascrittasi),
deossiribonucleotidi trifosfato (dNTPs), soluzione tampone,
ioni bivalenti Mg2+ (cofattori per polimerasi),sequenze primer
il cDNA generato può essere amplificato mediante PCR classica, oppure essere
quantificato mediante real-time PCR (qPCR).
RT - PCR
sintesi di una molecola di DNA a doppio filamento a partire da uno stampo di RNA
molecola di DNA sintetizzata mediante il processo di retrotrascrizione : cDNA
una tecnica utilizzata in laboratorio per studiare l'espressione genica,
perché consente di sottoporre a ulteriori analisi il cDNA sintetizzato
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)
DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie
Esame microscopico (batterioscopico)
(su campioni a fresco o previa colorazione)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)
DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie
Esame colturale (isolamento)
Crescita dei microrganismi su sistemi artificiali in vitro denominati terreni di
coltura minimi o di arricchimento per batteri esigenti
Identificazione presuntiva (forma, organizzazione, aspetto coloniale)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)
DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie
Identificazione finale (definitiva):
biochimica (basata su caratteristiche metaboliche del microrganismo, metodi manuali
o automatizzati)
Immunologica (ricerca di antigeni microbici nel campione)
e molecolare (sonde specifiche a DNA che identificano uno specifico patogeno
Metodo immunologico: ricerca degli
Ag batterici (test di agglutinazione)
Metodo molecolare: ricerca di sequenze
genomiche dell’agente batterico
(PCR, multiplex PCR)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)
DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie
Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, si procede alla
determinazione della sensibilità/resistenza dell’isolato agli antibiotici
(antibiogramma)
predire successo o fallimento in vivo della terapia antibiotica.
I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un
microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.
I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico
terapia alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza
professionale.
Tests di antibiotico-sensibilità
Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’
Metodi manuali (es diffusione in agar) e sistemi automatizzati
Diffusione in agar
1. Allestimento brodocoltura da coltura pura
2. Semina brodocoltura
3. Apposizione dischetti antibiotizzati
4. Incubazione (37°C, 18-24h)
5. Misurazione diametro alone di inibizione
Concentrazione antibiotico
diminuisce con l’aumentare
della distanza dal dischetto
MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa
dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio; la più bassa
concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile
test automatizzato: tecnica della microdiluizione usata per determinare le MIC
card : pozzetto di controllo (solo terreno di coltura
microbiologico); micropozzetti con quantità
predefinite di antibiotici specifici combinati con il
terreno di coltura
Inoculo della card con microrganismo in sospensione
(previa diluizione ad una concentrazione
standardizzata) ed inserimento nell’incubatore/lettore
dello strumento
Lo strumento esegue il monitoraggio della crescita in ciascun pozzetto della card
per un determinato periodo di tempo (24 h) e determina i valori di MIC (o i risultati
dei test) per ciascun antibiotico contenuto nella card.
Esempio referto antibiogramma
Categorie Interpretative:
(Sensibilità, S Intermedia, Resistenza)
individuate da valori di MIC detti breakpoints
(soglia, limite)
S intermedia:
efficacia potrebbe essere più bassa di
quella registrata per gli isolati sensibili
DIAGNOSI INDIRETTA: rileva risposta immune umorale specifica dell’ospite
al patogeno (su siero del paziente)
Metodo immunologico ricerca di Ab verso l’Ag batterico
Test immunoenzimatico (elisa) Saggio in immunofluorescenza
si rende visibile una reazione antigene -
anticorpo marcando uno dei reagenti
fluorocromi
La fluorescenza emessa viene osservata
con un microscopio a luce ultravioletta
( strisci di sospensioni di cellule batteriche
e protozoarie)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
Benedetta Cremonesi
DELEGAZIONE REGIONALE LOMBARDIA
CORSO DI PREPARAZIONE
ALL’ESAME DI STATO PER L’ABILITAZIONE
ALLA PROFESSIONE DI BIOLOGO (Sez.A-Sez.B))