di che cosa abbiamo bisogno? un nucleo nmr-attivo un campo magnetico statico b 0 un trasmettitore di...

Di che cosa abbiamo bisogno?Un Nucleo NMR-attivoUn campo magnetico statico B0

Un trasmettitore di radiofrequenza

PRINCIPI DI BASE

M PiccioliR.M.B.Biotec 2014-2015

Parole Chiave

Esperimenti in Onda continua ed in Trasformata di Fourier

PRINCIPI DI BASE


Thank you, Mr. Fourier!

F() F(t)


FOURIER TRANSFORMATIONS

F()=(0)

F()=A(sin)/ centered at 0

F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20

F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20

F(t)=exp(-t/T2)

F(t)=exp(-t/T2)exp(i2A)


Why bother with FT?

FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function(deconvolution).

In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the

radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum)

The FT allows to determine the frequency content of a squared function


Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR

Una somma di onde, puo’ essere decomposta nelle singole onde che l’hanno generata e puo’ essere convertita in una serie di frequenze

Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma

anche tutte le frequenze intornoTanto piu’ l’impulso è corto e tanto più è largo il range di

frequenze eccitate

La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioniM Piccioli

R.M.B.Biotec 2014-2015

A “real” F.I.D.


The NMR Experiment The NMR Experiment After the pulse is After the pulse is switched off, the switched off, the magnetization magnetization

precesses in the xy precesses in the xy plane and relaxes plane and relaxes to equilibriumto equilibrium

The current induced in a coil The current induced in a coil by the magnetization by the magnetization precessing in the xy plane is precessing in the xy plane is recorded. It is called recorded. It is called FIDFID..

zz

yy

xx

zz

yy

xx

zz

yy

xx

MM

BB11

90°90° tt

II

II

tt

2T

t

e

)(

2

1I

To have a spin transition, a To have a spin transition, a magnetic field Bmagnetic field B11 , oscillating , oscillating

in the range of in the range of radiofrequencies and radiofrequencies and

perpendicular to z, is applied perpendicular to z, is applied ((perturbing pulseperturbing pulse) )

The BThe B11 field creates field creates

coherence among the coherence among the spins (they all have spins (they all have

the same phase) and the same phase) and net net magnetizationmagnetization in in

the x,y plane is the x,y plane is createdcreated

Parole Chiave

Impulso

Trasformata di Fourier

PRINCIPI DI BASE

Parole Chiave

Frequenza di Larmor

Precessione del segnale(evoluzione del Chemical shift)

PRINCIPI DI BASE

Esperimento NMR

Lo stato del sistema all’equilibrio

Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare l’esperimento

Consideriamo solo un singolo spin.

Per esempio un campione contenente solo H2O

Esperimento NMR

L’effetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dall’equilibrio

La magnetizzazione di H2O è ruotata. Tanto piu’ lungo è l’impulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

ImportanteIl segnale osservato nell’esperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

Esperimento NMR

IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

Segnale ricevuto

• Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo).

• Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame

• Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito

My=exp(t/T2)

Time (t)

Fourier Transformation

Frequency ()

=0

Segnale ricevuto

• Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dell’impulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza obs=(1-0)

My=cos(obs)texp(t/T2)

Time (t)

Fourier Transformation

Frequency ()

My=cos(obs)texp(t/T2)

=0=obs

Free Induction Decay (FID)

Observed NMR signal in the time domain

Resonance frequencies are acquired as a function of time

Common case of observed FIDs

t t t

FTrelax.

x90

Preparation Detection

x

y

z

x90 t2

0

dte)t(f)(F ti


Signal to noiseScans S/N1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00


Sensibilità dell’Esperimento NMR

S/N N 5/2 B03/2

N = Numero di spins che contribuiscono al segnale

rapporto giromagnetico del nuclide studiato

Camp magnetico utlizizzatoM PiccioliR.M.B.Biotec 2014-2015

The NMR spectrometer

• Magnet

• Probe

• Coils

• Transmitters

• Amplifiers and pre-amplifiers

• Receiver

• ADC

The NMR spectrometer

The Magnet

A “cutted” magnet

History

First magnets were built using ferromagnetic material=permanent magnet

Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material

Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

CryomagnetsSuperconducting wirehas a resistance approximately equal to zerowhen it is cooled to a temperature close toabsolute zero (-273.15o C or 0 K) byemersing it in liquid helium. Once current iscaused to flow in the coil it will continue toflow for as long as the coil is kept at liquidhelium temperatures.

The length of superconducting wire in themagnet is typically several miles.

Magnet

The ProbeThe sample probe is the name given to that part of the spectrometer which accepts the sample, sends RF energy into the sample, and detects the signal emanating from the sample.It contains the RF coil, sample spinner, temperature controlling circuitry, and gradient coils.

Picture an axial cross section of a cylindrical tube containing sample. In a very homogeneous Bo magnetic field this sample will yield a

narrow spectrum

B0 homogeneity

In a more inhomogeneous field the sample will yield a broader spectrum due to the presence of lines from the parts of the sample experiencing different Bo magnetic fields.

Ubiquitin

76 amino acids, 8,5 kDa


1D experiment

Could be nice but...

..Too crowded..

What do we learn?

Chemical shifts relaxation rates

Not enough to get a structureM Piccioli


Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i

vari spin che permettano l’assegnamento.

Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari.


NMR MULTIDIMENSIONALE

Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare.

All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali.


The need for multidimensional NMR


COSA SIGNIFICA Spettro NMR

BIDIMENSIONALE


Cosa è un esperimento bidimensionale ?

Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito

Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema

Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati

SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta,Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazioneM Piccioli


PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2)

90°

Aq F1

HAA (F1)

HB

Aq F2

A (F1) B (F2)

HAA (F1) A (F2)


Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di

un altro spin?

Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari


Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)

Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo,Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2)Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata


Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1.

Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema

M (I t1) (St2)

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)


EXAMPLEN

H H

CC

O

We make a 1H experiment and we acquire.

Then all signals transfer the information because of scalar coupling

N

H H

C

Then I observe Hc

I observe Hn

I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J coupling


EXAMPLEN

H H

CC

O

N

H H

C


Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm

Signal!This indicates that there is a scalar coupling

between Hn and Hc


EXAMPLEN

H H

CC

O

N

H H

C


Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm

Signal!This indicates that there is a scalar coupling

between Hn and Hc

Hn Hn

Hc

J-coupling


EXAMPLEN

H H

CC

O


Spectrum beforeThe J couplingHc Hc

Hn

J-coupling

If you begin from Hc , the situation is the same !


EXAMPLEN

H H

CC

O


Spectrum beforeThe J coupling

Hc Hc

Hn

J-coupling

Therefore, if I consider only this system

Hn Hn

Hc

J-coupling


The first dimension = t1

The second dimension = t2

the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE

example

t1 t2

t1 dimensionOr F1

t2 dimensionOr F2


Usually t1 is also defined as indirect dimension

t2 is also defined as direct dimension

the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE

example

t1 t2

t1 dimensionOr F1

t2 dimensionOr F2


F1

F2

Definitions

Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions

Diagonal peakThe same frequency is observed in both dimensions

CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies


Accoppiamento scalare

L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY


Example: COSY

Through-bond connectivities

COSY= COrrelation SpectroscopY

H4-H5

H4’-H5’


Example: COSY

Through-bond connectivities

COSY= COrrelation SpectroscopY

H4-H5

H4’-H5’

1

2

3

4

5

6


Beyond COSYCOSY is not the only 2D experiment

It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms

The most important routes, which is COMPLEMENTARY

TO J-couplingIs THROUGH SPACE

COUPLING


Accoppiamento dipolareL’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio

Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia

L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A.

NON si osservano doppietti

L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE

Nuclear Overhauser Effect

Perturbo A Aumenta la intensità di B


Accoppiamento dipolare

L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare2 spin possono essere accoppiati :-Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici-scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio-dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici

Pensate a degli esempi, per favore

L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY(in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo


Through space AND throuhg bonds

Through space

Through bond


Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri

E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare


Example:Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

NOESYNOE Effect:

If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization

AAAA ABABM PiccioliR.M.B.Biotec 2014-2015

Example:

Cross peaks: A and B Cross peaks: A and B are closeare close

Diagonal peakDiagonal peak

The real The real case:case:Some 1500 Some 1500 peaks are peaks are observed observed for a for a protein of protein of 75 75 aminoacidaminoacidss

AAAA ABAB

NOESY experiment


2D NOESY Spectrum


Distance constraints

NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling

BB00

II

JJ

rr

6IJ

cIJ r


The “old times” approachNOESYNOESY

CCOOSYSY

Identify through space connectivitiesIdentify through space connectivitiesHN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)

Identify through bond connectivitiesIdentify through bond connectivitiesHN(i)-Ha(i)HN(i)-Ha(i)

NOESY conn.NOESY conn.

COSCOSY connY conn


La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale

In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es1H e 13C1H e 15N13C e 15N13C e 13C


In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili.

Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H

Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati.


Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità:

1. Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento

2. 2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali

3. Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1DM Piccioli


1J couplings for

backbone resonances


The 2D Hetcor experiment

Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment


The 2D Hetcor experimentTwo dimensional Heteronuclear correlation Experiment


E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)

’ possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato


E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)

Inoltre possiamo combinare tutto cio’ con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali


Eccito (impulso a 90°) 1H Acquisisco (t1) 1H –Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC

Acquisisco (t2) 13C

2D HETCOR Expriment


2D HETCOR Expriment


2D HETCOR Expriment

Prima dimensione


2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

Seconda dimensione


Esempio

COSY


Esempio

COSY

N.B. In questo caso non si osserva solo l’accoppiamento 3J ma si osserva una “propagazione” dell’informazione attraverso gli accoppiamenti scalari


EsempioHETCOR

514

32


Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Experiment


2D HSQC Expriment



2D HSQC Experiment

Prima dimensione

Seconda dimensione



2D HSQC Expriment

Prima dimensione



2D HSQC Experiment

Seconda dimensione

Prima dimensione



2D HSQC Experiment


Seconda dimensione

Prima dimensione

E’ possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo all’altro anche indipendentemente dall’acquisizione

In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati!

Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre l’accoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H


Eccito (impulso a 90°) 1H Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC

Acquisisco (t1) 13C –

Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13C a 1H utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC

Acquisisco (t2) 1H

2D HSQC Experiment


Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and backSignifica che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito

2D HSQC Experiment

Il doppio trasferimento fa si che l’esperimento sia molto piu’ selettivo

Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1J


The HSQC experiment


Caratteristiche dell’esperimento HSQC

Non esiste la diagonaleNon esiste la diagonale

La magnetizzazione viene trasferita da 1H al 13C ad esso accoppiato

Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13C

Infine si ri-trasferisce su 1H e si osserva 1H

Tutti gli Tutti gli 11H che non sono accoppiati a H che non sono accoppiati a 1313C NON si osservanoC NON si osservano

Heteronuclear NMR

OBSERVE 13C during t1

Transfer the information to all 1H coupledOBSERVE 1H during t2

1H

13C

No more diagonal

Each peak indicate A different H-C pair


Heteronuclear NMROBSERVE 13C during t1

Transfer the information to all 1H coupledObserve 1H during t2

1H

13C

No more diagonal

Two protons are bound to the same carbon

CH2


The HSQC experiment


Heteronuclear cases

The scheme of 1J scalar couplings


The 1H- 15N HSQC experiment

Heteronuclear Single Quantum Coherence


The HSQC experiment

In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an

observable peak

Each amide NH group gives rise to one peak

Detect H-N couplings

Same sensitivity of a 1H experiment (although you are

observing 15N)but much larger resolution

if you can do the job (whatever is your job)M Piccioli


Heteronuclear NMR in proteinsexample: 15N labelled proteins


The HSQC experiment

In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an

observable peak

Each amide NH group gives rise to one peak

Detect H-N couplings

Same sensitivity of a 1H experiment (although you are

observing 15N)but much larger resolution


Ca2+

Apo Cb @ 3.3 M GdmCl

Loss of secondary structure elements: unfolded protein

Refolding

Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl

The role of metal cofactor in protein unfolding

Metal triggered protein folding


7795

5935

26

60

45 96 7

33

20

34

27

75

15 6

62

65

9472

90

137812

80

100

8

8846

4286

87

81

8568

102

582

5254 55

71

56 91

29

66

36

328

38101

2558

98 5376

1674

84

30

21

3969

40

9767

37

41

99 1443

6489

2448

5147

11

23

9357 19

4 10

83

22

1779

HN1 83

HN 28

HN 32

Apo vs holo protein, mapping the environment of the Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ionmetal ion

15N

15HM PiccioliR.M.B.Biotec 2014-2015


The need for multidimensional NMR

Troppi segnali 1H ?


Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H

15N Only

A more effective fingerprint-characterization-folding-dynamics

protein size >10000Homonuclear 2D experiments donot have enough resolution

HSQC or HMQCHSQC-NOESY or HSQC TOCSY


Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H

15N and 13C

Scalar couplings through 13C atoms-triple resonance-assignment-structure

protein size >20000


di che cosa abbiamo bisogno? un nucleo nmr-attivo un campo magnetico statico b 0 un trasmettitore di...

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