DETERMINACIÓ IL-6 EN TEIXIT COLÒNIC DE PACIENTS

AMB MALALTIA DE CROHN

Pol Pons EstebanellÁlvaro del Río Valdivieso

Curs 2015/2016Tècniques d’assaig immunoenzimàtic

ÍNDEX1. Introducció .....................................................................................

.................................... 2 2. Fonament de la

tècnica ................................................................................................... 3

3. Material específic i reactius necessaris ....................................................................... 4

4. Fases de l’ELISA ............................................................................................................... 5

5. Disseny i condicions del primer assaig ........................................................................ 7

6. Interferències i problemes que es poden plantejar .................................................. 12

7. Fonts d’informació ............................................................................................................ 13

1

1. INTRODUCCIÓ

Malaltia de Crohn

Citocina que es vol determinar: IL-6

Quin interès té la IL-6?

2Figura 2: Protein data bank in Europe

IL-6 d’humà (Homo Sapiens)

Figura 1: Part de l’aparell digestiu que es pot veure afectat per la malaltia de

Crohn

2. FONAMENT DE LA TÈCNICA

3

ELISA sandwich

Sistema Estreptavidina-biotina

Color ∞ [Ag]

Figura 3: Interacció estreptavidina-

biotina

Figura 4: Esquema ELISA proposat

3. MATERIAL I REACTIUS NECESSARIS

4

Producte Tipus Quantitat i [ ] Casa Referència Preu (€)

Ac de captura

Ac anti-IL-6 policlonal de

conill0,2 mL i 500 - - -

IL-6 estàndard

Estàndard IL-6 humana 1 mL i 2 - - -

Ac de detecció

Ac anti-IL-6 monoclonal

de ratolí biotinitzat

0,2 mL i 500 - - -

Estreptavidina-enzim

Estreptavidina-HRP 0,25 mL i - - -

Taula 1: Productes utilitzats per a l’ELISA proposat

4. FASES DE L’ELISA

5

Fase I: Adsorció a la fase

sòlida(Sensibilització de

la placa)

Fase II: Bloqueig

llocs actius

Fase III:Rentat + addició

estàndard i mostres

4. FASES DE L’ELISA

6

Fase IV: Addició anticòs

biotinitzat

Fase V: Addició

estreptavidina-HRP

Fase VI: Addició substrat

+cromogen

Fase VII: Finalització reacció

5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG

7

BgBgSt 1

St 2

St 3

St 4

St 5

St 6

St 7

M1d1

M2d1

M3d1

M1d2

M2d2

M3d2

M4d1

M5d1

M6d1

M5d2

M6d2

M6d2

Llegenda:- Bg = Background- St = Estàndard- = Mostra- = Dilució- Blanc

Figura 5: Esquema de

placa proposat

Anticòs de captura:

5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG

• =

• Preparem 6 mL de 5

60 L

Rang acceptable μg/mL:

2 8

5

𝟏𝟏𝟎𝟎

8

9

Mostra:

5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG

• Segons bibliografía =

• La [ ] més freqüent = 54,1 Serà la

• Per tant, es prepara per dilució 1/3 de

54,1 18,0 333 μL

10

𝟐 ·𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠𝐦𝐋 𝟐𝟎𝟎𝟎𝟎 𝐩𝐠

𝐦𝐋 𝟐𝟎𝟎 𝐩𝐠𝐦𝐋 St 1

5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG

200 100 50 25 12,5 6,25 3,13

500 μL

500 μL 500 μL 500 μL 500 μL 500 μL

1/100 1/10010 μL 10 μL

Estàndards, 1mL:

Figura 6: Dilucions seriades

11

Anticòs de detecció:

5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG

• =

Rang acceptable μg/mL:

0,125 0,250

0,200

𝟏𝟐𝟓𝟎𝟎

• Preparem 6 mL de 0,200

2,4 L

6. INTERFERÈNCIES I PROBLEMES

• Falta d’informació en quant a IL-6 en teixit colònic en comparació al sèrum.

• Tractament de mostra.

• Problemes al treballar amb concentracions baixes.

• Errors associats a dilucions.

• Menor especificitat i caracterització del Ac policlonal.

12

7. FONTS D’INFORMACIÓ• Thermofisher.com. (2016). HRP-Conjugated Streptavidin - Thermo Fisher Scientific. [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/N100 [Accessed 14 Mar. 2016].• Thermofisher.com. (2016). IL-6 Antibody Monoclonal, Biotin conjugate (505E23C7) (AHC0469). [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/genome-database/antibody/IL-6-Antibody-clone-505E23C7-Monoclonal/AHC0469 [Accessed 14 Mar. 2016].• Thermofisher.com. (2016). IL-6 Antibody Polyclonal (PA1-26811). [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/genome-database/antibody/IL-6-Antibody Polyclonal/PA1-26811 [Accessed 14 Mar. 2016].• Sigmaaldrich.com. (2016). Interleukin-6, human (hIL-6) recombinant (E. coli) | Sigma-Aldrich. [online] Available at: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/11138600001?lang=en&region=US [Accessed 14 Mar. 2016].

13

7. FONTS D’INFORMACIÓ• IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer. (2011). Cytokine & Growth Factor Reviews, 22(2), pp.83-89.• Increased production of tumour necrosis factor-alpha interleukin-1 beta, and interleukin-6 by morphologically normal intestinal biopsies from patients with Crohn's disease. (1996). Gut, 39(5), pp.684-689.•Significance of interleukin-6 in patients with inflammatory bowel disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2007457.•Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21821036.• IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12220549. 14