“determinaciÓn de la capacidad protectora de...
TRANSCRIPT
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Kinesiología
“DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD
PROTECTORA DE ANTOCIANINAS DE UN
EXTRACTO DE VITIS vinifera EN AORTAS DE RATA
SOMETIDAS A ESTRÉS OXIDATIVO”
AUTORES:
Isabel Margarita Muñoz Muñoz
Víctor Emanuel Soto Rojas
2005
“DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD PROTECTORA DE
ANTOCIANINAS DE UN EXTRACTO DE VITIS vinifera EN
AORTAS DE RATA SOMETIDAS A ESTRÉS OXIDATIVO”
Tesis entregada a la
UNIVERSIDAD DE CHILE
en cumplimiento parcial de los requisitos
para optar al grado de
LICENCIADO EN KINESIOLOGIA
FACULTAD DE MEDICINA
Por
Isabel Margarita Muñoz Muñoz
Víctor Emanuel Soto Rojas
2005
Director de Tesis: Profesor Asistente Sandro Bustamante Delgado, M. Sc.
Patrocinante de Tesis: Sra. Sylvia Ortiz Zúñiga, M. Sc.
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE LICENCIATURA
Se informa a la Escuela de Kinesiología de la Facultad de Medicina que la
Tesis de Licenciatura presentada por los candidatos:
Isabel Margarita Muñoz Muñoz
Víctor Emanuel Soto Rojas
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para
optar al grado académico de Licenciado en Kinesiología, en el examen de defensa
de Tesis rendido el Martes 4 de Enero del 2005.
DIRECTOR DE TESIS
Sandro Bustamante Delgado ............................................................
COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS NOMBRE FIRMA Sra. Sylvia Ortiz Z. ............................................................
Sra. Soledad Bollo ............................................................
Sra. Gladys Tapia ............................................................
AGRADECIMIENTOS
Nuestros más sinceros agradecimientos a todos aquellos que colaboraron
de una u otra manera al desarrollo y término de esta tesis.
A todas nuestras ratas que sin ellas no podríamos haber realizado esta
tesis, por su colaboración para lograr hacer ciencia.
A Don Juan por estar siempre dispuesto a ayudarnos ante cualquier
problema y duda que pudiera suscitarse en el transcurso de cada uno de los
experimentos.
A los docentes Miguel Morales y Roberto Gallardo por su apoyo físico y
moral, ante las dificultades.
Al Dr. Ramón Rodrigo que colaboró con la revisión de nuestro anteproyecto
y proyecto, entregando sus conocimientos para encausar nuestra tesis.
A Aníbal, Osvaldo, Don José y demás funcionarios de la biblioteca de
nuestra facultad, por su constante apoyo y disposición en la búsqueda de material
bibliográfico.
A nuestros compañeros de laboratorio, que nos apoyaron en variadas
ocasiones en el desarrollo de los experimentos.
Al encargado del agua destilada que siempre nos guardó provisiones para
efectuar nuestra investigación.
A mi compañero de tesis, por su motivación, responsabilidad,
conocimientos ante este desafío que nos propusimos a comienzos de año,
principalmente por ser una tesis que se desarrolló en un área en que los
Kinesiólogos no presentan una relevante participación.
A nuestras familias y amigos que nos animaron y recordaron que no en
todas las investigaciones se logra corroborar la hipótesis de trabajo y que aún
siendo así, es un aporte a la ciencia.
Finalmente los agradecimientos a nuestro tutor que nos guió en cada paso
de nuestra investigación, como también por su constante entrega de tiempo y
conocimientos.
“Dedicado a mi madre, por darme su infinito cariño y amor.
A mis abuelos, por enseñarme a servir a los demás.
A Dios por protegerme cada día.
Al que amo, por ser mi alegría de cada día”
Isabel Margarita
“A Perro”
Probeta
INDICE
RESUMEN ....................................................................................................... i
SUMMARY...................................................................................................... ii
ABREVIATURAS.............................................................................................iii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
MARCO TEÓRICO.......................................................................................... 3
• Músculo liso.......................................................................................... 3
• Especies reactivas de oxígeno ............................................................. 4
• Estrés oxidativo .................................................................................... 5
• Sistema antioxidante ............................................................................ 6
• Polifenoles ............................................................................................ 7
• Antocianinas ......................................................................................... 8
• Vitis vinifera .......................................................................................... 8
OBJETIVOS .................................................................................................. 10
• Generales ........................................................................................... 10
• Específicos ......................................................................................... 10
HIPÓTESIS ................................................................................................... 11
VARIABLES .................................................................................................. 11
MATERIALES Y MÉTODO............................................................................ 12
• Diseño de investigación...................................................................... 12
• Tipo de estudio ................................................................................... 12
• Criterios de inclusión/exclusión .......................................................... 12
• Animales............................................................................................. 12
• Obtención y preparación de segmentos de aorta ............................... 12
• Estabilización del aparato contráctil de la aorta.................................. 13
• Contracción inducida por Fenilefrina (FE) .......................................... 13
• Generación de especies reactivas del oxígeno (EROs)
mediante electrólisis ........................................................................... 14
• Grupos experimentales....................................................................... 14
• Reactivos y soluciones ....................................................................... 15
• Análisis estadístico ............................................................................. 15
RESULTADOS.............................................................................................. 16
• Contracción inducida por Fenilefrina pre electrólisis .......................... 16
• Contracción inducida por Fenilefrina post electrólisis ......................... 16
• Contracción inducida por electrólisis .................................................. 17
DISCUSIÓN .................................................................................................. 18
CONCLUSIONES.......................................................................................... 21
PROYECCCIONES....................................................................................... 22
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 23
ANEXOS ....................................................................................................... 27
• Anexo 1 Estructura química de las antocianinas ............................ 27
• Anexo 2 Metabolismo del oxígeno .................................................... 28
• Anexo 3 Generación de radical hidroxilo ......................................... 29
• Anexo 4 Generación de radical superóxido ..................................... 30
• Anexo 5 Mecanismo de estabilización de EROs de
de los flavonoides ............................................................... 31
• Anexo 6 Montaje del baño de órganos ............................................ 32
APENDICE.................................................................................................... 33
• Tabla 1................................................................................................ 33
• Figura 1 .............................................................................................. 34
• Tabla 2................................................................................................ 35
• Figura 2 .............................................................................................. 36
• Figura 3 .............................................................................................. 37
i
RESUMEN
La producción de EROs es natural en distintos procesos metabólicos. La
exposición a niveles suprafisiológicos de EROs, denominada estrés oxidativo,
puede provocar daño a las biomoléculas de los tejidos. Cuando la capa de
músculo liso que compone los vasos es expuesta a EROs, el daño generado
provoca que el músculo liso disminuya su capacidad contráctil, con la consecuente
pérdida de capacidad para regular el tono vasomotor.
Para contrarrestar los efectos deletéreos del estrés oxidativo, existen
mecanismos antioxidantes endógenos que actúan capturando las EROs. Sin
embargo, en ciertos estados patológicos estos mecanismos se ven sobrepasados.
Una de las estrategias para disminuir el impacto negativo del estrés oxidativo ha
sido reforzar los mecanismos antioxidantes endógenos mediante la
suplementación dietaria de compuestos antioxidantes o, la administración
terapéutica de medicamentos con acción antioxidante, como las vitaminas C y E y,
algunos compuestos polifenólicos, como los contenidos en extractos de V. vinifera.
El objetivo del presente estudio fue determinar si el extracto seco de Vitis
vinifera que contiene 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicósido,
posee efectos protectores in vitro contra el estrés oxidativo producido por
electrólisis sobre anillos aórticos de rata y determinar su posible dependencia de la
concentración.
No obstante lo anterior, nuestros resultados sugieren que el extracto usado
(250 ng/mL y 500 ng/mL) no demostró proteger los anillos aórticos sometidos a un
modelo fisiológico de daño por EROs inducido por electrólisis, daño que si fue
prevenido por DMSO, un agente específico para capturar anión superóxido y
radical hidroxilo. Si bien ha sido demostrada la acción antioxidante de antocianinas
en diversos modelos físico-químicos in vitro, se sugiere ensayar su potencial
farmacológico de protección al estrés oxidativo en otros modelos fisiológicos.
PALABRAS CLAVE: V. vinifera, antocianinas, músculo liso vascular, estrés
oxidativo, aorta de rata.
ii
SUMMARY
EROs production is natural in different metabolic processes. The exposure
at supraphysiological levels of EROs, denominated oxidative stress, causes
damage to tissue biomolecules. When the smooth muscle layer that composes the
blood vessels is exposed to EROs, the generated damage causes that the smooth
muscle diminishes its contractile capacity, with the consequent loss of capacity to
regulate the vasomotor tone.
In order to resist the harmful effects of oxidative stress, endogenous
antioxidant mechanisms exist that act capturing the EROs. Nevertheless, in certain
pathological states these mechanisms are overwhelmed. One of the strategies to
diminish the negative impact of oxidative stress has been to reinforce endogenous
antioxidant mechanisms by supply of dietary antioxidant compounds or,
administration of therapeutic medicine with antioxidant action, like vitamins C and
E and, some poliphenolic compounds, like those contents in V. vinifera extracts.
The objective of the present study was to determine if the 0.02% malvidin-
3-glucoside anthocianyns-referred standardized extract has protective effects in
vitro against oxidative stress produced by electrolysis on rat aortic ring, and to
determine its possible dependency of the concentration.
Despite previous facts, our results suggest the used extract (250 ng/mL and
500 ng/mL) did not demonstrate to protect the aortic ring submissive a
physiological model of damage by EROs induced by electrolysis, damage that if it
were come up by DMSO, a specific agent to capture superoxide anion and
hydroxyl radical. Although anthocyanins antioxidant action has been demonstrated
in diverse physical-chemical models in vitro, it is suggested to try its
pharmacological potential of protection to oxidative stress in other physiological
models.
KEY WORDS: V. vinifera, anthocyanins, vascular smooth muscle, oxidative
stress, rat aorta .
iii
ABREVIATURAS
Ca+2 : Ion calcio.
CIF : Contracción inducida por fenilefrina.
CIE : Contracción inducida por electrólisis.
FE : Fenilefrina.
DMSO: Dimetil sulfóxido.
EvvA : Extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon, que contiene
0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicósido.
EROs : Especies reactivas del oxígeno.
ROS : Reactive oxygen species.
KHm : Solución Krebs-Henseleit modificada.
O2· - : Anión superóxido.
·OH : Radical hidroxilo.
1
INTRODUCCIÓN
La producción de las EROs es un proceso natural, inevitable y constante;
un continuo biológico, consecuencia de la vida en un ambiente aeróbico. Todas las
células, independiente de su tipo, están permanentemente produciendo EROs. El
daño que las EROs provocan en los diferentes tejidos depende del balance entre
su producción y las defensas antioxidantes de que dispone el organismo. Si la
producción de EROs es mayor que la capacidad antioxidante endógena, ésta
puede llevar a daños irreparables en los tejidos. En el músculo liso vascular, la
exposición a EROs provoca una vasoconstricción inducida por EROs, mediada por
derivados del ácido araquidónico; y una pérdida de la capacidad contráctil del
músculo liso por alteración de canales de Ca+2. Todo esto conlleva una pérdida de
la capacidad de regulación del tono vascular. Esto contribuye a la aparición y
desarrollo de una serie de patologías cardiovasculares, entre otras,
ateroesclerosis, hipertensión arterial, trombosis profunda y enfermedad de
Alzheimer.
Los sistemas antioxidantes endógenos pueden ser reforzados mediante la
incorporación en la dieta de compuestos antioxidantes que actúan como
coadyuvantes frente al efecto deletéreo de la exposición a EROs. Existen
abundantes estudios científicos que demuestran que compuestos polifenólicos
como los flavonoides, pueden actuar capturando estas EROs. Si bien la mayoría
de los reportes se basan en la determinación de su capacidad antioxidante en
ensayos in vitro, de carácter físico-químico, se ha extrapolado su potencial
beneficio en la protección cardiovascular, potencial que posee sustentación en
estudios epidemiológicos. No obstante, no hay suficiente evidencia experimental
que aporte antecedentes respecto de la capacidad de protección de flavonoides
ante estrés oxidativo en modelos fisiológicos o funcionales.
Este estudio pretende determinar el efecto protector del EVvA frente al daño
provocado por EROs en el músculo liso vascular.
Se ha demostrado que otros compuestos del tipo flavonoide, como las
proantocianinas, poseen efectos protectores contra los efectos deletéreos de las
2
EROs. Sin embargo, los altos costos del proceso de extracción de las
proantocianinas no las convierte en alternativas atractivas para su uso
fitofarmacéutico. Las antocianinas, en cambio, de estructura más simple que las
anteriores, poseen un proceso de extracción de menor complejidad y menor costo,
lo que haría más atractivo del punto de vista farmacotécnico la fabricación de un
fitofármaco a partir de antocianinas, siempre y cuando, su eficacia farmacológica
fuese al menos igual al perfil demostrado por las proantocianinas.
A diferencia de los fármacos alopáticos, cuyos rangos terapéuticos son muy
estrechos, los fitofármacos tienen rangos muy amplios, por lo cual se hace menos
probable alcanzar la concentración mínima tóxica, además de poseer escasos
efectos secundarios.
La posible limitación de la presente tesis está impuesta por el modelo
experimental, ya que éste se circunscribe a la evaluación de la capacidad de
protección de EVvA ante la acción deletérea de O2.- y •OH en un modelo funcional
in vitro. Por otra parte, no permite que los resultados obtenidos puedan ser
extrapolados directamente a modelos in vivo.
3
MARCO TEÓRICO
Músculo Liso El músculo liso está formado por fibras musculares lisas que corresponden
a células uninucleadas, delgadas y aguzadas en los extremos, cuya longitud varía
entre 20 y 500 µm. Existen distintos tipos de músculo liso: multiunitario y unitario,
siendo este último el que se encuentra en las paredes vasculares (Guyton, 2001).
En la variedad unitaria de músculo liso, las fibras se encuentran asociadas en
capas o haces, gracias a lo cual pueden actuar como una sola, transmitiendo las
fuerzas generadas. Las uniones estrechas que presentan entre sus membranas
celulares permiten el paso de iones, mediante los cuales se propaga el potencial
de acción.
El aparato contráctil del músculo liso no posee una estructura fibrilar
definida como el músculo estriado (Berne, 1999). Si bien carece de troponina, hay
abundantes miofilamentos finos de actina que forman parte del citoesqueleto,
anclados a los cuerpos densos y áreas densas de membrana. Estos miofilamentos
están solapados alrededor de una proporción menor de miofilamentos gruesos de
miosina, alineados aproximadamente a lo largo del eje celular en el sentido de
generación de la fuerza. Este sistema puede atravesar las membranas
plasmáticas de las células musculares (Guyton, 2001). El proceso de contracción del músculo liso está regulado por Ca+2 (Guyton,
2001; Berne, 1999; Karaki y cols., 1997). Existen cuatro mecanismos reguladores
del flujo de Ca+2 intracelular:
• Activación de canales de Ca+2 por receptores del sarcolema dependientes
de ligando que estimulan la liberación de Ca+2 desde el retículo
sarcoplásmico.
• Intercambio Na+/ Ca+2 .
• Activación de canales catiónicos inespecíficos.
• Activación de canales de Ca+2 voltaje dependientes (tipo L), ya sea por
potencial de acción, por depolarización inducida o por canales de calcio
4
dependiente de ligando, siendo ésta la vía más importante (Berne, 1999;
Karaki y cols., 1997).
La acción de los agonistas adrenérgicos como norepinefrina está medida
por todos estos mecanismos anteriormente mencionados para la movilización de
Ca+2, además de sensibilizar los elementos contráctiles del músculo que son
sensibles a Ca+2, aumentando así la fuerza de contracción a determinadas
concentraciones de Ca+2 intracelular (Karaki y cols., 1997).
La contracción del músculo liso tiene dos fases: una rápida o transiente,
dependiente del Ca+2 liberado del retículo sarcoplásmico que induce la fase lenta o
de meseta dependiente de la entrada de Ca+2 extracelular. El aumento de Ca+2
intracelular permite la contracción, porque al unirse a calmodulina se genera un
complejo que va a activar a la miosina quinasa de cadena ligera. La miosina
quinasa de cadena ligera, a su vez, fosforila a la miosina, permitiendo el
deslizamiento sobre la miosina y con esto se genera la contracción muscular
(Karaki y cols., 1997).
Especies Reactivas de Oxígeno (EROs)
Las EROs son especies reactivas derivadas del oxígeno que incluyen
moléculas químicas radicalarias y no radicalarias, siendo estas últimas, agentes
oxidantes que fácilmente pueden ser convertidas a radicales (Finkel y cols., 2000).
Las especies radicalarias se caracterizan por que su estructura atómica presenta
un electrón desapareado en su orbital externo, lo que le da una configuración
espacial altamente inestable, como el anión superóxido (O2.-) y el radical hidroxilo
(·OH). Entre las especies no radicalarias mencionamos el peróxido de hidrógeno
(H2O2), y el oxígeno singlete (102) (Halliwell y cols., 1999). Las especies
radicalarias del oxígeno tienen vida media corta debido a su gran reactividad por
su o sus electrones desapareados, los cuales interactúan con moléculas o
elementos que generalmente poseen electrones apareados, produciéndose una
oxidación de las moléculas estructurales de las células causando daño irreversible
(Pietta, 2000).
5
Las reacciones univalentes que llevan a la formación de las EROs se deben
a la reducción sucesiva del oxígeno a anión superóxido al incorporar un electrón, a
peróxido de hidrógeno al aceptar 2 electrones y a radical hidroxilo al aceptar 3
electrones (Anexo 2) (Guyton, 2001).
Las EROs tienen diferentes funciones en los seres vivos, de los cuales son
elementos constitutivos (Peters y cols., 1999). Las funciones favorables son la
producción de energía, fagocitosis, regulación de crecimiento celular, señales
intercelulares y síntesis de importantes compuestos biológicos. Dentro de las
reacciones deletéreas están las que afectan a lípidos de membrana
(lipoperoxidación), daño oxidativo a proteínas de tejidos y enzimas, por medio de
la modificación de algunos amino ácidos que son más susceptibles; carbohidratos
y ácidos nucleicos (Pietta, 2000; Cheeseman y cols., 1993).
En los seres vivos, las EROs pueden provenir de distintas fuentes. Durante
el metabolismo aeróbico las células generan energía reduciendo al oxígeno
molecular hasta la formación de agua. Esta reacción, que ocurre en la mitocondria,
es catalizada por la citocromo c oxidasa, involucra la transferencia de cuatro
electrones al oxígeno sin formación de intermediarios. Pero una pequeña
proporción del oxígeno, de 2 a 4%, puede aceptar un menor número de electrones
(Rodrigo y cols., 2003), donde en vez de la producción de agua se forman como el
·OH y el O2.- (Rodríguez y cols., 2001). En el plasma sanguíneo se está generando
H2O2 continuamente a partir de la oxidación del GSH y del ascorbato (Halliwell y
cols., 1999). Los macrófagos y neutrófilos activados liberan EROs para destruir
organismos patógenos dentro del proceso de fagocitosis (Market y cols., 1984).
Los peroxisomas y la enzima xantina oxidasa, que degradan estas sustancias,
EROs contenidas en alimentos de consumo habitual como café, té, chocolate y
bebidas de cola (Pietta, 2000).
Estrés Oxidativo Cuando el equilibrio entre radicales libres y antioxidantes se pierde en favor
de los primeros, se desencadenan procesos dañinos que se asocian al desarrollo
de numerosas enfermedades, lo que se denomina estrés oxidativo (Finkel y cols.,
6
2000). Esto puede deberse a una disminución de los sistemas antioxidantes, un
aumento de las especies prooxidantes o ambas (Sies, 1993).
A nivel molecular, se ha comprobado, en músculo liso, que las EROs
interfieren con la apertura de canales de Ca+2 voltaje dependientes de gran
conductancia unitaria, tanto en el número de canales como en su probabilidad de
apertura (Soto y cols., 2002), lo que alteraría la integridad vasomotora y afectaría
la maquinaria contráctil de los vasos.
Sistema antioxidante A la permanente producción de EROs que dañan estructuras
biológicas, el organismo atenúa estos efectos deletéreos por medio de la acción
de sistemas antioxidantes.
Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en pequeñas
concentraciones en comparación a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe
significativamente la oxidación del sustrato, y también estabiliza las EROS
mediante la cesión de un H+ y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras
definiciones hablan de antioxidante como cualquier sustancia que, al estar
presente en bajas concentraciones comparada a las de un sustrato oxidable,
previene o retarda la oxidación de dicho sustrato y que protege a los sistemas
biológicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de procesos como
reacciones que causan excesivas oxidaciones (Halliwell y cols., 1999). Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno
de ellos está conformado por sistemas enzimáticos como la superóxido dismutasa,
catalasa y glutatión peroxidasa, siendo éstas la primera defensa contra los
radicales libres que actúan neutralizando a estas especies altamente reactivas en
moléculas menos dañinas para la célula. Otros sistemas, no enzimáticos, están
conformado por compuestos como caroteniodes, glutatión reducido y las vitaminas
C y E que estabilizan las EROs o también que provocan la quelación de iones
metálicos de elementos de transición como hierro y cobre, que al estar en estado
reducido potencian su autoxidación y generación de anión superóxido (Anexo 4)
(Sies, 1993).
7
Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las
EROs. Son variados los alimentos que están constituidos por estas sustancia y
cada vez más utilizados por las personas tanto por medio del consumo directo de
vegetales y frutas que los incluyen, como también por medio del uso de fármacos.
Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se destacan las vitaminas E y C, los
betacarotenos, procianidinas y polifenoles.
Polifenoles
Compuestos orgánicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido
a un anillo aromático, que se conocen como compuestos fenólicos y aquellos en
que se repite este radical son conocidos como polifenoles.
Los compuestos de esta familia presentan variados efectos beneficiosos
para la salud: prevención contra cáncer (Hou, 2003), propiedades antiinflamatorias
(Youdim y cols., 2002), antialérgicas (Middleton y cols., 1992), antitumorales
(Bingham S., 1990), antimicrobianas (Nishino y cols., 1987), vasorelajantes
(Bustamante y cols., 2003) y antioxidantes (Youdim y cols., 2000; Serraino y cols.,
2003; Aldini y cols., 2003). Entre sus acciones antioxidantes encontramos la
inhibición de la formación de EROs por medio de la inhibición de enzimas
productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelación de los elementos
traza involucrados en la producción de EROs; el atrapamiento directo de EROs y
el up-regulation de los sistemas antioxidantes endógenos (Pietta, 2000).
Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical
aroxilo (FI-O·), para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual
adquieren una estructura quinona estable (Anexo 6)(Pietta, 2000).
Los polifenoles más estudiados provenientes de extracto seco
estandarizado de Vitis vinifera son antocianinas, procianidinas y proantocianidinas,
entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actúan atrapando los
radicales libres para luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibición
de la acción enzimática de elastasa e hialuronidasa (Bustamante y cols., 2003).
Estudios clínicos demuestran que el uso terapéutico de los polifenoles
provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades
cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de síntomas
8
en pacientes con insuficiencia venosa (German y cols., 2000; Bustamante y cols.,
2003).
Antocianinas Las antocianinas (del Griego anthos significa flores y kyanos azul) es el
pigmento más importante de las plantas, visible al ojo humano.
Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de
otros polifenoles por poseer azúcares dentro de sus grupos funcionales y, en su
mayoría, presentar varios grupos –OH (Muñoz y cols., 2003). Las diferencias
individuales entre los antocianinas dependen del número de grupos hidroxilo, la
naturaleza y número de azúcares que están unidos a la molécula, a la posición de
esa unión y la naturaleza y número de ácidos aromáticos unidos al azúcar en la
molécula (Kong y cols., 2003).
Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacológicas utilizadas
para la terapia de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones
realizadas con extractos de Vitis vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que
disminuyen la fragilidad y permeabilidad capilar; también efectos antiinflamatorios
y actividad antiedema (Wagner, 1985).
El estudio de la capacidad antioxidante de las antocianinas provenientes de
vino tinto, muestran que son efectivos en el secuestro de EROs y también en la
inhibición de la lipoperoxidación (Ghiselli y cols., 1998; Jankowski y cols., 2000).
La capacidad antioxidante se relaciona con el número de grupos –OH que
presenten y el lugar de la sustitución (Wang y cols., 1997). A su vez las
antocianinas son compuestos muy sensibles a cambios de pH y temperatura
debido a la deficiencia del electrón en su estructura (Satué-Gracia y cols., 1997).
Vitis vinifera Las antocianinas que forman parte del EVvA utilizado en este estudio
provienen de la Vitis vinifera, que es un arbusto trepador originario de la zona
mediterránea y de Asia Menor, actualmente cultivada en casi todo el mundo. Se
caracteriza por su altura variable y sus ramas cilíndricas. Sus hojas son de forma
9
variable, pero siempre lobuladas y ligeramente dentadas; su color varía en
tonalidad de verde, dependiendo de la variedad. Las flores, pequeñas y poco
aparentes, son de color verdoso. El fruto (la uva) es una baya ovalada o redonda y
pulposa, puede ser de color verde, rojo-pardo y negro dependiente de la variedad.
En su interior encontramos las semillas. Son de las semillas y del orujo de la uva,
como del proceso de fermentación del vino, en tinajas de roble, de donde se
extraen los compuestos bioactivos, entre las que hayamos antocianinas (Muñoz y
cols., 2003).
10
OBJETIVOS Objetivo General
Determinar la capacidad de prevención in vitro del efecto deletéreo
provocado por EROS inducidas por electrólisis sobre la capacidad contráctil del
músculo liso vascular aórtico, mediante un extracto seco de Vitis vinifera, variedad
Cabernet Sauvignon, que contiene 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina
3-glicósido (EVvA).
Objetivos Específicos
1. Determinar y cuantificar la eficacia del EVvA en la prevención de la acción de
las EROs inducidas por electrólisis sobre la capacidad contráctil del músculo
liso de los anillos aórticos.
2. Determinar si el efecto protector del EVvA sobre la capacidad contráctil de la
musculatura lisa de los anillos aórticos, inducido por EROs, es dosis
dependiente.
11
HIPÓTESIS
H1 : El EVvA posee efecto protector contra la alteración de la capacidad contráctil
del músculo liso vascular de aortas de rata, derivado de la acción deletérea
de EROs inducidas por electrólisis.
H0 : El EVvA no posee efecto protector contra la alteración de la capacidad
contráctil del músculo liso vascular de aortas de rata, derivado de la acción
deletérea de EROs inducidas por electrólisis.
H2 : El efecto protector del EVvA sobre aorta de rata es dosis dependiente.
H0’ : El efecto protector del EVvA sobre aorta de rata no es dosis dependiente.
VARIABLES Variable Independiente: Dosis del extracto de Vitis vinifera.
Definición Conceptual: Dosis a la cual esperamos observar efectos protectores
contra el daño vascular producido por EROs.
Definición Operacional: 250 ng/mL y 500 ng/mL de EVvA.
Variable Dependiente: Capacidad contráctil del músculo liso vascular.
Definición Conceptual: Mantención dinámica del tono vascular normal, lo cual
implica la capacidad de control de la contracción del músculo liso vascular.
Definición Operacional: Alteración de la capacidad de contracción vascular,
posterior al daño inducido por EROs, seguido de una CIF.
Variables Desconcertantes
1. Estado fisiopatológico de las ratas previo al ensayo experimental.
2. Proceso de extracción y manipulación de las aortas durante el desarrollo
de los ensayos experimentales.
3. Diferencias intra e intermanipulador.
4. Aplicación correcta del protocolo experimental.
12
MATERIALES Y MÉTODOS Diseño de Investigación
Experimental in vitro (Hernández Sampieri, 2001).
Tipo de Estudio Correlacional (Hernández Sampieri, 2001).
Criterios de Inclusión/Exclusión. Inclusión: 1. Peso de la rata de 350 g. ± 50 g.
2. Contracción de anillos aórticos inducidas por FE, mayores a 500 mg. posterior
a la fase de estabilización.
Exclusión: 1. Los anillos aórticos que no cumplan con los criterios de inclusión.
Animales Se utilizaron ratas machos Sprague-Dawley, de 350 g. ± 50 g. de peso
corporal, obtenidas del Bioterio Central de la Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, mantenidas de acuerdo a las normas internacionales dadas por el National
Institute of Health (publicación 85-23, revisión 1985) con agua y alimento
(Champion Nutricion Animal, Santiago, Chile) proporcionados ad libitum.
Obtención y Preparación de Segmentos de Aorta Las ratas se sacrificaron sometiéndolas a una sobredosis del anestésico
Isofluorano (Zeneca Laboratories, Inglaterra), introduciéndolas en un recipiente de
acrílico y colocando dentro una matriz de algodón empapado en el anestésico. Se
esperaron 30 s y se constató que la rata no presentara signos vitales (reflejo
fotomotor, respuesta a estímulo táctil). Se les abrió la cavidad torácica y se les
extrajo la arteria aorta, la cual fue sumergida en solución Krebs-Henseleit
modificada (KHm), cuya composición es la siguiente (mM): NaCl 122; KCl 4,7;
CaCl2 x 2 H2O 2,0; MgCl2 x 6 H2O 1,2; KH2PO4 1,2; NaHCO3 15,5; EDTA 0,021 y
13
Glucosa 11,5. La solución se preparó en agua destilada y se ajustó a un pH de
7,40 con HCl (10% v/v) ó NaOH (0,1 N).
El segmento de aorta se limpió del tejido conectivo y graso que lo rodea,
cuidando de no dañar el endotelio. Del segmento inmediatamente inferior al arco
aórtico se cortaron cuatro anillos de una longitud aproximada de 2 a 3 mm. Dos
ganchos de acero inoxidable, atados cada uno a un hilo de seda de 15 cm de
longitud, fueron introducidos a través del lumen de cada anillo aórtico, y éstos
fueron llevados al interior de baños de vidrio de doble pared, termorregulados a
37ºC + 0,5ºC (Lauda Thermo-Temp). Cada lado del anillo aórtico fue fijado
mediante el hilo de sus ganchos, uno al fondo del baño y el otro a un transductor
de fuerza Grass FT-03 conectados a polígrafos Grass (modelos 7D y 5D) para la
determinación de la contracción isométrica. La solución KHm fue
permanentemente burbujeada con CO2-bioxide (95% O2 y 5%CO2, AGA Gases
Especiales, Santiago) (Apéndice, Fig. 4).
Estabilización del Aparato Contráctil de la Aorta Los anillos aórticos fueron sometidos a una tensión basal de 1,5 g. y se
estabilizaron en solución KHm por un periodo de una hora, cambiando la solución
cada quince minutos para evitar la acumulación de metabolitos.
Los resultados se expresaron en unidades de fuerza (mN), para lo cual el
desplazamiento del registro poligráfico (mm) se multiplicó por el factor 9,8x10-3.
Para hacer equivalente el desarrollo de tensión de los anillos de aorta de diferente
tamaño, sus valores de tensión desarrollada (mN) fueron estandarizados al peso
seco (mg) de las aortas, para lo cual los segmentos aórticos fueron expuestos a
calor seco durante 3 días, una vez finalizado el ensayo.
Contracción inducida por Fenilefrina (FE) Después del periodo de estabilización, los anillos aórticos se contrajeron
agregando 100 µL de FE para lograr una concentración final en el baño de 1µM
con 10 mL de solución KHm hasta alcanzar una contracción máxima estable, para
luego relajar lavando el tejido con un cambio de solución KHm. El procedimiento
14
de contracción y relajación se repitió de tres a cuatro veces, dejando un tiempo de
recuperación de 20 minutos entre cada ciclo.
Generación de Especies Reactivas del Oxígeno (EROs) Mediante Electrólisis
El procedimiento de generación de EROs mediante electrólisis, se realizó
de acuerdo a Peters y cols. (2000). Para ello, se aplicó un pulso de corriente
continua de 30 mA por 90 s, mediante una fuente de corriente constante de cuatro
canales (LSI Medical, EEUU) a través de dos electrodos de platino de 7,5 mm de
longitud sumergidos en el baño de órganos.
Grupos Experimentales
Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a cada uno de los grupos
experimentales y sometidas al protocolo de contracción inducida por FE 1µM
descrito anteriormente, como también a los procedimientos particulares indicados
para cada grupo.
Grupo 1: Control.
Estabilización, CIF, KHm por 50 minutos, CIF, KHm (N=5).
Grupo 2: Tratamiento 0 ng/mL (nulo).
Estabilización, CIF, KHm + 100 µL vehículo (KHm) (15 min), Electrólisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=4).
Grupo 3: Tratamiento 250 ng/mL.
Estabilización, CIF, KHm + 100µL EVvA (250 ng/mL, 15 min), Electrólisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=5).
Grupo 4: Tratamiento 500 ng/mL.
Estabilización, CIF, KHm + 100µL EVvA (500 ng/mL, 15 min), Electrólisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=5).
15
Grupo 5: Tratamiento con DMSO.
Estabilización, CIF, KHm + 100µL DMSO (100 mM, 15 min), Electrólisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=4).
Reactivos y Soluciones
El extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon,
estandarizado al 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicósido, fue
obtenido del Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias,
Universidad de Chile, mediante procedimientos estándares de extracción de
flavanoles (Muñoz, 2003). FE hidrocloruro, HCl, NaOH y todas las sales
necesarias para la preparación de la solución KHm fueron obtenidas del proveedor
local de Sigma-Aldrich Chemical (MO, EEUU). Las soluciones fueron preparadas
frescas el día de ensayo experimental en agua destilada. Se utilizó como vehículo
solución KHm a 37°C.
El DMSO (FLUKA, Alemania) se utilizó como estándar de capacidad de
captación de EROs, según lo descrito en la literatura (Peters y cols., 2000).
Análisis Estadístico
Los resultados fueron expresados como el promedio de las
contracciones ± la desviación estándar del promedio. Las diferencias entre de los
grupos experimentales, antes y después del tratamiento, fueron determinadas con
la prueba de análisis de varianza ANOVA seguido de la prueba a posteriori de
Bonferroni. Las diferencias dentro de los grupos experimentales, antes y después
de la electrólisis, fueron determinadas con la prueba t de Student. La significancia
se estableció en p<0,05.
16
RESULTADOS
Contracciones inducidas por FE pre Electrólisis
Las CIF pre electrólisis, en todos los grupos experimentales, mostraron un
comportamiento bifásico, con la fase dependiente de Ca+2 intracelular o rápida y la
fase dependiente de Ca+2 extracelular o lenta inalteradas. Los valores promedio
alcanzados fueron, grupo 1: 11,42 mN ± 3,77 mN; grupo 2: 9,05 mN ± 2,84 mN;
grupo 3: 4,99 mN ± 1,72 mN; grupo 4: 5,79 mN ± 1,81 mN y
grupo 5: 8,70 mN ± 2,24 mN (Apéndice, Tabla 1 y Fig. 1).
Contracciones inducidas por FE post Electrólisis Las CIF post electrólisis mostraron comportamientos distintos, según el
tratamiento aplicado (Apéndice, Tabla 1 y Fig. 1). En el grupo 1 no se vieron
alteradas las fases de la contracción y tampoco se apreció una diferencia
estadísticamente significativa (p>0,05) de la CIF post electrólisis con respecto a la
CIF pre electrólisis, mostrando un valor promedio de 12,21 mN ± 3,89 mN, que
representa un 106,97% ± 7,30% de la CIF pre electrólisis
En los grupos de tratamiento, los grupos 2, 3 y 4, mostraron diferencias
estadísticamente significativas (grupo 2 p<0,01; grupos 3 y 4 p<0,001) de la CIF
post electrólisis con respecto a los valores de la CIF pre electrólisis, como
consecuencia de la acción de las EROs sobre el músculo liso vascular. Se
observó una alteración del comportamiento bifásico de la contracción, siendo la
fase lenta la que más se comprometió al no poder mantenerse en el tiempo e
incluso descender a niveles cercanos a los basales. También se observó que la
magnitud de la fuerza desarrollada por los anillos aórticos disminuyó. El valor
promedio de las CIF post electrólisis mostrado por el grupo 2 es de
3,44 mN ± 0,82 mN, que representa el 38,78% ± 4,81% de la CIF pre electrólisis.
El valor promedio de las CIF post electrólisis mostrado por el grupo 3 es de
0,76 mN ± 0,39 mN, que representa un 17,90% ± 11,53% de la CIF pre electrólisis.
El valor promedio de las CIF post electrólisis mostrado por el grupo 4 es de
0,48 mN ± 0,50 mN, que representa un 8,26% ± 7,59%.
17
En el grupo 5, la CIF post electrólisis no presentó diferencias
estadísticamente significativas (p>0,05) con respecto de la CIF pre electrólisis,
mostrando valores promedio de 8,52 mN ± 1,93 mN, lo que representa un
98,88% ± 6,26 % de la CIF pre electrólisis.
Contracciones Inducidas por Electrólisis El grupo 2 fue el que presentó los mayores valores de CIE, con un
promedio de 3,87 mN ± 1,36 mN. Este valor será empleado como referencia para
la comparación con los otros grupos de tratamiento (Apéndice, Tabla 2 y Fig. 2).
El grupo 3 no presentó una diferencia estadísticamente significativa
(p>0,05) con respecto al grupo 2. El valor promedio del grupo 3 fue de 2,09 mN ±
1,42 mN, lo que representa un 53,88% ± 36,75% de la CIE del grupo 2.
EL grupo 4 no mostró diferencia significativa (p>0,05) con respecto al grupo
2. El valor promedio del grupo 4 fue de 2,45 mN ± 1,32 mN, lo que representa
un 63,30% ± 34,21% de la CIE del grupo 2.
Al comparar los grupos 3 y 4 no se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas (p>0,05).
El grupo 5 mostró un valor promedio de 0,12 mN ± 0,15 mN, lo que
representa un 3,11% ± 3,89% de la CIE del grupo 2. Estos valores determinan una
diferencia estadísticamente significativa con todos los grupos de tratamiento con
EVvA (p<0,05).
18
DISCUSIÓN
Los resultados esperados de los experimentos eran que el EVvA, y
específicamente las antoncianinas que éste contiene, protegiera a la musculatura
lisa vascular de los efectos deletéreos de la exposición a EROs generadas
mediante electrólisis, según el modelo experimental empleado (Peters y cols.,
2000). Nuestra hipótesis se basaba en las abundantes referencias bibliográficas
que mencionan la capacidad antioxidante de las antoncianinas (Wang y cols,
1997; Ghiselli y cols., 1998; Jankowski y cols., 2000; Kähkönen y cols, 2003;
Galvano y cols., 2004).
Según nuestro resultados experimentales, el EVvA no mostró efecto
protector contra la alteración de la capacidad contráctil del músculo liso vascular,
derivado de la acción deletérea de las EROs inducidas por electrólisis, en el
modelo experimental empleado (Peters y cols, 2000). El daño producido en este
modelo involucra una alteración de los mecanismos de apertura de canales de
Ca+2 (Soto y cols., 2002; Li y cols, 2004), lo que se ve reflejado en la alteración de
la curva de contracción de los anillos aórticos, ya sea en la magnitud de la fuerza
desarrollada por los anillos o en la alteración de una o ambas fases, rápida y/o
lenta, de la contracción de la musculatura vascular (Anexo, Figura 3) y también un
fenómeno de contracción inducida por electrólisis, mediado por derivados del
ácido araquidónico (Peters y cols., 2000).
Con respecto a los grupos experimentales, ninguno de los grupos de
tratamiento con EVvA mostró efecto protector contra la acción deletérea de las
EROs generadas por electrólisis, tomando como referencia la acción deletérea
provocada por EROs en el grupo 2; la diferencia no fue estadísticamente
significativa. Los grupos 3 y 4 mostraron una diferencia significativa con el grupo 5,
que según el modelo experimental, se utilizó como referencia de captación de
EROs.
Según estos resultados, el EVvA no posee efectos de protección contra el
estrés oxidativo provocado en el músculo liso vascular por las EROs generadas
por electrólisis, pese a que la evidencia actual indica que las antocianinas, que
19
están contenidas en el extracto y que esperábamos serían los responsables de los
posibles efectos, si poseen actividad antioxidante. Más aún, se observa una
tendencia pro-oxidante del EVvA, reflejada en el aumento de la CIE a medida que
se aumenta la concentración de EVvA empleada en los grupos experimentales.
Sin embargo, nuestros datos no arrojaron diferencias estadísticamente
significativas que permitan corroborar esta tendencia.
La presentación en polvo del EVvA, sumada a la baja concentración de
antocianinas del extracto, dificultó la disolución del EVvA para la obtención de las
concentraciones requeridas en el baño de órganos. Debido a lo anterior, se
dificultó la obtención de concentraciones más elevadas de antocianinas en el baño
de los anillos aórticos, pudiendo ser que a las concentraciones empleadas en los
grupos experimentales no fueron suficientes para que el efecto antioxidante se
expresara. Esto no implica que las concentraciones elegidas fueran inadecuadas,
ya que este ensayo fue la primera prueba que se realizó con el EVvA, y las
concentraciones de los grupos de tratamiento fueron seleccionadas tomando en
cuenta rangos de concentraciones en los cuales, según la literatura las
antocianinas exhiben actividad antioxidante en una variedad de modelos in vitro
(Morazzoni y cols, 1991).
El desconocimiento de la composición del EVvA proporcionado por la
Facultad de Ciencias dificulta la comparación con extractos utilizados en otros
trabajos. El conocimiento de la composición total de antocianinas y otros
compuestos polifenólicos presentes en el EVvA ayudarían a orientar a priori los
resultados, según la cantidad en que estén presentes, y en base a ellos, afinar la
determinación de las concentraciones adecuadas para alcanzar los efectos
esperados. Diversos trabajos muestran que las propiedades antioxidantes de
extractos o jugos de diferentes frutas dependen de las diferentes cantidades de
compuestos polifenólicos presentes en ellos y así también de las posibles
interacciones que se generen entre éstos (Frankel y cols., 1995; Burns y cols.,
2000; Arnous y cols., 2001). Las antocianinas no escapan a este hecho;
pudiéndose sugerir que la capacidad antioxidante de una antocianina depende de
su estructura química (Wang y cols., 1997; Kähkönen y cols., 2003). La presencia
20
de una antocianina única o una cantidad reducida, con baja capacidad
antioxidante, podría determinar la aparición de efecto protector a concentraciones
demasiado elevadas de EVvA, que no pudieron ser alcanzadas por las razones
expuestas en el párrafo anterior.
21
CONCLUSIONES
• El EVvA no posee efecto protector contra la alteración de la capacidad
contráctil del músculo liso vascular, derivado de la acción deletérea de las
EROs inducidas por electrólisis de aortas de rata en el modelo experimental
empleado; por lo tanto, se acepta H0.
• De acuerdo a lo expresado en el punto anterior, también se acepta la
segunda H0 porque el efecto protector del EVvA sobre aorta de rata no es
dosis dependiente.
22
PROYECCIONES
Muchos estudios se han realizado sobre extractos de diferentes vegetales
que poseen polifenoles, entre ellos antocianinas, esto debido a la constante
búsqueda de fitofármacos para la prevención y tratamiento de diferentes
patologías existentes, no siendo el estudio de la Vitis vinífera una excepción. Es
por ello que deben realizarse más investigaciones que respalden los efectos y que
ayuden a precisar los mecanismos de acción y las concentraciones a las cuales
los antocianinas son terapéuticamente útiles. Todo ello para la producción de
fitofármacos provenientes de estos extractos que sean más económicos y con
menores efectos colaterales en comparación de los medicamentos alopáticos.
23
BIBLIOGRAFÍA 1. Acuña V., Zubiaguirre M., 2002. Determinación del extracto liofilizado de
Mangífera indica en la protección in vitro de la alteración vascular inducida
por estrés oxidativo en aortas de rata. Tesis de pregrado, Escuela de
Kinesiología, Universidad de Chile.
2. Aldini G., Carini M., Piccoli A., Rossoni G., Facino R.M., 2003. Procyanidins
from grape seeds protect endothelial cells from peroxynitrite damage and
enhance endothelial-dependent relaxation in human artery: new evidences
for cardio-protection. Life Science 73, 2883-2898.
3. Altman R., 2003. Risk factors in coronary atherosclerosis athero-
inflammation: the meeting point. Thrombosis Journal 1, 4.
4. Arnous A., Makris D., Kelafast P., 2001. Effect of Principal Polyphenolic
Components in Relation to Antioxidant Characteristics of Aged Red Wines.
J. Agric. Food Chem. 49, 5736-5742.
5. Berne R., Levy M., 1999. Fisiología. ED. Harcourt Brace, Segunda Edición,
España.
6. Bingham S.A., 1990. Mechanisms and experimental and epidemiological
evidence relating dietary fiber (non-starch polysaccharides) and starch to
protection against large bowel cancer. Proc. Nutr. Soc. 49,152-171.
7. Bonetti P., Lerman L., Lerman A., 2003. Endothelial dysfunction: a marker of
atherosclerotic risk. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23,168-175.
8. Burns J., Gardner P., O’Neil J., Crawford S., Morecroft I., McPhail D., Lister
C, Matthews D., MacLean M., Lean M., Duthie G., Crozier A.. 2000.
Relationship among Antioxidant Activity, Vasodilation Capacity, and
Phenolic Content of Red Wines. J. Agric. Food Chem. 48, 220-230.
9. Bustamante S., Morales M., 2003. Bases farmacológicas y clínicas del
extracto de Vitis vinifera en patologías asociadas con el estrés oxidativo.
Revista de Fitoterapia 3 (2), 135-144.
10. Cheeseman K., Slater T., 1993. An introduction to free radical biochemistry.
Brit Med Bull 49, 481-493.
24
11. Finkel T., Holbrook N.J., 2000. Oxidants, oxidative stress and the biology of
ageing. Nature 408, 239–247.
12. Frankel E., Waterhouse A., Teissedre P., 1995. Principal Phenolic
Phytochemicals in Selected California Wines and Their Antioxidant Activity
in Inhibiting Oxidation of Human Low-Density Lipoproteins. J. Agric. Food
Chem. 43, 890-894.
13. Fridovich I., 1998. Oxygen toxicity: a radical explanation. J Exp Biol 201,
1203-1209.
14. Galvano F., La Fauci L., Lazzarino G., Vicenzo F., Ritieni A., Ciappellano S.,
Battistini N., Tavazzi B., Galvano G., 2004. Cyanidins: metabolism and
biological properties. J Nutritional Biochemistry 15, 2-11.
15. German J., Walzem R., 2000. The health benefits of wine. Annu Rev Nutr
20, 561-593.
16. Ghiselli A., Nardini M., Baldi A., Scaccini C., 1998. Antioxidant activity of
different phenolic fractions separated from Italian red wine. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 46 (2), 361-367.
17. Guyton A., Hall J., 2001. Tratado de fisiología médica. Editorial McGraw-Hill
Interamericana, Décima Edición, México.
18. Halliwell B., Gutteridge JMC., 1999. Free radicals in biology and medicine.
3ª Edición. Oxford University Press.
19. Hernández R., Fernández C., Baptista P., 2001. Metodología de la
investigación. Editorial McGraw-Hill, México.
20. Hou D., 2003. Potential mechanisms of cancer chemoprevention by
anthocyanins. Current Molecular Medicine 3, 149-159.
21. Jankowski A. Jankowska B., Niedworok J., 2000a. The influence of aronia
melanocapra in experimental pancreatitis. Polish Merkuriusz Lek 8 (48),
395-398.
22. Kähkönen M., Heinonen M., 2003. Antioxidant Activity Of Anthocyanins And
Their Aglycons. J Agric Food Chem 51, 628-633.
25
23. Karaki R., Osaki H., Hori M y Cols., 1997. Calcium movement distribution
and function in smooth muscle. Am Soc Pharmacol And Exp Ther 49 (2),
157-230.
24. Kong J., Chia L.., Goh N., Chia T., Brouillard R., 2003. Analysis and
biological activities of antocyanins. Phytochemistry 64, 923-933.
25. Li J., Li W., Liu W., Altura B.T., Altura B.M., 2004. Mechanisms of hydroxyl
radical-induced contraction of rat aorta. European Journal of Pharmacology
499, 171– 178.
26. Market M., Andrew P., Babiar B., 1984. Measurement of superoxide
production by human neutrophils. Methods Enzimol 105, 358-65.
27. Morazzoni P., Livio S., Scilingo A., Malandrino S., 1991. Vaccinium myrtillus
Anthocyanosides Pharmacokinetics in Rats. Arzneim.- Forsch/ Durg Res.
41 (1), 2.
28. Middleton E., Kandaswami C., 1992. Effects of flavonoids on inmune and
inflammatory cell functions. Biochem Pharmacol 43, 1167-1179.
29. Muñoz O., Schwartz M., Loyola E., 2003. Antocianos, colorantes naturales
de aplicación industrial. Revista de Fitoterapia 3 (2), 147-152.
30. Muñoz O., 2003. Antoncianos y betalainas: colorantes de aplicación
industrial. Editorial CYTED-CONICYT, Santiago.
31. Nishino C., Enoki N., Tanaka S., Mori, A., Kabayashi, K., Fukushima, M.,
1987. Antibacterial activity of flavonoids against Staphylococcus
epidermidis, a skin bacteria. Agric Biol Chem 51, 139-143.
32. Pietta G., 2000. Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod 63, 1035-1042.
33. 1er. Tte. José Miguel Rodríguez Perón, Tte. Cor. José Rogelio Menéndez
López, 1er. Tte. Yoel Trujillo López, 2001. Radicales libres en la
biomedicina y estrés oxidativo. Rev Cubana Med Milit 30 (1), 36-44.
34. Peters S., Mathy M., Pfaffendorf M., Van Zwieten P., 2000. Reactive oxygen
species-induced aortic vasoconstriction and deterioration of functional
integrity. Arch Pharmacol 361, 127-133.
26
35. Rodrigo R., Rivera G., 2003. Papel del estrés oxidativo y de los
antioxidantes en la prevención de las enfermedades crónicas no
transmisibles. Monografía. Universidad de Chile.
36. Satue-Gracia M., Heinonen M., Frankel E., 1997. Anthocyanins as
Antioxidants on Human Low-Density Lipoprotein and Lecithin-Liposome
Systems. J Agric Food Chem 45, 3362-3367.
37. Serraino I., Dugo L., Dugo P., Mondello L., Masona E., Dugo G., Caputi A.,
Cuzzocrea S., 2003. Protective effects of cyanidin-3-O-glucoside from
blackberry extract against peroxynitrite-induced endothelial dysfunction and
vascular failure. Life Science 73, 1097-1114.
38. Sies H., 1993. Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem 215, 213-
219.
39. Simon A., Castro A., Kaski J., 2001. Avance en el conocimiento de la
disfunción endotelial y su aplicación en la práctica clínica. Rev. Cubana
Med 40 (3), 212-222.
40. Soto M., González C., Lissi E., Vergara C., Latorre R., 2002. Ca+2- activated
K+ channel inhibition by reactive oxygen species. Am J Physiol Cell Physiol
282, C461–C471.
41. Wang H., Cao G, Prior R., 1997. Oxygen radical absorbing capacity of
anthicyanins. J Agric Food Chem 45, 304-309.
42. Wagner H., 1985. Annual Proceedings of Phytochemical Society of Europe
25, 409.
43. Youdim K., McDonald J., Kalt W., Joseph J., 2002. Potential role of dietary
flavonoids in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative
and inflamatory insults. Journal of Nutritional Biochemistry 13, 282-288.
44. Youdim K., Martin A., Joseph J., 2000. Incorporation of the elderberry
anthocyanins by endothelial cells increases protection against oxidative
stress. Free Radical Biology and Medicine 29 (1), 51-60.
27
ANEXOS Anexo 1 Estructura química de las Antocianinas
La estructura química de la antocianinas se caracteriza por poseer dos anillos aromáticos, unidos por un puente de tres carbonos a los cuales pueden estar unidos a uno o más grupos hidroxilo, siendo esta la estructura básica de todo polifenol. Lo que las caracteriza a las antocianinas es que poseen un oxígeno protonado; y que presenta uno o más grupos azúcar unidos al carbono 3 del anillo C. La capacidad antioxidante tiene directa relación el número de grupos hidroxilos unidos a los carbonos de los anillos, entre mayor numero de grupos –OH mayor capacidad antioxidante.
Azúcar
28
Anexo 2 Metabolismo del oxígeno
O2 + 1 ē O2·- (radical anión
superóxido)
2O2 + 2 ē + 2H+ O2 + H2O2 (peróxido de hidrógeno)
O2 + 3 ē + 2H+ -OH + •OH (hidroxilos)
O2 + 4 ē + 4H+ 2H2O (agua) (Guyton, 2001)
29
Anexo 3 Generación de radical hidroxílo Reacción de Fenton
Fe2+ + H2O2 Fe3++ -OH + •OH
Reacción de Haber-Weiss
Fe2+ Fe3+
O2·- + H2O2 -OH + •OH + O2
(Guyton, 2001)
30
Anexo 4 Generación de radical superóxido
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2.-
Cu+ + O2 Cu2+ + O2.-
(Guyton, 2001)
31
Anexo 5 Mecanismo de estabilización de EROs de los flavonoides
Flavonoide Radical Aroxilo
ERO
(Pietta, 2000)
32
Anexo 6 Esquema del montaje del baño de órganos
Los segmentos de aorta se montaron en baños de vidrio de doble pared, sumergidos en solución KHm, termorregulados a 37 + 0.5º C. El extremo inferior se fijo al fondo del baño y el extremo superior a un transductor de fuerza (T.F.) Grass FT-03 conectados a polígrafos Grass (modelos 7D y 5D). La solución KHm fue permanentemente burbujeada con CO2-bioxide (95% O2 ; 5% CO2).
33
APÉNDICE
Tabla 1. Tensión desarrollada por los anillos aórticos de rata, producida por
Fenilefrina, pre y post a la generación de EROs inducida por electrólisis.
* = p<0,01
** = p< 0,001
Contracción Pre Electrólisis Contracción Post ElectrólisisGrupo
Experimental Tensión
Absoluta (mN)Tensión
Relativa (%)Tensión
Absoluta (mN) Tensión
Relativa (%)
Grupo 1 (n=5) 11,43 ± 3,76 100 12,20 ± 3,88 106,97 ± 7,30
Grupo 2 (n=4) 9,06 ± 2,84 100 3,44 ± 0,81* 38,78 ± 4,81
Grupo 3 (n=5) 4,99 ± 1,72 100 0,76 ± 0,39** 17,90 ± 11,53
Grupo 4 (n=5) 5,79 ± 1,80 100 0,48 ± 0,49** 8,26 ± 7,59
Grupo 5 (n=4) 8,70 ± 2,23 100 8,52 ± 1,93 98,88 ± 6,26
34
Figura 1. Tensiones absolutas de las contracciones pre y post electrólisis inducidas por FE 1µM, en anillos aórticos de rata. Grupo 1: control (n=5), grupo 2: tratamiento con 0 ng/mL de EVvA (n=4), grupo 3: tratamiento con 250 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 4: tratamiento con 500 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 5: tratamiento con DMSO 100 mM (n=4). Los valores representan el promedio ± su desviación estándar.
* = Diferencia significativa de la contracción pre electrólisis con respecto a la contracción post electrólisis (p<0,01). ** = Diferencia significativa de la contracción pre electrólisis con respecto a la contracción post electrólisis (p<0,001). *** = Diferencia significativa de la contracción pre electrólisis con respecto a la contracción post electrólisis (p<0,001).
Contracción pre electrólisis Contracción post electrólisis
35
Tabla 2.
Tensión absoluta desarrollada por los anillos aórticos de rata, inducida
porelectrólisis.
* = p<0,05
Contracción Inducida por Electrólisis Grupo
Experimental Tensión
Absoluta (mN)
Grupo 1 (n=5) 0
Grupo 2 (n=4) 3,87 ± 1,36
Grupo 3 (n=5) 2,09 ± 1,42
Grupo 4 (n=5) 2,45 ± 1,32
Grupo 5 (n=4) 0,12 ± 0,15*
36
Figura 2. Tensiones absolutas de las contracciones inducidas por electrólisis, en anillos aórticos de rata de los grupos experimentales. Grupo 1: control (n=4) no graficado por presentar valor = 0 mN, grupo 2: tratamiento con 0 ng/mL de EVvA (n=4), grupo 3: tratamiento con 250 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 4: tratamiento con 500 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 5: tratamiento con DMSO 100 mM (n=5). Los valores representan el promedio ± su desviación estándar. * = Diferencia significativa de la contracción inducida por electrólisis con respecto al grupo 2 (p<0,05).
37
FE Lavado Incubación Electrólisis FE
Figura 3. Curso temporal de un registro poligráfico de anillos aórticos de rata. 1 = Contracción inducida por α-adrenérgico generando un ascenso rápido (fase rápida o transiente), dependiente de Ca+2 intracelular por apertura de canales de Ca+2 del retículo sarcoplásmico; 2 = mantención de la contracción o fase de meseta, dependiente de Ca+2 extracelular; 3 = retiro del estímulo α-adrenérgico por lavado con KHm, provocando la relajación del músculo liso vascular, 4 = Período de incubación con el EVvA por 15 minutos; 5 = contracción inducida por electrólisis, por acción del las EROs sobre el ácido araquidónico; 6 = contracción inducida por α-adrenérgico post electrólisis. Se observa la fase rápida, a diferencia de la fase de meseta que no se logra mantener. Sólo se mantiene una contracción que alcanza el 50% de la fase rápida. * = corte del registro para mostrar los hechos relevantes para comprensión del protocolo. Las contracciones fueron inducidas por fenilefrina 1 µM, antes y después de electrolisis (90 s., 30 mA). FE = fenilefrina; Lavado = lavado con solución KHm.
CIF pre Electrólisis CIE CIF post Electrólisis
1
2
* 4 5
6
3