determina de proteinas pelo metodo kjedahl
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Faculdade Metropolitana de Campinas
VERIS
Curso de Nutrição
Bromatologia
Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl
Campinas
2011
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Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl
Relatório apresentado à
disciplina de bromatologia,
ministrado pela, como forma de
avaliação prática do conteúdo.
Campinas
2011
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SumárioIntrodução..........................................................................................................1
Objetivos.............................................................................................................2
Materiais..............................................................................................................3
Métodos...............................................................................................................4
Resultados..........................................................................................................5
Discussão............................................................................................................7
Conclusão...........................................................................................................9
Referências bibliográficas:................................................................................10
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Introdução
Proteínas são macronutrientes constituídos por uma cadeia de aminoácidos
unidos por ligações peptídicas. Possuem funções estruturais, de transporte,
hormonal, de armazenamento e defesa. Diferenciam-se quimicamente das outras
frações de nutrientes que constituem um alimento por possuírem um átomo de
nitrogênio em sua composição.
A partir desta particularidade, pode-se determinar a quantidade de proteínas
presentes nos alimentos. O método mais utilizado é pelo processo de digestão
Kjeldahl, proposto em 1883 pelo mentor de mesmo nome. Este processo é
constituído de três etapas, digestão, destilação e titulação. A proteína sofre uma
hidrolise ácida e, assim a matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio
transformado em amônia. Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes
proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o fator empírico 6,25 para
transformar o numero de g de nitrogênio encontrado em número de g de
proteínas.
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Objetivos
Objetivo geral:
Conhecer as etapas do método de digestão de Kjeldahl, para determinar a
concentração de proteínas na amostra.
Objetivo especifico:
Analisar as etapas de digestão, destilação e titulação da amostra, analisando
detalhadamente cada uma a fim de compreender os processos a que a amostra
foi submetida e como estes interferem na determinação da concentração proteica.
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Materiais e métodos
Materiais:
- 1 béquer de 50 ml
- 2 Erlenmeyer de 250 ml
- 4 Tubos micro Kjedahl
- Leite em pó
- 1 Balança Analítica
- 1 Bloco Digestor
- 1 Destilador de Proteína
- 1l Solução de NaOH 40 %
- 1l Solução de H3BO3 a 2 % p/v
- 100 ml Vermelho de metila, 0,1 % em álcool
- 100 ml Verde de bromo cresol, 0,1 % em álcool
- Solução padronizada de HCL 0,02N
- Bureta de 50 ml com suporte
- 100 g mistura catalisadora: 96% de k2SO4, 4 % CuSO4.5H2O bem
moídos e misturados
- 500 ml Ácido sulfúrico concentrado, com baixo teor de nitrogênio
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Métodos
Foram pesados 200 g de leite em pó, 1,5 g de mistura catalisadora e 3 ml de
ácido sulfúrico concentrado. Em seguida a amostra foi transferida para o tubo
micro-kjedahl, e colocada no bloco digestor por cerca de 1 a 6 horas e, resfriada.
Assim, este processo foi realizado antes da aula, pela técnica de laboratório.
Após resfriada a amostra sofreu o processo de destilação, foram adicionados 3 ml
de água ao tubo micro-kjedahl e, 10 ml de hidróxido de sódio ao copo destilador.
No aparelho destilador a amostra foi destilada pela presença de hidróxido de
sódio que volatiliza a amônia, esta foi recolhida em um Erlenmeyer de 250 ml
contendo, 10 ml de solução de ácido bórico, com os indicadores vermelho de
metila, 4 gotas, e verde de bromocresol, 6 gotas. O ácido bórico fixou a amônia,
formando o borato de amônia. A destilação persistiu por alguns minutos, até que
a solução contida no Erlenmeyer obtivesse uma coloração azul, foram recolhidos
100 ml, com o cuidado de não desligar o aparelho destilador, para não haver
refluxo para o tubo com ácido concentrado.
O destilado foi titulado com ácido clorídrico (HCl) 0,0 2 N. Uma bureta de 50 ml foi
completada com HCl , e gotejada na amostra ate que esta passasse da cor verde
azulado para roxo claro.
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Resultados
O método de Kjeldahl consiste na digestão da amostra protéica por ácido
sulfúrico, destilação com fixação da amônia pelo ácido bórico e, titulação com
ácido clorídrico onde, o volume deste utilizado na titulação vai determinar a
quantidade de nitrogênio da amostra e, conseqüentemente a quantidade de
proteína, visto que, em geral o nitrogênio corresponde a 16% do peso da amostra
protéica.
No experimento realizado em primeira aula pratica, obteve-se 4,3 ml de ácido
clorídrico (HCl) na titulação, com este volume a solução de borato de amônia
tornou-se roxa claro, o que indica que o ácido desprendeu a amônia da molécula
de borato.
Levando-se em consideração que a massa atômica do HCl é aproximadamente
36, com massa atômica 1 do hidrogênio e 35 do cloro e, que segundo Cecchi
(2003), o método é uma titulometria de neutralização onde 1 mol de HCl é igual a
1 mol de nitrogênio (N), obteve-se os seguintes resultados:
1 mol HCl__________ 36 g
X mol _____________ 0.043 g
Logo, em 0,043 g de HCl, tem-se 0,0119 mols, que é igual a 0,0119 mols
de N.
A massa atômica do nitrogênio é de aproximadamente 16. Fazendo a
conversão:
Massa de N= Volume de HCl . Massa de HCl . mol de N (CECCHI, 2003).
Massa de N = 0.043. 0.0119 . 14
Massa de N = 0.716
Proteína total = Nitrogênio total. Fator
Proteína total = 0.716. 6.25
Proteína total= 4.475 %
Em uma segunda amostra, titulou-se mais de 150 ml de HCl sem que a amostra
passasse da cor azul para roxo claro, isto pode ter ocorrido devido a
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superaquecimento do aparelho de destilação. A alta temperatura pode ter
volatizado a amônia e, assim houve grande perda de nitrogênio.
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Discussão
A qualidade nutricional de uma proteína pode ser medida através do conhecimento
da sua concentração nos alimentos e da sua composição de aminoácidos. Para a
determinação dos aminoácidos em um alimento, são utilizadas técnicas
cromatográficas. O método mais utilizado para a determinação da concentração de
protéica é o de Kjeldahl, que parte do conceito de que a fração de nitrogênio não-
protéico de um alimento é irrelevante e, na determinação de nitrogênio total obtém-
se o conteúdo de proteínas. (COULTATE, 2004).
A proporção de nitrogênio para a maioria das proteínas é de 16% do peso total, ou
seja, em 100 g de proteínas, 16 g corresponde a nitrogênio. Assim, um fator de 6.25,
que é a diferença entre o peso total e o peso correspondente ao nitrogênio, é
utilizado para converter o teor deste em concentração de proteínas. Em alguns
alimentos, como cereais, que têm variações na concentração de aminoácidos, um
fator diferenciado é utilizado para obter-se maior precisão. (COULTATE, 2004;
ZENEBON et al, 2008).
No método referido, primeiramente a amostra protéica passa por uma hidrolise
ácida, com ácido sulfúrico concentrado, na presença de calor e de uma mistura
catalisadora que acelera a reação. Sendo a proteína formada por cadeias de
aminoácidos unidos por ligações peptídicas que, segundo Mahan (2005), “é formada
entre o grupo carboxila do primeiro aminoácido e o nitrogênio do segundo’’, o ácido
hidrolisa os grupamentos amina.
A mistura catalisadora, utilizada na hidrólise ácida, é composta de substancias que
aumentam a velocidade da reação, fornecendo um mecanismo de reação diferente
entre reagentes e produtos. Os catalisadores mais utilizados são mercúrio, cobre e
selênio, geralmente é utilizada uma mistura, pois, em pequenas concentrações
evita-se os problemas de toxidez e perda de nitrogênio causada por estes.
(ANDRADE, 2009; CECCHI, 2003).
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Após permanecer no bloco digestor por algum tempo, a amostra torna-se
transparente, o que indica que esta totalmente digerida e, transformada em sulfato
de amônia. Esta amostra passa pelo processo de destilação, no tubo micro-kjeldahl
é adicionado água e hidróxido de sódio (NaOH) 40% para alcalinizar a amostra ,
esta é destilada pelo aparelho. A amônia desprendida é recolhida em um erlenmyer
com ácido bórico, que fixa a amônia formando o borato de amônia de coloração
azul. (CECCHI, 2003).
Para perceber-se o ponto de equivalência entre o titulante e a amostra são utilizados
indicadores, como o verde de bromocresol e vermelho de metila, estes sofrem a
mudança de cor indicando que o ponto de equivalência foi atingido.
A titulação é feita com ácido clorídrico. Na aula pratica utilizou-se HCl 0,02 N,
segundo Rosenberg (2002), a normalidade exprime o número de equivalentes-
gramas de soluto existente em um litro de solução.Assim, 20 g de soluto estavam
presentes em 1 litro da solução ácida utilizada.
O borato de amônia obtido na destilação, é titulado com este ácido , que desloca a
amônia da molécula de borato. O ponto de equivalência é atingido quando a amostra
adquire a cor roxa claro. (CECCHI, 2003.)
Na aula pratica, com 4,3 ml de HCl atingiu-se o ponto de equivalência. Em uma
segunda amostra utilizou-se mais de 150 ml de ácido sem que a amostra passasse
de azul para roxo. Isto pode ter ocorrido devido a superaquecimento do aparelho de
destilação, causando a volatilização da amônia, perdendo assim o nitrogênio da
amostra.
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Conclusão
O método de Kjeldahl para determinação de proteínas, é uma técnica relativamente
simples e econômica para analise de alimentos. Entretanto, as etapas de digestão,
destilação e titulação têm que ser realizadas cuidadosamente, pois a concentração
dos reagentes interfere no resultado final, além disso, o aparelho digestor deve estar
calibrado para que não haja superaquecimento e, conseqüente perda de nitrogênio
por volatilização da amostra.
A determinação da concentração de proteínas nos alimentos esta relacionada com a
qualidade protéica dos mesmos, e o nitrogênio pode ser utilizado como parâmetro,
pois a sua presença na composição das proteínas é uma particularidade da mesma.
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Referências bibliográficas:
ANDRADE, Edira Castello Branco; Análise de alimentos uma visão química da
nutrição, 2ª edição, Varela, São Paulo, 2009, pg 62-65.
CECCHI, Heloisa Mascia; Fundamentos teóricos e práticos da análise de alimentos,
2ª edição, UNICAMP, Campinas, 2003, pg 61-64
COULTATE, T.P.; Alimentos a química de seus componentes , 3ª edição, Artmed,
Porto Alegre, 2004, pg 113-116
MAHAN, L. Kathleen; Krause, Alimentos, Nutrição e Dietoterapia, 11[ edição, Roca,
São Paulo, 2005.
ROZENBERG, Izrael Mordka; Química geral, 2ª edição , Edgard Blucher Ltda., São
Paulo, 2002 , pg 452-453
ZENEBON, Odair, PASCUET; Neus Sadocco; TIGELA, Paulo; Métodos físico-
químicos para analise de alimentos, 4 edição, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2008,
pg 122-124.
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