4. DETEKCIJA OTROVAUvodkljuan korakdetekcija:otrova: ciljano odreivanje skupine ili odreenog otrovaotrovnosti: je li prisutno ita otrovnoSvaka tvar je otrov; ne postoji niti jedna koja nije otrov. Samo doza ini tvar otrovom ili lijekomUvodeksperiment je neophodan u istraivanju odgovora na kemijsku tvarbilo koja tvar moe prouzroiti oteenja ili smrt pod odreenim uvjetima izloenostinema apsolutno sigurne tvari, koja ne bi mogla izazvati tetne uinkeskoro sve to konzumiramo (sol, eer, krob, mast, proteini, neki minerali i vitamini, ak i voda) u dovoljno visokim koliinama moe djelovati tetnoOtkrivanje otrovnostistara metoda za vodu, hranu i zrakbioloki model za otkrivanje otrovnostiOtkrivanje otrovnostirano otkrivanje otrovnostiu hrani, vodi, zraku,...detekcija (stalna ili povremena) tono odreenog otrova prikladnom metodommjerenje posebnih uinaka otrovaotkrivanje ope otrovnosti na biolokom modeluKvalitativne i kvantitativne analitike metodeopi protokol za kvantitativna odreivanja toksikanata u biolokim uzorcima:cilj analize uzorkovanje ekstrakcija izolacija identifikacija i mjerenje analiza podatakadetekcija, identifikacija i odreivanje toksinosti i koncentracija toksinih tvariklasifikacija analitikih metoda:bioloke metode (bioassays)fizikalne i/ili kemijske metodemetode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)fizikalne i/ili kemijske metodeklasine/suvremene analitike i biokemijske tehniketemelj: fizikalna i/ili kemijska svojstva ispitivane tvarikromatografija, elektroforetske tehnike, spektrofotometrija (UV/VIS), GC, HPLC, MS, AAS, ICP-MS (Inductively coupled plasma - mass spectroscopy), IR, NMRmetode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)temelj: specifina reakcija liganda i vezujueg proteinametode razvrstane u tri osnovne kategorije:imunometodemetode koje koriste vezanje na receptormetode koje koriste vezujue proteine u krvotokumetode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)imunometodenajee koriteneligand: antigenvezujui protein: specifino antitijelobrza, visoko osjetljiva i specifina analizaodreivanje koncentracije antigena ili prisutnog antitijelajednostavnost izvoenjajednostavnost interpretacije rezultatametode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)metode koje koriste vezanje na receptorpodrazumijevaju prethodnu ekstrakciju receptorskog proteina iz ciljnog organa za odreeni hormon ili ksenobiotikmetode koje koriste vezujue proteine u krvotokuproteini prirodno prisutni u plazmi (npr. tiroksin vezujui protein (TBG) analiza tiroksina)bioloke metode (bioassays)praenje odgovora biolokog sustava na otrov (biljka ili ivotinja, organ ili tkivo, mikroorganizmi ili stanice)bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modeluproblem: izbor ivog organizma, organa ili stanice za takve pokusecilj: odreivanje opasnosti za ovjeka (razlike u odnosu na model, neki modeli posebno osjetljivi na neki otrov lani rezultati) paralelno koritenje dva modelabioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli: bakterijenajbolje definiran i razvijen modelrezultati relativno brzovelik broj stanica koje sudjeluju u pokusu vea sigurnost rezultataizbor bakterijskog soja ovisi o mediju i metodibioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli: bakterije2 naina utvrivanja otrovnostiinhibicija rasta (jednostavnija, sporija, moe detektirati vei broj uinaka otrova broj bakterija ili neki drugi imbenik, za vodu i sve to je u vodi topljivo)bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli: bakterije2 naina utvrivanja otrovnostimjerenje nekog specifinog parametra (npr. funkcija enzima, potronja kisika,...) djelovanja otrova na ve uzgojenu bakterijsku koloniju (bre, za sve medije)alge (rast, odreivanje klorofila,...)bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli: kulture prikladnih stanicavelika sigurnost u ponovljivosti rezultata, etikistanine linije mije jetre (najvie pokusa utvrivanja LD raeno na mievima)inhibicija rasta stanine kulture ili neki uinak otrova na staniceispitivanja na stanicama viih organizamabioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli: ivotinjenajdue koriten model, najpouzdanijimi, takor (otrov primjenjen na usta, kou, intravenski, intramuskularno, akutni pokus traje 24 sata, zapisivanje svih promjena, rtvovanje na kraju pokusa)posebno osjetljive ivotinje na neke otrove ili na otrove u nekim medijima (kanarinci, rijene pastrve)bioloke metode (bioassays)beskraljenjaci:vodena buha (Daphnia sp.) akutna smrtnost kroz 24-48 satirakovi (Palaemonetes spp.) toksinost topljivih pesticida, klora, tekih metala, industrijskih otpadnih tvari; smrtnost unutar grupa od 10-20 rakova izloenih 5-6 koncentracija testirane tvaribioloke metode (bioassays)kraljenjaciribe: pastrva, keder, aran, zebra fishvrste testova toksinosti na ribama:test akutne toksinosti: min. 5 konc. testirane tvari, 7 riba u grupi, vidljive promjene i smrtnost tijekom 96 satitoksinost u ranim fazama ivota: jajaca, novo izlegnute ribe, test period 1 mjesectoksinost na rast mladih riba: deformacije, rast, smrtnost, test period 1 mjesecivotni ciklus: produkcija jajaaca, odnos spolova, vie generacija, nekoliko mjeseci do godinabioloke metode (bioassays)vii kraljenjaciprocjena redoslijeda koritenja:mi takor koko vodozemci morska svinja hrak zec riba pas gmizavci maka prepelica puran primatibioloke metode (bioassays)prednosti: vea slinost biotransformacijskim procesima u ovjekunedostaci:mogunost primjene biolokih metoda samo za tvari koje proizvode bioloki odgovor u ivim organizmima i tkivimabioloka varijabilnost (manja preciznost, slabija reproducibilnost, potreba ponavljanja pokusa)cijena (nekoliko tisua do nekoliko stotina tisua dolara)vrijemeprostorbioloke metode (bioassays)koritenje ivotinja etika?klasine bioloke metode samo ako nema odgovarajuih alternativnih prednosti metoda sa staninim kulturama:minimalne potrebe koritenja ivotinjaprimjena uglavnom u poetnim ispitivanjima biolokih (toksinih) djelovanja ksenobiotikapraenje morfolokih i biokemijskih promjena u staninoj kulturiolakano prepoznavanje tetnih uinaka ksenobiotikasvoenje na minimum brojnih testova na ivotinjamaEtika?bioloke metode vs. imunometodebioloke: odreivanje koncentracije temeljeno na biolokoj aktivnosti ispitivane tvariimunometode: prepoznavanje samo dijela strukture antigena - njegove antigenske determinante; vea osjetljivostotkrivanje otrovnosti u ekotoksikologijije li ono to se ispituje otrovno za biosferu ekosustava (voda, tlo, zrak) u koji je dospjelohoe li primjena nekog novog proizvoda tetiti okoliu (za sve proizvode s vie od 1 000 t/god.)izbor organizma i vremena izloenostibar 2 predstavnika ekosustava koji se prouava (vii i nii organizam)OTKRIVANJE OTROVNOSTIotkrivanje otrovnosti u ekotoksikologijibakterije (za vode i tlo)plijesni (za razliite materijale)alge (za vode)muice (za vodu)koljke, puevi (beskraljenjaci, za razl. ekosustave)otkrivanje otrovnosti u ekotoksikologijiribe ili njihove kulture stanica (za vode)gliste (za tlo)kraljenjaci ili njihove kulture stanica (za sve uzorke)Provjera i dokazivanje valjanosti analitike metodecilj provjere: pokazati da ispravno primijenjen postupak daje rezultate koji udovoljavaju svrsiparametri provjere valjanosti metode:iskoritenje: mjerena koliina ispitivane tvari (aktivna tvar i odgovarajui metaboliti) izraena kao % dodane u uzorak tonost metode)selektivnost: granice do kojih metoda moe biti koritena za odreivanje pojedine tvari u smjesi ili uzorku bez interferencije sa slinim komponentamakalibracija: mogunost mjernog sustava da daje prihvatljivu korelaciju odgovora instrumenta i koncentracije ispitivane tvariparametri provjere valjanosti metode:ponovljivost: bliskost podudaranja uzajamno neovisnih rezultata testa (u kratkim vremenskim razmacima, isti operator, ista metoda, identian ispitivani materijal, isti laboratorij, koritena ista oprema)reproducibilnost: bliskost podudaranja neovisnih rezultata dobivenih istom metodom na identinom ispitivanom materijalu, ali pod razliitim uvjetima unutarlaboratorijska reproducibilnost : dan-na-dan varijacije uslijed promjene analitiara, proizvodne serije reagencija, rekalibracije instrumenata, laboratorijskog okolia (npr. temperatura) meu-laboratorijska reproducibilnost: varijacije uslijed razliitih kalibracijskih standarda, razlika u interpretacijama protokola, razlika opremi ili izvoru reagencija, faktora okolia (npr. klimatski uvjeti)Provjera i dokazivanje valjanosti analitike metodeparametri provjere valjanosti metode:granica detekcije: najmanja koliina ispitivane tvari, koja se moe detektirati, ali ne nuno i kvantificirati kao egzaktna veliinagranica kvantifikacije: najnia koncentracija kod koje je mogua jednoznana identifikacija ispitivane tvari i sa kojom se postie prihvatljivo iskoritenjeOtkrivanje i dokazivanje otrovaputevi ulaska u organizam:respiratorni trakt (inhalacija)koa (apsorpcija uslijed dermalnog kontakta)digestivni trakt (s hranom, vodom)neposredan unos u krvotok (ozlijede, ubodi, injekcije)toksikokinetika (put toksine tvari u organizmu)toksikodinamika (zbivanja na staninoj i molekularnoj razini koja dovode do toksinog odgovorarazlike u toksinosti s obzirom na otrov, nain unosa, vrstu i spolLD50 za diklorvos s obzirom na vrstu i put izloenosti:stupnjevanje akutne oralne toksinosti (LD50) - klasifikacija temeljena na masi tvari:ekstremno toksine tvari (botulin): 1 mg/kg tj. m.vrlo toksine tvari (strihnin): 1-50 mg/kg tj. m.umjereno toksine tvari (DDT): 50-500 mg/kg tj. m.slabo toksine tvari (morfin): 0.5-5 g/kg tj. m.vrlo slabo toksine tvari (etanol): 5-15 g/kg tj. m.netoksine tvari: 15 g/kg tj. m.pribline LD50 vrijednosti ksenobiotika za ovjeka prosjene tjelesne mase 70 kg:subletalni efektrezultat djelovanja mikro koliina toksinih tvari, koje neprekidno tijekom dueg vremena, u malim koliinama dospijevaju u organizam iz biosfereindustrija - otpadne vode, sastojci dima, industrijske kemikalije, meuprodukti sinteza, farmaceutski proizvodipoljoprivreda - pesticidi, umjetna gnojivaprodukti sagorijevanja gorivaotpaci iz kuanstva, zdravstvenih ustanovaOtkrivanje i dokazivanje otrovasubletalni efekt posljedice:suptilne biokemijske lezije u vitalnim organimasmanjenje obrambenih sposobnosti organizmanepovoljno djelovanje na reprodukcijski sustavpromjene genetskih faktoramutageno, teratogeno i kancerogeno djelovanjeocjenu otrovnosti tvari temeljiti ne samo na akutnoj, ve nuno i na subletalnoj toksinostiotkrivanje otrova u biolokim materijalimaglavni cilj: utvrditi stanje bolesnika, a zatim eventualno uzrok trovanjakliniko-laboratorijsko otkrivanje obuhvaa:odreivanje biokem. pokazatelja stanja bolesnikautvrivanje posebnih uinaka otrovaanalize prosijavanjatestove dokazivanja prisutnosti otrovaotkrivanje otrova u biolokim materijalimaodreivanje biokem. pokazatelja stanja bolesnika sve pretrage koje se moraju uiniti kod bolesnika kojima treba odrati vitalne funkcijeacidobazni status (kada dolazi do promjena pH i/ili parcijalnih tlakova O2 i CO2 u krvi, alkalne ili kisele dijureze kao tehnike ubrzanog otklanjanja otrova)elektroliti (kada dolazi do dehidracije povraanje, proljev, znojenje, mokrenje; za vrijeme lijeenja)druge specifine biokemijske pretrage (jetreni enzimi)otkrivanje otrova u biolokim materijalimautvrivanje posebnih uinaka otrovamjerenje aktivnosti acetilkolinesteraze razgrauje neurotransmiter acetilkolin acetilkolin izaziva kontrakciju miia, suenje zjenica, pojaava peristaltiku crijeva, usporava rad srca, pojaava luenje lijezda znojnica, slinovnica, ima ulogu u odravanju svijesti,...na biosintezu, pohranu i razgradnju acetilkolina utjeu brojni lijekovi i otrovikod sumnje u primjenu bojnih otrova, organofosfornih insekticidainhibicija enzima potvrda iz analitikog laboratorijaotkrivanje otrova u biolokim materijalimautvrivanje posebnih uinaka otrovakoagulacijske pretragemjerenje pokazatelja zgruavanja krvikod trovanja antikoagulansimamjerenje postotka methemoglobina (eljezo u hemu nije Fe2+ nego Fe3+) i karboksihemoglobina (COHb)kod poara i kemijskih nesrea (NO3-, NO2-, CO)specifine pretrage (zelena pupavka NH3 u krvi)otkrivanje otrova u biolokim materijalimatestovi za prosijavanje i dokazivanje otrovaizravno dokazivanje otrovaimunokemijske metode, kromatografija, spektrofotometrija,...otkrivanje otrova u zrakukolorimetrijski testovigotovi setovi reagensana prikladnom sorbensu nalaze se sve potrebne kemikalije koje u kontaktu s otrovom daju obojeni produkt testovi na papiru natopljenom prikladnim reagensomtehnike indikatorskih cjevica (sorbens, sisaljka, za velik broj polutanata)otkrivanje otrova u zrakuinstrumentalne metodeelektrokemijske metode (ISE, stalno praenje kvalitete zraka,...) spektrometrija masa (najpouzdanija metoda)mobilni sustav plinski kromatograf-spektrometar masaotkrivanje otrova u vodikolorimetrijski testovigotovi setovi za najee polutante (nitrati, nitriti, cijanidi, amonijak, halogeni anioni, teki metali, cijanidi, pesticidi,...) jednostavni, najee kvalitativni odgovorinstrumentalne metodeza kontinuirana mjerenja elektrokem. (ISE)Testovi toksinostiobavezno testiranje toksinosti za tvari kojima mogu biti izloeni ovjek i drugi ivi organizmi u okoliu (lijekovi, aditivi u hrani, kontaminanti u hrani porijeklom iz okolia, industrijske kemikalije, pesticidi, tvari iz svakodnevne uporabe u domainstvu, kozmetiki pripravci)kontrola i testiranje propisani zakonskim regulativamaodabir testova toksinosti ovisan o:vrsti kemijske tvaripredvienoj uporabimoguim nainima izloenostipropisima zemlje u kojoj se provodi registracijaosnovni principi testiranja toksinosti: testovi na eksperimentalnim ivotinjama ili biljkamaepidemioloke studije: utvrivanje odnosa izloenosti i uinaka ksenobiotika na zdravlje pojedinih populacijaekotoksikoloke studije: primjena preciznih analitikih metoda u odreivanju ostataka ksenobiotika u okoliuispitivanje perzistentnosti i ponaanja ksenobiotika kao kontaminanata unutar prehrambenog lancapitanja koja prethode ispitivanju toksinosti ksenobiotika:Da li je spoj potpuno nov, ili je ve bio u uporabi u nekom vremenskom periodu?Da li e biti koriten u okoliu?Da li e biti dodavan u hranu?Da li primjena podrazumijeva jednokratnu ili ponavljanu dozu?U kojim dozama e se primjenjivati?Koja e starosna skupina biti izloena?Da li se moe oekivati izloenost trudnica ili djece?razmatranja u pripremi testiranja toksinosti na ivotinjama:najpogodnija vrsta za ispitivanjeslinosti biotransformacija s onima u ovjekauvjeti i nain uzgoja ivotinjanain prehrane i sastav hranezdravstveno stanje ivotinja spol ivotinjarazmatranja u pripremi testiranja toksinosti na ivotinjama:broj ivotinja u testunain aplikacije pri tretmanutrajanje testiranjatestovi akutne toksinostirazliite jednoktatne doze, odreivanje LD50najee na glodavcimadaju informaciju o potencijalnoj toksinosti novih ksenobiotikaukazuju na nain toksinog djelovanja, toksinost za ciljni organ i letalnost - polazite za odabir doza u testovima s ponavljanom izloenoutestovi subakutne, subkronine i kronine toksinostinajmanje 3 dozehematoloka ispitivanjakliniko-kemijska ispitivanjatestovi na teratogenost i reprodukciju, multigeneracijski testovitestovi na mutagenostspecijalni testovi toksinosti:testovi one i kone iritacije (ekstremni pH)imunotoksinost (uinci na imunoloki sustav praenje otpornosti na infekcije)neurotoksinost (uinci na sredinji i periferni ivani sustav praenje promjena u ponaanju)toksikokinetiki parametritoksikodinamiki parametri