deteÇÃo e identificaÇÃo rÁpidas dos principais ......espécies do género staphylococcus....

DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDAS DOS PRINCIPAIS CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM FÁRMACOS

POR ESPETROSCOPIA DE INFRAVERMELHO

Joana Anjos Ferreira Dissertação para obtenção do grau de mestre em Engenharia Farmacêutica

Orientador: Professor Doutor João Almeida Lopes, Faculdade de Farmácia Co-orientadora: Sofia Queirós, Generis Farmacêutica SA

Lisboa, 7 de Março de 2017

FACULDADE DE FARMÁCIA UNIVERSIDADE DE LISBOA

DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDAS DOS PRINCIPAIS CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM FÁRMACOS

POR ESPETROSCOPIA DE INFRAVERMELHO

Joana Anjos Ferreira Dissertação para obtenção do grau de mestre em Engenharia Farmacêutica

Orientador: Professor Doutor João Almeida Lopes, Faculdade de Farmácia Co-orientadora: Sofia Queirós, Generis Farmacêutica SA

Lisboa, 7 de Março de 2017

Deteção e identificação rápidas dos principais contaminantes microbiológicos em fármacos por espetroscopia de infravermelho

1

Resumo

A espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com refletância total

atenuada (FTIR-ATR) combinada com a análise multivariada de dados tem vindo a ser

proposta como um método para a discriminação de bactérias patogénicas a diferentes níveis

taxonómicos (p.e., espécie, sub-espécie e serotipo). O controlo microbiológico na indústria

farmacêutica é um fator extremamente importante para garantir a segurança e eficácia de um

medicamento. Durante a análise microbiológica de um produto, pode observar-se crescimento

de microrganismos provenientes de várias fontes e é necessário assegurar a qualidade do

produto fazendo a sua deteção e identificação. O principal objetivo deste trabalho é avaliar o

potencial da espetroscopia FTIR-ATR combinada com técnicas quimiométricas para diminuir

o tempo de identificação de microrganismos em medicamentos (formas sólidas). Esta

metodologia foi testada com Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas

aeruginosa. Foram utilizados 52 isolados destas bactérias recolhidos do ambiente e de

fármacos não estéreis. Estes foram identificados pelo método VITEK implementado na

Generis Farmacêutica SA e em seguida analisados por FTIR-ATR. Após o tratamento

espectral foram construidos modelos de análise de componentes principais (PCA) e mínimos

quadrados parciais de tipologia discriminante (PLS-DA). O método FTIR-ATR permitiu

distinguir corretamente bactérias gram-negativas de gram-positivas, assim como discriminar

espécies do género Staphylococcus. Quanto ao género Pseudomonas, apesar de se ter

considerado um número muito reduzido de isolados, foi possível identificar o correto

agrupamento de cada espécie nos modelos PCA e de agrupamento hierárquico. Relativamente

ao género Escherichia, não se verificou a presença de microrganismos correspondentes. Dos

dois grupos de microrganismos em estudo (Staphylococcus e Pseudomonas) foi possível

observar agrupamentos correspondentes aos principais contaminantes patogénicos. Este

resultado confirma o potencial do método FTIR-ATR neste campo de utilização mostrando a

sua aplicabilidade num laboratório microbiológico de um laboratório farmacêutico.

Palavras-chave: FTIR-ATR; contaminação microbiológica; Staphylococcus; VITEK; análise

multivariada.


2

Abstract

Attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy combined

with multivariate data analysis has been proposed as a taxonomic method used to classify and

distinguish pathogenic bacteria at multiple levels (for example, species, subspecies and

serotype). The microbial contamination control in the pharmaceutical industry is a key factor

to be considered in order to assure the safety and efficacy of a drug. During microbiological

analysis of a drug, the growth of several microorganisms can be observed. Therefore it is

crucial their identification and classification to safeguard the quality of the product. The aim

of this work is to propose and describe a fastest method based on FTIR spectroscopy and

chemometric techniques to be used in the microbiological analysis of a drug (solid form).

This methodology was applied to distinguish different microorganisms, namely Escherichia

coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The fifty-two bacterial isolates

used in this methodology were collected from the environment and from the microbiological

analysis of non-sterile drugs. They were identified according to the reference method

(VITEK) used in Generis Farmacêutica SA, and the spectral analysis of each isolate was

performed by ATR-FTIR spectroscopy. PCA and PLS-DA models were correspondingly

constructed, and the two methods were compared. The results obtained revealed that both

methods are in agreement. The FTIR method correctly distinguished gram-negative from

gram-positive bacteria. It was also able to distinguish species belonging to the Staphylococcus

genus. Regarding the Pseudomonas genus although it was considered a reduced number of

samples, it was possible to identified accurately group each species when performing the PCA

and HCA analysis. Concerning the Escherichia genus, no microorganisms were found. For

the two groups of microorganisms considered in this study, well-defined clusters of the main

pathogens were identified: S.aureus and P.aerugionosa. Overall, the results of this study

demonstrate that ATR-FTIR spectroscopy combined with chemometrics serves as a valid

method to be considered in a microbial laboratory of a pharmaceutical company.

Key-words: FTIR-ATR; microbiological contamination, Staphylococcus; VITEK;

multivariate analysis


3

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta

para a realização desta dissertação.

Ao meu orientador, Professor Doutor João Almeida Lopes pela orientação e conselhos

prestados para a realização desta dissertação e por mostrar sempre disponibilidade.

À Dr.ª Sofia Queirós e à Generis por aceitarem este projeto e me disponibilizarem

todos os meios para o realizar.

Um agradecimento especial à Ana Paula Grancho cuja ajuda foi imprescindível e por

sempre se mostrar disponível para ajudar no que fosse preciso.

À Dr.ª Madalena Pimentel pelo apoio e acompanhamento demonstrado.

À Dr.ª Clara Sousa pelo tempo disponibilizado para esclarecer as dúvidas encontradas

desde o início deste projeto.

À Bárbara cujos conselhos e disponibilidade foram uma mais-valia ao longo de todo o

trabalho.

Ao meu irmão e aos meus pais cujo apoio foi fundamental a todos os níveis. Sem eles

não teria sido possível.

Aos meus amigos Alexandra, Maria e Marcelo por todo apoio e ajuda neste trabalho,

como em todos os momentos da minha vida.

Ao Paulo por toda a paciência, pelo apoio incondicional e por nunca me deixar

desanimar.

Por fim, resta-me agradecer a todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a

realização desta dissertação e para terminar esta etapa da minha vida.

Muito obrigada!


4

Índice

1. Introdução ........................................................................................................................... 9

1.1. Análise microbiológica de produtos não estéreis ....................................................... 9

1.2. Microrganismos relevantes ...................................................................................... 10

1.2.1. Enterobacteriaceae .............................................................................................. 10

1.2.2. Pseudomonas ........................................................................................................ 11

1.2.3. Staphylococcus ..................................................................................................... 11

1.3. Identificação de contaminantes microbiológicos ..................................................... 13

1.3.1. Métodos moleculares/biológicos .......................................................................... 13

1.3.2. Métodos bioquímicos ........................................................................................... 13

1.3.3. Métodos espetroscópicos ...................................................................................... 16

1.3.4. FTIR - ATR para identificação de microrganismos ............................................. 19

1.4. Análise Multivariada ................................................................................................ 22

1.4.1. Pré-processamento espetral .................................................................................. 22

1.4.2. Técnicas quimiométricas ...................................................................................... 24

2. Revisão da literatura ......................................................................................................... 28

3. Objetivos .......................................................................................................................... 29

4. Materiais e métodos ......................................................................................................... 30

4.1. Isolados ..................................................................................................................... 30

4.2. Análises espetroscópicas .......................................................................................... 33

5. Resultados e discussão ..................................................................................................... 35

5.1. Avaliação dos resultados pelo método VITEK ........................................................ 35

5.2. Discriminação pelo método FTIR ............................................................................ 36

5.2.1. Distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos ....................... 38

5.2.2. Distinção de microrganismos do género Pseudomonas ....................................... 42

5.2.3. Distinção de microrganismos do género Staphylococcus .................................... 44

6. Conclusões e perspetivas futuras ...................................................................................... 62

Referências ............................................................................................................................... 64


5

Índice de Figuras

Figura 1. Kits que incluem 20 testes bioquímicos (adaptado de (39)). .................................... 14

Figura 2. Carta de identificação gram-positiva para o VITEK (adaptado de (41)). ................. 15

Figura 3. Sistema VITEK adaptado de (41). ............................................................................ 15

Figura 4. Esquema de um espetrómetro com interferómetro: F - Fonte de radiação IV; D -

Divisor de feixe; E1 - Espelho fixo; E2 - Espelho móvel (Adaptado (52)). .............................. 17

Figura 5. Esquema de um cristal para refletância total atenuada (ATR) (Adaptado (56)). ...... 18

Figura 6. Espetro FTIR representativo de bactérias com respetiva identificação das principais

bandas (Adaptado de (64)). ...................................................................................................... 22

Figura 7. Ilustração do método de PCA (adaptado de ((74)). .................................................. 24

Figura 8. Ilustração de um modelo de PLS-DA com três classes em que o i é o número de

amostras e o j o número de variáveis (Adaptado de (78)). ....................................................... 27

Figura 9. Espetros FTIR-ATR dos microrganismos padrão (E. coli, S. aureus e P. aeruginosa)

sem pré-processamento. ........................................................................................................... 37

Figura 10. Espetros dos microrganismos padrão de E. coli, P. aerugionosa e S. aureus pré-

processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2) na região 1500-900 cm-1. ........................................ 38

Figura 11. Representação gráfica da variância capturada com o aumento do número de CPs.38

Figura 12. Mapa de scores dos dois componentes principais do modelo PCA de todos os

microrganismos em que a vermelho estão representados os gram-negativos e a verde os gram-

positivos de acordo com a informação dada pelo VITEK. ...................................................... 39

Figura 13.Mapa de scores do modelo de PCA de todos os microrganismos após eliminar

aswa02 e asxy02 ( modelo construído com 5 CPs). ................................................................. 40

Figura 14. Representação da estatística de Hotelling’s T2 do modelo de PCA de todos os

espetros. .................................................................................................................................... 40

Figura 15. Representação da estatística de resíduos do modelo de PCA de todos os espetros.

.................................................................................................................................................. 41

Figura 16. Dendrograma feito com os todos os espetros onde estão representados os

microrganismos gram-positivos a verde e os microrganismos gram-negativos a vermelho. ... 41

Figura 17. Mapa de scores da família Pseudomonas em que estão representados os CPs 1, 2 e

5. ............................................................................................................................................... 42

Figura 18. Representação da estatística de resíduos para o modelo PCA das Pseudomonas. . 42

Figura 19. Representação da estatística de Hotelling’s T2 para o modelo de PCA do género

Pseudomonas. ........................................................................................................................... 43


6

Figura 20. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao

género Pseudomonas (foram usados 6 CPs). ........................................................................... 43

Figura 21. Variância capturada em função do número de CPs para o modelo PCA dos

espetros de Staphylococcus. ..................................................................................................... 44

Figura 22. Mapa de scores de todos os espetros de Staphylococcus com representação do 1º e

2º CPs. ...................................................................................................................................... 45

Figura 23. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 2º

CP. ............................................................................................................................................ 46

Figura 24. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 3º

CP. ............................................................................................................................................ 46

Figura 25. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de 3 isolados diferentes: S. aureus

(vermelho), S. capitis (azul) e S. auricularis (verde). Espetros pré-processados com SNV e

Sav-Gol (9,2,2). ........................................................................................................................ 47

Figura 26. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PCA

do género Staphylococcus. ....................................................................................................... 48

Figura 27. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao

género Staphylococcus (foram usados 10 CPs). ...................................................................... 48

Figura 28. Representação gráfica da percentagem de erro da validação cruzada em função do

número de variáveis latentes. ................................................................................................... 49

Figura 29. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS dos Staphylococcus. 50

Figura 30. Estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA dos

Staphylococcus. ........................................................................................................................ 51

Figura 31. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de isolados de S. warneri (verde, rosa,

preto e azul), comparado com o S. capitis (05)(vermelho). Espetros pré-processados com

SNV e Sav-Gol (9,2,2). ............................................................................................................ 52

Figura 32. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS-DA de Staphylococcus.

.................................................................................................................................................. 53

Figura 33. Mapa tridimensional de scores com as variáveis latentes 1,2 e 3 para o modelo

PLS-DA de Staphylococcus. .................................................................................................... 54

Figura 34. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-

DA de Staphylococcus. ............................................................................................................ 55

Figura 35. Mapa de scores do modelo PLS-DA de previsão com os dados de teste (SA01). .. 55

Figura 36. Previsão da amostra de teste SA01 como membro da classe de S. aureus. ............ 56

Figura 37. Previsão da classe da amostra para pssc02. ............................................................ 57


7

Figura 38. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra pssc02. .................... 57

Figura 39. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e dos resíduos com a projeção da

amostra desconhecida (pssc02). ............................................................................................... 58

Figura 40. Previsão da classe da amostra para pssc01. ............................................................ 58

Figura 41. Previsão da classe da amostra para aslt01. ............................................................. 59

Figura 42. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra aslt01. ...................... 59

Figura 43. Previsão da classe da amostra para psvt02. ............................................................ 60

Figura 44. Previsão restrita da classe da amostra para asxy02. ................................................ 60

Figura 45. Probabilidade de previsão da classe de S. xylosus para o isolado asxy02. ............. 61

Índice de Tabelas Tabela 1. Turbidez para preparação dos inóculos. ................................................................... 15

Tabela 2. Atribuição do número de onda ao grupo funcional existente nas células microbianas

(adaptado(61)). ......................................................................................................................... 20

Tabela 3. Revisão dos estudos publicados recentemente sobre identificação e discriminação

de m.o. com o uso de espetroscopia. DA: análise discriminante; CVA: análise canónica

variada; PAS: espetroscopia foto-acústica; CA: análise de clusters; SOM: (self-organized

maps) mapas auto-organizados; KNN: (K-nearest neighbor); ANN: redes neuronais artificiais.

.................................................................................................................................................. 28

Tabela 4: Codificação e origem dos isolados utilizados neste estudo. ..................................... 31

Tabela 5.Resultados das identificações dos isolados utilizados neste estudo pelo método

VITEK. ..................................................................................................................................... 36

Tabela 6. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus lentus. 51

Tabela 7. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus capitis. 52

Tabela 8. Estatísticas para cada classe do modelo PLS-DA de Staphylococcus. ..................... 54

Tabela 9. Resumo dos resultados do VITEK e da previsão pelo modelo PLS-DA das amostras

utilizadas para testar o modelo. ................................................................................................ 61


8

Abreviaturas ANN - Redes neuronais artificiais

API - Princípio ativo

ATR - Refletância total atenuada

CA - Análise de agrupamentos

CPs - Componentes principais

CVA - Análise canónica variada

DA - Análise discriminante

DNA - Ácido desoxirribonucleico

EP - Farmacopeia Europeia

FP - Farmacopeia Portuguesa

FTIR - Espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

GMP - Good Manufacturing Practices

HCA - Agrupamento hierárquico

IV - Radiação de infravermelho

KNN - K-nearest neighbors

m.o.- microrganismo

MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight

MRSA - Staphylococcus aureus resistentes à meticilina

MSC - Correção multiplicativa de sinal

NID – Não identificado

PAS - Espetroscopia foto-acústica

PCA - Análise de componentes principais

PCR - Reação em cadeia da polimerase

PFGE – Eletroforese em gel de campo pulsado

PLS-DA - Regressão por mínimos quadrados parciais - discriminante

RNA - Ácido ribonucleico

Sav-Gol - Filtro de Savitzky-Golay

SNV- Variação de padrão normal

SOM - Mapa auto-organizativo

TAMC - Contagem de microrganismos aeróbios

TYMC - Contagem de fungos e leveduras

UFC - Unidades formadoras de colónias

USP - Farmacopeia Americana

UV - Radiação ultravioleta


9

1. Introdução

1.1. Análise microbiológica de produtos não estéreis

Na indústria farmacêutica, a análise microbiológica de medicamentos é uma das

etapas que garante a qualidade do produto final. Os fabricantes têm de garantir uma baixa

carga microbiana no produto acabado, sendo para isso necessária a implementação de boas

práticas de fabrico (Good Manufacturing Practices - cGMP). Estas práticas aplicam-se aos

procedimentos de produção, embalagem e distribuição dos fármacos. Deste modo, é

fundamental a análise microbiológica de matérias-primas, produtos a granel e produto

acabado, bem como da água purificada. A monitorização ambiental das áreas de produção e

embalagem são também um fator de grande importância na qualidade dos medicamentos(1–3).

Os métodos utilizados e os resultados obtidos devem estar em conformidade com as

especificações e critérios descritos na Farmacopeia Europeia (EP). As análises realizadas em

matérias-primas, produto a granel e produto acabado, envolvem contagem de microrganismos

aeróbios totais (TAMC) e contagem de leveduras e fungos totais (TYMC). Estas contagens

são expressas em unidades formadoras de colónias (UFC). Para além das análises referidas

anteriormente, são feitas pesquisas a microrganismos específicos, que variam consoante a

natureza das matérias-primas utilizadas e o método de produção. Normalmente os

microrganismos (m.o.) específicos em estudo, na análise de produtos não estéreis, são

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, e bactérias

gram-negativas tolerantes à bílis(4,5).

A comprovação da qualidade microbiológica de medicamentos existentes no mercado

nacional é avaliada pela autoridade reguladora portuguesa (INFARMED). As indústrias

farmacêuticas submetem ao INFARMED um dossier de Autorização de Introdução de

Mercado (AIM) para cada produto, onde estão estabelecidas as especificações de análise.

Estas podem variar consoante a natureza das matérias-primas utilizadas, o método de

produção estabelecido, as caraterísticas da substância ativa, a via de administração, a

população alvo, a indicação terapêutica e a duração do tratamento(6). Cada laboratório

farmacêutico rege-se pela AIM de cada medicamento para proceder à análise dos mesmos,

sendo as especificações mais frequentes, para produtos sólidos não estéreis, as seguintes(7):

-‐ TAMC < 103 UFC/g;

-‐ TYMC < 102 UFC/g;

-‐ Ausência de Escherichia coli verificada em 1 g;

-‐ Ausência de Staphylococcus aureus verificada em 1 g;


10

-‐ Ausência de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1 g;

-‐ Ausência de Salmonella verificada em 1 g;

-‐ Bactérias gram-negativas tolerantes à bílis < 100 UFC/g. Os critérios de aceitação devem ser interpretados da seguinte forma(7):

• 101 UFC: Contagem máxima aceitável = 20 UFC



A avaliação microbiológica de produtos não estéreis é particularmente pertinente, uma

vez que a contaminação microbiana pode reduzir ou mesmo eliminar o efeito terapêutico dos

fármacos ou causar infeções induzidas pelos mesmos. Além destes fatores, a contaminação

microbiológica pode alterar as propriedades químicas, físicas e organoléticas dos fármacos,

ou alterar o conteúdo em substância ativa(8-10).

1.2. Microrganismos relevantes

1.2.1. Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae é uma família de bactérias gram-negativas muito abundante, com

uma grande variedade de organismos patogénicos. Os indivíduos da família

Enterobacteriaceae são bastante conhecidos, pertencendo alguns à flora intestinal de seres

humanos e animais, outros ao solo ou à água(11,12).

Escherichia coli (E. coli) é uma das bactérias com maior patogenicidade da família

Enterobacteriaceae. São bactérias anaeróbias facultativas em forma de bastonete e a maioria

colonizam o trato gastrointestinal dos seres humanos e animais(13). Existem diferentes estirpes

patogénicas de E. coli e a sensibilidade destas estirpes a antibióticos varia amplamente. Os

organismos gram-negativos por si só são bastante resistentes a antibióticos, quando

comparados com os organismos gram-positivos. Os antibióticos que podem ser utilizados no

tratamento de infecção por E. coli incluem a amoxicilina, penicilinas semi-sintéticas,

cefalosporinas, ciprofloxacina e nitrofurantoína(16,17). O uso excessivo de antibióticos em

seres humanos ou como promotores de crescimento em alimentos para animais torna a

resistência aos antibióticos um problema crescente. A E. coli, por exemplo tem uma taxa de

mutações adaptativas muito elevada o que torna este microrganismo muito preocupante em

caso de contaminação(16).

O género Salmonella também faz parte da família das Enterobacteriaceae. Este

género é composto por três espécies: Salmonella subterranea, Salmonella bongori e


11

Salmonella enterica(17,18). Uma infeção por Salmonella enterica pode provocar salmonelose,

que varia clinicamente da gastroenterite comum de Salmonella (diarreia, cólicas abdominais e

febre) a febres entéricas (incluindo febre tifóide) que são doenças sistémicas febris com risco

de vida que requerem administração de antibióticos(19). Um número crescente de estirpes

multirresistentes de Salmonella apresenta uma suscetibilidade diminuída a alguns antibióticos

como a ciprofloxacina, com falhas de tratamento concomitantes(20).

1.2.2. Pseudomonas

As espécies do género Pseudomonas são bacilos aeróbios gram-negativos contendo

mais de 140 espécies, em que cerca de 25 estão associadas a seres humanos. Estas incluem P.

aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. stutzeri, P. maltophilia e P. putrefaciens.

As bactérias são encontradas principalmente no ambiente, como no solo, água e plantas.

Apenas algumas das muitas espécies causam doenças, sendo a mais comum a Pseudomonas

aeruginosa(21). Infeções por Pseudomonas são frequentemente reconhecidas em hospitais

através das mãos dos técnicos de saúde ou por equipamentos hospitalares. As infeções por

Pseudomonas são consideradas infeções oportunistas, o que significa que estas bactérias

provocam doenças quando o sistema imunológico está comprometido. O aumento da

resistência a antibióticos de bactérias do género Pseudomonas tornou o tratamento das

infeções muito mais desafiante(21,22).

1.2.3. Staphylococcus

O género Staphylococcus é constituído por 39 espécies, incluindo 21 sub-espécies. É

caracterizado por m.o. de células esféricas gram-positivas, não esporoladas, com cocos

isolados, em pares ou em correntes curtas, formando assim grupos irregulares(23). O

metabolismo desta família é respiratório e fermentativo e a parede celular destas bactérias

contém peptidoglicano e ácido teicoico(24). Os principais habitats da maioria das espécies de

Staphylococcus são a pele e as membranas mucosas dos mamíferos e aves. S. aureus é

considerado o patogeno humano mais importante entre os Staphylococcus. Outras espécies

comuns deste género são: S. epidermidis, S. haemolyticus e S. saprophyticus. S. auricularis,

S. capitis ssp. capitis e urealyticus, S. caprae, S. cohnii ssp. cohnii e S. urealyticus, S. hominis

ssp. hominis, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. pettenkoferi, S. saccharolyticus, S. schleiferi

subsp. schleiferi, S. simiae, S. simulans, S. warneri e S. xylosus(25). As espécies do género

Staphylococcus podem ser diferenciadas pela coagulase. A atividade desta enzima é utilizada

para distinguir espécies patogénicas de Staphylococcus de espécies não patogénicas, sendo

um bom indicador da patogenicidade do S. aureus. Exemplos de espécies coagulase-positiva


12

são S. aureus, S. delphini e S. lutrae. A maior parte das restantes espécies de Staphylococcus

são coagulase-negativa, como é o caso do S. epidermidis que é a espécie encontrada mais

frequentemente em seres humanos. Staphylococcus aureus é um agente patogénico virulento

sendo atualmente a causa mais comum de infeções em doentes hospitalizados. Uma infeção

por S. aureus pode envolver qualquer sistema de órgãos e tem uma grande capacidade de

causar uma vasta gama de infeções(26). Colonizam-se à superfície do corpo, particularmente

em áreas húmidas como axilas, área inguinal e narinas. A colonização nasal desempenha um

papel crucial como fonte de infeções invasivas desta espécie, uma vez que através das

cavidades nasais pode ser transferido para a pele e para outras áreas do corpo. Os

profissionais de saúde têm uma elevada taxa de transporte nasal de S. aureus (50% a 90%),

assim como os doentes com diabetes, os doentes que recebem hemodiálise a longo prazo e os

utilizadores de fármacos por via intravenosa(27). Nas instalações de cuidados de saúde, as

estirpes de S. aureus são transmitidas de um paciente para o outro, principalmente pelos

profissionais de saúde. Isto é de extrema importância para a transmissão de S. aureus

resistentes à meticilina (MRSA). Os profissionais de saúde infetados podem servir como um

reservatório(28,29). S. auricularis faz parte da flora do canal auditivo externo humano e

coloniza exclusivamente esta região. O S. capitis é encontrado em torno das glândulas

sebáceas na testa e couro cabeludo após a puberdade. S. haemolyticus e S. hominis são

preferencialmente isolados de axilas e áreas púbicas ricas em glândulas apócrinas. S.

saprophyticus ssp. saprophyticus coloniza frequentemente o reto e o trato genital de mulheres

adolescentes(25,30,31). S. lugdunensis é frequentemente encontrado nas extremidades inferiores

e nas virilhas(32). No entanto, estas espécies podem ser encontradas ocasionalmente em outros

locais do corpo. As espécies S. sciuri e S. xylosus são comensais da pele e da membrana

mucosa de muitos animais e, ocasionalmente, de seres humanos. Ambas as espécies são

também encontradas em alimentos; S. kloosii, S. equorum subsp. equorum, e S. galinarum são

encontrados em vários mamíferos e produtos alimentares. S. chromogenes, S. hyicus, S. lentus

são residentes comuns de animais de casco e, além disso, podem ser isolados a partir dos seus

produtos alimentares. S. vitulinus é encontrado preferencialmente em cavalos e baleias. S.

arlettae é encontrado em mamíferos e aves e S. muscae é descrito nas moscas(23).

Os Staphylococcus podem tornar-se patogénicos dependendo da espécie e da estirpe,

após quebra na barreira epitelial cutânea, através de trauma ou intervenções médicas. A

recuperação de um isolado requer sempre a avaliação do significado clínico para determinar

se é um contaminante, colonizador ou patogénico(33).


13

1.3. Identificação de contaminantes microbiológicos

1.3.1. Métodos moleculares/biológicos

A identificação de m.o. pode ser feita através de vários métodos, sendo os mais

precisos as técnicas de genética molecular, tais como impressão digital de DNA, perfis de

plasmídeo e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Estes métodos de identificação

são demorados, dispendiosos, e exigem profissionais especializados, o que pode impedir uma

resposta rápida à presença de espécies de bactérias patogénicas em laboratórios da indústria

farmacêutica(34). No entanto, a análise comparativa da sequência de DNA dos genes de

macromoléculas tornaram-se comuns na microbiologia como uma ferramenta para a

classificação de m.o. As moléculas mais úteis e extensivamente investigadas em termos de

taxonomia são os rRNAs e os seus genes correspondentes, especialmente 16S rRNAs e 23S

rRNAs. A identificação molecular baseada na análise da sequência de DNA tem como

principal vantagem uma maior precisão na identificação da espécie do m.o. em estudo e como

principal desvantagem, a presença de entradas de sequências defeituosas e/ou redundantes,

terminações de sequência irregulares e nomenclatura desatualizada nas bases de dados

atualmente disponíveis para esta identificação, podendo induzir a uma identificação

incorreta(35).

Por esses motivos, nos últimos anos, os métodos de reação em cadeia da polimerase

(PCR) em tempo real foram desenvolvidos e descritos para deteção e identificação rápidas de

várias estirpes bacterianas. O PCR em tempo real é uma ferramenta promissora para distinguir

sequências específicas a partir de uma mistura complexa de DNA e, portanto, é útil para

determinar a presença e quantidade de agentes patogénicos específicos numa amostra. Podem

facilmente detetar-se estirpes bacterianas diretamente a partir de amostras clínicas ou de

pequenas quantidades de células bacterianas em cultura, melhorando assim a sensibilidade e

reduzindo o tempo necessário para a identificação de bactérias. Este método tem sido

particularmente útil, facilitando a identificação de bactérias a qualquer nível taxonómico:

estirpe, espécie ou género(36–38).

1.3.2. Métodos bioquímicos

Atualmente, na indústria farmacêutica utilizam-se maioritariamente: um método

manual que recorre a galerias API (índice analítico de perfil) e um método automatizado que

utiliza o sistema VITEK. Recorre-se as estes métodos devido à fácil e rápida execução da

técnica, e também porque são facilmente adaptados à rotina de um laboratório de análises

microbiológicas de produtos farmacêuticos. Para a velocidade, padronização, redução de


14

custos e conveniência, os testes clássicos de fermentação, oxidação, degradação e hidrólise de

vários substratos são incorporados em sistemas de teste comerciais e testes bioquímicos

automatizados. Os resultados com testes convencionais podem ser ligeiramente diferentes

daqueles obtidos com sistemas de testes bioquímicos rápidos devido ao uso de outros

indicadores mais sensíveis(23).

Galerias API

As galerias API tornaram a identificação microbiana fácil e rápida, baseada no

conceito da identificação numérica. Os sistemas API são produtos comerciais. A galeria API

20 E (comercializada pela BioMérieux) é um método de identificação de m.o., que utiliza tiras

que contêm até 20 pequenos compartimentos onde ocorrem as reações bioquímicas (Figura

1).

Figura 1. Kits que incluem 20 testes bioquímicos (adaptado de (39)).

Os vinte compartimentos são inoculados com uma suspensão bacteriana de uma

cultura idealmente pura. Após incubação, as reações traduzem-se em mudanças de cor que

são espontâneas ou manifestadas pela adição de reagentes. As reações são lidas de acordo

com uma tabela ou quadro de leitura. A identificação é feita usando um sistema informático

de identificação ou um catálogo analítico, onde se obtém a identificação do perfil numérico

com sete algarismos, que é denominada de índice analítico de perfil (API). O programa

interpreta um grande número de perfis que permite a identificação de cerca de 600 espécies de

bactérias e leveduras. O kit de teste API consiste em testes de assimilação de elementos

enzimáticos e compostos de carbono, cujo número varia dependendo do tipo de kit API de

ensaio utilizado(39,40).

VITEK

O VITEK é um sistema automatizado de identificação direcionado a laboratórios de

microbiologia clínica que fornece condições de identificação de colónias através de testes

bioquímicos. Este sistema de identificação de bactérias e leveduras, utiliza cartas

colorimétricas com 64 poços, contendo substratos para testes individuais, que são incubadas e

interpretadas automaticamente(41). No entanto existem requisitos para a preparação adequada

do inóculo: meios de cultura adequados, idade da cultura, condições de incubação e turbidez


15

do inóculo. A turbidez é ajustada em conformidade (Tabela 1) e medida utilizando um

medidor de turbidez chamado DensiChek (42).

Tabela 1. Turbidez para preparação dos inóculos.

Produto Gama de turbidez McFarland Gram-negativa 0,50-0,63 Gram-positiva 0,50-0,63

Levedura 1,80-2,20 Bacilos 1,80-2,20

As cartas de identificação (Figura 2) são inoculadas com suspensões de m.o.

utilizando uma cassete. A carta é colocada na ranhura vizinha ao tubo que contém a suspensão

com o inóculo. A cassete pode acomodar até 10 testes (ou seja, até 10 cartas de identificação).

A cassete é colocada manualmente numa estação de câmara de vácuo. O vácuo que se forma

dentro do equipamento faz com que a suspensão do organismo seja forçada, através do tubo

de transferência, a preencher os micro-canais que chegam a todos os poços do carta.

Figura 2. Carta de identificação gram-positiva para o VITEK (adaptado de (41)).

Cada um dos poços contém um teste individual a um substrato. Estes medem atividade

metabólica como a acidificação, alcalinização, a hidrólise enzimática e crescimento na

presença de substâncias inibidoras. Uma película opticamente transparente presente em

ambos os lados do cartão permite o nível adequado de transmissão de oxigénio, mantendo o

recipiente selado e impedindo o contacto com as misturas organismo-substrato. Os cartões

têm códigos de barras que contêm informações sobre o tipo de produto, número de lote, data

de validade, e uma identificação exclusiva que pode ser ligada à amostra, quer antes ou depois

de carregar a carta no sistema (Figura 3)(42).

Figura 3. Sistema VITEK adaptado de (41).


16

1.3.3. Métodos espetroscópicos

Espetroscopia de massa (MALDI-TOF)

A espetrometria de massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-

time of flight) é outra técnica utilizada para identificação molecular. Através da análise da

massa e da carga dos iões, pode fornecer uma identificação de género e espécie de um

microrganismo em apenas alguns minutos. A amostra é depositada numa matriz com um

suporte de metal apropriado e é ionizada por um feixe de laser cujo comprimento de onda

pode ir desde a gama de ultravioleta (UV) a infravermelho (IV) (impulsos com duração de

pico-segundos a alguns nano-segundos)(7).

O MALDI-TOF é um método rápido, preciso e de baixo custo para a identificação de

bactérias, em comparação com técnicas convencionais de biologia molecular. Além disso,

permite a identificação de bactérias diretamente a partir de amostras clínicas(43,44).

Espetroscopia Raman

A espetroscopia Raman é uma forma de espetroscopia vibracional, assim como a

espetroscopia IV. No entanto, enquanto que as bandas do IV surgem a partir de uma alteração

no momento dipolar de uma molécula (devido a uma interação da luz com a molécula), as

bandas Raman surgem a partir de uma alteração na polarizabilidade da molécula devido à

mesma interação. Isto significa que estas bandas observadas (correspondentes a transições de

energia específicas) são provenientes de vibrações moleculares específicas. Quando as

energias destas transições são representadas como um espetro, proporcionam uma "impressão

digital molecular" da molécula que está a ser observada. Certas vibrações que são permitidas

no Raman são proibidas no IV, ao passo que outras vibrações podem ser observadas em

ambas as técnicas (embora com diferentes intensidades), podendo assim, estas técnicas serem

consideradas como complementares(45,46).

A espetroscopia de Raman não requer preparação especial da amostra e os tempos de

medição são bastante curtos (a partir de uma fração de segundo a vários minutos)(47,48). Cada

m.o. produz um espetro único o que faz com que a especificidade da técnica analítica, em

combinação com o processamento quimiométrico apropriado, permita a caracterização, a

discriminação e a identificação de bactérias, fungos e leveduras ao nível da espécie e da sub-

espécie(49).

Espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

Os métodos implementados para a identificação de contaminantes microbiológicos na

indústria farmacêutica são igualmente métodos dispendiosos e demorados. A espetroscopia de


17

IV é um método rápido, barato e bastante simples. Esta técnica encontra-se detalhadamente

descrita no ponto 1.3.4. e tem características comuns com a técnica de Raman.

A espetroscopia de IV consiste no estudo da interação da radiação infravermelha com

a matéria. A luz analisada após ter interatuado com a matéria contém informação sobre a

estrutura desta. Um espetro é o registo desta interação(50). Para que uma molécula apresente

absorção de radiação de IV deve possuir características específicas: a molécula precisa que o

momento dipolar sofra uma variação durante a vibração. A região do espetro eletromagnético

correspondente à radiação de infravermelho divide-se em três regiões principais:

infravermelho próximo (13000-4000 cm-1), infravermelho médio (4000-400 cm-1) e

infravermelho distante (< 400 cm-1). A espetroscopia FTIR baseia-se na absorção de radiação

infravermelha média e as principais vantagens dos espetrómetros FTIR com interferómetro

em relação aos dispersivos são(51):

• uma relação sinal/ruído muito superior para um espetro acumulado no mesmo

intervalo de tempo;

• uma maior exatidão nos números de onda, associada a uma resolução constante em

toda a gama espectral.

O método de espetroscopia de IV com transformada de Fourier é baseado na

interferência da radiação entre dois feixes resultando um interferograma. Um interferograma é

o registo do sinal produzido pela combinação das múltiplas frequências possíveis de obter

com a transformada de Fourier.

Figura 4. Esquema de um espetrómetro com interferómetro: F - Fonte de radiação IV; D - Divisor de feixe; E1 - Espelho

fixo; E2 - Espelho móvel (Adaptado (52)).

O instrumento transformada de Fourier mede todas as frequências em simultâneo. Isso

faz com que o método FTIR seja um método rápido. É utilizado um interferómetro (p.e., de

Michelson), que permite uma ampla faixa de frequências de vibração a ser monitorizadas

simultaneamente. Este interferómetro é constituído por um divisor de feixe (D) e dois

espelhos: E1 que é fixo e E2 que é móvel (Figura 4). O divisor de feixe consiste numa placa

que reflete metade da radiação incidente. Assim metade da radiação segue para o espelho E1 e

metade para o E2. Após a reflexão em ambos os espelhos, as duas componentes recombinam-


18

se no divisor de feixe. A única parte que se move continuamente no instrumento é o

movimento do espelho (E2) no interferómetro. Em suma, o processo instrumental é composto

pelas seguintes etapas: a energia infravermelha é emitida por uma fonte (D) de corpo negro

(este feixe passa através de uma abertura que controla a quantidade de energia presente na

amostra (e consequentemente no detetor); o feixe entra no interferómetro onde é feita a

“codificação espectral”, e o sinal resultante do interferograma sai do interferómetro; no

compartimento da amostra, esta é atravessada pelo feixe ou reflete-o, dependendo do tipo de

análise a ser feita (é aqui que frequências específicas de energia, características de cada

amostra, são absorvidas); o feixe passa finalmente para o detector para uma medição final (os

detetores utilizados são apropriados para medir o sinal especial do interferograma). O sinal

medido é digitalizado e enviado para o computador onde é aplicada a inversa da transformada

de Fourier. O espetro final é apresentado ao utilizador para interpretação e posterior

processamento dos dados(52–55).

O modo de refletância total atenuada (ATR) pode ser utilizado em amostras sólidas ou

líquidas e tem de existir um contato muito próximo entre a amostra e o cristal para que este

tipo de refletância ocorra. Uma grande vantagem do ATR é o facto de não ser necessária

qualquer preparação da amostra a analisar. O cristal é fabricado com materiais com um

elevado nível de refração como por exemplo o germânio, zinco-selénio ou diamante. Um

acessório de ATR funciona medindo as alterações que ocorrem num feixe de infravermelho

totalmente refletido internamente quando o feixe entra em contato com uma amostra (Figura

4). O componente principal de um acessório de ATR é um prisma de uma substância

transparente ao IV, de elevado índice de refração. As faces laterais do prisma são cortadas

segundo um ângulo tal que a luz incidente é refletida com um ângulo superior ao ângulo

crítico. Nestas condições, há reflexão total e a luz permanece dentro do cristal durante

sucessivas reflexões. Se a amostra estiver depositada na face do cristal, com um bom contato

ótico, em cada reflexão alguma radiação penetra na amostra e pode ser absorvida, como se

esquematiza na Figura 5.

Figura 5. Esquema de um cristal para refletância total atenuada (ATR) (Adaptado (56)).


19

Depois de um certo número de reflexões, a luz deixa o prisma e é focada no detetor. A

radiação resultante atenuada é medida e representada graficamente como uma função do

comprimento de onda e dá origem a absorções características da amostra(51,56,57).

1.3.4. FTIR - ATR para identificação de microrganismos

A técnica FTIR-ATR pode ser utilizada para a classificação, identificação e deteção de

microrganismos. Tem sido aplicada com sucesso na identificação e classificação de m.o. por

espécie e sub-espécie(58). Quando aplicada a células microbianas inteiras, o espetro de

infravermelho reflete a composição bioquímica qualitativa das células(4,59), permitindo

caracterizar e diferenciar células microbianas com base em componentes das células de

membrana incluindo os lipopolissacáridos, lipoproteínas, e fosfolípidos(34,54). A base da

espetroscopia FTIR é a interação da radiação infravermelha com uma amostra, neste caso

específico com o isolado bacteriano, proporcionando uma impressão digital específica que

reflete a estrutura e a composição de toda a célula. No modo ATR a magnitude da atenuação

depende das bactérias em contato com o feixe. A compreensão dos espetros de IV das células

microbianas requer uma perceção geral da sua composição, dos principais tipos de células,

das estruturas químicas presentes, e do conhecimento da diferenciação de células e tecidos(60).

Ao contrário dos organismos eucariotas (animais, plantas, leveduras ou fungos), os

procariotas (bactérias) existem apenas num número limitado de formas morfológicas (p.e.

bacilos e cocos). No entanto, a sua composição química e as suas estruturas variam

consideravelmente. As estruturas citoplasmáticas de bactérias são menos compartimentadas e

mais simples do que as das leveduras e fungos, mas têm estruturas moleculares e supra-

moleculares complexas. A maior parte das diferenças estruturais que fornecem a possibilidade

de diferenciação entre as bactérias por FTIR residem no envelope celular, que é geralmente

definido como a parede celular além da membrana citoplasmática. A parede celular de

bactérias gram-positivas é formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a

parede celular de bactérias gram-negativas é mais complexa, uma vez que é formada por uma

camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeo e

proteína(64).

As bandas de absorção observadas na região IV entre aproximadamente 1800 cm-1 e

400 cm-1 surgem principalmente a partir dos modos de vibração fundamentais e podem ser

atribuídas a determinados grupos funcionais. A partir da literatura podem ser obtidas

descrições de espetros de vários m.o. e correlações entre estrutura de espetros e as

macromoléculas biológicas mais importantes. A interpretação dos espetros IV de moléculas


20

biológicas baseia-se principalmente na análise de estruturas conhecidas (Tabela 2). Os ácidos

nucleicos, proteínas, lípidos e hidratos de carbono estão sempre presentes em diferentes

quantidades e numa grande diversidade de células microbianas(61).

Tabela 2. Atribuição do número de onda ao grupo funcional existente nas células microbianas (adaptado(61)).

Número de onda (cm-1) Designação

3500 Movimentos de distensão O-H de grupos hidroxilo 3200 Movimentos de distensão N-H das proteínas 2955 Movimentos de distensão assimétricos C-H de -CH3 em ácidos gordos 2930 Movimentos de distensão assimétricos C-H de >CH2 2918 Movimentos de distensão assimétricos C-H de >CH2 em ácidos gordos 2898 Movimentos de distensão C-H em grupos metilo 2870 Movimentos de distensão simétricos C-H de –CH3 2850 Movimentos de distensão simétricos C-H de >CH2 em ácidos gordos 1740 Movimentos de distensão >C=O dos ésteres 1715 Movimentos de distensão >C=O dos ácidos carbónicos 1680-1715 Movimentos de distensão >C=O dos ácidos nucleicos 1695 Componentes da banda da amida I 1685 Resultante de folhas β -antiparalelas 1675 Configuração β das proteínas 1655 Estruturas α–helicoidais da amida I 1637 Estruturas das folhas -β da amida I 1550-1520 Amida II 1515 Banda da tirosina 1468 Deformação C-H de >CH2 1400 Movimentos de distensão simétricos C=O de COO 1310-1240 Banda da amida III das proteínas 1250-1220 Movimentos de distensão assimétricos P=O de >PO2 de fosfodiésteres

1200-900 Movimentos de distensão de C-O e C-C e deformação de C-O-C de hidratos de carbono

1090-1085 Movimentos de distensão simétricos P=O de >PO2 720 Vibração de rotação da ligação C-H de >CH2 900-600 Região da impressão digital (fingerprint)

Na maioria das implementações descritas na literatura, os m.o. são analisados na

forma de colónias (tal como neste estudo), dando origem a espetros muito complexos, uma

vez que o espetro resultante depende da composição química total das células (do material

intracelular, da membrana e da parede). Devido à complexidade do espetro resultante, é

indispensável uma avaliação por intermédio de análise multivariada (quimiometria)(63).

A técnica FTIR-ATR para identificação de contaminantes microbiológicos tem como

principais vantagens(52,61):

• técnica aplicável a todos os m.o.;

• os requisitos de biomassa podem ser reduzidos para colónias individuais tomadas

diretamente a partir das placas de cultura;


21

• os resultados estão disponíveis em poucos minutos após a obtenção de amostras

adequadas de cultura pura;

• classificação dos m.o. em níveis muito diferentes de discriminação taxonómica sem

qualquer pré-seleção de estirpes por outros critérios taxonómicos;

• a especificidade do método é de um modo geral extremamente alta;

• a deteção in situ de componentes celulares específicos é possível (p.e. materiais de

armazenamento de formação de esporos e a encapsulação de m.o.).

Por outro lado, também existem desvantagens(52):

• apenas os m.o. que podem ser cultivados em cultura e estão disponíveis como culturas

puras devem ser analisados;

• culturas mistas só podem ser investigadas com a ajuda de um microscópio de IV;

• a classificação e identificação são baseadas na análise de impressões espectrais;

• as informações específicas sobre um ou apenas alguns compostos específicos

presentes nas células geralmente não está disponível;

• a técnica proporciona uma impressão digital espectral de todos os constituintes

celulares, resultados estáveis só podem ser obtidos desde que os parâmetros

microbiológicos (meio de cultura, tempo de cultivo, e temperatura) sejam controlados

de forma rígida;

• as bases de dados espetrais que são utilizadas em diferentes laboratórios exigem a

utilização de meios de cultura adequados disponíveis no mercado;

• a aceitação da técnica de IV pela comunidade científica pressupõe que a informação

espetral pode ser transformada com esquemas de classificação que sejam pelo menos

semelhantes aos obtidos por quimio-taxonómica ou por técnicas de genética molecular

(tarefa realizada apenas por profissionais qualificados)(61).


22

Figura 6. Espetro FTIR representativo de bactérias com respetiva identificação das principais bandas (Adaptado de (64)).

1.4. Análise Multivariada

Para processar os dados espetrais complexos (de isolados intactos) obtidos por

espetroscopia de IV são necessários métodos estatísticos multivariados ou quimiométricos. A

quimiometria pode ser definida como uma ciência relacionada a medidas realizadas num

sistema ou processo químico, obtendo informações sobre o estado do sistema através da

aplicação de métodos matemáticos ou estatísticos(65,66). Para garantir robustez dos modelos

quimiométricos baseados em análises FTIR-ATR de m.o., é necessária uma base de dados

muito completa de isolados. Apenas deste modo é possível a validação e estabelecimento do

método para análise de rotina. Todos estes métodos requerem um conjunto muito completo de

isolados e técnicas de pré-processamento espetrais adequadas de modo a construir modelos

que permitam inequivocamente a discriminação de m.o.(54).

Na análise de espetros IV de m.o. são utilizadas duas abordagens quimiométricas(67):

• análise por métodos não supervisionados - os dados são analisados independentemente

da identidade da amostra. Estes são considerados métodos qualitativos uma vez que o

objetivo é a distinção de microrganismos;

• análise por métodos supervisionados - parte-se de um conjunto de amostras, bem

caracterizadas, para a construção de um modelo que será posteriormente utilizado para

a identificação de uma amostra desconhecida.

1.4.1. Pré-processamento espetral

O tratamento quimiométrico dos espetros deve ser feito após uma primeira etapa

designada por pré-processamento espetral. Esta etapa consiste na aplicação de métodos

Número de onda (cm-1)

Abs

orvâ

ncia

(u.a

.)


23

corretivos dos espetros. As interferências nos espetros devem-se ao facto dos aparelhos das

medições espetrais serem afetadas por vários fenómenos tanto ao nível químico como físico.

Por exemplo, variações de temperatura, quantidade de amostra e efeito causado pela dispersão

da luz devem ser eliminados dos espetros de forma a que estes evidenciem apenas informação

química ou bioquímica da amostra. Também podem ocorrer distorções causadas pela

saturação do detetor ou relacionadas com o ruído atribuível ao detetor. Os métodos de pré-

tratamento permitem eliminar algumas destas perturbações de forma a melhorar o

desenvolvimento dos modelos quimiométricos(68). Existem vários tipos de pré-processamento

que podem ser aplicados aos espetros, traduzindo diferentes alterações nos dados. Os mais

utilizados são as derivadas (combinados com filtros de Savitzky-Golay), variação de padrão

normal (SNV) e correção multiplicativa de sinal (MSC)(69).

Derivação

Os filtros de Savitzky-Golay têm como principais objetivos reduzir o ruído existente

nos espetros originais e derivação do sinal para remoção de efeitos de linha de base. Esta

operação envolve a derivação matemática de uma função, sendo a função o espetro de uma

amostra em vários comprimentos de onda. Estes filtros são essencialmente funções locais que

são aplicadas a cada espetro sendo posteriormente aplicadas as derivadas. A primeira ou

segunda derivada do espetro original amplificam as diferenças entre espetros enquanto

minimizam perturbações causadas pelos fenómenos descritos atrás(72,73).

Variação de padrão normal

A variação de padrão normal (SNV) é um pré-processamento que centra cada espetro

em torno do zero, por subtração da média e divisão pelo desvio padrão. Este método permite

reduzir interferências causadas pelo tamanho de partícula e pelas diferenças de densidade das

amostras(71). Para este método o espetro de uma amostra i transformado X(i)’, é dado pela

Equação 1. X(i) representa o espetro da amostra i inicial, mi a média das leituras espetrais

para a amostra i e si o desvio padrão(72).

𝑋(𝑖)! = ! ! !!!!!

[Equação 1]

Correção multiplicativa de sinal

A correção multiplicativa de sinal (MSC) é um pré-processamento que reduz o efeito

de luz dispersa em espetros de refletância. A MSC seleciona um espetro de referência no


24

conjunto total de espetros disponíveis para análise. Na maioria das vezes o espetro de

referência consiste no espetro médio do conjunto usado no desenvolvimento do método

(calibração). Através de regressão linear são corrigidos todos os espetros tendo o espetro de

refência como alvo(72,73).

1.4.2. Técnicas quimiométricas

Análise de Componentes Principais

A análise de componentes principais (PCA) é um método utilizado para reduzir a

dimensão de um conjunto de dados tornando-o mais interpretável. A PCA evidencia em que

aspeto uma determinada amostra difere de outra e quais as variáveis que mais contribuem

para essa diferença. Esta análise permite criar um padrão das amostras, formando grupos entre

as amostras semelhantes. Esta técnica é utilizada para identificar correlações entre um

conjunto de variáveis e transformar o conjunto original de variáveis num novo conjunto de

variáveis não correlacionadas denominadas por componentes principais (CPs)(67). Os CPs são

uma combinação linear das variáveis originais, neste caso as absorvâncias em diversos

comprimentos de onda. Os CPs individuais podem ser interpretados através da sua conexão

com as variáveis originais. Ou seja, mostram-se os mesmos dados num sistema de

coordenadas diferente. As relações entre amostras são reveladas através das suas projeções

nos CPs (scores). A distância entre amostras pode ser avaliada no espaço dos PCs

constituindo uma medida mais fiável para análise de similaridade. A tabela de dados original

é transformada numa nova matriz reorganizada cuja estrutura revela as relações entre linhas

(amostras) e colunas (variáveis) que podem estar ocultas na matriz original, assim, a nova

estrutura constitui a parte explicada dos dados originais(74). Em termos matriciais o modelo de

PCA pode ser descrito através da Equação 2 e da Figura 7.

𝑋 = 𝑇×𝑃! + 𝐸 [Equação 2]

Figura 7. Ilustração do método de PCA (adaptado de ((74)).

X : Matriz original de dados (n linhas e p colunas)

T : Matriz de scores (n linhas e d colunas)

Pt : Matriz transposta dos loadings (p linhas e d colunas)


25

E : Matriz de resíduos ( mesmo tamanho de X)

p : Número de variáveis (absorvâncias)

n : Número de amostras (isolados)

d : Número de fatores

O objetivo do modelo de PCA é encontrar as direções no espaço de dados que

descrevem a maior variação do conjunto de dados. Cada direção é uma combinação linear das

variáveis iniciais que mais contribuem para a variação real entre amostras. Pela construção,

CPs são ortogonais entre si e também são classificados de modo que cada um carrega mais

variância que qualquer um dos que se seguem. A prioridade é dada à interpretação destes CPs,

começando com o primeiro, que incorpora a maior variação e, portanto, constitui um sistema

alternativo menos complexo que é mais adequado para a interpretação da estrutura de dados.

Normalmente, apenas os primeiros CPs contêm informações pertinentes.

Os resíduos (E) mantêm a variação que não está incluída no modelo, como uma

medida de quão bem as amostras ou variáveis se enquadram no modelo. Se todos os CPs

fossem retidos, não haveria nenhuma aproximação e o ganho de simplicidade consistiria

apenas em ordenar a variação dos próprios CPs pelo tamanho. Decidir sobre o número de

componentes a reter num modelo de PCA é um compromisso entre simplicidade e

robustez(67,75).

Análise hierárquica

A análise hierárquica de grupos (HCA) permite comparar e categorizar os dados de

acordo com as ponderações de importância/variabilidade das variáveis. Assim, os dados serão

incluídos em grupos de acordo com a sua similaridade. Um agrupamento consiste num grupo

de objetos semelhantes entre si. Os pontos de um agrupamento específico partilham algumas

características comuns que os diferenciam daqueles reunidos em outros agrupamentos. Estes

são caracterizados tendo em conta três propriedades principais: tamanho, forma e distância

para o agrupamento mais próximo. HCA é um modelo não supervisionado de análise de

dados que é utilizado tanto para análise explicativa como para a confirmatória. Este método

difere da análise discriminante (técnica de classificação supervisionada) em que um objeto

não rotulado é atribuído a um grupo de objetos pré-classificados(74,76).

O dendrograma consiste na representação gráfica dos resultados. O agrupamento

hierárquico encontra aglomerados em modo aglomerativo (de baixo para cima) ou divisor (de

cima para baixo) para formar uma estrutura em forma de árvore. O modo aglomerativo

começa com a definição de cada ponto como seu próprio agrupamento e a estes juntam-se


26

aglomerados semelhantes em pares até que o conjunto de dados seja classificado. O eixo

horizontal de um dendrograma descreve a variância ou heterogeneidade crescente. A

magnitude dessa heterogeneidade depende do número de espetros num agrupamento e das

semelhanças entre eles. Os dendrogramas são usados para identificar as semelhanças entre

espetros de bactérias que representam a mesma espécie ou género, e além disso pode

identificar uma bactéria desconhecida através do cálculo da distância espectral entre ela e

bactérias conhecidas(53). O modo divisivo começa considerando todo o conjunto de dados

como um único agrupamento, que é então recursivamente dividido até que somente

agrupamentos contendo pontos de dados exclusivos sejam obtidos. Algoritmos diferem na

forma como eles calculam a similaridade entre agrupamento(73,74).

Regressão por mínimos quadrados parciais – discriminante (PLS-DA)

O PLS-DA consiste na clássica regressão PLS onde a variável resposta é categórica e

representativa de classes(76). O PLS-DA é realizado para modelar a separação entre grupos de

observações(77). PLS-DA é um caso especial de PLS onde as variáveis independentes (matriz

X) é regredida numa matriz Y consistindo de uns e zeros identificativa das classes. Estes uns

e zeros indicam a classe à qual as amostras pertencem(74). O PLS-DA permite melhorar a

separação entre classes quando comparado com o método PCA, pois força a que se obtenha a

máxima separação entre classes(75). Este método supervisionado requer o conhecimento da

identidade de cada amostra (isolado). Com um conjunto de amostras bem caracterizadas, um

modelo pode ser calibrado para que possa prever a identidade de novas amostras,

relacionando um conjunto de variáveis de resposta Y (classes) com um conjunto de variáveis

X (espetros)(34). Esta abordagem visa maximizar a covariância entre as variáveis

independentes X (espetros) e a variável dependente Y correspondente (classes, grupos, isto é,

a classe que se deseja prever). Permite a previsão da variável Y com base num número

reduzido de fatores (variáveis latentes). Estes fatores descrevem o comportamento das

variáveis dependentes Y e abrangem o espaço no qual as variáveis independentes X são

projetadas (Figura 8).


27

Figura 8. Ilustração de um modelo de PLS-DA com três classes em que o i é o número de amostras e o j o número de variáveis (Adaptado de (78)).

Por exemplo, se considerarmos a divisão de amostras em diferentes classes, então a

variável Y será composta por vetores que terão uma entrada 0 para todas as amostras na

primeira classe e uma entrada 1 para todas as amostras da segunda classe (ou vice-versa)(78).

Para avaliar um modelo de PCA e de PLS-DA avaliam-se normalmente duas

estatísticas: a estatística de Hotelling’s T2 que incorpora a informação retida nos CPs e a

estatística dos resíduos que permite avaliar a componente não modelada (ou seja a

componente que não ficou retidas nos CPs). A avaliação destas duas estatísticas permite-nos

concluir sobre isolados atípicos, ou seja, ‘outliers’ do modelo construído(73).

PLS-DA

!!

X (espetros) Y (classes)

Cla

sse

1 C

lass

e 2

Cla

sse

3

PLS-DA

!!

X (espetros) Y (classes)

Cla

sse

1 C

lass

e 2

Cla

sse

3

X (espetros) Y (espetros)

Cla

sse

2 C

lass

e 1

Cla

sse

3

PLS-DA


28

2. Revisão da literatura

O potencial da espetroscopia FTIR o âmbito da identificação de microrganismos está

documentado desde a década de 90. A técnica tem sido aplicada em muitos campos

diferentes, como a microbiologia alimentar, diagnóstico médico e ecologia microbiana. A sua

aplicação pode abranger identificação de patogenos, contaminantes alimentares, culturas

probióticas e microrganismos ambientais. Alguns estudos centram-se apenas na diferenciação

de espécies enquanto outros tentaram mostrar bases de dados abrangentes para aplicação em

microbiologia(79). Existe um elevado número de estudos sobre este tema. Alguns

especialmente relevantes e recentes encontram-se listados na Tabela 3.

Tabela 3. Revisão dos estudos publicados recentemente sobre identificação e discriminação de m.o. com o uso de espetroscopia. DA: análise discriminante; CVA: análise canónica variada; PAS: espetroscopia foto-acústica; CA: análise de

clusters; SOM: (self-organized maps) mapas auto-organizados; KNN: (K-nearest neighbor); ANN: redes neuronais artificiais.

Género(s)/ Espécie(s) Técnica espetroscópica Percentagem de

identificação/discriminação correta

Abordagem quimiométrica Ref.

Células microbianas intactas FTIR; NIR Raman (Estudo pioneiro) CA, ANN (60)

Bactérias intactas e fungos ATR (Estudo pioneiro) CA, ANN (61)

Staphylococcus Transmissão 97% dos isolados de S. aureus PCA, FDA (80)

Salmonella Enteritidis Transmissão 100% dos tipos de fagos (utilizando extratos das proteínas de membrana externa)

PLS-DA (34)

E.coli Transmissão 77,92% das estirpes de E. coli PLS-DA (59) Lactobacillus casei, B. cereus, E.coli, S.cerevisiae, A.niger e F.verticilliodes

PAS 100% das estirpes de E. coli CVA; Distância de Mahalanobis

(55)

Pichia Pastoris ATR 100% entre células cultivadas sob condições de nitrogénio e de limitação de carbono

PCA; PLS-DA (4)

E. coli; S. aureus; B. subtilis; C.albicans

Espetroscopia Microscópica Elevada precisão HCA; CA (62)

Acinetobacter baumannii; A. calcoaceticus ATR Superior a 90% PLS-DA; HCA (81)

Listeria Espetroscopia Microscópica 93% CVA; PCA;

PLSDA (82)

S. aureus ATR 98% pela KNN 93% pelos SOM 92% pelo PCA

PCA; KNN; SOM (83)

L. plantarum, L. acidophilus, L. kefirgranum, L. kefiranofaciens e L. cassei

ATR 100% ao nível da espécie HCA (84)

O. limosa, A. platensis, P. laminosum, Phormidium sp, S. javanicum, N. punctiforme e P. angustissimum

ATR 80% PCA; SIMCA (85)

A. flavus, A. fumigatus e A. parasiticus ATR 75%-100% ao nível da

toxigenicidade HCA; DA (86)

S. aureus ATR 100% ao nível das estirpes ANN (87) Yersinia enterocolitica Transmissão 79,9% ao nível da espécie ANN (88) B. cereus, Salmonella enterica, E. Coli, Listeria ATR 94% PCA; SIMCA (89)

Burkholderia cepacia complex ATR 90% ao nível da espécie PCA; PLS-DA; (54)


29

3. Objetivos

O principal objetivo deste trabalho é avaliar o potencial da técnica FTIR como técnica

de identificação e discriminação de microrganismos contaminantes de medicamentos (formas

sólidas). Os objetivos deste trabalho são:

• a construção de uma biblioteca no FTIR-ATR para os principais microrganismos

contaminantes de medicamentos sólidos não estéreis;

• a identificação de estirpes através do método FTIR-ATR;

• a comparação do desempenho do método baseado em FTIR-ATR com o método

VITEK usado em rotina;

• a diminuição do tempo de identificação de microrganismos com consequente

diminuição do tempo de análise microbiológica de um medicamento.


30

4. Materiais e métodos

A parte prática desta dissertação foi realizada no Laboratório de Microbiologia da

Generis Farmacêutica SA na Venda Nova, Lisboa.

4.1. Isolados

As amostras biológicas são colónias recolhidas de crescimentos bacterianos presentes

na análise de produtos e no controlo microbiológico ambiental feito nas áreas de produção e

embalagem da unidade fabril da Generis Farmacêutica SA. Foram recolhidos 52

microrganismos cujas identificações pelo método VITEK correspondiam a microrganismos

dos géneros Staphylococcus e Pseudomonas (Tabela 4).

Para além de bactérias isoladas da rotina do laboratório foram ainda utilizados

microrganismos padrão de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Estes padrões foram preparados

a partir de microrganismos Bioball(90). Estes padrões contém um número exato de UFC

viáveis. A Bioball é uma bola liofilizada de aproximadamente 3 mm de diâmetro que é

conservada individualmente em frascos entre -33ºC a -18ºC.

As abreviaturas referentes a cada microrganismo dão-nos informação sobre a origem

do mesmo, uma vez que a primeira letra ‘a’ ou ‘p’, refere-se ao fato desta colónia ter sito

obtida da monitorização ambiental ou da análise de um produto. A segunda letra ao género:

‘s’ – Staphylococcus e ‘p’ - Pseudomonas. As terceira e quarta letras indicam a espécie e o

número distingue isolados da mesma espécie.


31

Tabela 4: Codificação e origem dos isolados utilizados neste estudo.

Abreviatura m.o. Origem

Staphylococcus

ST01 S. aureus Bioball ST02 S. aureus Bioball ST03 S. aureus Bioball ST04 S. aureus Bioball psau01 S. auricularis produto psep01 S. epidermidis ambiente psep02 S. epidermidis ambiente asep03 S. epidermidis ambiente asep04 S. epidermidis ambiente asep05 S. epidermidis ambiente aslt01 S. lentus ambiente pslt02 S. lentus produto pslt03 S. lentus produto pslt04 S. lentus produto pslt05 S. lentus produto ascc01 S. cohnii ssp cohnii ambiente ascc02 S. cohnii ssp cohnii ambiente asxy01 S. xylosus ambiente asxy02 S. xylosus ambiente ashh01 S. hominis ssp hominis ambiente pshh02 S. hominis ssp hominis ambiente assp01 S. saprophyticus ambiente assp02 S. saprophyticus ambiente assp03 S. saprophyticus ambiente assp04 S. saprophyticus ambiente assp05 S. saprophyticus ambiente aswa01 S. warneri ambiente aswa02 S. warneri ambiente pswa03 S. warneri ambiente aswa04 S. warneri ambiente aswa05 S. warneri ambiente pssc01 S. sciuri produto pssc02 S. sciuri produto psvt01 S. vitullinus produto psvt02 S. vitullinus produto ascp01 S. capitis ambiente ascp02 S. capitis ambiente ascp03 S. capitis ambiente ascp04 S. capitis ambiente ascp05 S. capitis ambiente

Pseudomonas

PS01 Pseudomonas auriginosa Bioball




apfr01 Pseudomonas fluorescens ambiente

apst01 Pseudomonas stutzeri ambiente apst02 Pseudomonas stutzeri ambiente

ppor01 Pseudomonas oryzihabitans produto

Escherichia

EC01 E. coli Bioball EC02 E. coli Bioball EC03 E. coli Bioball EC04 E. coli Bioball


32

a) Preparação dos isolados

As colónias após serem detetadas, ao fim de 5 dias de incubação entre 30 °C a 35 °C e

20ºC a 25ºC (conforme procedimentos de análise microbiológica), foram repicadas com uma

ansa estéril e isoladas em placa, com um meio de TSA (Trypticase Soy Agar). Tal

procedimento foi realizado numa câmara de fluxo laminar para que não ocorressem

contaminações cruzadas. As placas, nas quais foram feitos os isolamentos, foram incubadas

durante 18 horas entre 30 °C a 35 °C. Em todas as repicagens e isolamentos deste estudo foi

utlizado apenas o meio TSA, uma vez que é um meio de cultura não seletivo onde crescem

várias bactérias. Este meio é rico em triptona e peptona, proteínas e lípidos.

b) Preparação dos microrganismos padrão

A preparação dos microrganismos padrão iniciou-se pela reidratação do Bioball num

líquido de hidratação (pode ser uma solução salina). O líquido de reidratação deve estar à

temperatura ambiente e cada Bioball foi reidratado em 1,1 ml deste liquído. Em seguida foi

agitado no vortex e usaram-se alíquotas de 100 µl para o espalhamento em cada placa de

TSA. As placas onde foram feitos os espalhamentos dos m.o. são incubadas a 30 ºC – 35 ºC

durante 18 horas. Este procedimento foi feito para três microrganismos padrão: E. coli , S.

aureus e P. aeruginosa. Entre a preparação de cada m.o. procedeu-se à limpeza da câmara de

segurança biológica com iso-propanol estéril a 70%.

c) Identificação no VITEK

Após 18 horas de incubação dos microrganismos de acordo com as alíneas a) e b),

estes foram postos em identificação no VITEK, método atualmente em uso no laboratório de

microbiologia da Generis Farmacêutica SA. Para este método de identificação foi necessário

seguir os seguintes passos para cada microrganismo:

-‐ Num tubo de ensaio de poliestireno, foram colocados 3 ml de uma solução aquosa a

0,45% de NaCl, pH 5,0 - 7,2;

-‐ Com uma ansa estéril transferiu-se um número suficiente de colónias isoladas da placa

com a cultura fresca (18 horas);

-‐ Homogeneizou-se a suspensão no vortex;

-‐ A quantidade de colónias necessárias para a suspensão mediu-se pela turbidez do

inóculo, com o auxílio de um Densicheck (aparelho que mede a turbidez da amostra

dentro do tubo de ensaio);

-‐ Verificou-se que o valor McFarland apresentado variava entre 0,50 - 0,63 após várias

medições da mesma;


33

-‐ Após esta preparação, foram colocados 25 µl da suspensão, num cartucho de

identificação de bactérias no ID Endosafe®-PTS ™ Gram (sistema que classifica a

amostra em colónias gram-negativas/ gram-positivas / leveduras);

-‐ Após esta classificação foi atribuída uma carta correspondente a esta identificação e a

amostra foi colocada no VITEK para identificação;

-‐ Os resultados da identificação demoraram em média 4 a 18 horas, consoante a espécie

em identificação.

Estes isolados foram identificados no VITEK três vezes, a partir de culturas frescas de

dias diferentes como forma de garantir que os isolados selecionados corresponderiam a

microrganismos puros.

4.2. Análises espetroscópicas

Foram utilizados 52 isolados para a aquisição de 468 espetros no FTIR. Para cada

amostra adquiriram-se espetros em triplicado em três dias diferentes, ou seja, para cada

isolado foram obtidos 9 espetros. Antes de iniciar cada aquisição, limpou-se o suporte do

FTIR com álcool a 70% e fez-se um background. Para cada isolado, foi colocado com uma

ansa estéril uma quantidade mínima de material biológico no suporte do FTIR de forma a não

ser possível visualizar o cristal quando este estava depositado. Esperou-se aproximadamente 3

minutos entre a deposição de cada amostra e a aquisição da primeira réplica para que fosse

mais fácil obter 3 réplicas consecutivas de cada amostra.

O espetrofotómetro utilizado para a aquisição de espetros neste estudo foi o Spectrum

One FT-IR Spectrometer-Perkin Elmer com um intervalo de números de onda de 4000 cm-1 a

600 cm-1, resolução de 4 cm-1 e 32 acumulações de varrimentos. Após a aquisição espetral

seguiu-se o tratamento quimiométrico dos espetros através do software SOLO. O tratamento

quimiométrico dos espetros teve início pela construção de modelos PCA em que foi

necessário transformar a transmitância (T) em absorvância (A) utilizando a equação 3.

𝐴 = log !!

[Equação 3]

Neste estudo, apesar de terem sido adquiridos espetros numa gama de 4000 cm-1 a 600

cm-1, para a análise quimiométrica dos espetros foi feita uma restrição espetral para um

intervalo de 1500 cm-1 a 900 cm-1. Desta forma é possível eliminar a banda da água na zona

dos 3250 cm-1 e as restantes zonas dos espetros que não revelam diferenças taxonómicas das

diferentes espécies.


34

Em seguida foram aplicados os pré-processamentos: a variação do padrão normal

(SNV) para minimizar interferências causadas pelas diferenças das amostras; um filtro

Savitzky-Golay para reduzir o ruído, considerando a segunda derivada. Após o pré-

processamento escolhe-se o número de componentes principais para a construção do modelo.

Em seguida analisou-se os mapas de agrupamentos em função dos componentes principais

escolhidos assim como as estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos.

A partir do modelo de PCA foram construídos modelos de HCA, ou seja,

dendrogramas de forma a avaliar as semelhanças dos espetros. Para isso, utilizou-se o método

de Ward. Este destina-se a medidas escalonadas e faz uso de distâncias euclidianas. A

dissimilaridade entre agrupamentos é baseada na distância euclidiana entre os centros dos

agrupamentos(91).

Em relação aos espetros de Staphylococcus, como é o género que tem maior número

de isolados(40) foi feita uma análise supervisionada dos dados recorrendo ao PLS-DA. Para

construção destes modelos é necessário escolher um método de validação cruzada.

A validação cruzada envolve a remoção de um sub-conjunto de espetros (o conjunto

de teste) do conjunto de dados. O modelo é construído com os restantes objetos e em seguida

aplicou-se ao modelo resultante os espetros removidos. Dessa forma, cada experiência de

validação envolve o teste de um modelo com objetos que não foram usados para a sua

construção. Neste estudo escolheu-se como método de validação os blocos contíguos, pela

sua simplicidade e facilidade de implementação(92). Para implementar este método é

necessário escolher o número de espetros para cada sub-conjunto, um número de divisão de

dados, neste caso escolheu-se 34 que corresponde ao número de isolados que foram utilizados

(cada isolado tem nove espetros). O número de isolados utilizados corresponde ao número de

microrganismos do género Staphylococcus com identificações coerentes no VITEK, e em que

existe pelo menos mais do que um isolado da mesma espécie.


35

5. Resultados e discussão

5.1. Avaliação dos resultados pelo método VITEK

As identificações que foram feitas no VITEK para garantir que os microrganismos

utilizados fossem puros, assim como a informação sobre a origem do microrganismo e a

respetiva abreviatura atribuída para facilitar as identificações no VITEK estão descritas na

Tabela 5.

De acordo com os resultados do VITEK, existem alguns isolados em que as três

identificações não são concordantes. Por exemplo quando o resultado de uma das três

identificações foi não identificado (NID). Esta discordância entre os isolados pode revelar a

presença de colónias mistas em alguns casos, ou pode estar relacionado com contaminações

cruzadas, uma vez que as identificações foram feitas a partir de culturas frescas em dias

diferentes. No entanto, como o VITEK é um método desenvolvido para a área clínica, a não

concordância das identificações através desta técnica também pode estar relacionada com esse

fator. No caso dos microrganismos padrão da Bioball não foram feitas as três identificações

no VITEK uma vez que já existia a certeza de serem puros.

O grupo dos Staphylococcus é o maior grupo, uma vez que estas bactérias são as que

mais aparecem na flora residente da unidade fabril, sendo facilmente transmissíveis pelos

humanos.


36

Tabela 5.Resultados das identificações dos isolados utilizados neste estudo pelo método VITEK.

VITEK

Abreviatura 1ª Identificação

2ª Identificação

3ª Identificação

Staphylococcus

ST01 99% 99% - ST02 99% - - ST03 99% - - ST04 99% - - psau01 94% 97% 97% psep01 99% 99% 99% psep02 96% 93% 94% asep03 99% 99% 99% asep04 99% 99% 99% asep05 99% 96% 99% aslt01 95% NID NID pslt02 88% 89% 89% pslt03 97% 89% S. sciuri 89% S. sciuri pslt04 99% NID 85% S. sciuri pslt05 99% NID 97% E.casseliflavus ascc01 99% 98% 98% ascc02 95% 97% 97%

asxy01 99% S. galinarium 89% 89%

asxy02 89% 89% 94% K. Kristinae ashh01 95% Baixa discriminação Baixa discriminação pshh02 94% Baixa discriminação Baixa discriminação assp01 99% 99% 99% assp02 95% 95% 95% assp03 99% 99% 98% assp04 99% 98% 99% assp05 95% 99% 99% aswa01 97% 97% 97% aswa02 95% 99% K. Kristinae 99% K. Kristinae pswa03 96% 98% 98% aswa04 98% 97% 97% aswa05 95% 95% 95% pssc01 90% 93% 93% pssc02 90% 93% S. lentus - psvt01 91% 93% S. sciuri 93% S. sciuri psvt02 97% 93% 87% S. sciuri ascp01 99% Baixa discriminação Baixa discriminação ascp02 96% 96% 96% ascp03 97% 97% 97% ascp04 98% 98% 98% ascp05 93% 93% S. warneri 95% S. warneri

Pseudomonas

PS01 98% - - PS02 98% - - PS03 98% - - PS04 98% - - apfr01 99% 96% 95% apst01 98% 95% 98% apst02 89% Klebsiella 99% 90% ppor01 93% 99% 99%

Escherichia

EC01 99% - - EC02 99% - - EC03 99% - - EC04 99% - -

5.2. Discriminação pelo método FTIR

Os espetros FTIR-ATR de todos os isolados revelaram alta similaridade e bandas

atribuídas com componentes bacterianos tais como lípidos (3000-2800 cm-1),

proteínas/amidas I e II (1700-1500 cm-1), fosfolípidos/DNA/RNA (1500-1185 cm-1),


37

polissacáridos (1185-900 cm-1) e a região da impressão digital (900-600 cm-1)(93). As

principais diferenças espetrais foram detetadas nas regiões dos fosfolípidios/DNA/RNA e

polissacáridos (1500-900 cm-1): estas regiões foram anteriormente utilizadas em estudos para

discriminação em diferentes níveis taxonómicos em diferentes espécies bacterianas.

Como se pode observar na Figura 9, os espetros de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa

são bastante complexos e semelhantes entre si. A cada isolado correspondem 9 espetros (três

réplicas em três dias diferentes).

Figura 9. Espetros FTIR-ATR dos microrganismos padrão (E. coli, S. aureus e P. aeruginosa) sem pré-processamento.

Os pré-processamentos utilizados após a aquisição dos espetros foram: a variação do

padrão normal (SNV) e um filtro Savitzky-Golay com segunda derivada. Os parâmetros do

filtro de Savitzky-Golay foram 9 pontos, um polinómio de segunda ordem e segunda

derivada. Apesar de existirem outros métodos de pré-processamento para a mesma finalidade,

os métodos de processamento utilizados produziram os melhores resultados na modelação.

Após o pré-processamento e restrição da zona espectral (Figura 10), pode observar-se que

existe uma diferença visual significativa principalmente entre as bactérias gram-negativas

(linhas azul e vermelha) e as gram-positivas (linha a vermelho).

Número de onda (cm-1)1000150020002500300035004000

% T

rans

mitâ

ncia

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Número de onda (cm-1)


38

Figura 10. Espetros dos microrganismos padrão de E. coli, P. aerugionosa e S. aureus pré-processados com SNV e Sav-Gol

(9,2,2) na região 1500-900 cm-1.

5.2.1. Distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos

Inicialmente, fez-se uma análise mais abrangente dos espetros, recorrendo a uma análise

de PCA de todos os espetros adquiridos, em que o primeiro passo foi a determinação do

número de CPs. Uma das formas de determinar este número baseia-se na representação

gráfica dos valores próprios em função do número de CPs. O número a usar deverá ser aquele

a partir do qual se observa uma descida repentina no declive das retas do gráfico (que por sua

vez corresponde ao ponto para o qual a adição de maior número de CPs não trará maior

significância ao modelo): no caso da Figura 11 foram utilizados 3 CPs.

Figura 11. Representação gráfica da variância capturada com o aumento do número de CPs.

900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)

-0.025

-0.02

-0.015

-0.01

-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

Abso

rvân

cia n

orm

aliza

da

ECSAPA

Principal Component Number2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Varia

nce

Cap

ture

d (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

Var

iânc

ia c

aptu

rada

(%)

Número de componentes principais


39

É possível visualizar a distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos

ao fazer um PCA de todos os espetros (Figura 12): nesta situação existem espetros que não

são concordantes com esta discriminação. Na zona dos gram-negativos (vermelhos) aparecem

os isolados aswa02 e asxy02 incorretamente. Estes não têm identificações no VITEK

concordantes. Este método identificou como Kocuria kristinae (gram-positivo) e como

Staphylococcus, embora ambas as identificações correspondam a microrganismos gram-

positivos, sabemos que estes isolados não são puros pela discordância de identificações, o que

pode justificar a sua localização no mapa de scores.

Figura 12. Mapa de scores dos dois componentes principais do modelo PCA de todos os microrganismos em que a vermelho estão representados os gram-negativos e a verde os gram-positivos de acordo com a informação dada pelo VITEK.

Na Figura 13 pode observar-se a representação tridimensional dos scores do modelo

de PCA após a eliminação dos isolados aswa02 e o asxy02, sendo possível distinguir

claramente as bactérias gram-negativas das gram-positivas.

Os pontos verdes fora do agrupamento são o psau01 e o pssc02. Estes m.o. têm

poucos isolados (e consequentemente poucos espetros) desta espécie, tornando-se bastante

diferentes dos restantes, o que poderá justificar a sua localização. Para avaliar toda a

informação do modelo é necessário observar as estatísticas de Hotelling’s T2 (Figura 14) e

dos resíduos (Figura 15). Este é um modelo construído com todos os espetros adquiridos, que

correspondem a isolados muito diferentes e por esse motivo seria de esperar que os que têm

Scores on PC 1 (44.84%)-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1

Scor

es o

n PC

2 (1

8.26

%)

-0.15

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15 Gram-negativaGram-positiva95% Confidence Level

Scores no CP 1 (43,82%)

Sco

res

no C

P 2

(17,

75%

)


40

identificações discordantes no VITEK não sejam contemplados pelo modelo construído que

descreve as características da maior parte das amostras.

Figura 13. Mapa de scores do modelo de PCA de todos os microrganismos após eliminar aswa02 e asxy02 ( modelo

construído com 5 CPs).

Figura 14. Representação da estatística de Hotelling’s T2 do modelo de PCA de todos os espetros.

0.1

Scores on PC 1 (44.45%)

0

-0.1-0.05


0

0.05

0.05

0

-0.05

-0.1

Scor

es o

n PC

3 (6

.35%

)Scores on PC 5 (5.01%)Gram-negativaGram-positiva

Sample50 100 150 200 250 300 350 400

Hot

ellin

g T^

2 (7

9.96

%)

0

10

20

30

40

50

60

70Gram-negativaGram-positivaModel-specific T2 Limit95% Confidence Level

Scores no CP 5 (5,13%) Scores no CP 1 (43,45%)

Sco

res

no C

P 3

(6,7

4%)

Hotelling’s

T2 (8

2,17

%)

Amostra

pssc02

psau01

ppor01

apfr01

psau01

pssc02


41

Figura 15. Representação da estatística de resíduos do modelo de PCA de todos os espetros.

A análise de agrupamento hierárquico aglomerado (HCA) ajuda a identificar

semelhanças entre os espetros de microrganismos recorrendo às distâncias entre espetros e a

algoritmos de agregação. A distância utilizada foi a distância euclidiana e o algoritmo de

Ward(94). Este modelo (Figura 16) foi construído a partir dos agrupamentos do modelo de

PCA com 6 CPs. Neste caso, o eixo horizontal dá-nos a distância entre os grupos e avalia a

categorização dos m.o. de acordo com a sua importância para o modelo, em que o grupo dos

m.o. gram-positivos (verde) engloba as variações impostas a m.o. com maior relevância para

o modelo.

Figura 16. Dendrograma feito com os todos os espetros onde estão representados os microrganismos gram-positivos a verde e os microrganismos gram-negativos a vermelho.

Variance Weighted Distance Between Cluster Centers0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center

Class 0Gram-negativaGram-positiva

Amostra

Res

íduo

s Q

(17,

83%

)

Distância ponderada de variância entre centros dos grupos

apfr01

apst01

pslt04

pssc02

pslt03

psau01 pslt02


42

5.2.2. Distinção de microrganismos do género Pseudomonas

Foi construído um modelo PCA para os isolados deste género com 5 CPs, em que o 1º

CP descreve aproximadamente 64% do modelo e o 5º, embora não contribua

significativamente para o modelo, permite identificar de forma clara a presença de quatro

espécies diferentes (Figura 17), mostrando-se o número de componentes adequado à

modelação em estudo. É ainda possível observar a elevada similaridade entre as amostras de

cada espécie.

Figura 17. Mapa de scores da família Pseudomonas em que estão representados os CPs 1, 2 e 5.

Na Figura 18 e na Figura 19 estão representadas as estatísticas de resíduos e de

Hotelling’s T2 respetivamente.

Figura 18. Representação da estatística de resíduos para o modelo PCA das Pseudomonas.

0.1


0.050

-0.05-0.1-0.03

-0.02-0.010


0.010.02

0.030.04

0.05

0.15

0.1

0.05

0

-0.05

Scor

es o

n PC

1 (6

3.51

%)

Scores on PC 5 (2.64%)P.aerugionosaP.fluorescensP.oryzihabitantsP.stutzeri

Sco

res

no C

P 1

(63,

51%

)

Scores no CP 5 (2,64%) Scores no CP 2 (17,61%)

Res

íduo

s Q

(4,5

6%)

Amostra

ppor01 apfr01 apst01


43

Figura 19. Representação da estatística de Hotelling’s T2 para o modelo de PCA do género Pseudomonas.

Pode comprovar-se a correta associação das diferentes espécies através da

classificação do dendrograma da Figura 20. O facto da ramificação correspondente à P.

aeruginosa ser a mais distante das restantes é uma grande vantagem para este estudo, uma vez

que essa é a espécie considerada mais patogénica no género das Pseudomonas. Esta

associação está relacionada também com o número de isolados desta espécie ser maior do que

o das restantes em estudo.

Figura 20. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao género Pseudomonas (foram

usados 6 CPs).

Sample10 20 30 40 50 60 70

Hot

ellin

g T^

2 (9

5.99

%)

0

2

4

6

8

10

12P.aerugionosaP.fluorescensP.oryzihabitantsP.stutzeriModel-specific T2 Limit95% Confidence Level

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

PA01_1 PA01_2 PA01_3 PA03_1 PA03_2 PA03_3 PA02_1 PA02_2 PA02_3 PA04_1 PA04_3 PA04_2 PA01_4 PA01_5 PA01_6 PA04_7 PA04_8 PA04_9 PA02_7 PA02_9 PA02_8 PA03_7 PA03_8 PA03_9 PA03_4 PA03_6 PA03_5 PA01_7 PA01_9 PA01_8 PA02_4 PA02_5 PA02_6 PA04_4 PA04_5 PA04_6 apfr01_1apfr01_3apfr01_2apfr01_7apfr01_8apfr01_9apfr01_4apfr01_5apfr01_6ppor01_1ppor01_2ppor01_3ppor01_4ppor01_6ppor01_5ppor01_7ppor01_8ppor01_9apst01_1apst01_2apst01_3apst01_4apst01_5apst01_6apst01_7apst01_9apst01_8apst02_1apst02_2apst02_3apst02_4apst02_6apst02_5apst02_7apst02_9apst02_8Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center

Class 0P. aeruginosaP. fluorescensP. oryzihabitantsP. stutzeri

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

PA01_1 PA01_2 PA01_3 PA03_1 PA03_2 PA03_3 PA02_1 PA02_2 PA02_3 PA04_1 PA04_3 PA04_2 PA01_4 PA01_5 PA01_6 PA04_7 PA04_8 PA04_9 PA02_7 PA02_9 PA02_8 PA03_7 PA03_8 PA03_9 PA03_4 PA03_6 PA03_5 PA01_7 PA01_9 PA01_8 PA02_4 PA02_5 PA02_6 PA04_4 PA04_5 PA04_6 apfr01_1apfr01_3apfr01_2apfr01_7apfr01_8apfr01_9apfr01_4apfr01_5apfr01_6ppor01_1ppor01_2ppor01_3ppor01_4ppor01_6ppor01_5ppor01_7ppor01_8ppor01_9apst01_1apst01_2apst01_3apst01_4apst01_5apst01_6apst01_7apst01_9apst01_8apst02_1apst02_2apst02_3apst02_4apst02_6apst02_5apst02_7apst02_9apst02_8Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center

Class 0P. aeruginosaP. fluorescensP. oryzihabitantsP. stutzeri

Hotelling’s

T2 (95.

99%

)

Amostra

Distância ponderada de variância entre centros dos grupos 0


44

5.2.3. Distinção de microrganismos do género Staphylococcus

O grupo do género Staphylococcus é o que tem maior relevância neste estudo, uma

vez que é o único grupo que tem um número de isolados suficientemente representativo para

uma análise mais conclusiva. Tal como para os estudos dos géneros anteriores, iniciou-se pela

análise exploratória não supervisionada dos espetros deste grupo, fazendo-se em seguida uma

análise supervisionada dos dados através da construção de modelos PLS-DA.

• Análise exploratória

A construção de um modelo PCA com todos os espetros de Staphylococcus teve início

na observação da variância capturada pelo modelo para cada número de CP. Selecionou-se o

número de CPs com maior variância, neste caso 4 (Figura 21). Neste primeiro modelo

também foram incluídos os espetros dos isolados que não tiveram identificações concordantes

no VITEK.

Figura 21. Variância capturada em função do número de CPs para o modelo PCA dos espetros de Staphylococcus.

Ao observarmos o mapa de scores (Figura 22) com todos os espetros, percebe-se que

os isolados pssc02, asxy02 e aswa02 não são concordantes com os restantes, tal como se tinha

constatado pelas identificações não concordantes do VITEK. Estes isolados foram eliminados

e foi feito um novo modelo de PCA.

Variâ

ncia

cap

tura

da (%

)

Número de componentes principais


45

Figura 22. Mapa de scores de todos os espetros de Staphylococcus com representação do 1º e 2º CPs.

Os dois primeiros CPs do novo modelo (4 CPs) mostram na Figura 23, que o S.

auricularis (psau01) não se encontra próximo dos restantes. Este isolado embora seja do

mesmo género dos restantes, é o único isolado desta espécie neste modelo. Quando se fala de

distinção entre Staphylococcus, a espécie auricularis apresenta diferenças genéticas

significativas nomeadamente ao nível dos genes sodA, gap, 16S rRNA e hsp60 em relação às

restantes espécies em estudo(95). Estas diferenças genéticas podem refletir-se em diferenças

fenotípicas captadas nos espetros FTIR.

Quando se observa o terceiro CP (Figura 24) podemos ver que o ascp02 se revela

bastante diferente dos restantes. Com o objetivo de compreender a posição destes isolados,

foram feitas as representações dos espetros do ascp02, do psau01 em simultâneo com S.

aureus (Figura 25). Ambos os isolados (psau01 e ascp02) foram identificados de forma

coerente no VITEK, no entanto quanto aos espetros pré-processados observam-se várias

diferenças entre eles, tanto na região dos hidratos de carbono, como na região dos

fosfolípidos/DNA/RNA, o que pode justificar a esta diferença no modelo de PCA.

Scores on PC 1 (24.97%)-0.1 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08

Scor

es o

n PC

2 (1

9.41

%)

-0.1

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.warneriS.xylosus95% Confidence Level

Sco

res

no C

P 2

(19,

10%

)


pssc02 psau01

asxy02 aswa02


46

Figura 23. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 2º CP.

Figura 24. Mapa de scores do modelo PCA dos Staphylococcus com representação do 1º e 3º CP.

Scores on PC 1 (28.02%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08

Scor

es o

n PC

2 (1

7.80

%)

-0.12

-0.1

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level

Scores on PC 1 (28.02%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08

Scor

es o

n PC

3 (1

0.24

%)

-0.1

-0.05

0

0.05

S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level

Sco

res

no C

P 2

(14,

72%

)


Sco

res

no C

P 3

(11,

59%

)


ascp0

2

psau01


47

Figura 25. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de 3 isolados diferentes: S. aureus (vermelho), S. capitis (azul) e S. auricularis (verde). Espetros pré-processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2).

As estatística de Hotelling’s T2 e de resíduos (Figura 26) neste modelo consideram

como amostras atípicas ao modelo: psau01, ascp02, pslt02, pslt03, pslt04 e ascc01. O psau01

é uma amostra atípica devido ao facto de existir apenas um isolado desta espécie no conjunto

de amostras. Os isolados pslt02, pslt03 e pslt04 têm identificações não concordantes no

VITEK, e por isso seria de esperar que também fossem atípicas para o modelo. É de salientar

que a maioria destes isolados são provenientes de microrganismos em condições de stress. Os

isolados ascp02 têm identificações concordantes no VITEK, no entanto a análise dos seus

espetros já revelou ter algumas diferenças (Figura 25), o que pode estar relacionado com

alguma contaminação durante a aquisição dos espetros ou durante o crescimento das culturas.

O ascc01 revelou-se concordante na identificação pelo FTIR.

900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)

-0.025

-0.02

-0.015

-0.01

-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

Abso

rvân

cia

norm

aliz

ada

SAScp02Sau01


48

Figura 26. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PCA do género Staphylococcus.

A HCA foi utilizada para complementar o método de PCA usando o método de Ward e

as distâncias euclidianas. O dendrograma foi obtido a partir dos scores do modelo de PCA(96).

Embora a associação dos seis grupos não seja correta, o grupo dos isolados de S. aureus é o

que se encontra mais distante.

Figura 27. Dendrograma obtido da análise de HCA de espetros dos isolados pertencentes ao género Staphylococcus (foram usados 10 CPs).

Variance Weighted Distance Between Cluster Centers0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0

50

100

150

200

250

300Dendrogram of Data with Preprocessing: Transmission to Absorbance (log(1/T)) + SNV + 2nd Derivative (order: 2, window: 9 pt, incl only, tails: polyinterp) + Mean Center

S.aureusS.auricularisS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus

Hotelling’s

T2 (6

4,50

%)

Q Resíduos (35,50%)

Distância ponderada de variância entre centros dos grupos


49

• Análise supervisionada

Para iniciar a modelação com PLS-DA, incluíram-se todos os espetros de

Staphylococcus, mesmo os que se revelaram não concordantes no VITEK, com exceção do S.

auricularis que por ser apenas um isolado desta espécie não poderia ser incluído no modelo

devido à necessidade de execução da validação cruzada. Antes de criar o modelo PLS-DA foi

também eliminado um isolado – SA01 – para avaliar posteriormente a previsão do modelo

com um isolado puro. O pré-processamento e a gama espectral utilizados foram iguais aos

usados nos modelos PCA. Como é um método supervisionado é necessário nomear as classes,

neste caso com o nome das diferentes espécies em causa. O passo a tomar antes de criar o

modelo é a escolha do método para a validação cruzada do modelo. Os modelos PLS-DA

exigem validação cruzada para garantir a confiabilidade do modelo, pois produzem

separações entre os agrupamentos de diferentes grupos(75). Neste caso, escolheram-se: blocos

contíguos (divide o conjunto em conjuntos de amostras que são contíguas) com um número

máximo de variáveis latentes de 20 e um número de divisão de dados igual a 38 (corresponde

ao número de diferentes microrganismos utilizados neste modelo).

Após a construção do modelo é necessário escolher o número de variáveis latentes.

Para fazer essa escolha deve analisar-se o gráfico do erro da validação cruzada em relação ao

número de variáveis latentes (Figura 28). Neste modelo utilizaram-se três variáveis latentes.

Figura 28. Representação gráfica da percentagem de erro da validação cruzada em função do número de variáveis latentes.

Quando observamos as variáveis latentes 1 e 2 no mapa de scores (Figura 29), existem

três isolados - psvt02, pssc01 e pssc02 - que não são descritos por estas e estão bastante

Latent Variable Number2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

CV

Cla

ssifi

catio

n Er

ror A

vera

ge

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

0.26

0.28

0.3

0.32

Número de variáveis latentes

Méd

ia d

o er

ro d

a cl

assi

ficaç

ão C

V


50

distantes das restantes. É necessário reforçar que estes isolados correspondem a amostras

cujas identificações no VITEK não foram coerentes. Além disso, são amostras que foram

recolhidas de contaminações em produtos, o que pode justificar a sua grande diferença das

restantes. As bactérias que crescem numa análise de produto estão em condições de stress por

estarem em contacto com uma substância ativa. A presença microbiana em fármacos é um

fenómeno no qual uma subpopulação de microrganismos é capaz de sobreviver sem adquirir

alterações genéticas que confiram resistência. No entanto, a resistência num estado de stress

intracelular ativo pode acelerar processos de evolução adaptativa(97).

Figura 29. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS dos Staphylococcus.

Ao analisar o mapa de scores e as estatísticas de Hotelling’s T2 e resíduos (Figura 30)

eliminaram-se os isolados psvt02, pssc01, psc02 e aswa02. O aswa02 é um isolado em que as

identificações no VITEK não foram coerentes, por esse motivo seria expectável que não fosse

incluído no modelo.

Scores on LV 1 (81.57%)-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3

Scor

es o

n LV

2 (4

.82%

)

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.vitulinusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level

Sco

res

na v

ariá

vel l

aten

te 2

(4,8

4%)

Scores na variável latente 1 (81,73%)

psvt0

2

pssc0

1

pssc0

2


51

Figura 30. Estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA dos Staphylococcus.

Construiu-se um modelo PLS-DA, com 5 variáveis latentes, com alteração do número

de divisão de dados utilizado na validação cruzada(34) correspondente ao número de isolados

deste modelo.

Na Figura 32 é possível ver a discrepância entre os grupos de S. lentus e S. capitis.

Esta discrepância pode justificar-se com as diferenças entre as identificações no VITEK.

Nestas duas classes existem identificações não concordantes no mesmo isolado. Quanto aos S.

lentus, o agrupamento que fazem entre eles no modelo corresponde às identificações do

VITEK, uma vez que o pslt03 e pslt04 são isolados que identificaram espécies diferentes

(Tabela 6). Em relação aos Staphylococcus capitis (Tabela 7) o isolado ascp01 deverá

corresponder a esta espécie embora esta informação não seja conclusiva no VITEK.

Tabela 6. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus lentus.

1ª ID VITEK

2ª ID VITEK

3ª ID VITEK

pslt02 88% 89% 89% pslt03 97% 89% S. sciuri 89% S. sciuri pslt04 99% NID 85% S. sciuri

Os isolados ascp01, ascp03 e ascp04 deverão ser da mesma espécie. Em relação ao

ascp02 já não existe tanta proximidade. No entanto identificações em relação a este m.o. no

VITEK são coerentes. O isolado ascp05 está representado no grupo dos S. warneri o que

Hotelling T^2 (89.02%)0 5 10 15

Q R

esid

uals

(10.

98%

)

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.sciuriS.vitulinusS.warneriS.xylosusModel-specific T2 LimitModel-specific Q Limit95% Confidence Level

Res

íduo

s Q

(11,

01%

)

Hotelling’s T2 (88,99%)


52

confirma a informação retirada do VITEK em que duas das três identificações indicavam

ascp05 como S. warneri. O espetro deste isolado sobrepõe-se em praticamente toda a região

espetral dos espetros de S. warneri (Figura 31).

Tabela 7. Resumo dos resultados das identificações do VITEK para Staphylococcus capitis.

1ª ID VITEK

2ª ID VITEK

3ª ID VITEK

ascp01 99% Baixa Discriminação

Baixa Discriminação

ascp02 96% 96% 96% ascp03 97% 97% 97% ascp04 98% 98% 98%

ascp05 93% 93% S. warneri

95% S. warneri

Figura 31. Média dos espetros FTIR (1500-900 cm-1) de isolados de S. warneri (verde, rosa, preto e azul), comparado com o

S. capitis (05)(vermelho). Espetros pré-processados com SNV e Sav-Gol (9,2,2).

No que diz respeito às classes dos S. epidermis, S. cohnii, S. warneri e S.

saprophyticus podemos confirmar os resultados do VITEK com os espetros FTIR, uma vez

que podem observar-se grupos bem definidos destas espécies.

Os isolados inicialmente considerados da espécie S. hominis, embora não existam três

identificações coerentes no VITEK, têm semelhanças nos seus espetros e teria de ser utilizado

um terceiro método de identificação para podermos avaliar se realmente são colónias puras.

Poderia ser feito PCR com estes microrganismos seguido de sequenciação para avaliar a sua

900100011001200130014001500Número de onda (cm-1)

-0.025

-0.02

-0.015

-0.01

-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

Abso

rvân

cia

norm

aliz

ada

Swa01Swa03Swa04Swa05Scp05


53

espécie com segurança. A diferença entre os dois isolados desta espécie estará relacionada

com o facto de um dois isolados ser proveniente de uma análise de um fármaco e o outro

recolhido da monitorização ambiental. Outra possibilidade para a resolução desta espécie

seria utilizar-se maior amostragem para que conseguisse definir com maior precisão o grupo

correspondente.

Em relação ao S. xylosus, têm identificações não concordantes no VITEK mas as suas

réplicas dos espetros são concordantes, e pela análise dos espetros FTIR fazem pelo menos

parte do género Staphylococcus.

Figura 32. Mapa de scores das variáveis latentes 1 e 2 do modelo PLS-DA de Staphylococcus.

A distância entre scores (Figura 33) permite avaliar a aptidão do modelo para a

definição de classes: distância de cada amostra ao centro da respetiva classe e distância entre

classes. A classe mais discrepante é a dos Staphylococcus lentus sendo que é na classe

Staphylococcus capitis que existe maior variabilidade entre amostras.

Scores on LV 1 (32.83%)-0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08

Scor

es o

n LV

2 (9

.81%

)

-0.05

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus95% Confidence Level

pslt02

ascp02

pslt03, pslt04

ascp01, ascp03, ascp04

ascp05

Sco

res

na v

ariá

vel l

aten

te 2

(9,8

1%)

Scores na variável latente 1 (32,83%)


54

Figura 33. Mapa tridimensional de scores com as variáveis latentes 1,2 e 3 para o modelo PLS-DA de Staphylococcus.

Na Tabela 8 estão os valores de sensibilidade e especificidade dos dados de calibração para

cada classe, em que a classe com menor sensibilidade é a dos S. capitis e a que tem menor

especificidade é a classe da espécie warneri. Estão também os valores dos erros calculados

sobre os conjuntos que dividem os dados a analisar pela validação cruzada (RMSECV) e o

erro de calibração (RMSEC). A classe que apresenta maiores RMSECV e RMEC é a dos S.

warneri (sendo, portanto, esta a espécie para o qual o modelo demonstra uma menor

performance e um ajuste menos adequado). As estatísticas dos resíduos e de Hotelling’s T2

detetaram como amostras atípicas as amostras da espécie lentus (Figura 34).

Tabela 8. Estatísticas para cada classe do modelo PLS-DA de Staphylococcus.

Espécie Sensibilidade Especificidade RMSECV RMSEC 1- S. aureus 1,000 1,000 0,231 0,170 3- S. capitis 0,778 0,986 0,330 0,225 4- S. conhii 1,000 0,935 0,276 0,232 5- S. epidermidis 1,000 0,952 0,307 0,214 6- S. hominis 1,000 1,000 0,250 0,184 7- S. lentus 1,000 1,000 0,206 0,137 8- S. saprophyticus 0,933 0,952 0,323 0,220 11- S. warneri 1,000 0,864 0,374 0,281 12- S. xylosus 1,000 0,867 0,201 0,186

Scores on LV 1 (32.83%)

0.05

0

-0.05-0.04-0.03

-0.02

Scores on LV 2 (9.81%)

-0.010

0.010.02

0.03

-0.03

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

Scor

es o

n LV

3 (8

.49%

)

Scores on LV 2 (9.81%)S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus

Sco

res

na v

ariá

vel l

aten

te 3

(8,4

9%)

Scores na variável latente 1 (32,83%) Scores na variável latente 2 (9,81%)


55

Figura 34. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e de resíduos para o modelo PLS-DA de Staphylococcus.

De forma a testar o modelo PLS-DA criado, projetou-se o isolado SA01, que não foi

utilizado neste modelo. O modelo consegue prever a classe deste isolado como se pode ver no

mapa de scores da Figura 35 a cinzento, no grupo dos S. aureus. A Figura 36 é uma das

representações que serve de forma a avaliar uma amostra de previsão verificando-se que o

modelo considera o SA01 como S. aureus, tal como esperado.

Figura 35. Mapa de scores do modelo PLS-DA de previsão com os dados de teste (SA01).

pslt04 pslt03

pslt02

Hotelling’s

T2 (65,

28%

)

Residuos Q (p=0.950) (34,72%)

Scor

es n

a va

riáve

l lat

ente

5 (4

,12%

)

Scores na variável latente 2 (9,81%) Scores na variável latente 1 (32,83%)


56

Figura 36. Previsão da amostra de teste SA01 como membro da classe de S. aureus.

De forma a avaliar a robustez do método proposto, foi necessário determinar a

possibilidade de identificar isolados que não pertençam às espécies modeladas. Esperava-se

que quando um isolado pertencente a um tipo de espécie diferente fosse examinado com este

modelo, este seria identificado como diferente ou não pertencente a qualquer um dos tipos de

espécie incluídos. Assim, foram utilizados nove isolados para testar o modelo, não tendo sido

estes utilizados no modelo PLS-DA.

Para avaliar a capacidade de prever o pssc02 (este isolado foi identificado como S.

sciuri e depois como S. lentus no VITEK), pode observar-se na Figura 37 através da previsão

de classes que este não associa a amostra desconhecida a nenhuma destas. No entanto, existe

probabilidade de ser S. lentus quando vemos a probabilidade de previsão desta classe (Figura

38). Esta amostra considera-se desconhecida para o modelo, tanto pela análise da sua

contribuição para o mesmo como pela análise das estatísticas de Hotelling’s T2 e resíduos

(Figura 39).

SA01

S. aureus utilizados na calibração

Amostra

Pre

visã

o de

cla

sses

(S.aureus)


57

Figura 37. Previsão da classe da amostra para pssc02.

Figura 38. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra pssc02.

pssc02

pssc02

S. lentus utilizados na calibração

Pre

visã

o re

strit

a de

cla

sses

Amostra

Pre

visã

o de

cla

sses

(S.lentus

)

Amostra


58

Figura 39. Representação das estatísticas de Hotelling’s T2 e dos resíduos com a projeção da amostra desconhecida (pssc02).

A amostra seguinte utilizada para testar o modelo foi o pssc01. Este isolado foi

coerentemente identificado pelo VITEK, no entanto como a classe S. sciuri não está

representada no modelo: este não o conseguiu associar a nenhuma das restantes classes

(Figura 40).

Figura 40. Previsão da classe da amostra para pssc01.

pssc02

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pr

ed S

trict

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus

pssc01

Pre

visã

o re

strit

a de

cla

sses

Amostra

Hotelling’s T2 (p=0.950)(62,44%)

Res

íduo

s Q

(p=0

.950

)(37,

56%

)


59

Quando se faz a projeção do isolado aslt01 no modelo, este não o associa a nenhuma

classe (Figura 41), no entanto na Figura 42 revela-se semelhante à classe dos S. lentus.

Figura 41. Previsão da classe da amostra para aslt01.

Figura 42. Probabilidade de previsão da classe de S. lentus na amostra aslt01.

Foram considerados os espetros do isolado psau01 como amostra desconhecida para o

modelo e como seria expectável, o modelo considera-a uma amostra atípica, uma vez que esta

classe não se encontra representada no modelo. O mesmo acontece para o isolado psvt01 e

psvt02 (Figura 43).

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pr

ed S

trict

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


aslt01

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pr

ed M

embe

r S.le

ntus

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus

aslt01

S. lentus utilizados na calibração

Pre

visã

o re

strit

a da

cla

sse

Amostra

Pre

visã

o re

strit

a da

cla

sse

S.lentus

Amostra


60

Figura 43. Previsão da classe da amostra para psvt02.

Em relação à classe S. warneri, embora esteja representada no modelo de previsão, o

isolado aswa02 é considerado desconhecido, o que está de acordo com os resultados do

VITEK em que este tem identificações como K. kristinae.

Tal como acontece anteriormente, o modelo PLS-DA também não associa o asxy02 a

outra classe (Figura 44), uma vez que este isolado teve identificações como K. kristinae

poderá não ser uma amostra pura e por esse motivo bastante diferente da classe de S. xylosus

representada neste modelo (Figura 45).

Figura 44. Previsão restrita da classe da amostra para asxy02.

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pr

ed S

trict

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


psvt02

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pr

ed S

trict

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


asxy02

Pre

visã

o re

strit

a da

cla

sse

Amostra

Pre

visã

o re

strit

a da

cla

sse

Amostra


61

Figura 45. Probabilidade de previsão da classe de S. xylosus para o isolado asxy02.

Em suma, na Tabela 9 estão os resultados dos 9 isolados utilizados para testar o

modelo PLS-DA construído com os espetros dos isolados dos Staphylococcus. Os resultados

pelo FTIR comprovam os resultados do VITEK. No entanto seria necessário testar o modelo

com maior número de amostras pertencentes às restantes classes, uma vez que só foi testada

uma amostra pertencente à classe de S. aureus.

Tabela 9. Resumo dos resultados do VITEK e da previsão pelo modelo PLS-DA das amostras utilizadas para testar o modelo.

Amostra/ Isolado Resultado VITEK Resultados PLS-DA

SA01 Concordantes (m.o. padrão) Previsão na classe correta

psau01 Concordantes Não prevê

pssc01 Concordantes Não prevê

pssc02 Não concordantes Não prevê

aslt01 Não concordantes Não prevê

aswa02 Não concordantes Não prevê

psvt01 Não concordantes Não prevê

psvt02 Não concordantes Não prevê

asxy02 Não concordantes Não prevê

Sample50 100 150 200 250

Clas

s Pre

d M

embe

r S.xy

losus

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Class 0S.aureusS.capitisS.cohniiS.epidermidisS.hominisS.lentusS.saprophyticusS.warneriS.xylosus

asxy02

Amostra

Pre

visã

o re

strit

a da

cla

sse


62

6. Conclusões e perspetivas futuras

Neste estudo provou-se que o método utilizado é eficaz na distinção de

microrganismos gram-positivos de gram-negativos dentro dos géneros de Staphylococcus e

Pseudomonas. Esta distinção permite que este método possa vir a ser utilizado em parceria

com o VITEK, uma vez que esta distinção é necessária para a escolha das cartas a utilizar

neste método bioquímico. Devido à rapidez e facilidade de aquisição de espetros de

contaminantes de fármacos pelo método espetroscópico em estudo, esta ferramenta poderia

ser utilizada no laboratório de microbiologia como técnica de distinção de m.o. gram-

positivos de gram-negativos. Este passo permitiria reduzir os custos do método atualmente em

uso - ID Endosafe®-PTS ™ Gram - que requer cartuchos de identificação descartáveis.

A separação da P. aeruginosa das restantes amostras do mesmo género revelou-se

coerente com os resultados do VITEK, apenas com a construção de modelos de PCA. Seria

necessária a recolha de um maior número de amostras para poder avaliar os dados com maior

detalhe num modelo supervisionado como o PLS-DA.

Em relação aos Staphycoccus, os resultados na sua maioria são coerentes com os

resultados do VITEK. No caso do ascp05 foram necessárias três identificações no VITEK

para perceber que a primeira identificação (por norma apenas existe uma identificação quando

há crescimento bacteriano) não correspondia ao microrganismo correto, o isolado em questão

seria uma S. warneri que foi imediatamente localizado no mapa de agrupamentos junto à

classe dos S. warneri. Em relação aos nove microrganismos utilizados para testar o modelo

PLS-DA construído, os resultados foram concordantes com os do VITEK, apenas porque

excepcionalmente foram feitas três identificações por este método. Tal não acontece numa

situação de rotina o que permite concluir que existem alguns erros associados a este método

de identificação.

Durante a recolha de m.o., não foi possível detetar, na flora residente, estirpes do

género Escherichia, por esse motivo, apenas foram utilizados m.o. padrão da espécie

Escherichia coli para a construção de modelos de PCA para distinção de bactérias gram-

negativas de gram-positivas.

No entanto, para que o FTIR-ATR pudesse ser implementado como um método

alternativo ao VITEK, seria necessário construir modelos de PLS-DA com um maior número

de amostras, tanto a nível de variabilidade de espécie como de amostras da mesma espécie.

Para aumentar a robustez do modelo seria necessária a utilização de métodos como a

sequenciação para identificação dos isolados puros. Para além disso seria necessário repetir


63

este procedimento para cada um dos géneros dos m.o. específicos que são alvo de pesquisa na

análise microbiológica de medicamentos não-estéreis: Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, e bactérias gram-negativas tolerantes à bílis.

O método FTIR-ATR na identificação de m.o. revelou-se vantajoso para a

discriminação de espécies do género Staphylococcus, sendo este método significativamente

mais rápido e com um custo muito inferior ao do VITEK. Cada identificação no VITEK tem

um preço de aproximadamente de 14€ (somente em consumíveis) e um tempo de

identificação mínimo de 4 horas, enquanto que o custo de um espetro é aproximadamente de

1€ (somente em consumíveis) e o tempo de aquisição ronda os minutos, o que revela que este

seja um método com potencial para a indústria farmacêutica.


64

Referências

1. World Health Organization. Good practices for pharmaceutical microbiology laboratories.

2010. 1–27.

2. U.S.Pharmacopea. Microbiological attributes of nonsterile pharmaceutical products. USP29. p.

2969.

3. EudraLex. The Rules Governing Medicinal Products in the European Union: Good

Manufacturing Practice. 2011;4:1–9.

4. Kuligowski J, Quintás G, Herwig C, Lendl B. A rapid method for the differentiation of yeast

cells grown under carbon and nitrogen-limited conditions by means of partial least squares

discriminant analysis employing infrared micro-spectroscopic data of entire yeast cells.

Talanta. 2012;99:566–73.

5. Quintelas C, Mesquita DP, Lopes JA, Ferreira EC, Sousa C. Near-infrared spectroscopy for the

detection and quantification of bacterial contaminations in pharmaceutical products. Int J

Pharm. 2015;492(1):199–206.

6. INFARMED. Controlo Laboratorial [Internet]. [citado 1 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://www.infarmed.pt/portal/page/portal/infarmed/monitorizacao_do_mercado/comprovacao

_da_qualidade/controlo_laboratorial

7. European Pharmacopea. Edition 9th, Council of Europe. 2017.

8. Ratajczak M, Kubicka MM, Kamińska D, Sawicka P, Długaszewska J. Microbiological quality

of non-sterile pharmaceutical products. Saudi Pharm J. 2015;23(3):303–7.

9. Inspection Guides - Microbiological Pharmaceutical Quality Control Labs (7/93). Office of

Regulatory Affairs. 2016

10. Mugoyela V, Mwambete KD. Microbial contamination of nonsterile pharmaceuticals in public

hospital settings. Ther Clin Risk Manag. 2010;6:443–8.

11. Fraser S.L. Enterococcal Infections: Background, Pathophysiology, Epidemiology. Medscape.

2016.

12. Marcus J. Zervos MD, Joseph W. Chow MD, Anne Chen MD, Robert R. Muder MD.

Enterococcus species. 2010.

13. Lim JY, Yoon J, Hovde CJ. A brief overview of Escherichia coli O157:H7 and its plasmid

O157. J Microbiol Biotechnol. 2010;20(1):5–14.

14. Johnson JR, Kuskowski MA, Menard M, Gajewski A, Xercavins M, Garau J. Similarity

between Human and Chicken Escherichia coli Isolates in Relation to Ciprofloxacin Resistance


65

Status. J Infect Dis. 2006;194(1):71–8.

15. Perfeito L, Fernandes L, Mota C, Gordo I. Adaptive Mutations in Bacteria: High Rate and

Small Effects. Science (80- ). 2007;317(5839):813–5.

16. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HLT. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol. Fevereiro

de 2004;2(2):123–40.

17. Su L-H, Chiu C-H. Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature. Chang

Gung Med J. 30(3):210–9.

18. Porwollik S, Boyd EF, Choy C, Cheng P, Florea L, Proctor E, et al. Characterization of

Salmonella enterica subspecies I genovars by use of microarrays. J Bacteriol. American

Society for Microbiology (ASM); 2004;186(17):5883–98.

19. Ralph A. G. Medical Microbiology. Em: Musher DM, editor. Medical Microbiology. 4.a ed.

University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.

20. Threlfall EJ. Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food-

and water-borne infections. FEMS Microbiol Rev. 2002;26(2):141–8.

21. Iglewski BH. Pseudomonas. Medical Microbiology. University of Texas Medical Branch at

Galveston; 1996.

22. Selina SC. Pseudomonas Infection: Background, Pathophysiology, Epidemiology [Internet].

2016 [citado 20 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://emedicine.medscape.com/article/970904-overview#showall

23. Becker K, Eiff C. Staphylococcus, Micrococcus, and Other Catalase-Positive Cocci.

Bacteriology. 2009. 308–30.

24. Över U, Tüç Y, Söyletir G. Catalase-negative Staphylococcus aureus: a rare isolate of human

infection. Eur Soc Clin Infect Dis. 2000;6:681–2.

25. Schleifer KH, Kloos WE. Isolation and characterization of staphylococci from human skin. I.

Amended descriptions of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus and

descriptions of three new species: Staphylococcus cohnii, Staphylococcus haemolyticus, and .

IntJSystBacteriol. 1975;25(1):50–61.

26. Polgreen PM, Herwaldt LA. Staphylococcus aureus colonization and nosocomial infections:

Implications for prevention. Curr Infect Dis Rep. 2004;6(6):435–41.

27. Chow JW. Staphylococcus aureus Nasal Carriage in Hemodialysis Patients. Arch Intern Med.

1989;149(6):1258.

28. Albrich WC, Harbarth S. Health-care workers: source, vector, or victim of MRSA? Lancet


66

Infect Dis. 2008;8(5):289–301.

29. Archer GL. Staphylococcus aureus  : A Well-Armed Pathogen. Clin Infect Dis. 1998;26:1179–

81.

30. Kloos WE, Schleifer KH. Simplified Scheme for Routine Identification of Human

Staphylococcus Speciesg. J Clin Microbiol. 1975;1(1):82–8.

31. Rupp ME, Soper DE, Archer ’ GL. Colonization of the Female Genital Tract with

Staphylococcus saprophyticus. J Clin Microbiol. 1992;30(11):2975–9.

32. Bieber L, Kahlmeter G. Staphylococcus lugdunensis in several niches of the normal skin flora.

Clin Microbiol Infect. 2010;16(4):385–8.

33. Hidron AI, Edwards JR, Patel J, Horan TC, Sievert DM, Pollock DA, et al. Antimicrobial‐

Resistant Pathogens Associated With Healthcare‐Associated Infections: Annual Summary of

Data Reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control

and Prevention, 2006–2007 •. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008;29(11):996–1011.

34. Preisner O, Guiomar R, Machado J, Menezes JC, Lopes JA. Application of fourier transform

infrared spectroscopy and chemometrics for differentiation of salmonella enterica serovar

enteritidis phage types. Appl Environ Microbiol. 2010;76(11):3538–44.

35. Becker K, Harmsen D, Mellmann A, Meier C, Schumann P, Peters G, et al. Development and

Evaluation of a Quality-Controlled Ribosomal Sequence Database for 16S Ribosomal DNA-

Based Identification of Staphylococcus Species Development and Evaluation of a Quality-

Controlled Ribosomal Sequence Database for 16S Ribosomal DNA-Based. J Clin Microbiol.

2004;42(11):4988–95.

36. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends

Mol Med. 2002;8(6):257–60.

37. Barghouthi SA. A universal method for the identification of bacteria based on general PCR

primers. Indian J Microbiol. Springer; 2011;51(4):430–44.

38. Woods DF, Reen FJ, Gilroy D, Buckley J, Frye JG, Boyd EF. Rapid Multiplex PCR and Real-

Time TaqMan PCR Assays for Detection of Salmonella enterica and the Highly Virulent

Serovars Choleraesuis and Paratyphi C. J Clin Microbiol. 2008;46(12):4018–22.

39. BioMérieux. API® / ID 32 - A referência - bioMérieux Portugal, Lda. [Internet]. Obtido de:

http://www.biomerieux.pt/servlet/srt/bio/portugal/dynPage?open=PTG_IND_BPA_PRD&doc=

PTG_IND_BPA_PRD_G_PRD_NDY_9&pubparams.sform=2&lang=pt

40. Juang D-F, Morgan JM. The applicability of the API 20E and API Rapid NFT systems for the

identification of bacteria from activated sludge. EJB Electron J Biotechnol. 2001;4(1):717–


67

3458.

41. BioMerieux. VITEK® 2 Compact | bioMérieux Industry website [Internet]. p. 1. BioMerieux.

VITEK® 2 Compact | bioMérieux Indus. Obtido de: http://www.biomerieux-

industry.com/cosmetics/vitekr-2-compact

42. Pincus dh. Microbial identification using the biomérieux VITEK ® 2 SYSTEM VITEK 2 and

VITEK 2 XL. :1–32.

43. BioMérieux. MALDI-TOF Mass Spectrometry | bioMérieux Corporate Website [Internet].

Obtido de: http://www.biomerieux.com/en/maldi-tof-mass-spectrometry

44. Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti J-L, et al. MALDI-TOF mass

spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin

Biochem. 2011;44(1):104–9.

45. Jarvis RM, Goodacre R. Discrimination of Bacteria Using Surface-Enhanced Raman

Spectroscopy. Anal Chem. 2004;76(1):40–7.

46. Hamasha KM. Raman spectroscopy for the microbiological characterization and identification

of medically relevant bacteria. 2011.

47. Kaiser optical systems inc. Raman Spectroscopy - A Tutorial [Internet]. [citado 26 de Outubro

de 2016]. Obtido de: http://www.kosi.com/na_en/products/raman-spectroscopy/raman-

technical-resources/raman-tutorial.php

48. Instruments P. Raman Spectroscopy Basics - Application Note. :1–5.

49. Schmid T, Sebesta A, Stadler J, Opilik L, Balabin RM, Zenobi R. Tip-enhanced Raman

spectroscopy and related techniques in studies of biological materials. Em: Dubowski JJ,

Geohegan DB, Träger F. 2010.

50. Ilharco LM, Garcia AR, Lopes LMF, Brito de Barros R, Júlio MF, Morais J. Espectroscopia:

Para além do que os nossos olhos vêem. Ingenium. 2015;147:42–3.

51. Ilharco LM. Espectroscopia de Infravermelho uma Técnica Antiga, Sempre Actual. 1998. 34-

45.

52. Davis R, Mauer LJ. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy: a rapid tool for detection

and analysis of foodborne pathogenic bacteria. Curr Res Technol Educ Top. 2010;2(1):1582–

94.

53. Bellisola G, Sorio C. Infrared spectroscopy and microscopy in cancer research and diagnosis.

Am J Cancer Res. e-Century Publishing Corporation; 2012;2(1):1–21.

54. Patrícia Coutinho C, Sá-Correia I, Almeida Lopes J. Use of Fourier transform infrared


68

spectroscopy and chemometrics to discriminate clinical isolates of bacteria of the Burkholderia

cepacia complex from different species and ribopatterns. Anal Bioanal Chem. 2009;

394(8):2161–71.

55. Irudayaraj J, Yang H, Sakhamuri S. Differentiation and detection of microorganisms using

fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy. J Mol Struct. 2002;606(1–3):181–8.

56. PerkinElmer. FT-IR Spectroscopy ATR. [Internet]. [citado 13 de Outubro de 2016] Obtido de:

https://shop.perkinelmer.com/Content/technicalinfo/tch_atraccessories .

57. Atitar MF, Belhadj H, Dillert R, Bahnem DW. The Relevance of ATR-FTIR Spectroscopy in

Semiconductor Photocatalysis. Em: Emerging Pollutants in the Environment - Current and

Further Implications. InTech; 2015; 202-227.

58. Sousa C, Grosso F, Meirinhos-Soares L, Peixe L, Lopes J. Identification of carbapenem-

resistant Acinetobacter baumannii clones using infrared spectroscopy. J Biophotonics.

2014;7(5):287–94.

59. Carlos C, Maretto DA, Poppi RJ, Sato MIZ, Ottoboni LMM. Fourier transform infrared

microspectroscopy as a bacterial source tracking tool to discriminate fecal E. coli strains.

Microchem J. 2011;99(1):15–9.

60. Naumann D. Infrared and NIR Raman spectroscopy in medical microbiology. Mantsch HH,

Jackson M. 1998

61. Naumann D. Infrared Spectroscopy in Microbiology. Encycl Anal Chem. 2000;102–31.

62. Ngo-Thi NA, Kirschner C, Naumann D. Characterization and identification of microorganisms

by FT-IR microspectrometry. J Mol Struct. 2003;661–662(1–3):371–80.

63. Miranda M. Aplicação de Espectroscopia de FT-IR para a Serotipagem e Avaliação da

Susceptibilidade à Penicilina em Streptococcus pneumoniae. 2008.

64. Kardas M, Gozen AG, Severcan F. FTIR spectroscopy offers hints towards widespread

molecular changes in cobalt-acclimated freshwater bacteria. Aquat Toxicol. 2014;155; 15–23.

65. Lavine B, Workman J. Chemometrics. Anal Chem. 2008;80(12):4519–31.

66. Difoggio R. Guidelines for Applying Chemometrics to Spectra: Feasibility and Error

Propagation. Appl Spectrosc Vol 54, Issue 3, pp 94A-113A. Society for Applied Spectroscopy;

2000;54(3):94A–113A.

67. Goodacre R. Explanatory analysis of spectroscopic data using machine learning of simple,

interpretable rules. Vib Spectrosc. 2003;32:33–45.

68. Siesler HW. Near-infrared spectroscopy  : principles, instruments, applications. Wiley-VCH;


69

2002. 348.

69. Varmuza K, Filzmoser P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics.

CRC Press. 2009. 35-37.

70. Osborne BG, Osborne, G. B. Near-Infrared Spectroscopy in Food Analysis. Encyclopedia of

Analytical Chemistry. 2000.

71. Eigenvector. Advanced Preprocessing: Sample Normalization - Eigenvector Documentation

Wiki [Internet]. [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Advanced_Preprocessing:_Sample_Normalization

#SNV_.28Standard_Normal_Variate.29

72. Naes T, Isaksson T, Fearn T, Davies T. A user friendly guide to Multivariate Calibration and

Classification. NIR Publications. 2002.

73. Wise BM, Gallagher NB, Bro R, Shaver JM, Windig W, Koch RS. PLS_Toolbox Version 4.0

for use with MATLAB TM. 2006. 1-414 .

74. European Pharmacopeia. Chemometric methods applied to analytical data. Edition 9th, Council

of Europe. 2017.

75. Worley B, Halouska S, Powers R. Utilities for quantifying separation in PCA/PLS-DA scores

plots. Anal Biochem. 2013;433(2):102–4.

76. Eigenvector. PLSDA [Internet]. 2016 [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Plsda

77. CAMO Software AS. PLS-DA [Internet]. 2016 [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://www.camo.com/resources/pls-da.html

78. Gromski PS, Muhamadali H, Ellis DI, Xu Y, Correa E, Turner ML, et al. Metabolomics and

partial least squares-discriminant analysis - a marriage of convenience or a shotgun wedding.

Anal Chim Acta. 2015;879:10–23.

79. Wenning M, Scherer S. Identification of microorganisms by FTIR spectroscopy  : perspectives

and limitations of the method. Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97:7111–20.

80. Lamprell H, Mazerolles G, Kodjo A, Chamba JF, Noël Y, Beuvier E. Discrimination of

Staphylococcus aureus strains from different species of Staphylococcus using Fourier

transform infrared (FTIR) spectroscopy. Int J Food Microbiol. 2006;108(1):125–9.

81. Sousa C, Silva L, Grosso F, Lopes J, Peixe L. Development of a FTIR-ATR based model for

typing clinically relevant Acinetobacter baumannii clones belonging to ST98, ST103, ST208

and ST218. J Photochem Photobiol B Biol. 2014;133:108–14.


70

82. Oust Janbu A, Møretrø T, Bertrand D, Kohler A. FT-IR microspectroscopy: a promising

method for the rapid identification of Listeria species. Fed Eur Microbiol Soc. 2007;278:164–

70.

83. Amiali NM, Golding GR, Sedman J, Simor AE, Ismail AA. Rapid identification of

community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Fourier transform

infrared spectroscopy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011;70(2):157–66.

84. Bosch A, Golowczyc MA, Abraham AG, Garrote GL, De Antoni GL, Yantorno O. Rapid

discrimination of lactobacilli isolated from kefir grains by FT-IR spectroscopy. Int J Food

Microbiol. 2006;111(3):280–7.

85. Bounphanmy S, Thammathaworn S, Thanee N, Pirapathrungsuriya K, Beardall J, McNaughton

D, et al. Discrimination of cyanobacterial strains isolated from saline soils in Nakhon

Ratchasima, Thailand using attenuated total reflectance FTIR spectroscopy. J Biophotonics.

2010;3(8–9):534–41.

86. Garon D, El Kaddoumi A, Carayon A, Amiel C. FT-IR Spectroscopy for Rapid Differentiation

of Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus and Characterization of

Aflatoxigenic Isolates Collected from Agricultural Environments. Mycopathologia.

2010;170(2):131–42.

87. Grunert T, Wenning M, Barbagelata MS, Fricker M, Sordelli DO, Buzzola FR, et al. Rapid and

Reliable Identification of Staphylococcus aureus Capsular Serotypes by Means of Artificial

Neural Network-Assisted Fourier Transform Infrared Spectroscopy. J Clin Microbiol.

2013;51(7):2261–6.

88. Kuhm AE, Suter D, Felleisen R, Rau J. Identification of Yersinia enterocolitica at the species

and subspecies levels by Fourier transform infrared spectroscopy. Appl Environ Microbiol.

American Society for Microbiology. 2009;75(18):5809–13.

89. Al-Holy MA, Lin M, Al-Qadiri H, Cavinato AG, Rasco BA. Classification of foodborne

pathogens by fourier transform infrared spectroscopy and pattern recognition techniques. J

Rapid Methods Autom Microbiol. 2006;14(2):189–200.

90. Biomérieux. BioBall® - Amostras de referência precisas para controlo de qualidade

quantitativo [Internet]. [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de:

http://www.biomerieux.pt/servlet/srt/bio/portugal/dynPage?open=PTG_IND_BPA_PRD&doc=

PTG_IND_BPA_PRD_G_PRD_NDY_13&crptprm=ZmlsdGVyPQ==

91. Kaufman L, Rousseeuw PJ. Finding Groups in Data: An Introduction to Cluster Analysis.

Wiley-Interscience. 2005. 368.

92. Eigenvector. Using Cross-Validation - Eigenvector Documentation Wiki [Internet]. [citado 26


71

de Dezembro de 2016]. Obtido de: http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Using_Cross-

Validation#Contiguous_Blocks

93. Sousa C, Novais Â, Magalhães A, Lopes J, Peixe L. Diverse high-risk B2 and D Escherichia

coli clones depicted by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Sci Rep. 2013;3:3278.

94. Davis R, Mauer L. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy: a rapid tool for detection

and analysis of foodborne pathogenic bacteria. Curr Res Technol Educ Top. 2010;(1):1582–94.

95. Ghebremedhin B, Layer F, König W, König B. Genetic classification and distinguishing of

Staphylococcus species based on different partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf

gene sequences. J Clin Microbiol. 2008;46(3):1019–25.

96. Solberg R, Escobar J, Arduini A, Torres-Cuevas I, Lahoz A, Sastre J, et al. Metabolomic

Analysis of the Effect of Postnatal Hypoxia on the Retina in a Newly Born Piglet Model.

Bundy JG, editor. PLoS One. Public Library of Science. 2013;8(6):66540.

97. Cohen NR, Lobritz MA, Collins JJ. Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell

Host Microbe. NIH Public Access. 2013;13(6):632–42.


72

Anexos

Anexo 1: Diferenciação das espécies de Staphylococcus através das suas características biológicas e bioquímicas (23).


73

Anexo 2: Resultado do VITEK para uma amostra padrão de S. aureus.

deteÇÃo e identificaÇÃo rÁpidas dos principais ......espécies do género staphylococcus....

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