deteccion molecular de virus de post larvas de camaron blanco
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REPORTE
DETECCION MOLECULAR DE
VIRUS DE POSTLARVAS DE
CAMARON BLANCO (Litopenaeus
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ALUMNA: Isela Elizabeth Rangel Ventura
Miércoles, 24 de marzo de 2011.
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INTRODUCCION
El camarón ha sido uno de los recursos más apreciados desde la
antigüedad constituyendo una fuente importante de ingresos y empleos en el
ámbito mundial (López, 2006). Litopenaeus vannamei, es una especie
originaria del océano Pacífico, del este de Sonora hasta el norte de Perú;
siendo cultivado a gran escala en México desde 1980 y como consecuencia del
crecimiento de la industria camaronícola han surgido empresas dedicadas a la
producción de larvas para sustituir las de origen silvestre y mejorar el
desempeño productivo (Castillo J., 2008). A pesar de ello se han presentado
obstáculos en el desarrollo bajo una serie de circunstancias causando grandes
pérdidas por efecto de enfermedades virales (Velásquez P., 2004), a nivel
mundial se han descrito alrededor de 15 virus como agentes infecciosos, de
éstos, ocho han provocado las epizootia mas devastadoras: el Virus de la
Necrosis Infecciosa Hematopoyética e Hipodérmica (IHHNV), el Virus
Hematopancreático (HPV), el Virus de la Nucleosis Poliédrica de Litopenaeus
vannamei (PySNPV o Virus tipo BP), el Virus de la Necrosis de Glándulas
Digestivas (BMN), el Virus del Síndrome de Taura (TSV), el Virus de la Cabeza
Amarilla (YHV) y el Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV). Siendo
este ultimo el que mas ha impactado en pérdidas económicas.
En la década pasada, se reportó la presencia del virus causante del
IHHNV en poblaciones de L. stylirostris, F. californiensis y L. vannamei
colectados en el Golfo de California y en el estado de Nayarit (Morales-
Covarrubias y Chávez-Sánchez, 1999). En el Golfo de California, la
prevalencia de este virus alcanzó un 46% en la parte Norte y un 26% en la
porción Media-Sur por lo que se sugiere tiene una amplia distribución en la
región y probablemente esté plenamente establecido en poblaciones de
camarón silvestre (Pantoja, et al., 1999). El virus también ha sido detectado en
el estado de Nayarit, con un rango de prevalencia del 44.64 al 46.42% en
adultos capturados en el medio silvestre con fines de reproducción en criaderos
para acuacultura (Morales-Covarrubias y Chávez-Sánchez, 1999).
Recientemente, se reportó una investigación coordinada por el Instituto
Nacional de Pesca, en donde se determinó la prevalencia y distribución de
enfermedades en camarones silvestres y cultivados en el Golfo de México. Los
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resultados de este estudio señalan la presencia de algunas de las
enfermedades con baja incidencia, particularmente, se detectó la presencia del
virus IHHNV con baja prevalencia en poblaciones silvestres de L. setiferus, F.
aztecus y F. duorarum en Tamaulipas y Campeche, así como en L. vannamei
cultivado en Tamaulipas y Yucatán (Hernández-Martínez, et al., 1999).
El diagnóstico de los virus se ha realizado tradicionalmente empleando
técnicas histopatológicas a través de cortes histológicos en muestras incluidas
en parafina y la inclusión de estos organismos en parafina ha permitido llevar
un registro histórico de las muestras. Modernamente, se han implementado
sistemas comerciales para el diagnóstico de virus, utilizando métodos
moleculares como la amplificación por la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) a partir de muestras frescas de camarones, ya que aumentan
significativamente el nivel de sensibilidad y detección de dichos agentes
infecciosos. Sin embargo, aún existen muchas colecciones biológicas y
particularmente histológicas que en su momento no fueron analizadas
mediante las nuevas técnicas moleculares, que podrían aportar datos para su
análisis histórico y para construir modelos epidemiológicos de la enfermedad
(López, 2006). La limitación más importante para analizar estas colecciones a
nivel molecular, es la adecuada recuperación del ADN a partir de las
preparaciones incluidas en parafina. Reportes previos, utilizando muestras
histológicas de otros organismos, han demostrado que se necesitan tiempos
muy largos de extracción y el rendimiento de ADN es muy bajo (Cawkwell y
Quirke, 2000).
A nivel mundial, dentro de los países compradores de camarón se
encuentran: E.U.A., Unión Europea y Japón; y las mayores pérdidas
internacionales se registran en los 90´s por enfermedades virales siendo
afectados los principales países productores como Ecuador a causa del
Síndrome de la Mancha Blanca y el Virus del Síndrome de Taura; México
también fue afectado fuertemente a finales de los 80 e inicios de los 90 por
Virus de Necrosis Infecciosa Hematopoyética e Hipodermal (IHHNV) dejando
pérdidas de 25 millones de dólares y en el 2000 se ve nuevamente afectado
por otros virus, el Síndrome de Taura y el Síndrome de la Mancha Blanca
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produciendo una pérdida de 300 millones de dólares (Velásquez P., 2004) y
TSV a mediados de los 90´s hasta la fecha.
Las especies más importantes a nivel comercial mundial son las
pertenecientes a la familia Penaeidae: Penaeus monodon, Fenneropenaeus
orientalis, F. chinensis, y Litopenaeus vannamei las cuales representan hasta
un 80% de la producción mundial de camarón (López, 2006). En México, la
camaronicultura ha sobrepasado el cultivo por pesquerías registrándose la
mayor producción en los estados del noroeste de México (Sonora, Sinaloa y
Nayarit).
El IHHNV es un virus de ADN pequeño con un diámetro aproximado de 22 μm
que afecta a las etapas postlarvales y juveniles de los camarones peneidos
(Lightner, 1996), este virus es de origen Indo-Pacífico pero ahora se distribuye
extensamente en todo el mundo. Este virus que causa altas mortalidades en
Litopenaeus stylirostris y el síndrome de la deformidad del rostro (RDS) en L.
vannamei, así como infecta a otras poblaciones de peneidos en el Pacífico y de
otras regiones. De acuerdo a su morfología y características bioquímicas, el
IHHNV pertenece taxonómicamente a la familia Parvoviridae, siendo el virus
más pequeño (22 nm de diámetro) con cadena simple de ADN que afecta a los
camarones peneidos. Su secuencia de 4075 pares de bases lo presenta como
uno de los virus de menor tamaño conocido.
En camarones de la especie L. vannamei, el virus se presenta como un
agente de enfermedad crónica, sin ocasionar grandes mortalidades, pero
produce el síndrome del enanismo (Runt Deformity Syndrome o RDS por sus
siglas en inglés), el cual es caracterizado por una gran variedad de
deformidades cuticulares y una reducción en la tasa de crecimiento
(Kalagayan, et al., 1991). Este virus puede causar un noventa por ciento de
mortalidad acumulada y los ejemplares que sobreviven son portadores de la
enfermedad y pueden transmitirla horizontalmente (por ingestión de las heces o
por eventos de canibalismo) o verticalmente (en el genoma de los gametos).
Para México, este virus se presume enzoótico en poblaciones silvestres de
camarones del Pacífico y se sospecha su posible presencia en camarones
silvestres del Golfo de México, ya que L. setiferus, F. aztecus y F. duorarum
han sido susceptibles en infecciones experimentales (Lightner, 1996).
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La enfermedad del WSSV es ocasionada por un baculovirus de ADN de
cadena lineal que mide 80 x 270 μm con una envoltura de entre 58-67 x 330-
350 μm. Respecto a los factores del agente, cuenta con una estabilidad que se
inactiva en <120 minutos a 50°C y <1 minuto a 60°C (49); es viable durante al
menos 30 días a 30°C en agua marina bajo condiciones de laboratorio (46); y
es viable en estanques durante al menos 3–4 días. Su ciclo de replicación en
estudios in-vitro con cultivos de células primarias y estudios in-vivo con
postlarvas muestran que es de aproximadamente 20 horas a 25°C. Y en
referencia a los factores del hospedero le afecta en todas las etapas de la vida,
desde los huevos a los reproductores, siendo los camarones de los más
susceptibles a este patógeno en órganos y tejidos infectados: tejidos
ectodérmicos y mesodérmicos, especialmente el epitelio cuticular y los tejidos
conjuntivos subcuticulares. Siendo comunes las infecciones persistentes y se
han hallado infecciones de por vida. En infecciones persistentes las cargas
víricas pueden ser extremadamente bajas y potencialmente indetectables por
las pruebas de diagnóstico disponibles (OIE, 2006).
Esta enfermedad afecta principalmente y de manera natural a P.
monodon, pero es capaz de infectar a casi cualquier decápodo en todos sus
estadios de vida (Wang, et al., 1998). Los primeros reportes de esta
enfermedad se originaron en el Este de Asia en 1992 y actualmente el virus se
ha extendido rápidamente en áreas del Sur de Asia, Asia Central y en América
Latina, hallándose tanto en poblaciones silvestres como en cultivos de camarón
(Numan, 1998). Los principales signos de la enfermedad se caracterizan por la
aparición de manchas blancas cuticulares muy distintivas, un letargo muy
generalizado, una disminución en la tasa de alimentación y la decoloración del
hepatopáncreas. Sin embargo, la enfermedad puede estar latente y de forma
asintomática. Los signos de esta enfermedad se han observado principalmente
en camarones crecidos en granjas de cultivo, donde puede causar una
mortalidad de hasta el 100% en un período mínimo de tres a diez días
(Lightner, 1996; Ponce y Olmos, 2000). En México, este virus fue introducido
desde el 2002 en el pacífico mexicano en donde año con año causa severas
pérdidas a la camaronicultura (Maldonado, et al., 2004). Para el 2003 ya se
habían publicado investigaciones en el estado de Sinaloa por parte del CIAD
con fines de observar su comportamiento en relación a las condiciones del
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estado; estableciéndose que el estado de Sinaloa cuenta con buenos recursos
naturales en cuanto a las especies endémicas cultivables y los sistemas
acuáticos para llevar a cabo los cultivos por la buena ubicación geográfica
(contemplando buen clima, franja costera, sistemas estuarios y sistemas
lagunares), así como centros de investigación y servicios conexos; sin
embrago, se establece que el factor determinante de la entrada del WSSV es
debido al deterioro de la calidad del agua en los cuerpos abastecedores,
destaque también la importancia de las características del hospedero (aspectos
genéticos, sexo, edad, susceptibilidad, etc.), las características del virus
(patogenicidad, virulencia y vectores potenciales), factores ambientales y
nutricionales y/o estresantes, y por ende, la relación patógenos hospedero. La
distribución del WSSV en Sinaloa va desde el norte, centro y sur del estado en
zona costera, por desarrollo de la actividad, las zonas centro y norte han sido
las mas afectadas siendo a la vez detectada en poblaciones silvestres y
cultivadas (Leobardo Montoya R., 2003).
Los métodos de diagnóstico para esta enfermedad van desde diagnóstico de
campo en el que los síntomas generales se basan en la presencia de manchas
blancas bajo la cutícula y marcado cambio de color con predominio de
langostinos decolorados, disminución del consumo alimenticio, aumento de la
letargia, desplazamientos de los langostinos moribundos hacia la superficie y
los bordes del agua de los tanques o estanques, con la consiguiente aparición
de aves depredadoras. Los métodos clínicos basados en lesiones
macroscópicas, examen microscópico, preparaciones montadas mediante la
demostración de núcleos hipertróficos en preparaciones de aplastamientos de
branquias y/o epitelio cuticular, con y sin tinción. La demostración, mediante
microscopia de campo oscuro, de agregados de WSSV en preparaciones
montadas de hemolinfa sin tinción. Cortes fijados con demostración histológica
de cuerpos de inclusión patognomónicos en los tejidos diana. Hibridación in
situ: uso de sondas de ADN específicas para WSSV con cortes de tejidos para
demostrar la presencia de ácidos nucleicos del WSSV en célula infectadas.
Inmunohistoquímica que cosiste en el uso de anticuerpos específicos para
WSSV con cortes de tejidos o preparaciones montadas para demostrar la
presencia de antígeno de WSSV en las células infectadas. Microscopía
electrónica: demostración del virus en cortes de tejidos o en preparaciones de
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virus semi-purificados (de hemolinfa, por ejemplo) (OIE, 2006). Una forma
convincente para prevenir la inducción de la enfermedad es por medio de
análisis previos a la muda del camarón ya que este proceso incrementa
mortalidad en postmuda favorecer a la propagación del virus, muchas
partículas virales ser.an liberadas con los exuvios, en tanto que los animales
blandos y debilitados ser.an presa f.cil de los animales sanos (Fundación
Cenaim – Espol, 2002).
El virus de la enfermedad de la cabeza amarilla (genotipo 1) (YHV) es
uno de los seis genotipos conocidos de virus del complejo de la cabeza
amarilla y es el único agente conocido de la enfermedad de la cabeza amarilla.
Se designa como genotipo 2 al virus asociado de la branquia (GAV). El GAV y
otros cuatro genotipos conocidos del complejo (los genotipos 3, 4, 5, 6) se
presentan generalmente en Penaeus monodon sanos del este de África, de
Asia y de Australia, y o bien no se asocia con la enfermedad o lo hace en raras
ocasiones. El YHV y otros genotipos del complejo de la cabeza amarilla son
clasificados por la Comisión Internacional para la Taxonomía de los Virus como
especies únicas del género Okavirus, de la familia Roniviridae, del orden de los
Nidovirales. Existe evidencia de la existencia de recombinación genética entre
los genotipos. La supervivencia fuera del hospedador: el YHV permanece
viable por un periodo de hasta 72 horas en aguas marinas oxigenadas. La
estabilidad del agente: el YHV puede inactivarse por calor a 60°C durante 15
minutos. Actualmente existe poca información sobre otros métodos de
inactivación pero parece que el virus es susceptible al tratamiento con cloro a
30 ppm. En su ciclo biológico no se han descrito infecciones por YHV con
multiplicidad alta en cultivos celulares. La infección con una multiplicidad
infectiva de 0,001 en cultivo celular del órgano linfoide primario indicó que se
obtiene un título vírico máximo 4 días después de la infección. Los signos
clínicos se presentan en P. monodon a los 7–10 días de la exposición. Los
signos clínicos del YHV puede infectar las gambas de cultivo desde las formas
postlarvarias en adelante, pero la mortalidad masiva generalmente aparece en
las formas juveniles tempranas y tardías. Excepcionalmente, puede darse una
gran actividad alimenticia seguida de un cese repentino de alimentación a los
2-4 días de la aparición de signos clínicos graves de la enfermedad y de
mortalidad. Las gambas moribundas pueden congregarse en los bordes de los
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estanques, cerca de la superficie. Las gambas moribundas pueden mostrar una
apariencia blanquecina en su conjunto y una decoloración amarillenta del
cefalotórax causada por el hepatopáncreas amarillo subyacente que puede
aparecer excepcionalmente blando cuando se compara con el hepatopáncreas
marrón de una gamba normal.
Como diagnósticos se pueden emplear una gran variedad de análisis, como
pueden ser preparaciones montadas: se fija la gamba entera o filamentos de
branquia con fijador de Davidson durante toda la noche. Después de la fijación,
se lavan bien varios filamentos de branquia con agua corriente para separar el
fijador y se tiñen con hematoxilina y eosina de Meyer (H&E) luego se añade
una gota de líquido de montaje y un cubreobjetos. Para muestras de brotes de
ECA, se observarán inclusiones citoplasmáticas, esféricas, teñidas de forma
uniforme, profundamente basófilas en cantidades moderadas o grandes
(aproximadamente 2 μm de diámetro o menores). Esta evidencia debe
utilizarse de forma conjunta con los resultados de frotis de hemolinfa a la hora
de hacer el diagnóstico presuntivo de un brote de ECA. Por lo que respecta a
los tejidos fijados y los filamentos en xileno, estos portas con preparaciones
completas pueden conservarse como registros permanentes. También se
emplean métodos como microscopía electrónica de transmisión (MET),
Detección por inmunotransferrencia y técnicas moleculares: Reacción en
cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR); en este último
método se describen tres métodos de RT-PCR. El primer protocolo es la RT-
PCR simple adaptada de Wongteerasupaya et. al. que puede utilizarse para la
confirmación de YHV en gambas recogidas en zonas en las que se sospecha
que hay un brote de YHV, no de GAV ni de otros genotipos. El segundo
protocolo es una PCR anidada de transcripción inversa múltiple, más sensible,
que se ha adaptado de Cowley et. al.. Puede utilizarse para la detección
diferenciada de YHV y de GAV en gambas afectadas por brotes de la
enfermedad o para el análisis de portadores sanos. Con esta prueba no se
detectarán todos los genotipos conocidos del complejo “cabeza amarilla”, y el
genotipo 3 puede reaccionar como GAV. El tercer protocolo consiste en una
PCR de transcripción inversa anidada proporcionada por Wijegoonawardane,
Cowley & Walker (no publicada). Esta prueba se puede utilizar para el detectar
virus de la familia cabeza amarilla en gambas sanas. Con ella se pueden
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detectar los seis genotipos conocidos en la actualidad (incluidos el YHV y el
GAV) pero no sirve para establecer diferencias entre genotipos. La
especificación del genotipo se puede lograr mediante análisis del producto
PCR-RT en secuencias de nucleótidos (OIE, 2006).
El síndrome de taura (TSV) surgió en América del Sur y afecta a la
principal especie Litopenaeus vannamei constituyendo una epizootia en los
países que ha alcanzado mortalidades de hasta el 90% de la producción.
Desde su reconocimiento en 1992, proveniente de camarones infectados de
granjas camaroneras ubicadas cerca de la desembocadura del río Taura,
Ecuador, su propagación entre los cultivos comerciales de ambos hemisferios y
ha otros continentes ha sido rápida. Quizá la mayor preocupación para los
países asiáticos que ya importaron o pretenden importar P. vannamei es la
posibilidad de introducir TSV. A pesar de los trabajos originales sugiriendo que
el síndrome de Taura (TSV) fue causado por un pesticida tóxico, es ahora
conocido que una cepa o quizá varias cepas cercanamente relacionadas
(mutaciones) del virus del síndrome de Taura (TSV) son los responsables de la
pandemia de TS en América. TSV es un virus de una cadena simple de RNA y
por lo tanto, susceptible a mutaciones, causando mayor preocupación y está
cercanamente relacionado a otros virus de insectos. El síndrome de Taura
causó serias pérdidas en los ingresos a toda Latino América en la década de
los noventa. Se ha sugerido que el TSV fue la causa directa de la pérdida
(debido a la mortalidad del camarón) de 1–1,3 miles de millones de dólares
EE.UU. durante los primeros tres años. Sin embargo, las pérdidas indirectas
debido a las pérdidas en ventas, incrementos en el costo de la siembra y
restricciones en el comercio regional fueron, probablemente, más altas.
Desafortunadamente, los mecanismos de diseminación de TSV aún son
inciertos, aunque las teorías iniciales se concentraron en que la diseminación
entre granjas fue a través de larvas y reproductores contaminados. Escasa
información ha demostrado que TSV fue introducido a Colombia y Brasil a
través de reproductores contaminados provenientes de Hawai. Estos
reproductores no fueron probados para TSV puesto que aún no se conocía que
el síndrome de Taura tuviera un origen viral. Estos casos demuestran, una vez
más, que muchos de los problemas involucran el movimiento transfronterizo de
animales; aún suponiendo que éstos son SPF. Recientes investigaciones han
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demostrado que los mecanismos de transferencia pueden ser a través de
insectos y de aves, las cuales tienen más probabilidad de ser la ruta de
infección. TSV ha sido encontrado algunas veces en pruebas biológicas del
tejido del patinador de agua (Trichocorixa reticulata), un insecto estuarino
común de distribución mundial cuyos extractos conteniendo virus han
demostrado inducir infecciones en P. vannamei SPF, en condiciones de
laboratorio. Patrones de diseminación y mortalidad de P. vannamei en Texas
han sugerido también que la ingestión de insectos infectados es un mecanismo
probable de diseminación del TSV. El virus del síndrome de Taura tiende a
infectar camarones juveniles de entre dos y cuatro semanas de tanques o
estanques sembrados (0,1–1,5 g de peso corporal) y tiene gran ocurrencia
dentro del período de un solo ciclo de muda. En la fase aguda de la
enfermedad, durante la premuda, los camarones están débiles y con
caparazones blandos, tienen los tractos digestivos vacíos y una expansión
difusa de los cromatóforos rojos, particularmente en la cola (por lo que su
nombre común-es enfermedad de la cola roja). Estos animales usualmente
morirán durante la muda (5–-95 por ciento), aunque las razones de esta gran
variabilidad en la tasa de sobrevivencia se mantienen desconocida; se sabe
que los camarones adultos son más resistentes que los juveniles. Los
camarones que sobreviven mostrarán signos de recuperación y entran en una
fase crónica de la enfermedad. Estos camarones mostrarán múltiples lesiones
melanisadas, con manchas irregulares distribuidas azarosamente en la
cutícula. Estas lesiones macroscópicas y microscópicas persistirán, pero
pueden perderse durante la muda después de lo cual el camarón parecerá
normal en apariencia y comportamiento. Sin embargo, aunque el camarón
puede ser resistente a una infección recurrente, éstos frecuentemente se
mantendrán como portadores crónicos asintomáticos de TSV de por vida
(Briggs M., et. al., 2005). El TSV llega a afectar a la glándula de la antena,
organohematopoyético, hepatopáncreas, epitelio intestinal, especialmente de
las cecas anterior y posterior. Las partículas virales pueden sobrevivir fuera de
la célula hospedera conservando su patogenicidad a temperaturas entre 0°
hasta los 120°C y en el agua contaminada puede permanecer activo hasta 14
días. El principal mecanismo de infección es horizontal al comer el camarón
sano restos de animales infectados o alimento contaminado. El TSV ataca a
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postlarvas, juveniles y adultos, siendo las fases larvarias las más afectadas, lo
que generalmente ocurre entre los 14 a los 40 días postlarva generándose
elevadas mortalidades (Aguado G., et. al., 2008).
Métodos histológicos y moleculares pueden ser usados para la detección,
diagnosis y vigilancia, aunque ensayos de hibridización in situ con sondas
específicas de ADN aplicados a cortes en parafina actualmente proveen una
excelente prueba de diagnóstico certero de este virus (sitio Web de la OIE).
Pruebas de RT-RCP pueden también ser usadas con ventaja en tamaños de
muestras grandes y en muestreos no letales en reproductores. Adicionalmente,
bio-ensayos en camarones vivos y métodos serológicos con anticuerpos
monoclonales, pueden ser también usados en el diagnóstico de infecciones con
TSV (Briggs M., et. al., 2005). El agente etiológico del TSV es un virus con una
sola cadena de ARN, perteneciente a la familia Discistroviridae, género
Cripavirus. Este virus invade y se replica en el citoplasma de las células
epiteliales de la epidermis del exoesqueleto y epidermis cuticular de branquias,
intestino anterior (esófago, estómago) y del intestino posterior. Los síntomas de
la fase aguda son: expansión de cromatóforos rojos y necrosis epitelial en
apéndices; mientras que los organismos de fase crónica pueden exhibir
lesiones cuticulares y expansión de los cromatóforos rojos. Los ejemplares que
sobreviven son portadores y pueden transmitirla horizontal y verticalmente la
enfermedad. En los estados de Sonora, Sinaloa, Chiapas y Guerrero se han
reportado brotes de la enfermedad con pérdidas de hasta el 100% (Rodríguez
G. et. al., 2001).
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JUSTIFICACION
El cultivo de camarón en México se inicio en 1985, incrementándose el
área y la producción en los últimos años. La camaronicultura en nuestro país
ha dependido de la captura aleatoria de reproductores silvestres para la
producción de larvas y su posterior engorda a talla comercial, esto ha dado
como resultado una gran variabilidad en la producción anual debido a que se
capturan reproductores enfermos, a la variación en la calidad de las diferentes
poblaciones (stocks), y la disponibilidad misma de reproductores durante el
año. La existencia de patógenos causales de enfermedades en los organismos
acuáticos cultivados requiere disponer de métodos de prueba adecuados que
permitan una identificación oportuna de diagnóstico en el caso de que se
presenten brotes o mortalidades en una granja al seguís los procedimientos de
certificació y calidad de la producción, así como en los ejemplares capturados
del medio natural que son utilizados en la producción (Lightner, D., et. al.,
2011). Así mismo, se reporta la presencia de ejemplares “portadores”, en los
que al no presentar signos visibles de la enfermedad, representan un riesgo
para los productores, cuando se importan, exportan o movilizan. Las
enfermedades en organismos acuáticos se dividen en “Enfermedades
Certificables”, que son aquéllas de las que actualmente no se dispone de
tratamiento alguno para su control; las “Enfermedades Notificables”, en las
cuales los patógenos causales de enfermedad son susceptibles de ser
controlados mediante la aplicación de algún medicamento o sustancia química
para su tratamiento, sin embargo, su presencia puede reportar mortalidades de
hasta el 100% y su control requiere de largos y costosos tratamientos, y las
“Enfermedades Comunes”, es decir las causadas por parásitos en los que su
control se puede realizar teniendo con monitoreos continuos de la calidad del
agua, o con algún tratamiento, pero de cualquier manera es necesario
identificar con precisión cual es este agente causal, evitando de esta manera
problemas posteriores como una resistencia que complique en el futuro su
tratamiento (Rodríguez G., et. al., 2001). En base a ello, los estudios en
México, sobre las enfermedades de los camarones en granja son recientes, en
especial las enfermedades virales. Existen 30 virus conocidos, de los cuales a
cuatro se les reconoce actualmente por tener un marcado impacto negativo en
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los laboratorios y granjas de camarón, siendo estos IHHNV (Infectious
Hypodemic and Hematopopietic Necrosis Virus), TSV (Taura Syndrome Virus)
y WSSV (White Spot Syndrome Virus); a diferencia, el Yelow Head Virus (YHV)
se encuentra en proceso de evaluación. Debido a que Litopenaeus vannamei
es afectado por estos patógenos virales como factores limitantes más
importantes de la camaronicultura se ha optado por la evaluación de estos
patógenos en el presente estudio, así como por la cuestión preventiva al inicio
del cultivo de las postlarvas en los estanques ya que según Fredi Cárdenas, el
propietario de la granja a estudiar, no realizan los análisis debidos de acuerdo a
las normas establecidas.
OBJETIVO GENEAL
Evaluación de las principales enfermedades varales de la región en
camarón blanco (Litipenaeus vannamei) de la Granja Costas del Mar de Cortéz
como prevención a los principales virus patogénicos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar la presencia o ausencia de WSSV en postlarvas de
Litipenaeus vannamei.
Determinar la presencia o ausencia de TSV en postlarvas de Litipenaeus
vannamei.
Determinar la presencia o ausencia de IHHNV en postlarvas de
Litipenaeus vannamei.
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METODOLOGIA
EXTRACCIÓN DE ADN DE POSTLARVAS DE CAMARÓN
La extracción de ADN se realizó mediante el uso del kit comercial DNAzol
(Invitrogen®) basado en el siguiente procedimiento: Se colocó en un tubo
eppendorf de 1500µl 10 ejemplares de postlarvas de camarón por cada pool,
enseguida se añadió 500 µl de DNAzol y se macera con un con un pistilo
manual, se pasa a centrifugación a 10,000 rpm por 10 minutos, posteriormente
se transfieren 350 µl del sobrenadante a otro tubo eppendorf de 1500 µl. Se le
añaden 150 µl de etanol al 100% (Frío -20°C) y se mezcla por inversión para
incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente y centrifugar 6000 rpm por 2
minutos tirando el sobrenadante. Posteriormente, a la muestra se le adicionan
150 µl de etanol al 75% (Frío -20°C) y se agita por inversión pasando a la
centrifuga a 13000 rpm por 2 minutos y se decanta el etanol dejando secar la
pastilla con el ADN a temperatura ambiente. Finalmente se resuspende la
pastilla en 30 µl de agua ultrapura y se almacena a -20 °C para su análisis.
En el caso de los ejemplares adultos, se tomó parte del tejido del organismo
siguiendo la misma metodología descrita anteriormente.
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
La preparación del gel de agarosa (0.8%, 30 mL) requiere de la adiciónr
de 0.24 g de agarosa en 30 mL de TAE 1X, los cuales son mezclados
suavemente y calentados hasta disolver completamente (es conveniente evitar
sobrecalentamientos o deficiente calentamiento, para no alterar la calidad de la
matriz de agarosa) y esperar que disminuya la temperatura de manera
considerable pero sin llegar a gelatinizar, para adicionar 0.8 L de bromuro de
etidio que debe mezclarse suavemente y agregarse a la base montada con el
peine respectivo para formar el gel y los pozos.
Una vez que gelatiniza el gel de agarosa, se agrega suficiente TAE
1X en una cámara de electroforesis y se podrá sumergir el gel ya formado y
posteriormente se quita el peine del gel cuidadosamente para permitir se
formen adecuadamente los pozos.
Para la carga de las muestras se requiere de 2 L de buffer de carga,
6 L de agua ultrapura y 2 L de aislado. Para cargar producto de PCR:
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Colocar 2 L de buffer de carga y 8 L de producto de PCR. La cámara se
corre por alrededor de 20-30 min a 80 V.
DETECCIÓN DE VIRUS DE DNA POR PCR EN POSLARVAS DE CAMARÓN
Para la técnica de PCR se usarán los siguientes juegos de primers:
Primers para el WSSV (WSSVout1 5’ATC ATG GCT GCT TCA CAG AC3’)
y (WSSVout2 5’ GGC TGG AGA GGA CAA GAC AT3’) en PCR sencillo
(982 pb), y (WSSVIN1 5’ TCT TCA TCA GAT GCTACT GC 3’) y (WSSVIN2
5’ TAA CGCTAT CCA GTA TCA CG 3’) para PCR-anidado (570 pb).
Primers para el IHHNV (IHHNV392F 5’ GGGCGA ACC AGA ATC
ACT TA 3’) y (IHHNV392R 5’ ATC CGG AGG AAT CTG ATG TG 3’) en
PCR (392pb).
La técnica de PCR de forma general consiste en una serie de 20 a 35
cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en
2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que
tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están
precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (>
90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de
producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos
incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones
divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los
cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplifica. En la etapa
de Inicialización, se lleva la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó
98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas
que requieran activación por calor. En la Desnaturalización, se desnaturaliza el
ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso
puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la
muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la
hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente
empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes
químicos capaces de realizar la desnaturalización. En el Alineamiento o unión
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del cebador, se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se
unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario
bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso),
permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las
cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del
cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser
amplificad. Y en la Extensión o elongación de la cadena, la ADN polimerasa,
tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo
del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra
molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el
grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de
ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende
de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de
máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de
extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del
fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada:
en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un
minuto.
FICHA TECNICA DEL AREA DE ESTUDIO
El 04 de marzo de 2011 se visitó la Granja Costera del Mar de Cortéz
del propietario Fredi Cárdenas Contreras, la granja posee 12 años de
inauguración en el ejido La Brecha, cuenta con nueve estanques con 70ha de
agua c/u, con 34ppm de salinidad, el agua de los estanque es obtenida del
estero desde hace 12 años. Realizan 2 siembras por año: a principios de
marzo y cosecha en junio, la segunda es a principios de julio y cosecha en
octubre (con diez días de espera para cada intercosecha). En el proceso de
cultivo de las larvas, la instalación es por medio de mangueras, utilizando
postlarvas de 14-15 pellets, siendo aclimatadas durante dos horas
aproximadamente en las respectivas tinas de aclimatación con filtros
conteniendo 1 millón de postlarvas (con un costo de $50 mil). Deberían realizar
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análisis una vez por semana, sin embargo no lo hacen, mas aún presentando
antecedentes de mancha blanca anualmente, es decir, todos los años; por lo
que hacen uso de antibiótico oxitetraciclina, el cual lo aplican junto con el
alimento.
RESULTADOS
El análisis de muestreo de ADN y ARN de las muestras de postlarvas de
camarón son certeras, es decir, si se visualizó la presencia de ácidos nucleicos
en el gel de agarosa (Figura-1) siendo mayor la concentración de ARN ya que
las bandas de ADN son poco apreciables; no obstante, el control positivo y la
clona positiva resultaron no visibles para ambas filas del gel.
Figura-1. Verificación de ácidos nucleicos en postlarvas de camarón en las celdas 1-5 y en camarones adultos
en las celdas 6-7), celda 8 para control positivo, celda 9 para control negativo, celda 10 para clona positiva
únicamente en RNA. (A) para DNA y (B) para RNA.
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El análisis para WSSV no se presentó virulencia alguna (Figura-2) dado
que las muestras de postlarvas de camarón se encuentran libres del patógeno
WSSV, cabe mencionar que las muestra dos original se perdió al momento de
cargar el gel y, en la muestra tres solo hay un poco de muestra ya que la otra
parte se encuentra en el pozo dos; pese a ello, en ninguna de las dos bandas
se manifiesta presencia del virus, por lo que se aseguran las muestras libres
del patógeno WSSV.
En cambio, para IHHNV la banda 6 manifiesta la presencia de este virus
(a pesar de que las bandas se manifiestan tenues), la cual pertenece a la
hemolinfa de un organismo adulto vivo, la banda 7 (del ejemplar adulto
congelado) junto con las demás bandas de las muestras de postlarvas no se
detectó presencia del patógeno de acuerdo a los controles positivos (bandas 8
y 9).
Figura-2. Análisis de WSSV (A) y IHHNV (B). En (A) las bandas 1-6 pertenecen a las postlarvas de
camaron, bandas 6-7 son provenientes de camarones adultos congelados, banda 8 como control
positivo, banda 9 como control negativo. En (B) las bandas 1-6 pertenecen a postlarvas de camarón,
banda 6 proviene de camarón adulto vivo, banda 7 proviene de camarón adulto congelado, banda 8
como clona positiva, banda 9 como control postivo, banda 10 como control negativo.
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En cuanto a la electroforesis de TVS no se logró obtener resultados ya
que el gel no se elaboró debidamente; sin embargo, en la lectura de β-actina
(Figura-3) se logra observar un pequeño margen de error de acuerdo a la
banda 9 perteneciente a una muestra de cDNA corrida junto con las 7 muestras
de las postlarvas de camarón, por lo que los datos anteriores se consideran
confiables. Mientras que para TSV no se establecen criterios de presencia o
ausencia.
DISCUSION
Los laboratorios dedicados al diagnóstico del TSV, WSSV e IHHNV
deben adoptar el diagnóstico molecular como servicio al comercio internacional
de Litopenaeus vannamei en la región como medido da control en la
introducción de estas virosis a nuestro país (Salazar M., et. al., 2005) siendo
principalmente en TSV puesto que es una de las enfermedades más
devastadoras que afectan a la industria de las granjas camaroneras a nivel
Figura-3. Análisis para β-actina y TSV. En β-actina la banda 9 muestra desvariación respecto a las
demás. En TSV de manifieste presencia del virus TSV.
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mundial. Como bien se sabe, que desde su primera descripción en Ecuador, se
ha esparcido a todos los países productores de camarón de América (Aguado
G., et. al., 2008) razón por la que es conveniente tomar parámetros de forma
preventiva. Además de que el síndrome de Taura se encuentra en la lista de
enfermedades notificables de la Organización Mundial de Sanidad Animal;
anexándose que el L. vannamei es particularmente susceptible a esta
enfermedad; la fase aguda puede durar hasta siete días y se han observado
tasas de mortalidad de hasta el 95%.
Cabe mencionar que la presencia del IHHNV en camarones
asintomáticos y a bajos niveles de prevalencia puede implicar que las
poblaciones de camarones sean resistentes o en todo caso tolerantes a este
virus (Mélida B., et. al., 2008) minimizando su poder patogénico y reduciendo
su capacidad de multiplicación e infección; pese a que pueda crear resistencia
al virus, no deja de producir pérdidas de económicas de producción al
acuicultor, de tal forma sigue siendo prevalente sus análisis continuos durante
el periodo de cultivo.
Por otro lado, se conoce bien que el WSSV se manifiesta con mayor
incidencia en los municipios del norte de Sinaloa por su alta producción de
camarón (Montoya R., 2003) es conveniente que los productores realicen
pruebas analíticas ante este patógeno en forma preventiva ya que es la
principal amenaza en las zonas de cultivo regional. Además que el virus
acelera la muda. Sin embargo esto llega a provocar la mortalidad en postmuda
favoreciendo a la propagación del virus, muchas partículas virales serían
liberadas con los exuvios, en tanto que los animales blandos y debilitados
serían presa fácil de los animales sanos (Echeverría F., et. al., 2002). Siendo a
la vez, en los meses de enero y febrero, en Sinaloa es la preparación de los
campos acuícolas, el detectarse WSSV, marca la presencia del virus en el
entorno en concentración baja, subiendo por arriba de tres cuartas partes en
los mes de junio en Guasave y agosto en Ahome y Agiabampo, siendo estos
donde el cultivo se encuentra en su fase de cosecha; en los meses de baja del
cultivo, a partir de septiembre en adelante, se observa persistencia de WSSV
(Macías R., et. al., 2010) y (Mañón R., et. al.). Se sugiere establecer un
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programa de monitoreo sanitario y verificar el impacto de ambos virus en
camarones de granjas vecinas a La Laguna Madre (Guzmán S., et. al., 2009)
sobre todo en el primer cultivo anual.
CONCLUSION.
Ninguna muestra tomada de la Granja Costas del Mar de Cortéz
presentó virulencia para ningún patógeno, siendo que se perdió el análisis para
TSV al momento de la lectura de electroforesis, por lo que se recomienda un
nuevo análisis para este patógeno en específico. Por lo que con los reslutados
establecidos se determina a la Granja Costas del Mar de Cortéz libre patógeno
para WSSV e IHHNV respectivamente.
El seguimiento de las virulencias de WSSV, IHHNV y TSV en la región
como uno de los puntos de mayor producción del estado de Sinaloa, permitirá
alertar a los productores vecinos para que apliquen las estrategias oportunas,
principalmente en el llenado o descarga de agua evitando riesgos para su
cultivo para estos como para sí mismos al percibir pequeñas incidencias
virulentas. Las detecciones de estos virus por PCR permite determinar la
presencia en cualquier fase del ciclo de cultivo, siendo conveniente previo/inicio
del cultivo.
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