desenvolvimento de um novo teste de...
TRANSCRIPT
Sistema Rh
Importância clínica: Reação Transfusional; Doença Hemolítica do Recém-nascido
Diferentes fenótipos: D positivo, D negativo, D fraco, D parcial
Fenótipo RhD negativo
Caracterizado pela ausência do antígeno D na superfície eritrocitária 17% da população europeia
8% da população africana
17,3% dos doadores da sangue da Fundação Hemominas
Bases genéticas do fenótipo RhD negativo
Várias bases genéticas já foram descritas, sendo as mais comuns:
Deleção completa do gene RHD
Gene híbrido
RHD pseudogene
RHD pseudogene 66% dos africanos RhD negativo (Singleton et al, 2000)
15% dos afroamericanos RhD negativo (Singleton et al, 2000)
11% dos brasileiros RhD negativo (Rodrigues et al, 2002)
Genotipagem do alelo RHDψ é necessária para inferência do fenótipo RhD
Métodos clássicos de genotipagem RHD (PCR convencional): exige etapas pós-PCR
Método PCR RHD multiplex- Maaskant-van Wijk et al, 1998Método SSP-PCR RHDψ - Singleton et al, 2000
PCR em tempo real – mais sensível e rápida, não necessita de etapas pós-PCR
Exemplos de aplicação da PCR em tempo real à imunohematologia eritrocitária: - Genotipagem RHD fetal a partir do plasma materno - Genotipagem em pacientes e em doadores de sangue para detecção do gene RHD
Persiste a necessidade de determinação do alelo RHDψ
O objetivo do presente estudo foi padronizar um método de genotipagem do alelo RHDψ utilizando a PCR em tempo real (TaqMan).
Foi desenvolvida uma reação visando a amplificação simultânea e específica do alelo RHDψ e do exon 5 do gene RHD selvagem.
Primers desenhados com o software Primer 3Plus para amplificação específica do gene RHD
Sondas: desenhadas usando o software Primer Express FAM – exon 5 do gene RHD selvagemVIC – alelo RHDψ
Resultados
RHDψ : Amplificação de um fragmento de 212 pb apenas para as amostras portadoras do alelo RHDψ com limite de detecção de 1ng para amostras contendo uma cópia do gene. RHD exon 5: Amplificação do exon 5, detectada pela amplificação de um fragmento de 82 pb foi observada em todas as amostras RhD positivo com limite de detecção de 1 pg.
Amostra homo/hemizigotapara RHDψ
Amostra heterozigota para RHDψ e RHD
Amostra RHD positiva sem RHDψ
Amostras RhD negativo portadoras do alelo RHDψ (n=37):Ct médio de 27 (SD=0,9) para RHDψ , Ct médio de 37 (SD=1,6) para o exon 5
Amostras RhD positivo (n=10):Ct médio de 23 (SD=2,8) para o exon 5
Amostra heterozigota para o alelo RHDψ (n=1):Ct médio de 29 para RHDψ, Ct médio de 23 para o exon 5
Critério para definição da presença do alelo RHDψ
RHDψ em homozigose: Ct RHDψ < Ct exon 5RHDψ em heterozigose: Ct RHDψ > Ct exon 5RHDψ negativo: amplificação apenas do exon 5
Valores de Ct na PCR em tempo real com amplificação simultânea de regiões específicas do RHDψ e do exon 5 do gene RHD.
Discussão
Foi possível estabelecer critérios para inferência de fenótipos RHDψ em hemi e homozigose ou em heterozigose.
Os resultados apontam que o novo teste permite a detecção específica do alelo RHDψe tem a vantagem de ser mais rápido, por eliminar a necessidade das etapas pós-PCR, além de permitir saber se esse alelo encontra-se em heterozigose com um outro alelo RHD.
O teste será validado com um maior número de amostras para que possa ser implementado.
Considerando-se a grande complexidade do sistema Rh, o teste representa mais uma ferramenta a ser acrescentada ao conjunto de testes para auxiliar na genotipagem RHD.
Apoio financeiro
Maria Clara Fernandes da Silva Malta – bióloga, PhD. Núcleo de Inovação Tecnológica, Fundação Hemominas Poliane de Cássia Gonçalves – bióloga. Bolsista de Apoio Técnico, FAPEMIGMarina Lobato Martins – bióloga, PhD. Gerência de Desenvolvimento Técnico Científico, Fundação Hemominas
Equipe