desarrollo de una metodología de extracción, purificación
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Desarrollo de una Metodología de Extracción, Purificación y Cuantificación de Antocianos en
Maqui (Aristotelia chilensis [Mol] Stuntz)
Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero en Alimentos
Paulo Isidoro Galleguillos Valencia Valdivia – Chile
2016
i
ÍNDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
RESUMEN 1
SUMMARY 2
1 INTRODUCCIÓN 3
2 MATERIAL Y MÉTODO 11
2.1 Ubicación del estudio 11
2.2 Materiales 11
2.3 Métodos 11
2.3.1 Método de extracción de antocianinas 11
2.3.2 Condiciones cromatográficas de antocianos 12
2.3.3 Purificación de antocianos en maqui 13
2.4 Secado convectivo 13
2.5 Determinación del contenido de antocianos (método diferencial
de pH)
13
2.6 Capacidad antioxidante 14
2.7 Validación de metodología 15
2.7.1 Límite de decisión (Ccα) y capacidad de detección (Ccβ) 15
2.8 Exactitud 16
ii
2.9 Precisión 16
2.10 Método de Monte Carlo 16
2.11 Optimización de diseño experimental 17
3 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 18
3.1 Validación 18
3.1.1 Método de extracción 18
3.1.2 Determinación de análisis cromatográfico 19
3.1.3 Purificación de compuestos 21
3.1.4 Curva de calibración 22
3.1.5 Sensibilidad, precisión y exactitud 25
3.2 Secado convectivo 25
4 CONCLUSIONES 30
5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 31
ANEXOS 35
iii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Condiciones de detección HPLC-DAD 12
2 Condiciones en gradiente 12
3 Características analíticas de la metodología para la
determinación de antocianos
25
4 Resultados obtenidos del secado convectivo 27
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Ion Flavilio, estructura general de las antocianinas R1 y R2
pueden ser H o azúcares R pueden ser OH o H
4
2 Antocianidinas más importantes 5
3 Estructura de antocianinas a diferentes pH 6
4 Cromatograma con el perfil de antocianos de maqui 8
5 Espectro de absorción de cianidina 3 glucósido 9
6 (A) Espectro de absorción de delfinina 3,5 diglucosido y (B)
espectro de delfinidina 3 sambubiosido
9
7 Espectro de DPPH radical (violeta) y no radical (amarillo) 15
8 Cromatograma obtenido con los 8 compuestos de interés, (1)
delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido, (2) delfinidina 3,5
diglucósido, (3) cianidina 3,5 diglucósido, (4) cianidina 3
sambubiosido 5 glucósido, (5) delfinidina 3 sambubiosido, (6)
delfinidina 3 glucósido, (7) cianidina 3 sambubiosido y (8)
cianidina 3 glucósido
19
9 Espectro del compuesto obtenido (rojo) y el presentado por el
autor (negro)
20
10 (A) Espectros de absorción presentados por Escribano-Bailon,
et al. (2006). (B) espectros de absorción obtenidos en la
presente memoria.
21
v
11 A) compuestos antes de su aislación, (B) delfinidina 3
sambubiosido 5 glucósido y (C) delfinidina 3,5 diglucósido
21
12 (A) cianidina 3,5 diglucósido y (B) delfinidina 3 glucósido 22
13 Curva promedio generada del patrón de cianidina 3 glucósido 22
14 Presentación de las curvas promedio para cada antociano 23
15 Histograma generado con las mil iteraciones de producidas con
Monte Carlo
24
16 Gráfico de dispersión de Ccα (rojo) y Ccβ (azul) 24
17 Superficie de respuesta estimada para optimizar antocianinas
totales (A.T.)
26
18 Superficie de respuesta estimada para la capacidad
antioxidante de las antocianinas en total, donde se observa el
óptimo a las 3 horas
26
19 Diagrama de Pareto para antocianinas totales 27
20 Diagrama de Pareto para la capacidad antioxidante 28
21 Gráfico de Tukey que ilustra la comparación de una muestra
fresca y otra con el método de secado optimizado.
28
vi
ÍNDICE DE IMÁGENES
Imagen Página
1 Colector de fracciones Waters III 14
2 Extracción de los antocianos en la baya 18
vii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo Página
1 Fotografía del equipo HPLC/UV visible con arreglo de diodos
utilizado para la determinación de antocianos
36
2 Patrón de cianidina 3 glucósido 37
3 Cromatogramas de extracción etanol, metanol y agua
respectivamente
38
4 Curva de calibración de los 8 antocianos 39
5 Curvas patrones de los 8 antocianos 40
6 Curvas generadas para el cálculo de Ccα 41
7 Tabla con el cálculo del porcentaje de recuperación (exactitud) 44
8 Curvas de secado a distintas temperaturas 45
9 Gráfico de antocianinas totales en peso seco 46
10 Gráfico de capacidad antioxidante 47
11 Tukey para Delfinidina 3,5 diglucósido y cianidina 3 glucósido
respectivamente
48
1
RESUMEN
Aristotelia chilensis (Mol) Stunz o comúnmente llamado maqui, es un pequeño arbusto
que habita el sur de chile, su fruto una pequeña baya la cual posee una alta
concentración de antioxidantes, específicamente antocianinas
El propósito de esta investigación fue desarrollar una metodología para la extracción,
purificación y cuantificación de antocianinas en maqui mediante cromatografía líquida
de alta resolución acoplado a un detector UV visible con arreglo de diodos (HPLC UV-
VIS DAD).
El método cromatográfico desarrollado permitió separar correctamente los 8 antocianos
que se encuentran en el maqui, utilizando como fase móvil (A) Acido trifluoroacético al
0,3% y (B) acetonitrilo en gradiente iniciando con (A) 95% y (B) 5%, 4 min (A) 95% y
(B) 5%, 4,5 min (A) 90% y (B) 10%, min 27 (A) 85% y (B) 15%, min 47 (A) 45% y (B)
45%, min 48 (A) 10% y (B) 90%, min 50 (A) 10% y (B) 90%, min 51 (A) 95% y (B) 5% y
finalmente a los 60 min (A) 95% y (B) 5%, con un flujo de 0,7 mL/min y una
temperatura de columna de 30°C, utilizando el método de extracción desarrollado en
este trabajo, además se determinó que la temperatura de secado óptimo a 60°C donde
se mantiene su concentración de antocianinas y capacidad antioxidante en un 57,99%
y 16,55% respectivamente, esto pensado en un futuro desarrollo de un producto que
contengan estos antioxidantes como componente activo.
2
SUMMARY
Aristotelia chilensis (Mol) Stunz or commonlly known as Maqui, is a Little Bush that
inhabits the southern chilean región, it´s fruit is a little Berry which posses a high
antioxidant concentration, specifically anthocyanins
The goal of this research was to develop a methodology for extraction, purification and
anthocyanins quantification in maqui via high resolution liquid chromatography attached
to a UV visible detector with diode arrengment (HPLC UV-VIS DAD).
The chromatographic method allowed to correctly separate 8 anthocyanins using (A)
trifluroacetic acid 0,3% and (B) acetonitrile in gradient starting with (A) 95% and (B) 5%,
4 minutes (a) 95% and (B) 5% 4,5 minutes (A) 90% and (B) 10% minute 27 (A) 85%
and (B) 15% minute 47 (A) 45% and (B) 45% minute 48 (A) 10% and (B) 90% minute
50 (A) 10% and (B) 90% minute 51 (A) 95% and (B) 5% and finally at 60 minutes (A)
95% and (B) 5% with a flux of 0,7 mL/min and a column temperature of 30°C, using the
extraction method developed in this work, furthermore it was determined that the
optimal drying temperature was 60°C where it´s anthocyanins concentration is kept and
antioxidant capability is a 57,99% and 16,55% respectively, this thinking on a future
development of a product that contains this antioxidants as active component.
3
1. INTRODUCCIÓN
Hoy en día existe un gran interés en el estudio de nuestra flora silvestre, no solo por la
preservación del mismo, sino también por el ámbito medicinal.
En nuestro país existe un peculiar arbusto denominado maqui (Aristotelia chilensis
(Mol) Stuntz). El maqui es un árbol pequeño, nativo de Chile, que se encuentra desde
la IV región hasta la XI. En lugares abiertos esta especie puede alcanzar entre 4 o 5
metros de altura y cuando crece en comunidades adquiere forma arbustiva (Hoffmann,
1982). Por otro lado, Zevallos y Matthei, (1992), indica que el maqui es un árbol
delgado de 30 a 35 cm de diámetro que alcanza una altura de hasta 10 metros, tiene
un tronco dividido que posee una corteza lisa, con ramas abundantes. El fruto del
maqui es una baya redonda comestible de color negro brillante, de unos 5 mm de
diámetro, de pulpa dulce en cuyo interior hay dos semillas angulosas (Hoffmann,
1997), otros autores mencionan que posee entre 2 a 4 semillas angulosas de 3 mm de
largo y 2 mm de ancho (Oyanadel, 2002). Cada 100 g de frutos contiene 150 calorías,
0,8 g de proteínas, 0,8 g de fibra cruda, 1,2 g de cenizas, 87 mg de calcio, 44 mg de
fósforo, 30,5 mg de hierro y 296 mg de potasio. Contiene también un considerable
porcentaje de vitamina C y oligoelementos, destacando la presencia de Br, Zn, Cl, Co,
Cr, Vn, Tn, y Mo (Damascos et al., 2008), además estudios revelaron que esta fruta
posee una alta concentración de polifenoles y antocianinas (Céspedes et al., 2008;
Schreckinger et al., 2010; Rubilar et al., 2011; Escribano Bailón et al., 2006).
Las antocianinas están presentes en diferentes órganos de las plantas, tales como
frutas, flores, tallos, hojas y raíces (Brouillard, 1982). Estos pigmentos son
normalmente encontrados disueltos uniformemente en la solución vacuolar de células
epidérmicas. Sin embargo, en ciertas especies, las antocianinas son localizadas en
regiones discretas de la vacuola celular, llamadas antocianoplastos (Pecket y Small,
1980). La principal fuente de antocianinas son frutas rojas, principalmente bayas, uvas,
cereales, maíz morado, vegetales y vino rojo entre las bebidas (Harbone, 1993;
Escribano-Bailón et al., 2004). Hay un creciente interés en la caracterización de estos
pigmentos particularmente debido a sus potenciales beneficios para la salud como la
4
lucha contra el cáncer, antiinflamatorio, antivirales y antimicrobianas (Benzie y Strain,
1996; Cheng y Breen, 1991).
Las antocianinas en chile son usadas como colorantes, según indica el Reglamento
Sanitario de los Alimentos (artículo 145) se permiten usar como sustancias colorantes y
para efectos de rotulación se deberá emplear el nombre “antocianinas”, según lo indica
el codex alimentarius.
Químicamente las antocianinas son glucósidos de las antocianidinas, es decir, están
constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la cual se le une
un azúcar por medio de un enlace β-glucosídico. La estructura química básica de estas
agliconas es el ion flavilio (Badui, 2006) (Figura 1), también llamado 2-fenilbenzopirilio
(Wong, 1995), que consta de dos grupos aromáticos: un benzopirilio y un anillo
fenólico; el flavilio normalmente funciona como un catión (Badui, 2006) ósea un ion con
carga positiva. Las agliconas libres raramente existen en los alimentos, excepto
posiblemente como componentes traza de las reacciones de degradación (Fennema,
2000). De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente
20), las más importantes son la pelargonidina, delfinidina, cianidina, petunidina,
peonidina y malvidina (Figura 2), nombres que derivan de la fuente vegetal de donde
se aislaron por primera vez (Fennema, 2000). la combinación de éstas con los
diferentes azúcares genera aproximadamente 150 antocianinas. Los carbohidratos que
comúnmente se encuentran son la glucosa y la ramnosa, seguidos de la galactosa,
xilosa y la arabinosa, ocasionalmente, la gentobiosa, la rutinosa y la soforosa.
Figura 1. Ion Flavilio, estructura general de las antocianinas R1 y R2 pueden ser H o azúcares R pueden ser OH o H
5
Figura 2. Antocianidinas más importantes
Fuente: Fennema. (2000).
El color de las antocianinas depende de varios factores intrínsecos, como son los
sustituyentes químicos que contenga y la posición de los mismos en el grupo flavilio;
por ejemplo, si se aumentan los hidroxilos del anillo fenólico se intensifica el color azul,
mientras que la introducción de metoxilos provoca la formación del color rojo (Badui,
2006).
Está bien documentado que varios factores como el tipo de sustituyentes en la
estructura química de antocianinas, pH, temperatura, incidencia de la luz, presencia de
oxígeno, etc, afectan de forma negativa la estabilidad de antocianinas, cuando
cualquiera de estos parámetros aumenta (García-Viguera et al., 1994; Garzón y
Wrolstad, 2002).
El pH es el factor que más afecta el color de las antocianinas en solución, y esto es
debido al cambio en el equilibrio de la estructura tanto reversible o irreversible en estos
compuestos (Mazza y Brouillard, 1987). El comportamiento de las antocianinas con el
aumento de pH y desprotonación se asocian con el cambio de la estructura molecular
de sus compuestos (Torskangerpoll y Andersen, 2005), en donde se observa una
disminución en la absorbancia del 50% en pH 3,15, esto ocurre a valores de pH
superiores a 3,0.
Se puede decir que las antocianinas actúan como indicadores ácido-base puesto que
el color resultante está en función de la estructura que se encuentre en mayor
proporción a determinados pH. Dependiendo del pH las antocianinas pueden existir en
cuatro especies diferentes: base quinoidal, catión flavilio, pseudobase carbinol y
6
chalcona. En soluciones muy ácidas (pH < 0,5) el catión flavilio rojo es la única
estructura. Con incrementos de pH la concentración del catión decrece al mismo
tiempo que la hidratación da lugar a la base de carbinol incolora. Entre pH 4 y 5,5
habrá poco color, debido a que las dos formas coloreadas estarán en bajas
concentraciones y el equilibrio se desplazará a las formas incoloro. Por lo tanto, la
forma chalcona es la más susceptible a la degradación, y la forma iónica flavilio es la
más estable (Chandra, et al., 1992; Wesche-Ebeling y Montgomery.,1990) (Figura 3).
Figura 3. Estructura de antocianinas a diferente pH. Fuente: Giustin y Wrolstad, (2001)
La naturaleza insaturada de las estructuras de antocianina las convierte en
susceptibles al oxígeno molecular (Fennema, 2000). La presencia de oxígeno junto
7
con elevadas temperaturas es la peor combinación para la deterioración del color.
Ocasionalmente el ácido ascórbico naturalmente presente puede dar lugar a
problemas, en presencia de iones de cobre y de oxígeno, ya que reacciona
oxidándose a ácido dehidroascorbico acompañado por la formación de peróxido de
hidrogeno, la cual oxida las antocianinas, generando una división del anillo pirilo por
ataque nucleofilico sobre la posición C-2 de la antocianina (Fennema, 2000),
produciendo la formación de malvonas incoloras (Coultate, 1984), perdiendo así su
capacidad antioxidante.
El efecto de la temperatura en la estabilidad de las antocianinas en sistemas modelos y
en productos alimenticios ha sido estudiado por muchos investigadores; el consenso
general es que los pigmentos de antocianos son notoriamente destruidos por el calor
durante el procesamiento y almacenamientos de los alimentos, donde la temperatura
crece de forma aritmética, mientras la destrucción de antocianos lo hace de forma
logarítmica (Markakis, 1982).
Sapers (1981), realizó un estudio sobre estabilidad de la col morada cuando es
calentada durante 5 horas, encontrando que la absorbancia de la muestra decrece
significativamente durante los primeros 30 minutos, seguida por un decrecimiento más
gradual de forma lineal.
Cuando las soluciones de antocianinas se secan por aspersión, a temperaturas
mayores a 100°C, ocurre una degradación del color, mientras que a las temperaturas
por debajo de los 90°C resulta en una degradación mínima.
Para la determinación de los Antocianos en maqui se utilizó cromatografía líquida de
alto rendimiento, la que es ahora una de las herramientas más poderosas y empleadas
en la química analítica (Quattrocchi et al., 1992). Tiene la capacidad de separar,
identificar y cuantificar los compuestos que están presentes en cualquier muestra que
se pueda disolver en un líquido. Hoy en día, compuestos en concentraciones tan bajas
como partes por billón (ppb = ng/mL) pueden ser fácilmente identificados. La utilización
del HPLC-UV/Vis se ha aplicado a casi cualquier muestra, tales como productos
farmacéuticos, alimentos, nutracéuticos, cosméticos, matrices ambientales, muestras
forenses, y productos químicos industriales.
8
En la actualidad la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-UV/Vis) ha llegado a
ser una de las técnicas de laboratorio más importantes como herramienta analítica
para separar y detectar compuestos químicos.
Tanaka et al (2003), presentó un cromatograma donde identifico 8 compuestos (Figura
4).
Figura 4. Cromatograma con el perfil de antocianos de maqui.
Fuente: Tanaka et al, (2003)
Estos compuestos encontrados son a menudo caracterizados utilizando su espectro de
absorción, especialmente para identificar el tipo de antocianina. Las antocianinas
tienen un rango de absorción amplio al final del azul del espectro visible con una
absorción máxima observada en las regiones de 500-535 nm (Abdel-Aal et al., 2006).
Se utilizó el espectro proporcionado por Federica et al. (2004), Figura 5 donde vemos
el espectro de absorción de cianidina 3 glucósido y también los aportados por
Escribano-Bailón et al. (2006) (Figura 6) donde vemos delfinidina 3,5 diglucósido y
delfinidina 3 sambubiosido respectivamente.
9
Figura 5. Espectro de absorción de cianidina 3 glucósido.
Fuente. Federica et al. (2004)
Figura 6. (A) espectro de absorción de delfinidina 3,5 diglucósido y (B) espectro de delfinidina 3 sambubiosido.
Fuente: Escribano-Bailón et al. (2006).
Proceso de Secado
Aristotelia chilensis se encuentra disponible entre diciembre y marzo, por lo que es
necesario alargar la vida útil de este producto. El método más antiguo utilizado en la
conservación de alimentos es la deshidratación, particularmente el secado con
temperatura. El secado de alimentos se define como el proceso unitario en el cual se
aplica calor, con el fin de remover el agua presente por evaporación. El principal
10
propósito del secado es extender la vida útil de los alimentos mediante la reducción de
la actividad de agua (Fellows, 2000).
El secado por convección utiliza el movimiento de los fluidos para transferir calor, el
que puede ocurrir de forma natural o forzada. En la convección natural el movimiento
del fluido se genera debido a las diferencias de densidad producidas por las diferencias
de temperatura, mientras que, en la convección forzada, el movimiento es producido
por medios externos, tales como, bombas, agitadores o ventiladores. La convección es
el principal modo de transferir calor entre la superficie de un material sólido y el fluido
circundante (Wang, 2006; Knudsen, 1999).
Hipótesis:
Si las bayas de maqui son ricas en antocianos, entonces es posible purificar estos
compuestos para utilizarlos como estándares analiticos y así desarrollar metodología
para cuantificarlos.
Objetivo general
Desarrollar una metodología de extracción, detección, purificación y cuantificación de
antocianos en maqui.
Objetivos específicos
Desarrollar una metodología de extracción de antocianos en el maqui.
Desarrollar una metodología de detección de antocianos mediante HPLC.
Purificar y concentrar cada uno de los antocianos presentes en el maqui.
Calcular su concentración y validar la metodología de cuantificación.
Determinar el efecto del secado convencional sobre el contenido de antocianos en maqui.
11
2. MATERIAL Y MÉTODO
2.1 Ubicación del estudio
El desarrollo experimental fue realizado en el laboratorio de análisis instrumental,
ubicado en el Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL),
perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias, de la Universidad Austral de Chile.
2.2 Materiales
Muestras de maqui (Aristotelia Chilensis (Mol) Stuntz) provenientes de distintos lugares
de Chile. Reactivos tales como Acetonitrilo, Acido trifluoroacético, ácido clorhídrico,
metanol, cloroformo obtenidos en MERCK, Cromatógrafo de alta resolución Alliance
2695, Waters, acoplado a un Detector con Arreglo de Diodos DAD 2996. (Anexo 1).
Columna XTERRA® C18 5µm, colector de fracciones Waters III y software Empower2
Waters.
2.3 Métodos
Se presentan a continuación las diferentes metodologías desarrolladas es esta
investigación.
2.3.1 Método de extracción de antocianinas.
Bligh y Dyer (1959), desarrollaron un método de extracción de lípidos, el cual emplea
una mezcla de solventes agua, cloroformo y metanol en proporciones (4/5/10 - v/v/v)
junto a la muestra formando una fase continua, pero al cambiar las proporciones a
(9/10/10 v/v/v) forma 2 fases una superior con los antocianos en metanol-agua y una
inferior con lípidos y cloroformo. Cabe destacar que las antocianinas, son estables a
pH bajos cercanos a 1, por lo que se utilizó agua acidificada al 0,1% y metanol
acidificado al 0,1%, usando HCl para acidificar.
Procedimiento
Se pesó 0,1 g de muestra y se agregó 3,31 mL de agua acidificada, 5 mL de
cloroformo y 10 ml de metanol acidificado, las muestras son agitadas por 20 minutos a
12
1700 rpm. Transcurrido el tiempo se adiciona 5 mL más de agua acidificada y 5 mL de
cloroformo, se centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos, al terminar se observaron 2 fases
siendo la superior la de nuestro interés.
Finalmente, las muestras se ultracentrifugaron a 12.000 rpm por 5 minutos para bajar
las partículas en suspensión y tomar una alícuota del sobrenadante.
2.3.2 Condiciones cromatográficas de antocianos. Utilizando el equipo HPLC DAD
se utilizaron las siguientes condiciones cromatográficas (Cuadro 1).
Cuadro 1. Condiciones de detección HPLC-DAD.
Columna XTERRA C18
Temperatura de columna 30ºC
Fase móvil Ácido trifluoroacético 0,3% / acetonitrilo
Flujo 0,7 mL/min
Tiempo de corrida por muestra 60 min
Detección (nm) 520
Volumen de inyección 20 µm
Modo Gradiente
Se presentan las condiciones usadas para la determinación (Cuadro 2).
Cuadro 2. Condiciones en gradiente.
Minuto A (Ácido trifluoroacetico 0,3%) B (acetonitrilo)
0 95% 5%
4 95% 5%
4,5 90% 10%
27 85% 15%
47 45% 55%
48 10% 90%
50 10% 90%
51 95% 5%
60 95% 5%
FUENTE: Tanaka et al., (2003).
13
2.3.3 Purificación de antocianos en maqui. Para la obtención de antocianos aislados
se utilizó el colector de fracciones Waters III (Imagen 1) acoplado a la salida del
detector DAD, de modo que cuando un compuesto sea detectado este será
recolectado en un tubo separando así cada antociano (Anexo 2).
Imagen 1. Colector de fracciones waters III
2.4 Secado convectivo
Se registró el peso de las muestras antes del análisis, en el cual se realizó el proceso
de secado en un horno con aire forzado a 3 distintas temperaturas (80, 70 y 60°C) las
muestras se secaron por 5 horas y se mantuvo un registro de su peso, contenido de
antocianos y capacidad antioxidante a los 0,5, 1, 2, 3, 4 y 5 horas.
2.5 Determinación del contenido de antocianos (método diferencial de pH)
Considerando el pH como uno de los principales factores que afecta la estabilidad del
color de las antocianinas, los espectros de UV-VIS a diferentes valores de pH también
varían y nos ayudan a determinar sí las antocianinas están o no polimerizadas (Giusti y
Wrolstad, 2001). El contenido de antocianinas totales se determinó mediante el método
14
diferencial de pH. La absorbancia del extracto se midió en un espectrofotómetro a 510
y 700 nm en buffers a pH de 1,0 y 4,5.
El contenido de antocianinas se determinó mediante la siguiente fórmula:
5.47005100.1700510 )()( pHpH AAAAA (1)
La concentración de antocianinas se determinó mediante la siguiente formula
expresada en (mg L-1):
1000
FDPMAC (2)
Donde:
A = Absorbancia de antocianinas.
PM = Peso molecular de la cianidina-3-glucósido (449,6).
ε = Coeficiente de extinción molar de la cianidina-3-glucósido (26900).
2.6 Capacidad antioxidante
Para la capacidad antioxidante se usó el método propuesto por (Brand-Williams et al.,
1995), método de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) que nos permite evaluar la
actividad de sustancias frente al radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•)
en una solución metanólica que tiene un color violeta intenso que se pierde
progresivamente cuando se añade la muestra que contiene antioxidantes. La
decoloración del radical se determina a 515 nm y la cuantificación se realiza por lo
general empleando soluciones patrón de Trolox.
Cuando la solución de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar
un átomo de hidrógeno como se muestra en la Figura 7, el color violeta se desvanece.
El cambio de color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la
determinación de los parámetros para las propiedades antioxidantes.
15
Figura 7. Espectro de DPPH radical (violeta) y no radical (amarillo)
2.7 Validación de metodología 2.7.1 Límite de decisión (Ccα) y capacidad de detección (Ccβ). De acuerdo a los
valores establecido por la norma ISO 11.843. Ccα corresponde, al límite en el cual y a
partir del cual se puede concluir con una probabilidad de error “α” que una muestra no
es conforme. Dicho límite igualmente corresponde a una concentración mínima, que
establece en este caso una probabilidad de un falso positivo de un 1%. Se obtiene con
el valor del intercepto de una curva de calibración promedio (γ0), pero se le suma la
desviación estándar (σ) del valor multiplicado por 2,33 (que representa un α=0,01 con
una varianza constante en el intervalo del ruido a σ). Ccβ es la capacidad de detección
que por definición corresponde al contenido mínimo de la sustancia que puede ser
detectado, identificado o cuantificado en una muestra con una probabilidad de error β. Estadísticamente corresponde a la probabilidad de obtener un falso negativo en un 5%.
Se procede analizando un blanco de muestra enriquecido con analito hasta el límite de
decisión (Ccα). Este blanco enriquecido pasa por todo el proceso analítico del método.
El proceso se repite 20 veces. Se analiza y se calcula desviación estándar (σ) de la
determinación. El resultado se obtiene sumando al límite de decisión la σ obtenida
multiplicada por 1,64.
𝐶𝑐𝛼 = 𝛾𝑜 + (2,33 × 𝜎) (3)
16
𝐶𝑐𝛽 = 𝐶𝑐𝛼 + (1,64 × 𝜎) (4)
2.8 Exactitud
Es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia
aceptado, también la exactitud indica la proximidad de la medición con respecto del
valor de referencia que se ha usado para calibrar el instrumento, expresándose como
porcentaje de recuperación (%R).
Para calcular la exactitud, en el caso de no existir patrones de referencia certificados
para el analito en cuestión se recurre a la determinación de la “Recuperación”, para ello
debe usarse un blanco de muestra adicionado de una cantidad conocida de analito,
sometido al procedimiento analítico. Esto debe repetirse a lo menos 3 veces.
%R =(CF − CV)
𝐶𝐴𝑥 100 (5)
Donde:
% R: Porcentaje de recuperación
CF: Concentración del analito medida en la muestra fortificada.
CV: Concentración del analito medida en la muestra sin fortificar.
CA: Concentración del analito adicionada.
2.9 Precisión
Describe la reproducibilidad de los resultados, concordancia entre los valores
numéricos de diferentes mediciones obtenidos analíticamente determinados en el
mismo equipo bajo las mismas condiciones, se expresa habitualmente como el
coeficiente de variación (CV).
%𝐶𝑉 = 𝜎
𝑋 𝑥 100 (6)
Donde:
% CV: Porcentaje de coeficiente de variación.
σ: Desviación estándar.
X: Promedio.
2.10 Método de Monte Carlo
Monte Carlo consiste en crear un modelo matemático del sistema, proceso o actividad
que se quiere analizar, identificando aquellas variables cuyo comportamiento aleatorio
17
determina el comportamiento global del sistema. Una vez identificados dichas variables
aleatorias, se lleva a cabo un experimento consistente en generar con ayuda del
ordenador muestras aleatorias (valores concretos) para dichas variables y analizar el
comportamiento del sistema ante los valores generados.
Tras repetir n veces este experimento, dispondremos de n observaciones sobre el
comportamiento del sistema, lo cual nos será de utilidad para entender el
funcionamiento del mismo obviamente, nuestro análisis será tanto más preciso cuanto
mayor sea el número n de experimentos que llevemos a cabo.
Ahora bien, llevando a cabo el cálculo de Ccα y Ccβ, primeramente, se creó un
algoritmo donde utilizamos las curvas de cada antociano y su desviación estándar
promedio para generar curvas aleatorias que se dispersen según la desviación
estándar entregada y con Monte Carlo iteramos 1000 veces para obtener datos
suficientes para el cálculo de Ccα y Ccβ.
2.11 Optimización de diseño experimental
Los resultados obtenidos fueron utilizados diseño experimental de superficie de
respuesta 3𝑘, este es un diseño cuadrático permite hallar el óptimo en una superficie
de respuesta. Estos diseños requieren, por lo menos, tres niveles para cada factor. En
este caso se utilizó un plan de 32 que requería nueve experiencias para dos factores
independientes con un punto central, obteniendo 10 condiciones a recrear. Una vez
analizadas estas formulaciones, se tabularán los resultados y se determinará la
formulación óptima.
18
3. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
3.1 Validación
Una vez desarrollado un método de análisis por HPLC DAD, al igual que toda técnica
analítica, esta debe validarse para demostrar su idoneidad, es decir, se debe confirmar
y documentar que los resultados producidos por el método son confiables. (Quattrocchi
et al., 1992).
3.1.1 Método de extracción. En este estudio se desarrolló el método de extracción
utilizado por Bligh y Dyer, (1959) sustituyendo el agua por agua acidificada con HCl al
0,01% (Imagen 2). Para verificar la efectividad de este método se inyectaron 20ul en el
HPLC para comprobar con el cromatograma la obtención y separación adecuada de
los picos en contraste con otros métodos como son dilución en etanol, metanol y agua
respectivamente (Anexo 3).
Imagen 2. Extracción de los antocianos en la baya
19
3.1.2 Determinación para análisis cromatográfico. Para el análisis cromatográfico
se utilizó en modo gradiente con una fase móvil compuesta de ácido trifluoroacético al
0,1% (A) y acetonitrilo 100% (B) y un flujo de 0,7 mL/min, la temperatura de la columna
fue de 30°C y la detección de los antocianos se hizo a 520 nm (Tanaka et al., 2013).
La separación óptima de todos los antocianos se logró utilizando una columna
XTERRA C18 la cual en contraste con la usada por Tanaka et al. (2003), resulto una
mejor separación de los picos 3 y 4.
Con las condiciones señaladas anteriormente se determinó el orden de salida o tiempo
de retención de cada compuesto, el tiempo de corrida se mantuvo a 60 min al igual que
Tanaka (2013), para mantener la alta definición de los picos y su separación (Figura 8),
el rango de detección fue de 200 a 700 nm para obtener el espectro de absorción,
pensando en que estos deben ser identificados y aislados.
Figura 8. Cromatograma obtenido con los 8 compuestos de interés, (1) delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido, (2) delfinidina 3,5 diglucósido, (3) cianidina 3,5 diglucósido, (4) cianidina 3 sambubiosido 5 glucósido, (5) delfinidina 3 sambubiosido, (6) delfinidina 3 glucósido, (7) cianidina 3 sambubiosido y (8) cianidina 3 glucósido
Este método presenta una gran mejora frente a la propuesta por Escribano-Bailón et al.
(2006), puesto que, al contrario, aquí se logró separar el pico 3 y 4, esto pudo deberse
por el aumento de la concentración de ácido trifluoroacético (0,1% a 0,3%) lo cual
20
aumento la diferencia de polaridades entre la fase estacionaria y móvil logrando
separar los picos.
El espectro de absorción de los diferentes antocianos se obtuvo usando el software
Empower2 y fue comparado con los obtenidos por Blando, et al. (2004), en la Figura 9,
se puede observar el espectro de cianidina 3 glucósido del autor junto al obtenido y se
puede apreciar que coinciden perfectamente.
Figura 9. Espectro del compuesto obtenido (rojo) y el presentado por el Blando, et al. (2004) negro)
Otra comparación con Escribano-Bailón et al. (2006) sobre los espectros de delfinidina
3,5 diglucósido y delfinidina 3 sambubiosido donde se respaldan nuestros resultados,
no obstante, Blando, et al. (2004), utilizo espectrometría de masa para validar los
compuestos mientras que se uso los espectros de absorción, demostrando que es una
buena técnica y más económica. En la Figura 10 sección (A) se puede observar
21
delfinidina 3,5 diglucósido (línea punteada) y delfinidina 3 sambubiosido (línea
continua).
Figura 10. (A) Espectros de absorción presentados por Escribano-Bailon, et al.
(2006). (B) espectros de absorción obtenidos en la presente memoria. 3.1.3 Purificación de compuestos. Utilizando el colector de fracciones acoplado al
HPLC-DAD se colecto en fracciones separadas los compuestos de interés (Figura 11 y
12) los cuales se concentraron mediante liofilizaron para ser almacenados. Se
obtuvieron 4 patrones completamente aislados, esto es debido a la baja estabilidad en
los tiempos de retención, lo que forzó a recolectar algunos compuestos en par.
Figura 11. (A) compuestos antes de su aislación, (B) delfinidina 3 sambubiosido
5 glucósido y (C) delfinidina 3,5 diglucósido
22
Figura 12. (A) cianidina 3,5 diglucósido y (B) delfinidina 3 glucósido 3.1.4 Curva de calibración. Para validar la metodología se hizo una curva tomando
como patrón cianidina 3 glucósido (Figura 13), este patrón se cuantifico utilizando el
método diferencial de pH con la cual se generaron 6 curvas de calibración para cada
antociano, expresado en mg de cianidina 3 glucósido las que mostraron un coeficiente
de determinación (𝑅2) de alrededor de 0,9992 (Anexo 4).
FIGURA 13. Curva promedio generada del patrón de cianidina 3 glucósido
Si tomamos en cuenta que son 8 antocianos, en forma simultánea se genera una curva
de calibración para cada uno de los analitos, obteniendo 48 curvas en total (Anexo 5).
y = 117393x + 119194R² = 0,99920
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60
Are
a.
Mill
on
es
(ug/ml)
Curva Patron Cianidina 3glucosido
Lineal (Curva Patron Cianidina3 glucosido)
23
Para cada antociano en estudio se obtuvo una curva de calibración promedio. (Figura
14), se obtienen las desviaciones estándar para la aplicación del método Monte Carlo
con el cual se iteró Ccα y Ccβ obteniendo asi los resultados de forma más rápida y
sistemática que usando los cálculos tradicionales que involucran el uso de equipos y
tiempo considerables.
La simulación por Monte Carlo también demostró ser más precisa tomando en cuenta
que itero 1.000 veces para el cálculo de Ccβ en contraste con la técnica tradicional
donde el análisis debe repetirse solo 20 veces.
Figura 14. Presentación de las curvas promedio de cada antociano
En la Figura 15 se presenta un histograma de las iteraciones generadas por Monte
Carlo, en este caso en concreto cianidina 3 glucósido, donde vemos la distribución de
los datos y su homogeneidad, así mismo en la Figura16 se presenta graficado la
dispersión de los datos tanto de Ccα como de Ccβ.
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000 1200
Are
a
Mill
on
es
Concentración (ppm)
Delfinidina 3 sambubiosido 5glucosido
Delfinidina 3.5 Diglucosido
Cianidina 3 Sambubiosido 5Glucosido
Cianidina 3.5 Diglucosido
Delfinidina 3 Sambubiosido
Delfinidina 3 Glucosido
Cianidina 3 sambubiosido
24
Figura 15. Histograma generado con las mil iteraciones de producidas con Monte
Carlo
Figura 16. Gráfico de distribución de los valores obtenidos para Ccα (rojo) y Ccβ
(azul) de las mil iteraciones.
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
FREC
UEN
CIA
CLASE
-20
0
20
40
60
80
100
120
0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000
Frec
uen
cia
Respuesta
25
3.1.5 Sensibilidad, precisión y exactitud. Estos parámetros fueron determinados
separadamente para los ocho antocianos del estudio (Anexo 6). La precisión se relaciona con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio
o central, el cual corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales. Por
otro lado, la exactitud de un método o error sistemático, corresponde al valor medio
obtenido comparado con el verdadero o aceptado. Estos parámetros se presentan en
el Cuadro 3, aquí los resultados nos muestran que cianidina 3 sambubiosido 5
glucósido tiene la mayor exactitud, mientras que delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido
tiene la mejor precisión, la precisión para la determinación de los antocianos no
superan el 6% (Anexo 7), por lo cual se consideran adecuadas.
Cuadro 3. Características analíticas de la metodología para la determinación de ___________antocianos.
Nombre Antociano Ccα
(ug/mL) Ccβ
(ug/mL) Exactitud
(%) Precisión
(%) Delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido 19,53 26,92 112,10 3,91 Delfinidina 3.5 diglucósido 47,39 63,13 105,10 5.67 Cianidina 3.5 diglucósido 22,18 30,42 117,50 5,90 Cianidina 3 sambubiosido 5 glucósido 8,78 12,51 96,80 5,97 Delfinidina 3 sambubiosido 9,76 13,86 120,30 5,89 Delfinidina 3 glucósido 27,26 37,01 115,10 5,66 Cianidina 3 sambubiosido 3,54 5,27 96,10 5,29 Cianidina 3 glucósido 4,73 6,93 109,20 5,98 Una vez teniendo validada nuestra metodología para antocianos en maqui, se realizó
una comparación de una muestra fresca con una muestra sometida a un tratamiento
térmico de secado para comparar el contenido de antocianos y ver la perdida de estos
por degradación, demostrando así la eficacia del método que además de permitir ver la
cantidad de antocianinas que fueron degradadas, también permite saber en qué
proporción fueron afectada cada una de ellas.
3.2 Secado convectivo Se optimizaron las condiciones de secado, utilizando para ello los factores de tiempo y
temperatura (Anexo 8) y como variables de respuesta, el contenido de antocianos
totales A.T (Anexo 9) y la capacidad antioxidante de estos DPPH (Anexo 10), los
resultados obtenidos otorgan una humedad de un 19%. En la Figura 17 se puede
26
observar la superficie de respuesta estimada de para la concentración de antocianos
totales más óptima a 60°C y con un tiempo de 4 horas y 30 minutos.
Figura 17. Superficie de respuesta estimada para optimizar antocianinas totales (A.T.)-
A su vez, la superficie de respuesta estimada para la capacidad antioxidante se
presenta en la Figura 18, la cual muestra que el tiempo óptimo para este factor es a las
3 horas, que, si bien es mucho antes que el tiempo óptimo de la concentración de
antocianos totales, es más importante, puesto que el interés es mantener al máximo
las propiedades antioxidantes con el mínimo de agua posible para su almacenamiento.
Figura 18. Superficie de respuesta estimada para la capacidad antioxidante de las antocianinas en total, donde se observa el óptimo a las 3 horas
27
El Cuadro 4 muestra los resultados obtenidos en este análisis, aquí se aprecia que
tanto el contenido de antocianos como la capacidad antioxidante han disminuido
alrededor de un 40% y 55% respectivamente, respecto a la diferencia que existe entre
la cantidad de antocianos disponibles y la capacidad antioxidante se explica pensando
en que existen otros compuestos antioxidantes distintos a las antocianinas que no
fueron analizados en este estudio.
Cuadro 4. Resultados obtenidos del secado convectivo
Tipo medición Sin tratamiento (fresco) Óptimo Pérdida Antocianinas totales (mg/100g) base seca (mg equivalentes de cianidina 3 glucósido)
3146,17 1824,75 42,01%
Capacidad antioxidante (mg /100g) base seca (mg en trolox equivalente)
13191,90 6044,21 54,18%
En los siguientes diagramas de Pareto (Figura 19 y 20) vemos que el efecto de la
temperatura es significativo de forma negativa para la concentración de antocianos, así
mismo para el caso de capacidad antioxidante (DPPH) se observa que influye
negativamente aun no siendo significativo.
Figura 19. Diagrama de Pareto para antocianinas totales
28
Figura 20. Diagrama de Pareto para la capacidad antioxidante
Finalmente se realizó una comparación de delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido,
medida por HPLC DAD en una muestra fresca y una con las condiciones óptimas, para
determinar si existe diferencia altamente significativa con un nivel del 99 % de
confianza (Figura 21), se adjuntan además Tukey para delfinidina 3,5 diglucósido y
cianidina 3 glucósido (Anexo 11)
Figura 21. Gráfico de Tukey que ilustra la comparación de una muestra fresca y otra con el método de secado optimizado.
Según lo observado en la figura 21 y puesto que el valor P = 0,0001 existe una
diferencia altamente significativa entre las medias de la muestra fresca y procesada,
29
por lo cual se puede observar que los contenidos de Delfinidina 3 sambubiosido 5
glucósido y de los demás antocianos presentes en maqui pueden ser monitoreados por
el método desarrollado en la presente memoria.
30
4. CONCLUSIONES
Fue posible la determinación y cuantificación de los 8 Antocianos presentes en
el maqui: delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido, delfinidina 3.5 diglucósido,
cianidina 3.5 diglucósido, cianidina 3 sambubiosido 5 glucósido, delfinidina 3
sambubiosido, delfinidina 3 glucósido, cianidina 3 sambubiosido, cianidina 3
glucósido mediante HPLC acoplado a un detector UV con arreglo de diodo.
Se logró desarrollar y validar un método de extracción, separación y
cuantificación para los ocho analitos en estudio. Los parámetros analíticos Ccα,
Ccβ, precisión y exactitud fueron los adecuados para los fines requeridos.
Se logró la aislación de 4 antocianinas, delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido,
delfinidina 3,5 diglucósido, delfinidina 3 glucósido y cianidina 3 glucósido.
El tratamiento térmico (secado convectivo) produce una pérdida del 40% de los
antocianos en el maqui y 55% de su capacidad antioxidante.
31
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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35
ANEXOS
36
Anexo 1. Fotografía del equipo HPLC/UV visible con arreglo de diodos utilizado para la determinación de antocianos.
37
Anexo 2. Patrón de cianidina 3 glucósido
38
Anexo 3. Cromatogramas de extracción etanol, metanol y agua respectivamente
Etanol
Metanol
Agua
39
Anexo 4. Curva de calibración de los 8 antocianos
40
Anexo 5. Curvas patrones de los 8 antocianos
41
Anexo 6. Curvas generadas para el cálculo de Ccα
Delfinidina 3 sambubiosido 5 glucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
10 3961791,61 5271350,89 4224516,16 5475769,24 4597318,86 5098475,41
20 4619760,92 4946611,63 4179993,49 5586569,79 4682008,31 4408906,41
40 5482232,64 8187239,00 5800322,16 7933579,21 6337121,31 7058849,22
80 10276723,45 11378781,48 10413447,9
0 11463182,9
3 11878761,2
9 10864370,37
100 14068593,14 12904279,86 12420769,7
6 13081804,4
1 14660616,8
5 13772858,75
Intercepto 2183115,83 3992213,72 2565657,79 4274664,01 2583919,78 3175864,13
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 0,96 0,98 0,98 0,99 0,98 0,97
Delfinidina 3.5 diglucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
200 22515820,23 22736637,63 23029792,32 22646139,34 22492646,83 22825382,16
400 43268344,37 41721964,49 42600839,47 42564874,50 39793043,72 41421570,44
600 57978358,20 61189337,84 59020779,09 61452893,27 64558319,02 62539210,75
800 74032183,52 79282745,59 83446040,90 86135874,48 77102246,30 85891409,54
1000 103987378,27 98850811,31 104582233,1 102176698,6 95115281,02 97839209,84
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 0,98 1,00 1,00 1,00 0,99 0,99
Cianidina 3.5 diglucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
100 11032235,93 10060345,87 11040396,22 10511869,34 10564163,83 10997907,05
150 16709489,83 15648481,16 15362091,48 14403328,33 15916089,02 16449318,34
200 19960947,28 18943537,35 18833437,16 19453680,66 20436320,55 19150674,13
250 24323662,25 23655118,80 25568757,92 24373484,05 23320447,98 24085780,37
300 31196724,00 29170979,72 26892971,94 30162889,44 30602628,10 30348897,99
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 0,99 0,99 0,97 1,00 0,98 0,99
42
(Continuación Anexo 6)
Cianidina 3 sambubiosido 5 glucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
30 3472026,39 3405991,55 3394537,53 3436164,29 3391744,90 3425154,92
70 7455328,59 7388788,62 7090341,71 7257029,35 7039957,39 7382668,54
100 9885426,16 9766434,94 10230939,99 10489331,63 9900183,97 9756356,61
150 15367907,25 14315811,89 15286181,82 15057304,67 14081567,92 15960695,49
200 19587907,82 20949927,92 18471419,49 20467479,06 19042727,48 21917128,76
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 1,00 0,99 0,99 1,00 1,00 0,99
Delfinidina 3 sambubiosido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
40 4540281,44 4522494,83 4505501,17 4483796,29 4421773,49 4494539,93
80 8314065,32 8260834,56 8036929,36 8102224,11 8114536,68 8351776,21
120 11672416,72 12221635,59 11811400,21 11457558,18 12667052,16 12048467,56
160 16978685,63 16781664,29 16146379,15 17178712,09 14932194,51 17464963,93
200 19705740,87 21136284,56 19201028,04 19487435,54 19579296,82 17817521,90
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 0,99 1,00 1,00 0,99 0,99 0,96
Delfinidina 3 glucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
100 11631629,21 11451976,78 11459719,4 11311636,5 11430375,2 11633466,31
150 16540737,9 16150417,68 15335057,8 16517352,8 16993494,2 16030696,48
200 21406799,4 21703639,87 21543503,9 21618354,9 21955570,1 21618257,75
300 28507530,63 31957156,79 32660315,7 30379182,3 31521747,3 29890908,2
400 40151704,46 39700039,38 41849506,5 44193552,3 43712106,2 41467470,69
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 0,99 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00
43
(Continuación Anexo 6)
Cianidina 3 sambubiosido
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
10 1204026,72 1194685,383 1148548,4 1228171,22 1147649,61 1179847,486
20 2250602,717 2118909,518 2224080,96 2144101,05 2131186,24 2114334,342
35 3582016 3342502,845 3464517,8 3720658,98 3589142,54 3686398,939
50 4952187,141 5304948,648 4909336,73 4648146,5 4868699,74 5207042,784
70 6997755,378 7533244,835 7218915,12 8288092,58 7530428,28 7195407,164
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 1,00 0,99 1,00 0,96 0,99 1,00
Cianidina 3 glucósido.
Concentración (ppm) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6
20 2336981,407 2389387,091 2318678,39 2321777,43 2303772,1 2283631,116
40 4199943,621 4248100,278 4091160,86 4005928,89 4038151,83 4232707,836
70 7349750,922 6966477,581 7059753,35 6667794,47 6936033,83 6649819,085
100 9884416,063 9100543,35 9811694,58 9633084,07 10377713,4 10451067,43
120 12277044,53 11113890,56 12144142,7 12696212 11620715,8 11866505,03
Intercepto 2244330,35 3819560,84 1350912,07 2205660,47 5045966,09 3754108,21
Pendiente 109974,09 90908,78 96843,04 88670,34 116944,91 101296,56
𝑅2 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 0,99
44
Anexo 7. Tabla con el cálculo del porcentaje de recuperación (exactitud)
Antociano Extracto (µg) Analito (µg)
Cantidad añadida
(µg) Analito
fortificado (µg) % R
Delfinidina 3 sambubiosido 5
glucósido 3439,76 774,47 700,62 1560,07 112,13%
Delfinidina 3.5 diglucósido 3584,41 849,71 730,09 1619,85 105,49%
Cianidina 3.5 diglucósido 865,16 198,55 176,22 405,68 117,54%
Cianidina 3 sambubiosido 5
glucósido 536,59 90,27 109,29 196,05 96,78%
Delfinidina 3 sambubiosido 639,45 137,58 130,25 294,21 120,26%
Delfinidina 3 glucósido 2222,66 536,50 452,72 1060,97 115,85%
Cianidina 3 sambubiosido 197,03 35,43 40,13 74,02 96,14%
Cianidina 3 glucósido 422,33 89,70 86,02 183,68 109,25%
45
Anexo 8. Curvas de secado a distintas temperaturas
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6
% H
um
edad
Tiempo (horas)
Curva de secado
80°C 70°C 60°C
46
Anexo 9. Gráfico de antocianinas totales en peso seco
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0 1 2 3 4 5 6
Co
nce
ntr
acio
n m
g/1
00
g
Cie
nto
s
Tiempo (horas)
Antocianinas totales
80°C 70°C 60°C Polinómica (80°C) Polinómica (70°C) Polinómica (60°C)
47
Anexo 10. Gráfico de capacidad antioxidante
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 1 2 3 4 5 6
Co
nce
ntr
acio
n (
mg/
10
0g)
Cie
nto
s
Tiempo (horas)
Capacidad Antioxidante
80°C 70°C 60°C
48
Anexo 11. Tukey para Delfinidina 3,5 diglucósido y cianidina 3 glucósido respectivamente
Fresco Optimo
Medias y 99,0% de Tukey HSD
Delfinidina 3 glucosido
-10
20
50
80
110
140
Con
cent
raci
on (p
pm)
Fresco Optimo
Medias y 99,0% de Tukey HSD
Delfinidina 3,5 diglucosido
-20
20
60
100
140
180
220C
once
ntra
cion
(ppm
)