des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. outils de mesure des contaminants des...
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Outils de mesure des contaminants des milieux lagunaires et marins. Delphine GUILLEBAULT (UMR LOMIC, Présidente de Microbia Environnement)TRANSCRIPT
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Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes
Delphine Guillebault
13 novembre 2013
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Des dinoflagellés Des diatomées
Des efflorescences d’algues toxiques
La biologie moléculaire, des bases de
données, des technologies de pointes
La diversité microbienne, les
empreintes génétiques et
chimiques
L’eau est le vecteur de nombreux microorganismes
ayant un impact sociétal et économique fort
Des bactéries
Des contaminations bactériennes
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• Révision des standards microbiologiques CE en 2015
• Augmentation de la population mondiale, réchauffement climatique avec (ré-) émergence de microorganismes indésirables pour l’homme
• Les questions:
Quelle qualité des eaux de consommation, d’élevage et récréatives?
Les réservoirs naturels?
Le recyclage de l’eau?
La réutilisation des eaux industrielles?
Des enjeux environnementaux…
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Un individu
Des gènes
Des séquences
Une identité
Le principe des bio-puces
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Quiestlàetcombiensont-ils?
Aujour’huiencatalogue:
Zig,Puce,Jules,Jimetc….
Ungène
Uneséquence
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304)
Une population
= un assemblage
d’individus
Un assemblage
d’individu
= un assemblage
d’identité
Le principe des bio-puces
Reconnaissance des
séquences par une sonde
spécifique
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Sondes hiérachiques:
Groupe
phylum
Classe
Genre
Espèces
Contrôle interne de présence de la cible
Choix d’un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques:
• molécule possédant des régions très conservée entre les différentes
espèces et moins conservée
• Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants
• Peu de transfert horizontal
• Très abondante
• Bases de données très riches et bien alimentées
Développement et/ou adaptation de sondes ciblant des micro-organismes d’intérêt
Ensemble de séquences
uniques
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Isolation des messagers RNA
Marquage
Fluorescent des RNA
Hybridation
sur la bio-puce
Échantillon
environnemental
ou issu de culture
Plus le signal
fluorescent est fort
plus la cible est
présente en grande
quantité
En pratique…. L’identification d’espèces à l’aide de sondes
Indicateur
d’activité
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Lame dotée d‘un revêtement
spécifique
Sondes immobilisées
(Oligonucleotides,
PCR-Fragments, cDNA)
ARN marqué
fluorescent
En pratique… Schéma d’une expérience d’hybridation de bio-puce
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En pratique…
Les résultats obtenus
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Objectifs:
Designer des sondes spécifiques ciblant des cyanobactéries et des diatomées toxiques, des
bactéries, virus et protozoaires pathogènes
=> participer aux efforts européens de surveillance des eaux côtières en matière de pathogènes véhiculés par l’eau douce à travers l’évaluation de la qualité microbiologiques de l’eau
Le projet européen MicroAQUA 7th Framework Programme
Theme: Innovative aquatic biosensors
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Group Pathogen
2stepdetectionrRNA
andtoxingeneon
micro-arrayglassclide
Standardprobeon
microtiterplateassay
Standardprobeon
microarrayglassslide
Standardprobeto
designedand
validated
Bacteria Campylobacter √
E.coliO157:H7 √
Legionella √
Mycobacterium √
Salmonella √
Shigella √
Aereomonasspp. √
Bacilluscereus1 √
Clostridiumbotulinum √
Clostridiumperfringens √
Listeriamonocytogenes √
Pseudomonaspp. √
Staphylococcusaureus √
Vibriospp. √
Yersiniaenterocolitica √
Cyanobacteria Microcystisaeruginosa x
Planktonthrix x
Nodulariaspumigena x
Anabaenaspp. x
Aphanizomenonflos-aquae x
Cylindrospermopsis x
Les micro-organismes ciblés dans ce projet:
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Une bio-puce dédiée à la
détection et la
quantification de
nombreuses cibles
microbiennes
La finalité du projet
Set de sondes spécifiques de
chaque cibles
Sondes hiérarchiques:
Groupe
phylum
Classe
Genre
Espèces
Impression des sondes sur
un support
Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue 2015-2016
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Grille
Super-grille
Cluster de
Super-grille
Dupliqua
Du cluster de
Super-grille
L’organisation d’une bio-puce
Impression des sondes sur
un support
Plusieurs millions de
spots (NimbleGen
Systems, Affymetrix,
Agilent Technologie)
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Toxine Anticorps
+ =
SPR CHIP SURFACE
Plus le signal est faible, plus il y a de
toxines dans l’échantillon
Un autre type de puce: les puces ciblant les toxines
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• Acide okadaïque
• Acide domoique
• Neosaxitoxine
• Saxitoxine
• Microcystine
• Anatoxines
• Cylindrospermopsines
• Nodularines
Les toxines détectées à l’aide de puces
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• Pyroséquençage 454: délai de plusieurs semaines
• Spectrométrie de masse: réponse en plusieurs jours et coût élevé
• Microscopie (LM & SEM): temps et expertise taxonomique, faible nombre
d’échantillons
• Hybridation FISH: une espèce à la fois parfois deux
• qPCR limitée à 8 espèces maximum (multiplexe), inhibitions fréquentes des
réactions d’amplification
Les avantages des bio-puces sur les autres méthodes
Bio-puces
• Nombre illimité d’espèces déposées sur la bio-puce avec possibilité
d’étudier facilement les nouvelles espèces
• Coût raisonnable 40 € par échantillon avec 2 réplicas et un nombre
d’espèces très important
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L’accès à ces technologies?
Une jeune société créée en Avril 2013 co-fondée par les Drs Carmem-Lara Manes et Delphine Guillebault (Présidente):
Microbia Environnement
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R&D
Commercialisation
produits
Prestation de services
Bio-puce diagnostic
algues toxiques,
microorganismes
pathogènes
Développement de bio-
puce et biocapteurs
diagnostic et aide au
transfert de technologies
similaires
Diagnostic biologique
et caractérisation
phylogénétique d’un
environnement naturel
ou industriel à façon
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Vente de la bio-puce MIDTAL ou de
la prestation MIDTAL pour la
surveillance des algues toxiques
Prestations de services: diagnostic, identification,
surveillance, valorisation, projets à façon
Développement technologique d’outils moléculaires de
détection
Commercialisation de bio-puces de diagnostic
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Merci de votre attention