der einfluß von stärke auf die aktivität der pyrophosphatase aus isolierten chloroplasten

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  • Planta (Berl.) 120, 155--162 (1974) 9 by Springer-Verlag 1974

    Der Einflu$ yon St/irke auf die Aktivit/it der Pyrophosphatase aus isolierten Chloroplasten*

    Brig i t t e K l e m m e und Gfinter J acob i

    Lehrstuhl f/ir Biochemie der Pflanze, Pflanzenphysiologisches Institut, Universit~t D-3400 GSttingen, Untere Karspiile 2, Federal Republic of Germany

    Eingegangen am 9. Juli / 4. August 1974

    The Inf luence of S ta rch on the A c t i v i t y of P y r o p h o s p h a t a s e f rom I so la ted Spinach Chloroplasts

    Sum~nary. The activity of the inorganic pyrophosphatase from isolated spinach (Spinacia oleracea L.) chloroplasts is strongly dependent upon the addition of magnesium ions. Since the complex of the bivalent ion with inorganic pyrophosphate is the real substrate, a definite Mg2+/Na~PeOT-ratio is required for maximum activity. When the activity was measured in par- ticle-free extracts from chloroplasts, this ratio was shown to be approximately 3. However, an increase up to 10 was observed in the presence of thylakoid membranes. Furthermore, the kinetics in the presence of broken chloroplasts becomes sigmoidal.

    The altered kinetics have been shown to be due to starch located in the thylakoids. The inhibitory effect is caused by amylose alone but not by amylopectin. Detailed kinetic analysis of the inhibition showed no influence of amylose on the Hill-coefficient. Since ethylenedia- minetetracetic acid was shown to have similar effects as amylose, starch might regulate the pyrophosphatase activity by binding Mg2+-ions.

    Einleitung Das V o r k o m m e n yon P y r o p h o s p h a t a s e n (PPasen) in hSheren Pf lanzen wurde

    wiederhol t durch Akt iv i t i t t smessungen in Homogena t en yon ganzen B1/fttern und auch in E x t r a k t e n von isol ier ten Chloroplas ten nachgewiesen (Naganna et al., 1955; Wessels und Bal tscheffsky, 1960; La tzko uud Gibbs, 1968; K a r n und Moudr ianakis , 1969; S immons und But ler , 1969; Burke, 1970; E1-Badry und Bassham, 1970; Gould und Winget , 1973;). Ki i rz l ich gelang es ers tmalig, eine spezifisch in den Chloroptas ten lokal is ier te Py rophospha t a se yon einer , ,cytoplas- ma t i schen" zu t r ennen und die Exis tenz yon mindes tens zwei I soenzymen mi t unterschiedl ichen kinet ischen Charak te r i s t ika zu beweisen (Klemme uud Jacobi , 1974). Ffir die Ak t iv i t s is t bei beiden E n z y m e n der Zusatz yon Mg ~+- Ionen erforderl ich. Da aber fiir die Max ima lak t iv i t i i t der gere in ig ten Enzympri~- p a r a t e ein Verhs von zugesetz tem Mg z+ zu P y r o p h o s p h a t (PP) yon e twa 2 - - 3 zu 1 bes teht , is t vor a l lem eine Wechse lwi rkung des b iva len ten Ions mi t dem Sub- s t r a t gegeben.

    Insbesondere durch Unte r suchungen mi t P y r o p h o s p h a t a s e n aus t ier ischen Geweben und aus Mikroorganismen wurde der Beweis e rbracht , dab das eigent-

    * Abki~rzungen: EDTA = ~thylendiamintetraessigs~ure (Na-Salz) ; Pa ~ anorganisches Phos- phat; PP=Na4PeOT; PP-ase=alkalische Pyrophosphatase; Tris=Tris(hydroxymethyl) aminomcthan.

    11 Planta (Berl.), Vol. 120

  • 156 B. Klemme und G. Jacobi

    liche Subs t r a t fiir die Py rophospha t a se der K o m p l e x zwischen P y r o p h o s p h a t und einem zweiwert igen Metal l ion ist (Naganna et al., 1955; Dixon and Webb , 1964; Josse, 1966; R a p o p o r t et al., 1972). Diese Ta t sache wird vor al lem ffir den Akt iv i - t i i t snachweis des E n z y m s in R o h c x t r a k t e n und in F r a k t i o n e n isol ier ter Organelle bedeutsam, in denen durch eine Komplex ie rung der Ionen durch andere Zell- bes tandte i le die appa ren te Mg2+-Konzentrat ion ve rminde r t wird. E in Beispiel hierfi ir wird in der vor l iegenden Arbe i t durch vergle ichende Akt iv i tg t smessungen mi~ isol ier ten Chloroplas ten und Chlorop las tenex t rak ten aufgezeigt und ein Beweis fiir die N a t u r der komplex ie renden K o m p o n e n t e erbracht .

    Material und Methoden Die Untersuchungen wurden mit isolierten Chloroplasten aus Spinacia oleracea durch-

    gefiihrt. Das Pflanzenmaterial wurde unter konstanten Bedingungen in einem halbklimati- sierten Raum bei 15 ~ C im Kurztag angezogen (Postius and Jacobi, 1971). Die Isolation der Chloroplasten erfolgte aus 4--6 Wochen alten Pflanzen nach Avron (1960). Ffir die Messungen warden die einmal gewaschenen Chloroplasten, die etwa 10--20% der Gesamteinheiten an PPase enthielten, direkt eingesetzt und mit der Aktivitg~t eines partikelfreien Chloroplasten- extraktes verglichen.

    Fiir die Herstellung des partikelfreien Extraktes warden die gewaschenen Chloroplasten in einem hypotonischen Medium (0.05 Tris-ttC1 Puffer, Ph 8,2) aufgenommen und 10 rain beschallt (20 kHz). Der nach Zentrifugation (30 min, 40000 gewonnene klare ?Jberstand enthielt die gesamte PPase-Aktivit~t und wurde als ,,partikelfreier" Extrakt verwendet.

    Die Aktivit~t der PPase wurde bei 37 ~ C in einem 1 ml Reaktionsgemisch mit der folgenden Zusammensetzung bestimmt: 60 mM Tris-HC1, pH 8,2; 1 mM PP; 0--20 mM MgCl~ und wenn nicht anders angegeben, 15 mg Chloroplastenprotein bzw. 3 mg Protein des partikelfreien Enzyms. Nach 3 rain Vorinkubation wurde die Reaktion durch Zugabe yon PP gestartet und nach 3 rain dureh Zugabe yon 0,5 ml HCIO 4 (10 % ) abgestoppt. In dem proteinfreien Uberstand wurde das aus PP freigesetzte Pa nach der Methode von Taussky und Shorr (1953) bestimmt.

    Die nach der Methode yon Whelau (1955) aus Chloroplasten isolierte und gereinigte Amy- lose wurde in 0,8 :N HC1 bei 80 ~ C im Wasserbad hydrolysiert. Die Amylose-Konzentration zu Beginn der Hydrolyse betrug 2,5 mg/ml. :Nach 0--200 min Inkubationszeit wurde die Hydro- lyse durch Zugabe yon festem Na~CO 3 gestoppt und die freigesetzte Glucose photometrisch mit ttexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase bestimmt (Bergmeyer, 1970). Ein Aliquot des jeweiligen Ansatzes wurde dem Reaktionsgemisch zur Bestimmung der PPase- Aktiviti~t zugestzt.

    Die St~rkemenge wurde mit K J naeh der yon Whelau (1955) beschriebenen Methode bestimmt.

    Protein wurde nach Lowry et al. (1951) mit t~inderserumalbumin als Standard gemessen.

    Ergebnisse 1. Abhiingigkeit der PPase-Aktivitiit von der Mg2+-Konzentration

    Die Abh~ngigke i t der PP-ase A k t i v i t ~ t yon der Mg2+-Konzentrat ion mi t Chloropl~sten und mi t dem par t ike l f re ien E x t r a k t ist in Abb. 1 dargestel l t . W~hrend die Max ima lak t iv i t~ t im E x t r a k t bei e inem 3 ~ 5 f a c h e n UberschuB an Mg 2+ re la t iv zu Pyrophosph~ t e rmi t t e l t wurde, ist das Verh~ltnis e twa 10:1, wenn im Ansatz n o c h T h y l a k o i d e en tha l t en sind. Bei der Messung mi t dem E x t r a k t folgt die Si~ttigung e inem hyperbo l i schen Verlauf im Sinne einer einfachen Michael is -Menten-Kinet ik , w~thrend un te r Zusatz yon Thylako iden eine sigmoide S/~ttigungskurve e rha l ten wird. Auf die kinet ische I n t e r p r e t a t i o n wird wel ter un ten eingegangen.

  • Einflul~ yon St~rke auf Pyrophosphatase 157

    -6 E

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    ./o oJ / j / / /

    10 20 9 , 5

    MgCI 2 ( raM)

    Abb. 1. Abh~ngigkeit der PP~se-Aktivit~Lt yon der Mg2+-Konzentration in Ans~tzen mit auf- gebrochenen Chloroplgsten (--o--) und mit partikelfreien Chloroplastenextrakten (--.--).

    Regktionsbedingungen s.a. Material und Methodik

    2. Ein/lufi yon Chloroplasten/ragmenten au[ die Aktivitdit von PP-ase

    I m weiteren wurden Versuehe durchgeftihrt, um Hinweise ffir die Ursaehe der Hemmung der PP-ase durch die Thylakoide zu linden. Es wurde zun~Lchst an eine Bindung yon bivalenten Ionen an die polaren Membranlipide, insbesondere an die Phospholipide, gedacht. Aus diesem Grunde wurden die Thylakoide mit verschie- denen apolaren LSsungsmitteln extrahiert und dem gelSsten Enzym wieder zuge- setzt. Die Zugabe der extrahierten Membranen zum paI~ikelfreien Uberstand f~hrte aber wieder zur Hemmung der Aktivit~t.

    Dai~ Membranbestandteile selbst keinen Einflul3 auf die PP-ase haben, wurde auch dutch Versuche mit Chloroplastenfragmenten, die durch Ultrasehall her- gestellt wurden, bewiesen. Isolierte Chloroplasten wurden in hypotonisehen Medien aufgebrochen und 10 rain bei 20 kHz beschallt. Da dureh die langfristige Besehal- lung die Thylakoide vollst/tndig desintegriert werden, sedimentieren die anfallen- den Vesikel nicht bei einer Zentrifugation yon 5000 g. Durch diese Behandlung wird aber eingeschlossene St~rke freigesetzt, die als festes Sediment im Zentri- fugenbeeher gewonnen wird. Wie Abb. 2 zeigt, hemmt nur das stSzkehaltige Sedi- ment, w~hrend der grfine Uberstand mit den Chloroplastenfragmenten keinen Effekt hat.

    3. Hemmung der PP-ase-Alctivitiit dutch Amylose

    Die St~rke wurde im weiteren gereinigt und in Amylose sowie in Amylopeetin aufgetrennt. Von diesen beiden Komioonenten der Assimilationssts erwies sich nur die unverzweigte Amylose als Inhibitor, ws Amylopeetin kaum einen EinfluI] auf die Aktivits hat (Abb. 3).

    11"

  • 158 B. Klemme und G. Jacobi

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    Abb. 2. Hemmung der PPase durch st/irkehaltige Thylakoide. --o-- st~rkefreie Chloroplasten- fragmente (Ultraschall) - - - - - st/~rkehaltige aufgebrochene Chloroplasten. Die Mg2+-Konzen - tration betrug 1 raM. 100% PPase-Aktivit~t entsprach 0,54 ~zmol freigesetztes Pa'min-1

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    St~rke (mg /m l )

    Abb. 3. Einflul~ yon Amylose (--.-

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