dall'analisi molecolare ai quadri clinici delle malattie lisosomiali
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Andrea Dardis, PhD Centro di Coordinamento Regionale per le Malattie Rare
University Hospital “Santa Maria della Misericordia” Udine, Italy
Dall'analisi molecolare ai quadri clinici della Malattie Lisosomiali
Circa 60 disordini dovuti a un difetto a carico di specifici enzimi lisosomiali o di proteine lisosomiali non enzimatiche transmembrana che determinano un accumulo di metaboliti non degradati all’interno dei lisosomi.
LE/Lysosomes
ER
enzima
Proteine di trasporto
Accumulo di macromolecole Danno cellulare ????????????
Malattie da accumulo lisosomiale
L’accumulo si osserva in diversi tessuti e organi
Manifestazioni fenotipiche complesse caratterizzate da associazione di sintomi viscerali, oculari, ematologiche, scheletriche
e neurologiche.
Forme infantili ed adulti
Malattie da accumulo lisosomiale
Più di 60 disordini ereditari
Prevalenza globale 1:8000 nati vivi
Eredità autosomica recessiva, a eccezione delle malattie di Fabry, di Hunter e di Danon (X linked)
Vengono classificate in base al substrato accumulato
Malattie di accumulo lisosomiale
Mucopolisaccaridosi Sfingolipidosi Glicoproteinosi altro
MPS I (Hurler, Scheie) Fabry Fucosidosi Def Multiplo Sulfatasi
MPS II (Hunter) Farber a-mannosidosi Def. Lipasi acida
MPS III A (Sanfilippo A) Gangliosidosi GM1 b-mannosidosi Galattosialidosi
MPS III B (Sanfilippo B) Gangliosidosi GM2 (Tay Sachs)
Schindler Glicogenosi II
MPS III C (Sanfilippo C) Gangliosidosi GM2 (Sandhoff)
Sialidosi Dannon
MPS III D (Sanfilippo D) Gangliosidosi GM2 (def GM2A)
Mucolipidosi II
MPS IV A (Morquio A) Gaucher (def bglu) Mucolipidosi III
MPS IV B (Morquio B) Gaucher (def Sap C) Mucolipidosi IV
MPS VI (Maroteaux-Lamy)
Krabbe Ceroidolipofuscinosi I
MPS VII (Sly) Leucodistrofia metacr. (def ARSA)
Ceroidolipofuscinosi II
Leucodistrofia metacr (def. SapD)
Ceroidolipofuscinosi 3
Niemann Pick A e B Ceroidolipofuscinosi 5
Niemann Pick C Ceroidolipofuscinosi 6
Ceroidolipofuscinosi 8
Deficit enzimatico Deficit di proteine non enzimatiche
Malattie di accumulo lisosomiale
Sospetto clinico
Ricerca di metaboliti Mucopolisaccaridi urinari (MPS)
Oligosaccaridi urinari (GSDII)
Test specifici enzimatici e/o molecolari
Chitotriosidasi plasmatica (Gaucher, NPA/B-C) Biomarkers
Non informativa in tutti i casi (mutazioni)
CCL18 Oxysterols (NPC-A/B, Wolman)
Deficit enzimatico 75%
Deficit di proteine non enzimatiche 25%
Malattie di accumulo lisosomiale
Dosaggio enzimatico Diagnosi molecolare
Diagnosi enzimatica
Nella maggior parte dei casi affidabile e rapida
Limiti
Non adatta alla prognosi e individuazione di portatori
Non sufficiente
3) Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori
2) In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)
1) Dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze enzimatiche
Non sufficiente
1-dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze enzimatiche
Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi
ATTIVITA ENZIMATICA MOLTO BASSA NON ASSOCIATA A MALATTIA
Arilsulfatasi A b-esosaminidasi a-iduronidasi a-glucosidasi a-galattosidasi a-fucosidasi b-glicuronidasi
Possibili errori nella diagnosi e consulenza genetica
Diagnosi enzimatica
In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)
Diagnosi enzimatica
Non sufficiente
XY Maschi emizigoti presentano un’attività della alfa galattosidasi A chiaramente patologica
XX Donne portatrici in eterozigosi, come conseguenza dell’inattivazione casuale del X, possono essere asintomatiche o sviluppare sintomi. L’attività enzimatica può risultare alterata o nella norma.
GM1
GM2
GM3
Ceramide
Globotriosylceramide
Glucosylceramide
Lactosylceramide
galactosylceramide Sfingomielina
HexA GM2 attivatore
Sialidasi a-Galactosidasi A
b-Galactosidase
Glucosilceramidasi
b-Galattosilceramidasi
Sulfatide
ARSA
SAP C
SAP B
SAP A
GM2 gangliosidosi
Leucodistrofia metacromatica
Krabbe Gaucher
•Difetto enzimatico
•Difetto di attivatore (rare) Attività enzimatica NORMALE
Non sufficiente Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori
Diagnosi enzimatica
Diagnosi molecolare
Unico strumento diagnostico nel 25% dei disordini
In casi di pseudodeficienze enzimatiche
In dosaggi di enzimi la cui funzione dipende
da attivatori
Donne con sospetta malattia lisosomiale
legata al X (Fabry)
Prognosi della malattia (attività enzimatica
non sempre correla con severità)
Determinazione dei portatori
Approfondimento della diagnosi
Certezza diagnostica
Consulenza genetica
Complementare la diagnosi enzimatica
Diagnosi molecolare
Assenza di mutazioni frequenti (mutazioni descritte: Fabry circa 600, Gaucher circa 300, NPC1 circa 400, ecc) la maggior parte “private”
Mutazioni puntiformi
Sequenziamento dell’intera zona codificante dei geni
Primo approccio
Geni da 5 a 30 esoni
Diagnosi molecolare
Ricerca di mutazioni puntiformi mediante sequenziamento
5’ 3’
1. PCR specifica degli esoni e zone introniche fiancheggianti 2. Sequenziamento automatico (Genetic Analyzer 3500XL, 24 capillari)
Diagnosi molecolare
c.1064T>C (p.L355P) c.2188 G>T (p.E730X)
Paziente con diagnosi enzimatica di glicogenosi 2. Autosomica recessiva - Gene GAA
Non riportata
Diagnosi molecolare
Le criticità
Mutazioni nuove : patogenetiche o polimorfismi (>1% nella popolazione normale)?
Ricerca nei database Studio di 100 alleli Saggi funzionali in vitro
Alleli complessi (2/+ mutazioni sullo stesso allele) Conferma nei genitori Clonaggio
Tutte le mutazioni devono essere confermate in una seconda PCR
Espressione in vitro delle muove mutazioni missenso e alleli complessi
Enzymatic activity Western blot
pcDNA3
GAA cDNA WT
pcDNA3
GAA cDNA mutant
site directed mutagenesis
0
20
40
60
80
100
120
WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T
% r
esidua
l GAA a
ctivity
76
110
95
70
WT ALDP
Expression of new missense mutations in COS-1 cells
c.1064T>C c.2104C>T GAA wt
Assenza di mutazioni in uno o entrambi gli alleli dopo sequenziamento della zona codificante
(circa 20% dei casi)
Mutazioni introniche profonde Delezioni parziali o totali di uno degli alleli
Delezioni parziali o totali di uno degli alleli
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
1 2 3 4 5
1 2 3 5
Mutazione intronica profonda
25 47 Kb 1
1-25 1-23
DNA
mRNA
24-25
RT-PCR
Sequenziamento
352nt 473 nt
121 nt del introne 23 rimangono ritenuti nel mRNA
Diagnosi molecolare
Campione DNA (cellule nucleate)
PCR di ogni esone
Sequenziamento automatico
mutazioni
Conferma nei genitori
Una o nessuna mutazione Mutazione intronica?? Delezione ???
Coltura di fibroblasti
Analisi del mRNA per mutazioni di slpicing
descritta
nuova
Patogenetica ???
MLPA
Diagnosi prenatale
E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia
Malattie autosomiche recessive: I genitori, entrambi portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto
Mamma (portatrice) Papà (portatore)
sano malato portatore
Diagnosi prenatale
Malattie X linked: le donne portatrici hanno una probabilità ½ di trasmettere il gene mutato alla prole
50% dei maschi affetti 50% delle femmine portatrici
Diagnosi prenatale solo nei maschi
Campione: Villo coriale (10-12^sett.) o amniociti (16^sett)
Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica
Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene presenti nella famiglia.
Solo utile in famiglie in cui le mutazioni sono state caratterizzate. Esclusione della contaminazione con DNA materno
Diagnosi prenatale
Esclusione della contaminazione con DNA materno
Analisi di microsateliti (STR)
Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra gli alleli portando ad un alto grado di polimorfismo
piccoli blocchi di ripetizioni in tandem,da 15-50 volte,semplici nella sequenza (1-6bp)e dispersi nel genoma
Sono numerosi
Analisi di microsateliti
Multiplex PCR Amplificazione di diversi (15) STR in contemporaneo utilizzando primers fluorescenti
Elettroforesi capillare (Genetic Analyzer 3500XL)
4000
3200
2400
1600
800
-
-
-
-
-
130 170 210 250 290 330 370 - - - - - - -
250 290
4000
3200
2400
1600
800
-
-
-
-
-
130 170 210 330 370 - - - - - - -
Madre
Villo
Madre
Allele 1 Allele 2
128 140
162 162
220 234
298 302
Villo
Allele 1 Allele 2
128 132
162 166
220 220
298 302
Next generation sequencing
Consente il sequenziamento simultaneo di un enorme numero di frammenti di DNA in tempi più rapidi e a costi più bassi
Targeted resequencing of genes involved in metabolic diseases In particular lysosomal diseases with similar phenotypes
Step 1 : DNA bank generation
Fragmentation
Genomic DNA
Ligation of adaptor and
index
Step 1 DNA library generation
Step 2 Clonal
amplification
Step 3 Sequencing
Genomic libray
Next generation sequencing 3 steps
A B
2-Amplificazione clonale
Next generation sequencing (NGS)
Support =FlowCell
Next generation sequencing (NGS)
3-sequencing by stnthesis (SBS)
Next generation sequencing (NGS)
4-Analisi
Immagini di fluorescenza Sequenze nucleotidiche (reads) “quality score”
Allineamento con la sequenza di riferimenti “Variant call “
L’accuratezza viene assicurata dalla lettura ripetuta e massiva di ogni frammento
deep coverage