Détection optique de biomolécules Détection optique de biomolécules uniques uniques

Maxime DahanMaxime DahanLaboratoire Kastler BrosselLaboratoire Kastler BrosselDépartement de physiqueDépartement de physiqueEcole normale supérieureEcole normale supérieure

Présentation généralePrésentation générale

• Microscopie de fluorescence• description simple d’un système fluorescent• sondes fluorescentes : colorants, GFP, nanocristaux

•Détecter une molécule unique• Rapport signal sur bruit, bruit de photon,…• Approches expérimentales

•Applications en biophysique• Résolution vs localisation : mouvement de la myosin V, microscopie ultrarésolution• « Motility assays »: myosine/actine, kinesine/microtubule, protéine/ADN• Mesure en polarisation: dynamique rotationelle de F1-ATPase• Relation Conformation/Dynamique : approche par transfert d’énergie de Forster et par transfert électronique – étude du répliement des protéines• Suivi de molécules uniques en cellules vivantes : diffusion membranaire, expression genique

Motivations :Motivations :« aller au-delà des valeurs moyennes « aller au-delà des valeurs moyennes

»»

• fluctuations statistiques :

En analysant molécule par molécule, on peut identifier et analyser les inhomogénéités dans

l’échantillon

Motivations (2) :Motivations (2) :pour analyser des processus pour analyser des processus

stochastiquesstochastiques

• fluctuations dynamiques :

En mesurant l’état d’une molécule au cours du temps, on peut déterminer les constantes

cinétiques qui gouvernent son évolution, même si on est à l’équilibre

k

k

k

k

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100

120

durée

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100

120

No

mb

re d

'éve

ne

me

nts

durée

k1

k1

t

Mesure d’ensemble :

kk

kpV

(cf. JFA – cours n°2)

HistoriqueHistorique

Canaux ioniquesCanaux ioniques

Neher et Sackmann (1976) [Prix Nobel 1991]

Mesures optiquesMesures optiques

• détection optique d’une molécule unique– mesure à basse température (1989)– mesure à température ambiante (1992-1994)

•premières expériences sur des biomolécules in vitro :– activité enzymatique d’une cholestérol oxydase (1998)– conformation de petites molécules d’ADN et ARN (1999)– activité d’une exonucléase (1999)

• premières expériences in vivo:– suivi de l’entrée d’un adéno-virus (2001)– diffusion latérale de canaux calciques (2001)– organisation membranaire de récepteurs dans des amibes Dictyostelium discoideum (2001)

Microscopie de Microscopie de fluorescencefluorescence

FluorescenceFluorescence

Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons.

excitation

La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus grande que plus celle d’absorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise → microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescenceMicroscopie de fluorescence

Il s’agit donc d’une détection sur fond noir

Voir des biomolécules en Voir des biomolécules en fluorescencefluorescence

• En général, les molécules biologiques (protéines, acides nucléiques,…) ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, GFP,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane).

• On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents :

couplage covalent (liaison chimique)

marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…)

clonage d’une protéine fluorescente

Modèle d’un système Modèle d’un système fluorescent fluorescent

à deux niveauxà deux niveaux

Description d’un système fluorescent à 2 Description d’un système fluorescent à 2 niveauxniveaux

fluor T

k1

AN

2303)(cm2

deskexck

|e>

|g>

Ihc

kexc

Tfluo est la durée de vie radiative

est la section efficace d’absorption

est le coefficient d’extinction

nrrdes kkk

La molécule peut se désexciter de deux manières différentes : en émettant un photon ou non radiativement.

Taux de fluorescence Taux de fluorescence

)saturation de (intensité hc

kkI

II

II

TPk

rnrs

s

s

fluoer

1

1

0 1 2 3 40,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Flu

ore

scen

ce (

a.u

.)

Intensité

1

ge

gexcedese

PP

PkPkdt

dP

Solution à l’état stationnaire:

0 1 2 3 40,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Flu

ore

scen

ce (

a.u

.)

Intensité

Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours d’avoir I << Is

Ihc

Q II s

, Pour

Cas limitesCas limites

fluodess T

k II 1

,Pour

A faible intensité, régime linéaire :

A forte intensité, régime saturée :

Efficacité quantiqueradiativenrr

r

kk

kQ

probabilité qu’un photon absorbé soit réémis

0 20 40 60 80

0,01

0,1

1

sig

nal

(a.

u.)

time (ns)

Etude résolue en tempsEtude résolue en temps

Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/Trep):

nrr kk

1

nrr

r

kk

kQ

tkk rnre )(

Si on connaît :

On peut déterminer kr et knr

Marqueurs fluorescents: Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, molécules, protéines,

nanocristauxnanocristaux

Fluorophores organiquesFluorophores organiques

Diagramme de JablonskiDiagramme de Jablonski

système à trois niveauxsystème à trois niveaux

On prend en compte l’état triplet

TISC

ISCfls kk

kkhcI

1

Green fluorescent proteinGreen fluorescent protein

Découverte en 1961 dans la méduse Aequorea Victoria, clonée en 1992

Absorption

Fluorescence

R. T

sie

n, F

EB

S L

ett. 2

005

Aussi, des mutants:• photoactivables, • dont l’émission change dans le temps• sensibles au calcium• indicateurs de la phosphorylation…

Autres mutants/ Autres couleurs :

Nanocristaux semiconducteursNanocristaux semiconducteurs

CdSe

ZnS Nanoparticules composées de 100 à100000 atomes of CdSe recouverts parune coquille de ZnS

2-5 nm

Des boites quantiques de quelques Des boites quantiques de quelques nanomètresnanomètres

Une particule dans une boite à 1 D :

Quels sont les niveaux d’énergie des électrons ?

²²²²Ln

m2nE

V(x)

0 L

)sin()(Lxn

L2xn

(en fait la boite est tridimensionnelle…)

Fonctions propres:

Energies propres:

Emission et absorption ajustable Emission et absorption ajustable avec la taille des nanoparticulesavec la taille des nanoparticules

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

350 450 550 650

Wavelength (nm)

(A

U)

2.2 nm CdSe

5.0 nm CdSe

absorption

Plus les particules sont petites, plus l’emission est décalée vers les courtes longueurs d’onde (grandes énergies)

LL

Semiconductor Quantum Dots

Longueur d’onde

taille

Excitation

ColorantNanocristal

Spécificités spectrales et photophysique des nanocristaux par rapport à des émetteurs

organiques

• emission etroite (quasi-atomique)• absorption large (solide)• photostabilité

Détection de molécules Détection de molécules fluorescentes uniquesfluorescentes uniques

Problème de détection: Problème de détection: quel est le rapport signal sur bruit ? quel est le rapport signal sur bruit ?

• Signal S de fluorescence (d’une seule molécule)

• Bruit B de variance de moyenne mB et de variance B:

1B

S

Sources de bruitSources de bruit

•Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise)

•Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée,…)

proportionnel à l’intensité lumineuse I

•Bruit électronique (courant d’obscurité, bruit de lecture,…)

indépendant de l’intensité lumineuse

2222

:tsindépendansont processus les

elecparphotontotal

elecparphotontotal BBBB

Bruit de Photon Bruit de Photon et Processus de Poissonet Processus de Poisson

On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un taux k sur un détecteur (une photodiode). On fait l’hypothèse que ce qui se passe entre t et (t+dt) est indépendant de ce qui se passe entre 0 et t (processus de Markov).

)()1),((

)()1),((

)(1)0),((

dtdtttN

dtkdtdtttN

dtkdtdtttN

oProb

oProb

oProb

Quel est la distribution du temps d’attente du premier evènement ?Quelle est la probabilité P qu’on ne détecte rien entre 0 et t ?

ktet )(

Quelle est la probabilité de détecter n photons durant le temps t ?

!

)(n

ktenNP

nkt (distribution de Poisson)

Distribution de PoissonDistribution de Poisson

!

)(n

kteNnP

nkt

Valeur moyenne :

ktn

ktennPnn

nkt !

)(

Variance : ktnnn 22

Bruit d’origine lumineuseBruit d’origine lumineuse

• Bruit de photons des molécules (non saturées):

• Bruit dû à la lumière parasite :

ItN par

ItS ItS 2

Itpar 2

Sources de bruit électroniqueSources de bruit électronique

• Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital

• Courant d’obscurité : du à l’apparition de Nobs photoélectrons à cause du bruit thermique (proportionnel au temps)

taN obsobs22

22 blec

taN obs2

Nombre de coups

lectureLumière incidente

Crée des photolélectrons

Rapport signal sur bruitRapport signal sur bruit

22 btaItkIt

kItS

B

Cas limite du « shot noise »:

kItS

B

0 10 20 30 40 50 600,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Sig

na

l (u

.a.)

Intensité I

Fluorescence des molécules Signal parasite (diffusé) Bruit électronique

Identifier un fluorophore uniqueIdentifier un fluorophore unique

Pour un fluorophore : photodestruction instantanée

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15

20

25

30

35

Flu

ore

sce

nc

e (u

.a.)

temps (s)(molécule de Cy3)

Possibilité de réduire le photobleaching avec des « oxygen scavengers »

Scintillement d’un nanocristal uniqueScintillement d’un nanocristal unique

Tableau comparatifTableau comparatif

TaillePhotostabil

itéAbsorption Stoechiometry

Cy3 1 nm ~ 5 s = 105 ++

GFP 2-4 nm~ 10-100

ms = 104 +++

QD10-30

nm> 20 mn = 106 +/++

Bille latex

100 nm1 µm

∞Diffusion

Contraste de phase

-

Approches expérimentalesApproches expérimentales

Champ procheChamp proche

Betzig (1992,1994)

Microscopie de champ lointain : Microscopie de champ lointain : microscopie confocale microscopie confocale

Mesure en diffusionMesure en diffusion

Chaque molécule qui traverse par diffusion le volume de focalisation émet des photons

Nie and Zare, Science (1994)

Détection de molécules uniques si :

Temps de diffusion:

Veff = 1x1x1 µm3 = 1 fl

C < 1 nM

t ~ L²/4D ~ 0.1-1 ms

0 500 1000 1500 2000 2500 30000

5

10

15

20

25

30

35

40

Nbe

de

cout

s en

0.2

ms

temps (ms)

(FCS: C = 5-10 nM)

Analyse des corrélations temporelles: FCS

Microscopie en balayageMicroscopie en balayageLaser

Photodiode, PM

Trou de filtrage

Objectif

On déplace le point de focalisation sur l’échantillon.

Inconvénient : le temps passé sur la molécule est bref

Taille de l’image : Np*Np pixels - Taille de la molécule : Nm*Nm pixelsFraction du temps passée à exciter la molécule : F = (Nm/Np)²

Exemple : taille d’un pixel : 200 nm, Np = 100, Nm = 4, soit F = 0,16 %

Si durée totale de l’image : 100 ms (10 µs/pixel), cela correspond à 160 µs.

Nm

Np

Microscopie en épifluorescenceMicroscopie en épifluorescence

On éclaire l’échantillon avec unelumière collimatée. Pour cela, on focalise la lumière dans le plan focal arrière de l’objectif.

Lampe UVou

Laser

CCD Camera

ProblèmeProblème

Dans un échantillon épais, on collecte la lumière de tous les plans de l’échantillon

profondeurchamp

Excitation

Objet dans le plan focal

Objet au dessus du plan focal

Objet en dessous du plan focal

Détection

Comment se débarasser de la lumière provenant des plans hors focus ?

Microscopie en onde évanescenteMicroscopie en onde évanescente

221

221 sin

41nn

d

d

z

eIzI

0)(

5.6233.15.1 21 cnn et

Angle critique : )/arcsin( 12 nnc

et 8.410.15.1 21 cnn d

62.5 65 170 nm70 100 nm75 83 nm

d41.8 50 84,4 nm60 57,6 nm65 51,8 nm

nm) ( 600

Il faut que l’objectif ait une ouverture numérique

supérieure à n2

69

5.1

)/arcsin(

max

1

1max

n

nNA

et 1.4 NA pour

Vérification expérimentaleVérification expérimentale

Sarkar, Atom et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12882-12886

Détection de molécules uniques Détection de molécules uniques dans structures nanofabriquéesdans structures nanofabriquées

Veff = 20x50x50 nm3 = 5.10-20 litres

Détection de molécules uniques si : C < 30 µM

Science 299, 682 (2002)

Permet de suivre l’activité enzymatique(ex. séquencage de l’ADN en molécules

uniques)