crystal structure of reduced and of oxidized peroxiredoxin-v2.0.pdf

7/28/2019 Crystal Structure of Reduced and of Oxidized Peroxiredoxin-V2.0.pdf

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Crystal Structure of Reduced andof Oxidized Peroxiredoxin IVEnzyme

Reveals a Stable Oxidized Decamer and a Non-disulfide-bonded Intermediate in the Catalytic Cycle

Lus Tavares; Miguel Gonalves; Ricardo Almeida


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Peroxirredoxina IV (Prx IV)

Peroxidase 2-Cys

Proteoantioxidante

ReticuloEndoplasmtico

Ciclo Reacional H2O2


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Ciclo Reacional

I.Reao com oH2O2

II.Formao daligao dissulfureto

III. Reduo daligao por membro

das PDI


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Alteraes Conformacionais

Forma reduzida Maior atividade peroxidtica

FF

(Fully folded)

Forma oxidada Mais facilmente reduzida por tioredoxinas

LU

(Locally unfolded)


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Objetivos do estudo

Melhor compreenso dasdiferentes formas enzimticas

Influncia no ciclo reacional


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Parte Experimental

Expressas em E. coli BL21-DE3;Produo

Resina Ni-NTA; Eluio Trombina (protease);Cromatografia de Afinidade

Leitura espetrofotomtrica; 280 nm (UV);Quantificao

Estado oligomrico das protenas r.;Cromatografia de ExclusoMolecular

Tavender, T. J. and Bulleid, N. J. (2010) Peroxiredoxin IV protects cells from oxidative stress by removing H2O2 produced during disulphideformation . J. Cell Sci. 123, 2672-2679


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Ensaio de Reduo da Prx IV

Prx IV + PDIAdio de

TCA

IncubaoCentrifugao

Resuspensodos pellets Aquecimento

ElectroforeseSDS-PAGE


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Ensaio de Hiper-Oxidao

Prx IV nativa oumutante

Tioredoxina+

TioredoxinaRedutase

Diferentes[H2O2]

Desnaturaoe Reduo

WesternBlotting


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Cristalizao de Protenas

Difraco de Raio-XD*TREK C245A oxidada

XDS Restantes Protenas

Mtodo da Gota Suspensa

Prx IV nativaMutante

C15A (oxid. ered.)

MutanteC245A (oxid. e

red.)

Arrefecimentocom N2lquido

Cristalografia de Raio-X


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Resultados


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Resultados

Caracterizao estrutural da Prx IV humana:

semelhana de outras Prx A forma reduzida corresponde a umdecmero (5 dmeros);

Em forma de Donut com as extremidades N-terminal voltadas para ointerior e as extremidades C-terminal para o exterior.

Ao contrario de outras Prx, quando no estado oxidado, o decmerocontinua a ser estvel e com arranjo quase igual ao da forma reduzida


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Resultados

Folha central rodeada de -hlices;

1 e 8 interagem com o monmero vizinho; Cistena peroxidtica na hlice 2; Hlice 6 e 2sofre um rearranjo espacial na forma oxidada.

Forma OxidadaForma Reduzida


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A Estabilidade do decmero na PrxIV pode dever-se a:

Interaces que ocorrem entre os monmeros devido hidrofobicidade de alguns aminocidos das cadeias laterais;

Alterao conformacional das hlices 6 e 2.

Resultados


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Caracterizao estrutural da PrxIV mutante(C51A):

Cys245 substituda por uma Ala; O decmero continua estvel; Estrutura semelhante protena normal; Mais insensvel hiper-oxidao.

Resultados


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Resultados

Forma sulfeniladaForma Reduzida


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ResultadosA quando da remoo do agente de reciclagem ainsensibilidade da protena normal foi idntica protenamutada.


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Resultados

Consequncias da remoo da hlice do C-terminal ereciclagem:

A cistena peroxidtica torna-se mais resistente hiper-oxidao;

A desorganizao da 6

pode servir de sinalizador s PDI;

As PDI no se ligam protena.


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Resultados


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Na forma reduzida e oxidada a estrutura decamrica mantm-se; A substituio da cistena da hlice N-terminal por uma alanina a

forma decamrica mantm-se;

Discusso/Concluso

Esta substituio leva a diminuio de hiper-oxidao


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As PrxIV possuem uma extenso na extremidade N-terminal;

A alterao conformacional na passagem da forma reduzida para aforma oxidada expe aminocidos hidrofbicos;

Discusso/Concluso

Aumenta a estabilidade do decmero


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Bibliografia Cao, Z.; Tavender, T. J.; Roszak, A. W.; Cogdell, R. J. and Bulleid, N. J. (2011) Crystal

Structure of Reduced and of Oxidized Peroxiredoxin IV Enzyme Reveals a StableOxidized Decamer and a Non-disulfide-bonded Intermediate in the Catalytic Cycle. J.Biol. Chem.286, 42257-42266

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