CROMATOGRAFÍA

Mikhail Tswett, 1906Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico

CROMATOGRAFÍA

Separación de los

componentes de una mezcla

(muestra), disueltos en una

fase móvil a medida que se

van desplazando con

diferente velocidad a través

de una fase estacionaria

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:

Fase Móvil- Gaseosa (Cromatografía de

gases)- Líquida (Cromatografía Líquida)

Fase Estacionaria

- Líquida (inmovilizada, soporte)- Sólida

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

CRITERIOS DE SEPARACIÓN:

1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil y estacionaria en función de sus características. La composición de la fase móvil es constante.

2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la composición de la fase móvil para eluirlos.

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

1.SOLUBILIDADFase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil

apolar

Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar

2. TAMAÑO (exclusión molecular)Fases móvil y estacionaria líquidas idénticasseparadas por una especie de tamiz o malla

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

1. INTERCAMBIO IÓNICOFase estacionaria positiva: Intercambio aniónicoFase estacionaria negativa: Intercambio catiónico

2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICAFase estacionaria hidrofóbica

3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICAFase estacionaria con ligandos inmovilizados

4. ADSORCIÓN INESPECÍFICAhidroxiapatita, colorantes inmovilizados

TIPOS DE CROMATOGRAFíA

Tipo de interacción/reparto

Tipo de cromatografía

Reparto Solubilidad •Fase Normal•Fase Reversa

Tamaño •Exclusión Molecular

Interacción Electrostática •Intercambio aniónico•Intercambio catiónico

Hidrofóbica

Afinidad biológica •Ligandos inmovilizados•Inmunoafinidad

Afinidad inespecífica

•Hidroxiapatita•Colorantes

FORMATO

1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados(HPLC)

2. “BATCH” o TANDAS

3. SUPERFICIES PLANAS

- Papel - Capa fina (TLC, thin layer

chromatography)

TERMINOLOGÍA

• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico)

componente estático de la cromatografía

• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar

• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos

• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

TERMINOLOGÍA

• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de

elución. Representación gráfica de la cuantificación de

solutos en el eluído de una columna

• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa

a través de la columna hasta que sale cada soluto

• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una

molécula que viaja a través de la columna con la

velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún

retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Bomba(s)

Registrador

Detector

(UV)

Colector de

fracciones

CO

LUM

NA

Solventes

(fase móvil)

Inyector

Mezclador

HPLC:High Performance Liquid

Chromatography

Waters, MilliporeWaters, Millipore

Perceptive BioSystems, BioCAD Perceptive BioSystems, BioCAD

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE HPLC

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA(manual)

SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIÓN

ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS MEDIANTE DIÁLISIS

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

VT = Vo+ Vi + Vg

Volumen total

de líquido (Vt)

Volumen de líquido

en los intersticios (Vo)

Volumen de líquido

en las partículas (Vi)

Volumen ocupado

por la matriz (Vg)

Volumen de elución (ml)20 40 60 80 100 120

0.0

2.0

Abs

orba

ncia

(28

0 nm

)

Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño

Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000 Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000 Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000

Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000 Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000 Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000

Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000 Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000 Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Estimación de masas moleculares

20 40 60 80 100 1200.0

2.0

A2

80

nm

Volumen de elución (ml)20 40 60 80 100 120

0.0

2.0

A2

80

nm

67 kD

43 kD

25 kD

14 kD

Log Mr

Vo

lum

en

de

elu

ció

n (m

l)

Recta de calibradoMarcadores de masa molecular

Proteína problema

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

VENTAJAS:

• Flexibilidad en cuanto a solvente

• Condiciones poco agresivas

• Proporciona información estructural

INCONVENIENTES:

• Poco resolutiva, debido a difusión

• La muestra se diluye

• Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños

Etapas finales de protocolos de purificación

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Columnas de “desalado”

Volumen de elución (ml)

0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.20.0

2.00.3 kD

120 kD

• Cambio de solvente

• Purificación de fragmentos de DNA marcados

(fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD

INTERCAMBIO IÓNICO

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO

SOPORTES:

• RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno)

- Densidad muy alta de grupos

intercambiadores

- Muy hidrofóbicas: desnaturalización

de biomoléculas

- Eliminación de impurezas iónicas de

solventes químicos y de tampones

Purificación de agua

•POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

-CH2CH2-N-H

CH2CH3

CH2CH3

+

-CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3

CH2CH3

CH2CH3

+

--CH2CH2-CH2-SO3

--CH2-COO3

Intercambiador Tipo Grupo cargado Abreviatura

De aniones

Fuerte

Dietil-2-hidroxipropilamino etilo

QAE

Débil

Dietilamino etilo

DEAE

De cationes

FuerteSulfo propilo

SP

Débil

Carboxi metilo

CM

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

pH

carga

+

-

aniónicofuerte(QAE)

aniónicodébil

(DEAE)

catiónicodébil(CM)

catiónicofuerte(SP)

INTERCAMBIO IÓNICO

[Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)]K=

[Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]

Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+)

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

1. Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales

2. Adsorción. Baja fuerza iónica. Intercambio aniónico, pH >pI Intercambio catiónico, pH < pI

3. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción.

4. Elución. Modificación de la fase móvil: aumento de fuerza iónica

pH

pI

+

-

INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE DISCONTINUO

Número de fracción

20 40 60 80 100 120

0.0

0.5

0.0

[NaCl](M)

- - - -

2.0A

bsor

banc

ia (

280

nm)

INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE LINEAL

Número de fracción

20 40 60 80 100 120

0.0

0.5

0.0

[NaCl](M)

- - - -

2.0A

bsor

banc

ia (

280

nm)

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Número de fracción20 40 60 80 100 120

0.0

1.0

0.0

2.0

Abs

orba

ncia

(28

0 nm

)

[Sal](M)- - --

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas

(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN-

(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

FORMATO

1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados(HPLC)

2. “BATCH” o TANDAS

3. SUPERFICIES PLANAS

- Papel - Capa fina (TLC, thin layer

chromatography)

CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS

- Papel

- Capa fina (TLC, thin layer

chromatography)

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras de celulosa del papel

- Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla)

Cromatografía de reparto, fase normal

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

• Aplicación de la muestra: volumen mínimo

• Desarrollo de la cromatografía: Extremo

sumergido en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de

la muestra. Recipiente cerrado herméticamente.

Ascendente/descendente

• Detección de las sustancias separadas: – Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)

– Tinción

– Autorradiografía (compuestos radiactivos)

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Optimización de cromatografía en papel

• Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de

sólido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o

cristal.

• Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel

VENTAJAS DE LA TLC

Característica Efecto Ventaja

Fase estacionaria finamente dividida

Elevada acción capilar Rapidez de desarrollo

Elevada superficie de contacto f. móvil f.

estacionaria Eficiencia cromatográfica

Sensibilidad

Ausencia de estructura fibrosa

Reducida dispersión de los solutos durante

aplicación y desarrollo

Válida cualquier fase estacionaria que pueda

ser pulverizada

Versatilidad

MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC

Método Aplicación Color

Inespecífico

Vapores de Iodo C. orgánicos Pardo-amarillento

H2SO4 + calor C. orgánicos Negro (carbonización)

Específico 2,4-dinitrofenilhidrac

ina

C. carbonílicos

Naranja

AgNO3/OH- C. carbonílicos

Marrón

Ácido iodoplatínico

Bases Púrpura-negro

Verde de bromocresol

Ácidos Verde-amarillento

Ninhidrina Aminas 1rias (aminoácidos

)

Azul-violáceo

Rodamina 6G Lípidos fluorescencia

FACTOR DE RETARDO (Rf)

origen

Frente del solvente

soluto

Rf =Distancia migrada por el soluto

Distancia migrada por el frente

TLC BIDIMENSIONAL1ª

dim

ensi

ón

punto de aplicación

2ª dimensión

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

+ glucose

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

1. Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales.

2. Adsorción. Alta fuerza iónica.

3. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción.

4. Elución. • Competición con ligando libre

• Desnaturalización (pH, temperatura, agentes caotrópicos)

Número de fracción20 40 60 80 100

0.0

2.0

Abs

orba

ncia

(28

0 nm

)

Adición de ligando libre

LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Ligando Aplicación 2’,5’-ADP Deshidrogenasas dependientes de NADP+

5’-AMP Deshidrogenasas dependientes de NAD+ Arginina Serín-proteasas

Benzamidina Serín-proteasas Calmodulina Quinasa, proteínas dependientes de calmodulina

Concanavalina A (ConA) Glicoproteínas, polisacáridos ADN ADN y ARN polimerasas

Gelatina Fibronectina

Heparina Factores de coagulación, lipoproteínas, enzimas específicas de ADN y ARN

Lectinas Glicoproteínas, polisacáridos

Lisina Plasminógeno, ARNr

Proteína A Anticuerpos (IgG) Proteína G Anticuerpos (IgG)

Poli-(U), Poli-(T) Poli-(A), ARNm Poli-(A) Poli-(U)

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA

1. Activación del soporte

2. Anclaje covalente del ligando

3. Bloqueo de grupos reactivos

remanentes

+ CNBr

OH

OH

agar

osa O

O

+ NH2-ligando O-C-NH-ligando

OH

NH

agar

osa

=

C=N

agar

osa

PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

INMUNOPRECIPITACIÓN

INMUNOPRECIPITACIÓN