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Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Laboratório de Sistemas Biomoleculares
Departamento de FísicaIBILCE-UNESP
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A cristalografia de raios X revela as posições tridimensionais da maioria dos átomos em uma molécula de proteína.
As características da estrutura terciária revelam muito sobre as funções das proteínas e suas evoluções.
Aspectos Gerais
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Para que obter cristais de macromoléculas?
O objetivo da cristalização de uma
macromolécula biológica, tal como, proteína ou
ácido nucléico, é o estudo estrutural dessas
macromoléculas, pelo método de difração de
raios X.
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Purificação da Macromolécula
Cristalização
Coleta de Dados
Densidade Eletrônica
Refinamento do Modelo
Estrutura
Resolução de Estrutura
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•Toxinas:problemas vasculares, processos inflamatórios, mecanismos de dor, processos alérgicos, asma bronquial drogas anti-trombóticas e drogas anti-convulsivante
Estrutura cristalográfica de toxinas do escorpião Hottentottajudaica (esquerda) e da bactéria Clostridium tetani.
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• Quinases: Sua função é ativar ou desativar cada etapa do ciclo celular, desde a duplicação do DNA até a separação em duas células→ drogas contra o câncer.
Estrutura terciária da quinase dependente de ciclina humana (CDK).
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• Hemoglobinas: compreensão dos mecanismos funcionais de Hbs normais e mutantes, bem como, Hbs talassêmicas e relacionadas à anemia.
Estrutura quaternária de hemoglobinas, do lobo guará (esquerda) e humana (direita).
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Princípios Gerais para Cristalização de
Macromoléculas Biológicas
Parte crítica: obter cristais.
Cristais de INHA de Mycobacterium tuberculosis, PNP humana e Hemoglobina do peixe Hoplosternum littorale.
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Pureza da Macromolécula
• A purificação é um ponto importante para a cristalização;
• A cristalização de uma amostra de proteína não pura, resulta em cristais pequenos e mal formados;
• Uma amostra de macromolécula deve estar, no mínimo, 97% pura e um cristal deve ter, no mínimo, 0,2mm de tamanho.
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Cristais pequenos e/ou mal formados
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Estabilização e Armazenamento
• Armazenadas em soluções com propriedades próximas às do meio celular;
• A desnaturação é minimizada evitando-se condições extremas de pH e temperatura;
• Agentes bactericidas ou fungicidas podem ser adicionados.
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Nucleação, Crescimento e término do crescimento.
• Nucleação: formação dos primeiros agregados ordenados. Requer um estado de supersaturação.
• Crescimento: É o aumento do cristal.
• Término do crescimento: Desconsiderando algumas causas, tais como, remoção da macromolécula do meio de cristalização, tem-se: defeitos de crescimento, defeitos das faces, envelhecimento da macromolécula, etc.
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Cristais imperfeitos
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Fatores que Afetam a Cristalização
• Temperatura: a solubilidade de uma proteína édependente da temperatura, assim, é necessário que os experimentos de cristalização sejam realizados em temperatura constante;
•pH: proteínas são polieletrólitos com uma carga líquida que varia conforme o pH. Quando a carga líquida de uma proteína é nula, a proteína apresenta uma maior facilidade em se agregar;
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• Compostos Orgânicos e Polímeros: os polietilenoglicóis
influenciam na cristalização diminuindo a atividade de água,
ou seja, diminuindo a quantidade destas moléculas em
solução e assim, a solução é levada a um estado de
supersaturação;
Força Iônica: Os sais podem diminuir ou aumentar a
solubilidade de uma proteína;
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Efeito de Solubilização por Sais
Salting-inOs íons interagem com os grupos iônicos das moléculas, diminuindo as interações soluto-soluto e, aumentando a solubilidade.
Representação esquemática da solubilização por salting-in.
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Salting-out
Os íons atraem as moléculas de água resultando em menor disponibilidade das mesmas para realizar interações com as moléculas de proteína.
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Diagrama de fases de Macromoléculas Biológicas
Representação do diagrama de fases de macromoléculas biológicas
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Técnicas de Cristalização
O método da Matriz Esparsa
• Dra. Jaru Jancarick (UC Berkeley);
• Diversas condições são testadas;
•Três parâmetros como variáveis principais:pH, aditivos e agentes precipitantes
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SaisTartarato de Sódio e Potássio; Fosfato de Amônio; Sulfato de Amônio;
Acetato de Sódio; Sulfato de Lítio; Formiato de Sódio e Potássio; Citrato deSódio; Formiato de Magnésio.
Não Voláteis
MDP;PEG 400; PEG1500; PEG 4000; PEG 8000
Voláteis
2-Propanol
Mistura
Sulfato de Amônio+PEG; 2-Propanol + PEG
Aditivos
Cloreto de Cálcio, Citrato de sódio, Cloreto de Magnésio, Acetato deAmônio, Sulfato de Amônio, Acetato de Magnésio, Acetato de Zinco e
Acetato de Cálcio.
Faixa de pH
4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5
Tabela 1. Componentes do método da matriz esparsa.
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Kits para cristalização da Hampton Research®
Screens
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Cristalização em Batch
A macromolécula é misturada ao agente cristalizante atingindo a supersaturação instantaneamente.
Representação da cristalização em batch.
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Cristalização por Difusão de Vapor
A supersaturação é alcançada por meio da difusão das espécies voláteis.
Representação da montagem de uma gota de cristalização.
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Passos para montagem de um placa de cristalização
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Análise das gotas de cristalização
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Cristalização por Diálise
A solução precipitante pode ser facilmente trocada.
Cristalização de proteínas por diálise.
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Cristalização por Microdiálise
Cristalização de proteínas pelo processo de microdiálise.
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Melhoria das Condições de Cristalização
Passo 1) Diminuição da concentração da macromolécula.
Após uma semana, se não houver melhora nos cristais:
Passo 2) Manter a concentração da macromolécula biológica e
abaixar a concentração do agente precipitante.
Após uma semana, se ainda não houver melhora nos cristais:
Passo 3) Tentar microssemeadura ou macrossemeadura, ou
tentar variar a temperatura.
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Cristais adequados para coleta de dados de difração de raios X
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Como identificar cristais de proteínas?
Cristais de proteína corados com Izit
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Cristalização Coleta de dados
LNLS Difração de raios X
Resolução da estrutura
cristalográficaAnálise
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Montagem dos cristais
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Analisando o modelo
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Qual o grande objetivo da cristalografia de proteínas?
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Cristalizando proteínas na presença de ligantes
Há duas alternativas:
• por co-cristalização, incubando-se a proteína com
o(s) ligante(s)
• Soaking, adicionando o(s) ligante(s) no cristal já
formado
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Desenho de Drogas
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Sítio ativo da PNP humana, na presença do substrato e na presença de um inibidor.
Inosina Imucilina H
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Mapa de densidade eletrônica da região do sítio ativo da PNP humana na presença de ligantes.