crea estrazione del dna da matrice vegetale longo - de pascale
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A.S. 2015/2016 CLASSI TERZE LICEO Responsabile: Prof.ssa Laura Persico
ESTRAZIONE DEL DNA DA MATRICE VEGETALE
Attività svolta presso l’Unità di ricerca di Turi (BA) del:
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Prelievo delle foglie giovani di vite, posizionate in fogli di carta stagnola (numerati).
Rilevazione del peso dei campioni con la bilancia analitica
e prelievo di circa 100 mg, inserimento in delle apposite
provette (eppendorf) insieme a delle biglie di tungsteno.
L’estrazione del DNA da una cellula vegetale richiede dei pas-
saggi aggiuntivi rispetto a quella animale poiché presenta una
membrana esterna detta parete cellulare, la quale garantisce e
preserva la struttura e il nutrimento della pianta.
Rottura della parete cellulare
Congelamento dei campioni in azoto liquido, per agevola-re la rottura della parete.
Rottura meccanica dei tessuti cellulari grazie all’agitatore Tissue Lyser, il quale con oscillazioni orizzontali fa muove-re le biglie all’interno delle provette favorendo la lacera-zione delle foglie e l’omogeneizzazione dei tessuti.
Dopo aver rotto la parete esterna, si procede con la lisi della
membrana interna:
Aggiunta della mix buffer AP1+RNase per favorire la rottura delle membrane e l’eliminazione dell’RNA;
Utilizzo del vortex per mescolare vigorosamente il contenuto delle provette;
Incubazione in un bagnomaria alla temperatura di 65°C.
Lisi delle cellule
Precipitazione e allontanamento
delle proteine e polisaccaridi
Aggiunta del Buffer AP2 (130µl) e miscelazione;
Incubazione per 5 minuti in ghiaccio;
Centrifugazione per 5 minuti alla velocità di 14000 rpm.
Eliminazione dei precipitati e
dei detriti cellulari
Trasferimento della soluzione ottenuta in colonnine (lilac spin column) con dei particolari filtri che per affinità trattengono gli scarti della cellula e fanno passare il DNA;
Centrifugazione per 2 minuti alla velocità di 14000 rpm,
Legame del DNA alla membrana
della colonna cromatografica
Trasferimento dell’eluato (contenente il DNA) in provette da 2ml e aggiunta del Buffer AP3 con etanolo per favori-re la precipitazione del DNA. Trasferimento in colonnine con affinità per il DNA.
Lavaggi della membrana alla
quale è legato il DNA
Eliminazione dell’eluato e aggiunta sul filtrino della colon-
nina del Buffer di lavaggio AW (500µl) centrifugazioni di 1
minuto a 8000 rpm per garantire una maggiore efficacia del
processo. I lavaggi vanno ripetuti 2 volte.
Eluizione del DNA della colon-
na cromatografica
Aggiunta del Buffer AE (40 µl + 30 µl);
Incubazione per 5 minuti a temperatura ambiente; Centrifuga di 1 minuto a 8000 rpm.
Lettura allo spettrofotometro
per misurare la quantità del
DNA estratto e valutarne la qua-
lità
Ottenuto il DNA, è necessario quantificarlo e valutarne la pu-
rezza mediante lettura allo spettrofotometro, eseguendo
letture a 230,280,260 nm.
La quantità del DNA viene valutata in base all’assorbanza a
260 nm.
La purezza del DNA si ricava dai rapporti tra le assorbanze
230,280,260 nm:
il rapporto A260/A280 ci permette di valutare la contami-
nazione da proteine (deve essere intorno a 1,8);
Il rapporto A260/A230 ci permette di valutare la contami-
nazione da carboidrati e fenoli (solventi organici). Deve
mantenersi intorno a 2,2.
Un ringraziamento speciale al CREA di Turi e ai ricercatori:
Fiammetta Alagna, Maria Francesca Cardone e Carlo Bergamini.
A cura di:
Giuseppe Longo Claudia De Pascale