cours m1 - 2012
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Cours M1 - 2012. Introduction aux techniques de biologie moléculaire Partie 2. Western-blot. Extraction des protéines: Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases - Tris-HCl Séparation fraction/extraits totaux - Centrifugation - Ultracentrifugation. Surnageant = Protéines. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Cours M1 - 2012
Introduction aux techniques de biologie
moléculairePartie 2
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Western-blot
Extraction des protéinesEchantillon d’origine:
Tissu (foie, cœur, etc…)
Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)
Extraction des protéines:
Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases
- Tris-HCl
Séparation fraction/extraits totaux
- Centrifugation
- Ultracentrifugation
Débris cellulaires
Surnageant = Protéines
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Western-blot
Dosage des protéines
- Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry:Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nmPeu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite
- Méthode de Bradford:Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe)Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm)Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents
- Méthode BCAAcide bicinchoniqueFormation complexe coloré avec Cu+Couleur violette, pic abs à 562 nmTrès sensible, rapide, compatible avec les détergents
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Western-blot
Dosage des protéines: exemple
Solution d’Albumine bovine à 1 mg/mL
Dilution en séries
Mesure au spectrophotomètre
Concentration
DODroite étalonnage
DO échantillon
Conc échantillon
Echantillon à doser Distribution
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Western-blot
Dépôt et migration des échantillonsGel SDS-page
Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
Gel de séparation (pH 8,8) 5-15% acrylamide
Gel de concentration (pH 6,8) 5% acrylamide)
Sens de migration
+ pourcentage est élevé+ densité réseau est élevée+ mailles sont serrées
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Dépôt et migration des échantillons
Solution de dépôt:
- Tampon HCl pH 6,8 Idem gel de concentration
- Bleu de bromophénol Suivi de la migration
- Glycérol Densifier l’échantillon
Western-blot
Séparation selon le poids moléculaire des protéines
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Western-blot
Coloration du gel Contrôle de l’homogénéité de la migration
Vérification de la présence de protéines
Bleu de Coomassie (coloration homogène)
Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)
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Western-blot
Transfert sur membrane
- Pression, application d’un courant
- Fixation des protéines de façon non-spécifique:
- Interactions ioniques
- Interaction hydrophobes
- Membranes nitrocellulose / PVDF
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Western-blot
Coloration de la membrane
Contrôle de l’efficacité du transfert
Contrôle de l’homogénéité des dépôts
Coloration réversible
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Les fluorochromes
Immunocytochimie
Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption
- un spectre d’émission
Ex: Fluorescéine
Absorption des radiations bleues (max 490 nm)
Émission d’une fluorescence verte (max 520 nm)
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Les fluorochromesDiagramme de Jablonski
Immunocytochimie
S0État fondamental
S1État excité
Niveau d’énergie des
électrons d’une
molécule fluorescente
LaserAbsorption
Fluorescence
Emission
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Étude des facteurs de transcriptionElectrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Gel retard
Facteur de transcription
activé
Recrutement du complexe d’activation de
la transcription
ADNSéquence de
fixation spécifique
GèneTATA box
Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible
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Principe (1)
Gel retard
Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.
Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.
Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la forme radioactive.
Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard plus important sur le gel appelé " supershift ".
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**
Sonde libre
Principe (2)
Gel retard
**
**
**
Sondes spécifiques marquées au P32
+
Protéines nucléaires extraites
- Fixation de la protéine sur sa séquence cible- Élimination des autres
Dépôt sur un gel natif
** *
**
*
**
Sonde + protéine
**
Sonde + protéine + Ac= « Super-Shift »
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Résultats
Gel retard
Extraits nucléaires de cellules Hela
Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires
- Manipulation de la radioactivité
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Le microscope à fluorescence
Immunocytochimie
Filtre correspondant au fluorochrome utilisé
Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les
radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine:
490 nm)
Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations
absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
Filtre d’émission (6): ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
1-lampe à arc 2-filtre d'excitation
3-miroir dichroïque 4-objectif
5-préparation 6-filtre d'émission
7-oculaire
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Le microscope à fluorescenceEx: Fluorescéine
Immunocytochimie
Le filtre d'excitation sélectionne les
radiations spécifiques du fluorochrome...
...qui sont réfléchies par le miroir et
éclairent l'échantillon...
...celui-ci émet les radiations de fluorescence
qui seules atteignent l'oculaire.
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small interfering RNA (siRNA)
siRNA
ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique
conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en
protéine
Mécanisme très spécifique
Permet l’étude des gènes
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RNA interférence
siRNA
ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA)
DICER
Complexe RISC (RNA-Induced Silencer Complex)
Elimination d’un des brins du siSNA, dit « passager »
Ciblage des ARNm de la cellule possédant une séquence complémentaire
DICER Ribonucléase qui clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 pb
Clivage de l’ARNm cible par RISC
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- Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible Mécanisme très spécifique
- Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage
RNA interférence
siRNA
- Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip
- Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine
Frede et al., 2005Anand et al., 2007
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Extraction d’ARN Molécules très fragiles
- Matériels stérile, RNAses et DNAses free
- Travail sur glace
- Port de gants
- Pointes avec filtre
Extraction Phénol/Chloroforme
Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN
- Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines
- Anti-RNases
Extraction d’ARN