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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LÍLIAN GRACE DA SILVA SOLON
CONTROLE DE QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICO E
BIODISPONIBILIDADE RELATIVA EM RATOS DE SUSPENSÕES
ORAIS DE NAPROXENO SÓDICO OBTIDAS DE FARMÁCIAS DE
MANIPULAÇÃO NA CIDADE DO NATAL - RN
Natal / 2010
1
LÍLIAN GRACE DA SILVA SOLON
CONTROLE DE QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICO E
BIODISPONIBILIDADE RELATIVA EM RATOS DE SUSPENSÕES
ORAIS DE NAPROXENO SÓDICO OBTIDAS DE FARMÁCIAS DE
MANIPULAÇÃO NA CIDADE DO NATAL - RN
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como
requisito para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares
Co-orientadora: Profa. Dra. Aurigena Antunes de
Araújo.
Natal / 2010
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Lílian Grace da Silva Solon
CONTROLE DE QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICO E BIODISPONIBILIDADE
RELATIVA EM RATOS DE SUSPENSÕES ORAIS DE NAPROXENO SÓDICO
OBTIDAS DE FARMÁCIAS DE MANIPULAÇÃO NA CIDADE DO NATAL - RN
Banca Examinadora:
Natal, 26 de fevereiro de 2010
NATAL / RN
2010
4
Dedico este trabalho:
À minha mãe, Maria da Conceição Silva, pelo apoio incondicional, pelo esforço,
carinho e compreensão.
À minha querida sobrinha Julia. A sua chegada a esse mundo trouxe intensa alegria
à nossa família.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS pela realização desse trabalho, pelo privilégio de conhecer
pessoas tão inteligentes e competentes ao longo do meu caminho, muito obrigada.
Ao Professor Dr. LUIZ ALBERTO LIRA SOARES pela orientação, amizade e
esclarecimentos constantes.
À Professora Dra. AURIGENA ANTUNES DE ARAÚJO, pelo seu incentivo e amizade,
por compartilhar comigo um pouco de toda sua experiência.
À Professora Dra. TATIANE PEREIRA DE SOUZA, que abriu as portas da minha
iniciação científica e acadêmica. Meu mais profundo respeito e admiração.
À Professora Dra. GERLANE COELHO BERNARDO GUERRA, pelo apoio,
cordialidade e amizade.
Aos professores Dr. ISAC MEDEIROS e Dr. EDUARDO DE JESUS OLIVEIRA, por
terem me recebido no Laboratório de Bioequivalência da Universidade Federal da
Paraíba.
Ao SÓCRATES GOLZIO, ALEXSANDRO e ROBERTO, pela grande ajuda durante os
experimentos no LTF - UFPB.
À professora Dra. MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA, pela confiança e receptividade no
LABMULT – UFRN.
Aos professores Dr. DIOGO TEIXEIRA e JAIRO SOTERO, pelo ótimo convívio e
ajuda no Laboratório de Química Farmacêutica – UFRN.
Aos amigos da Pós: ALMÁRIA, BENILSON, DAIANE, EDILENE, ELIZABETH,
LAYANY, MELINA GADELHA, NAIRA, VÍVIAN, ZAMA, pelo companheirismo, carinho
e ótimos momentos de convívio. A ajuda de vocês fez com que esse trabalho ficasse
melhor.
À amiga ANA JOSANE, pela ajuda e sugestões neste trabalho e pela amizade.
Ao amigo PHILIPPE MESQUITA, pelo companheirismo, incentivo e amizade.
6
Aos alunos de iniciação científica ANA ISABEL, FRANCINALDO, HUGO
CARPEGIANNY, MARIANE e ROBERTA STOPILHA. Muito obrigada pela ajuda.
Aos funcionários do Laboratório de Farmacologia do Centro de Biociências (UFRN):
NEIDA e RAIMUNDO, pela grande assistência prestada.
Ao CNPQ e CAPES pelo apoio financeiro.
Aos ANIMAIS utilizados para o desenvolvimento da ciência em benefício da
humanidade.
A todos que me apoiaram e me incentivaram para a realização desse trabalho, o
mais sincero muito obrigada.
7
RESUMO
Os medicamentos vendidos nas farmácias de manipulação têm sido notificados pela
ANVISA quanto à resposta terapêutica reduzida ou por toxicidade. Disto e visando
avaliar a qualidade dos produtos magistrais o presente trabalho objetivou realizar
ensaios de controle de qualidade e biodisponibilidade relativa em suspensões de
naproxeno sódico na concentração de 25 mg/mL, obtidas de seis farmácias de
manipulação na cidade do Natal (A, B, C, D, E e F) e de uma suspensão de
referência (R). No controle de qualidade físico-químico foram realizados ensaios para
determinação do teor, pH, homogeneidade, volume e características organolépticas.
O método utilizado no doseamento mostrou precisão, exatidão, linearidade e
especificidade. As formulações obtidas nas farmácias B, C e E apresentaram um teor
abaixo das especificações, enquanto que a formulação F apresentou um teor acima
do recomendado pela Farmacopéia Americana. Em relação ao pH as suspensões C,
E e F apresentaram resultados fora das especificações farmacopéicas. Desta forma,
apenas as suspensões R, A e D foram selecionadas para o ensaio de
biodisponibilidade relativa. As suspensões R, A e D foram administradas oralmente
em ratos Wistar e o sangue foi coletado em intervalos de 10, 20, 40 e 60 min, 3, 4, 6,
24 e 48 h. O plasma obtido foi então armazenado em freezer a – 80 ºC para posterior
análise em CLAE. O método utilizado apresentou especificidade, linearidade (R2 =
0,9987), precisão, exatidão, adequada recuperação e estabilidade. As condições
cromatográficas utilizadas na metodologia foram: fluxo 1,2 mL/min, a fase móvel
constituiu tampão fosfato de sódio monobásico 0,01 M pH 4,0 e acetonitrila (50:50,
v/v), coluna C18 e comprimento de onda em 280 nm. O índice de confiança de 90%
para as razões de Cmax e ASCt se encontrou dentro do intervalo de 80 – 125%
proposto pelo FDA apenas para a suspensão obtida da farmácia de manipulação D,
sendo, portanto considerada bioequivalente para a taxa de absorção nas condições
propostas por este estudo. Assim, os resultados obtidos indicam a necessidade de
uma maior fiscalização pelos órgãos competentes de forma a garantir a segurança do
paciente e qualidade do medicamento produzido pela farmácia de manipulação.
Palavras-chave : validação, controle de qualidade, CLAE, naproxeno,
biodisponibilidade.
8
ABSTRACT
Compounded medicines have been reported by the ANVISA due to decreased of the
therapeutic response or toxicity of these formulations. The aim of this work was to
investigate the physicochemical quality control among naproxen sodium oral
suspensions 25 mg/mL obtained from six compounding pharmacies (A, B, C, D, E and
F) and the manufactured suspension (R). In the quality control test, the tests of pH,
content, homogeneity, volume and physical and organoleptic characteristics were
performed according to the Brazilian Pharmacopoeia. The analytical method for
determination of naproxen in suspensions was validate. This method showed
excellent precision, accuracy, linearity and specificity. In the content test the
suspensions B, C and E showed lower value and the F suspension showed a high
value of the content. The products C and E were disapproved in the description of the
physical and organoleptic characteristics test. In the pH test, three suspensions were
outside specifications (C, E and F). Only the products R, A and D showed satisfactory
results in these tests and therefore they were approved for relative bioavailability test.
The R, A and D suspensions were orally administered to Wistar rats and the blood
samples were taken at time intervals of 10, 20, 40, 60 min, 3, 4, 6, 24 and 48 h. The
plasma samples were immediately stored at – 80 ºC until analysis of HPLC. The
bioanalytical method validation showed specificity, linearity (R2 0.9987), precision,
accuracy, good recovery and stability. The chromatographic conditions were: flow rate
of 1.2 mL.min-1 with a mobile phase of acetonitrile : sodium phosphate buffer pH 4.0
(50:50, v/v) at 280 nm, using a C18 column. The confidence interval of 90% for the
Cmax and AUCt ratio was within the range of 80 - 125% proposed by the FDA. Only
one suspension, obtained from the compounding pharmacy D, was considered
bioequivalent to the rate of absorption under the conditions proposed by this study.
Thus, the results indicate the need for strict supervision from the relevant authorities
to ensure the patient safety and the quality of compounded drugs by pharmacies.
Key words : validation, quality control, HPLC, naproxen, bioavailability.
9
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 21
2.1 FARMÁCIA MAGISTRAL ........................................................................... 21
2.2 NAPROXENO............................................................................................. 24
2.2.1 Farmacocinética ..................................................................................... 24
2.2.2 Mecanismo de Ação ............................................................................... 25
2.2.3 Indicações terapêuticas ........................................................................ 25
2.2.4 Efeitos adversos .................................................................................... 26
2.3 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ........................................................... 27
2.3.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLA E ou HPLC) ................. 28
2.4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE FÁRMACOS DAS MATRIZES
BIOLÓGICAS ...................................................................................................
31
2.4.1 Preparação das amostras ..................................................................... 31
2.4.2 Extração líquido-líquido (ELL ou LLE – liquid-liquid extraction ) ...... 32
2.4.3 Extração em fase sólida (EFS ou SPE – solid phase extraction ) ...... 33
2.4.4 Microextração em fase sólida (MEFS ou SPME – solid phase
microextraction ) .............................................................................................
34
2.4.5 Precipitação de proteínas ..................................................................... 35
2.4.6 Ultrafiltração .......................................................................................... 36
2.5 VALIDAÇÃO ............................................................................................... 37
10
2.5.1 Especificidade e seletividade ............................................................... 37
2.5.2 Linearidade ............................................................................................ 38
2.5.3 Intervalo ................................................................................................. 38
2.5.4 Precisão ................................................................................................. 38
2.5.5 Limite de detecção (LOD) ..................................................................... 39
2.5.6 Limite de quantificação (LOQ) ............................................................. 40
2.5.7 Exatidão ................................................................................................. 41
2.5.8 Robustez ................................................................................................ 42
2.5.9 Recuperação .......................................................................................... 42
2.5.10 Estabilidade ......................................................................................... 43
2.6 PADRONIZAÇÃO INTERNA E EXTERNA ................................................. 44
2.7 DEFINIÇÕES ............................................................................................. 45
2.7.1 Biodisponibilidade ................................................................................ 45
2.7.2 Biodisponibilidade absoluta ................................................................ 46
2.7.3 Biodisponibilidade relativa ................................................................... 46
2.7.4 Bioequivalência ..................................................................................... 47
2.7.5 Equivalentes farmacêuticos ................................................................. 47
2.7.6 Equivalentes terapêuticos .................................................................... 48
2.8 FATORES QUE INFLUENCIAM A BIODISPONIBILIDADE ....................... 49
2.8.1 Fatores fisiológicos relacionados ao trato ga strointestinal (TGI) .... 49
2.8.2 Características físico-químicas do fármaco ....................................... 50
2.8.3 Características da forma farmacêutica e seus excipientes ............... 51
2.9 PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS AVALIADOS .............................. 52
2.10 ENSAIOS DE BIODISPONIBILIDADE DO NAPROXENO REALIZADOS
EM ANIMAIS E HUMANOS .............................................................................
54
11
3 OBJETIVOS ................................................................................................... 58
3.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................... 58
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................... 58
4 METODOLOGIA............................................................................................ 60
4.1 MATERIAIS................................................................................................. 60
4.1.1 Equipamentos e acessórios ................................................................. 60
4.1.2 Reagentes ............................................................................................... 61
4.1.3 Produtos Farmacêuticos ....................................................................... 61
4.2 MÉTODOS.................................................................................................. 63
4.2.1 Amostragem ........................................................................................... 63
4.2.2 Considerações Éticas ........................................................................ 63
5 CAPÍTULO I – ESTUDO COMPARATIVO DE CONTROLE DE
QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICO EM SUSPENSÕES MAGISTRAIS
CONTENDO NAPROXENO SÓDICO 25 mg/mL ............................................
65
RESUMO ...................................................................................................... 66
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 67
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 70
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 74
CONCLUSÕES ............................................................................................. 81
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 82
6 CAPÍTULO II – PHARMACOKINETIC PROFILES OF COMPOUN DED
NAPROXEN SODIUM ORAL SUSPENSIONS ADMINISTERED TO RA TS
BY A SIMPLE ISOCRATIC HPLC METHOD …………………………………
86
ABSTRACT ................................................................................................... 87
INTRODUCTION .......................................................................................... 88
EXPERIMENTAL .......................................................................................... 89
12
RESULTS ..................................................................................................... 94
DISCUSSION AND CONCLUSIONS ............................................................ 101
ACKNOWLEDGMENT .................................................................................. 102
REFERENCES ............................................................................................. 103
7 CONCLUSÃO ............................................................................................ 108
8 REFERENCIAS .......................................................................................... 110
9 ANEXOS ..................................................................................................... 131
ANEXO I - PARECER N°178/2008 – APROVAÇÃO PELO COMIT Ê DE
ÉTICA EM PESQUISA DA UFRN ....................................................................
132
ANEXO II – RELATÓRIO EMITIDO PELO Galaxie Chromatography Data
System .............................................................................................................
134
ANEXO III – PDA 2D e 3D View ....................................................................... 139
ANEXO IV – PLANILHAS DO SOFTWARE WINNONLIN 2.0 .......................... 142
ANEXO V - CERTIFICADO DE ANÁLISE DO PADRÃO SECUNDÁRIO
NAPROXENO ..................................................................................................
147
ANEXO VI - CERTIFICADO DE ANÁLISE DO PADRÃO SECUNDÁRIO
DICLOFENACO ...............................................................................................
149
ANEXO VII - CERTIFICADO DE ANÁLISE DO SOLVENTE ACETONITRILA
GRAU HPLC ....................................................................................................
151
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASC Área Sob a Curva
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cmax Concentração Máxima Alcançada
DAD Detector de arranjo de diodos
DP Desvio Padrão
DPR Desvio Padrão Relativo
EMEA European Agency for Evaluation of Medicinal Products
FDA Food and Drug Administration
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Ke Constante de Eliminação
M Molar
mM Milimolar
pH Potencial Hidrogeniônico
PI Padrão Interno
RPM Rotações por Minuto
SE Solução Estoque
T1/2 Tempo de meia-vida
Tmax Tempo para o alcançar Cmax
USP United States Pharmacopoeia (Farmacopéia Americana)
UV/Vis Ultravioleta-visível
14
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DA LITERATURA
Figura 1 - Fórmula estrutural do naproxeno [ácido
(+)-6-metóxi-α-metil-2-naftalenoacético] .......................................................
24
Figura 2 - Tipos de Cromatografia de acordo com a fase estacionária e a
fase móvel .....................................................................................................
28
Figura 3 - Representação de um equipamento de CLAE ............................. 29
Figura 4 - Extração Líquido-Líquido .............................................................. 33
Figura 5 - Procedimento de Clean-up e extração em fase sólida ................. 34
Figura 6 - Precipitação de proteínas ............................................................. 35
Figura 7 - Curva de concentração sérica em função do tempo ..................... 54
Figura 8 - Gráfico de concentração plasmática em função do tempo após a
administração oral de 2,5 mg/Kg de naproxeno em cães da raça Beagle .....
55
Figura 9 - Perfil de concentração plasmática em função do tempo de
naproxeno em humanos sadios (n = 24), após a administração de
comprimidos de naproxeno sódico (550 mg) teste e referência ....................
56
CAPÍTULO I
Figura 1 - Fórmula estrutural do naproxeno .................................................. 68
Figura 2 - Representação gráfica da curva padrão de naproxeno ............... 74
Figura 3 - Espectros do naproxeno obtidos em cinco pontos diferentes do
pico ................................................................................................................
76
Figura 4 - Cromatograma do naproxeno padrão secundário (50 µg/mL)
obtido por CLAE. Tempo de retenção 4,24 minutos ......................................
80
Figura 5 - Cromatograma da amostra de suspensão oral de naproxeno
sódico (50 µg/mL) obtido por CLAE. Tempo de retenção 4,25 minutos .....
80
CAPÍTULO II
Figura 1 - HPLC chromatograms ………………………………………………. 95
Figura 2 - Mean plasma concentration-time profiles of naproxen in wistar
rats (n=5) after oral administration of naproxen sodium suspension:
reference versus test 1 (A) and reference versus test 2 (D) ………..……
100
15
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DA LITERATURA
Tabela 1 - Principais componentes da CLAE e algumas de suas
características ...............................................................................................
30
CAPÍTULO I
Tabela 1 - Valores de precisão (intra-dia e inter-dia) e exatidão das
soluções de trabalho de naproxeno (n = 5) ...................................................
75
Tabela 2 - Descrição das características físicas e organolépticas das
amostras de suspensão oral de naproxeno ...............................................
77
Tabela 3 - Valores de pH e teor encontrados nas amostras de suspensão 78
CAPÍTULO II
Tabela 1 - Intra-day and Inter-day assays precision and accuracy for
naproxen in rat plasma (n = 5) ………………………………………………..
96
Tabela 2 - Stability of naproxen in rat plasma after three freeze-thaw cycles
at – 20 ºC and after long term stability at – 80 ºC (n = 3) ……………………...
98
Tabela 3 - Pharmacokinetic parameters of naproxen after oral
administration of naproxen sodium suspension in rat, each value represents
the mean ± S.D. (n=5) …………………………………………………………….
99
Tabela 4 - The ratio of log-transformed values of Cmax and AUCt and the
corresponding CI 90% ……………………………………………………………
101
16
1 - INTRODUÇÃO
17
1 INTRODUÇÃO
A partir da década de 50 o mundo vivenciou uma explosão nos processos de
industrialização. A indústria farmacêutica apresentou alternativas padronizadas para
o tratamento das patologias. Com o desenvolvimento da genética e biologia
molecular foi possível o conhecimento dos receptores protéicos, e entendimento da
variabilidade da resposta inter e intra individual.
Atualmente tem-se uma grande preocupação quanto a individualização da
terapêutica, uma vez que pode permitir ajustes de concentrações dos medicamentos
relacionados com variáveis do paciente como sexo, idade, raça, fumante,
alcoólatra, insuficiência renal, doença hepática e interações medicamentosas. A
individualização da terapêutica pode mudar o contexto das práticas de saúde.
Primeiramente irá exigir dos serviços de saúde preparo quanto às técnicas
diagnósticas para quantificar o fármaco na corrente circulatória, o que implica maior
investimento nos serviços de saúde, requer compromisso ético e legal para
realização dessas práticas e irá permitir uma política de farmacovigilância incisiva e
eficaz. Além disso, poderá aumentar a segurança no tratamento realizado, com o
mínimo de efeitos adversos observados, sendo uma prática extremamente
importante para médico/paciente.
Durante muito tempo a indústria farmacêutica não percebeu a importância da
disponibilidade das substâncias, a partir das formas farmacêuticas. Os formuladores
ficavam satisfeitos quando se cumpriam as especificações pré-determinadas nos
testes físicos e químicos tradicionais.
A noção de disponibilidade da substância ativa a partir de um medicamento
nasceu da observação da não equivalência terapêutica entre especialidades
farmacêuticas, até o momento consideradas como substituíveis, devido a presença
18
do mesmo fármaco, na mesma dose unitária, na mesma forma farmacêutica. A
dificuldade e, às vezes, a impossibilidade de realizar comparações rigorosas dos
resultados terapêuticos dos medicamentos considerados equivalentes, conduziu a
necessidade de determinar sua biodisponibilidade antes de admitir que são
equivalentes e substituíveis entre si (AIACHE et al, 1983).
A bioequivalência ou biodisponibilidade relativa conquistou atenção crescente
nos últimos 30 anos após evidências de que produtos comerciais contendo a mesma
dosagem do fármaco, ou parte ativa, podem exibir diferenças pronunciadas na
resposta terapêutica.
No Brasil os termos biodisponibilidade e bioequivalência ficaram conhecidos
após a política dos medicamentos genéricos (BRASIL, 2000). A introdução destes
medicamentos foi um fator importante que trouxe à tona preocupações sobre a
biodisponibilidade, uma vez que o desempenho do fármaco in vivo era totalmente
desconhecido (HORVITZ, 1975; SMITH, 1972).
Medicamento genérico, no Brasil, é definido como equivalente farmacêutico
em relação ao medicamento de referência ou inovador, que se pretende ser com este
intercambiável, geralmente produzido após renúncia ou expiração da proteção
patentária ou de outros direitos de exclusividade, comprovada a sua segurança,
qualidade e eficácia (BRASIL, 2007).
O medicamento de referência é o medicamento inovador registrado no órgão
federal responsável pela vigilância sanitária e comercializado no Brasil, cuja eficácia,
segurança e qualidade foram comprovadas cientificamente junto ao órgão federal
competente por ocasião do registro (BRASIL, 2007).
Uma questão extremamente pertinente nos dias atuais diz respeito aos
medicamentos vendidos nas farmácias de manipulação, medicamentos genéricos e
medicamentos similares, que têm sido notificados pela Agência Nacional de
19
Vigilância Sanitária (ANVISA) quanto à resposta terapêutica reduzida. Com base em
informações coletadas entre os anos 2000 e 2003, o Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde (INCQS), comprovou, entre denúncias contra medicamentos
manipulados, 27 ocorrências graves, que relataram óbitos, comas e intoxicações.
Desde então a ANVISA, visando a segurança, tem adotado novos critérios para a
manipulação destes medicamentos. O rigor começou com a publicação da RDC
n°33, de 19 de abril de 2000, que estipulou procedi mentos para controle e garantia da
qualidade dos medicamentos produzidos por estes estabelecimentos. Atualmente a
resolução em vigor é a RDC n° 87, de 21 de novembro de 2008 (BRASIL, 2008).
As farmácias de manipulação atendem boa parte da população
principalmente pelos preços acessíveis e a possibilidade de tratamento
individualizado (FERREIRA, 2000). Considerando que a manipulação de
medicamento é o método tradicional de preparo de medicamentos individualizados,
torna-se importante o estudo periódico de farmacocinética com vistas a alcançar uma
política de farmacovigilância que proteja o paciente. Por isso, é necessária a
investigação destas formas farmacêuticas produzidas pelas farmácias e a avaliação
da segurança quanto à utilização destes produtos.
20
2 – REVISÃO DA LITERATURA
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 FARMÁCIA MAGISTRAL
A Farmácia Magistral é um estabelecimento de fórmulas magistrais e
oficinais, de comércio de fármacos, medicamentos, insumos farmacêuticos e
correlatos (BRASIL, 2000).
No Brasil, já nos primórdios do séc.XVIII, os boticários preparavam em suas
boticas, ervas e drogas vindas da Europa. Com o aumento do número dessas
boticas, o governo Imperial passou a controlar a atividade, criando um órgão
regulador: “Physicatura Mor” que exigia experiência de quatro anos como “fazedor
de remédio” para se instalar como boticário (FERREIRA, 2000).
No início do século XIX surgiram os primeiros cursos de Farmácia nas
Faculdades de Medicina e somente em 1898 surgiu a primeira Faculdade de
Farmácia em São Paulo. Nos anos 40 e 50, com o incentivo do Governo Getúlio
Vargas, indústrias estrangeiras de medicamentos se instalaram no país. O
medicamento surgiu como instrumento de dominação técnica e econômica e
começou então a decadência das farmácias magistrais, as quais quase
desapareceram nos anos 60 até meados dos anos 80. Paralelamente, ocorreu uma
certa desvalorização do farmacêutico de forma geral (QUINTANEIRO, 2002).
No final dos anos 80 várias ações e conscientizações, principalmente pelo
Conselho Federal de Farmácia (CFF) e Conselho Regional de Farmácia (CRF),
fizeram com que a população percebesse o papel social do farmacêutico, e dessa
forma ocorreu o resgate da verdadeira missão do profissional de farmácia,
ressurgindo assim a essência dos antigos boticários que além de manipular os
medicamentos, eram como amigos e zelavam pela saúde da família. Ocorreu nesse
22
período um crescimento de farmácias magistrais trazendo uma boa parte da clientela
de medicamentos industrializados (QUINTANEIRO, 2002).
O ano 2000 foi um marco importante na história da farmácia magistral. A
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou a RDC n° 33 de 19 de
abril de 2000 trazendo o Manual de Boas Práticas de Manipulação. Muita coisa
mudou, mas todos se adequaram e continuaram fazendo com que o setor crescesse
cada vez mais (CONSELHO, 1999).
Em 2003, nova Resolução é publicada, a RDC n° 354 d e 18 de dezembro de
2003, a qual estabelece critérios adicionais de Boas Práticas de Manipulação em
Farmácias, como a manipulação de produtos farmacêuticos, em todas as formas
farmacêuticas, de uso interno que contenham substâncias de baixo índice
terapêutico.
No dia 12 de dezembro de 2006 foi publicada a RDC n° 214 de 12 de
dezembro de 2006 após um ano e meio de discussão em consulta pública via
internet. Tanta polêmica fez com que alterações fossem propostas e algumas aceitas
com a publicação da RDC n° 67 de 8 de outubro de 20 07. No ano seguinte a mais
nova Resolução, a RDC n° 87 de 21 de novembro de 20 08, alterou alguns pontos da
RDC anterior, entre os quais se destacam: a retirada da obrigatoriedade da análise
de diluídos; prorrogação por 90 dias o prazo para implantação das cabines de
manipulação; e autorização para o farmacêutico responsável prescrever e indicar
produtos manipulados, que não exigem prescrição médica.
A publicação dessas resoluções trouxe para o laboratório da farmácia as
mesmas exigências da indústria, embora a realidade destes dois setores seja
bastante distinta. Além de procedimentos padronizados, gestão da qualidade,
monitoramento de processos, agora, mais rigor no controle de qualidade e
treinamento de colaboradores. A farmácia necessita realizar investimentos pesados
23
em equipamentos, treinamentos e contratação de serviços terceirizados (SBCC,
2009; ZOLNER, 2008).
A tecnologia disponível para preparações de medicamentos em pequena
escala está cada vez mais sofisticada, e as condições de preparação nas farmácias
são cada vez mais suscetíveis de se adequarem aos padrões de qualidade exigidos.
A farmácia de manipulação tem um importante papel na sociedade,
produzindo medicamentos individualizados, na quantidade exata para o tratamento
(uso racional), ajuste de dosagem de acordo com as necessidades individuais de
cada paciente, personalização da terapêutica, manipulação de medicamentos que
foram retirados do mercado, facilidade de administração, permitindo assim a escolha
da forma farmacêutica e associação de princípios ativos compatíveis, atendimento
farmacêutico personalizado, e, além disso, oferecendo um medicamento mais barato
que o industrializado (FERREIRA, 2000; LEAL, 2007).
Entre as desvantagens dos medicamentos manipulados elas estão o curto
prazo de validade devido a dificuldades na obtenção de produtos estáveis. Quando
se trata desse tipo de medicamento, para o qual não existe uma padronização com
relação ao excipiente utilizado entre as farmácias, existe grande preocupação
relacionada ao efeito destes. Da mesma forma acontece quando se trata da
manipulação de medicamentos utilizando fármacos de baixo índice terapêutico, os
quais podem atingir níveis tóxicos com extrema facilidade, sendo este um dos temas
que acelerou a modificação da legislação, de modo a garantir ainda mais a
segurança na preparação destes medicamentos (LEAL, 2007).
24
2.2 NAPROXENO
O naproxeno (Figura 1) é um dos AINES bastante utilizados na clínica médica
e comercializado em farmácias de manipulação, tendo como fatores relacionados ao
seu favor à sua potencia anti-inflamatória, um maior intervalo de dose e estudos de
comprovada segurança realizado em crianças (JACOB, 1998).
FIGURA 1- Fórmula estrutural do naproxeno [ácido (+)-6-metóxi-α-metil-2-naftalenoacético]
2.2.1 Farmacocinética
O naproxeno é totalmente absorvido quando administrado por via oral. Os
alimentos retardam a taxa, mas não a extensão da absorção. As concentrações
plasmáticas máximas ocorrem de 1 a 4 horas. A absorção é acelerada pela
administração concomitante de bicarbonato de sódio, mas retardada pelo hidróxido
de magnésio ou pelo hidróxido de alumínio. Sua meia-vida de eliminação é variável:
cerca de 12 horas no jovem, mas pode aumentar para 16 horas no idoso, por causa
do declínio da função renal relacionado com a idade (GOODMAN & GILMAN, 2007;
JACOB, 1998; RUNKEL et al., 1972). A fração livre de naproxeno é 41% maior nas
mulheres que nos homens, embora a ligação à albumina seja muito alta em ambos
os sexos (RANG, 2004).
25
O naproxeno atinge a concentração plasmática máxima de 90 µg/mL com
dose de 750 mg em adultos. O volume aparente de distribuição é de
aproximadamente 0,1 L/Kg (DESAGER et al., 1976; KOROLKOVAS, 2007).
Os metabólitos do naproxeno são excretados quase inteiramente na urina.
Cerca de 30% do fármaco sofre 6-desmetilação e a maior parte, bem como o próprio
naproxeno, é excretada como glicuronídio ou outros conjugados (GOODMAN &
GILMAN, 2007; JACOB, 1998). Cerca de 10% é excretado na forma inalterada e
menos de 3% de naproxeno e seus metabólitos são eliminados pelas fezes
(KOROLKOVAS, 2007).
O naproxeno liga-se 99% às proteínas plasmáticas. Após a sua
administração, compete com a aspirina pelo sítio de ligação às proteínas
plasmáticas. Prolonga também o tempo de protrombina (KATZUNG, 1998). Ele
atravessa a barreira placentária e é encontrado no leite de mulheres lactantes em
aproximadamente 1% da concentração plasmática materna (GOODMAN & GILMAN,
2007).
2.2.2 Mecanismo de ação
Atua como inibidor não seletivo da enzima ciclooxigenase (COX), impedindo
a formação de prostaglandinas (GOODMAN & GILMAN, 2007).
2.2.3 Indicações terapêuticas
Mostra-se eficaz para as indicações reumatológicas habituais e está
disponível em formulações de liberação prolongada e suspensão oral, para uso em
crianças (JACOB, 1998).
26
As posologias para cada indicação estão descritas abaixo (KOROLKOVAS,
2007):
• Para o tratamento da dismenorréia primária, 500 mg ou 250 mg a cada 6 ou 8
horas;
• Para inflamação leve a moderadamente grave do músculo esquelético e tecido
mole, 250 mg a cada 12 horas. Em tratamentos prolongados a dose deve ser
ajustada;
• Para processos inflamatórios agudos, 750 mg inicial seguido de 250 mg a
cada 8 horas até a sua cessação;
• Para artrite reumatóide e osteoartrite, de 500 mg a 750 mg duas vezes ao dia;
• Para o uso em crianças, a dose recomendada é de 10 mg/Kg de peso
corporal, dividido em duas tomadas.
2.2.4 Efeitos adversos
Os efeitos adversos mais comuns são os gastrointestinais, efeitos sobre o
Sistema Nervoso Central (SNC), prurido, icterícia, comprometimento da função renal,
ototoxicidade, angioedema, trombocitopenia e agranulocitose (GOODMAN &
GILMAN, 2007; JACOB, 1998).
Entre os efeitos sobre o SNC, destacam-se: sonolência, dor de cabeça,
tonturas, suores, fadiga e depressão. (GOODMAN & GILMAN, 2007).
27
2.3 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
A cromatografia é definida como um método físico-químico de separação, no
qual os constituintes da amostra a serem separados são particionados entre duas
fases, uma estacionária, geralmente de grande área, e a outra uma fase móvel (fluido
insolúvel na fase estacionária) (CIOLA, 1998). Durante a eluição da fase móvel sobre
a fase estacionária, os componentes contidos no sistema de solventes interagem de
forma diferente com a fase estacionária e são seletivamente retidos resultando em
migrações diferentes dos componentes pela fase estacionária. Estas diferenças no
gradiente de migração dependerão das características físico-químicas da fase móvel,
da fase estacionária e também dos analitos (NASCIMENTO, 2004).
Nos últimos 50 anos, a cromatografia vem ocupando um lugar de destaque
no meio científico, isto se deve não somente ao desenvolvimento de vários novos
tipos de técnicas cromatográficas (cromatografia a líquido, cromatografia a gás e
cromatografia de fluido supercrítico), mas também a sua facilidade de efetuar
separações, identificação e quantificação de espécies químicas (SKOOG, 2002). A
Figura 2 mostra os diferentes tipos de cromatografia de acordo com a fase
estacionária e a fase móvel.
28
FIGURA 2 – Tipos de Cromatografia de acordo com a fase estacionária e a fase móvel. CGL –
Cromatografia Gás-Líquido; CGS – Cromatografia Gás-Sólido; CFS – Cromatografia em Fluido
Supercrítico; CLL – Cromatografia Líquido-Líquido; CCD – Cromatografia em Camada Delgada; CLS –
Cromatografia Líquido-Sólido; CTI – Cromatografia de Troca Iônica; CET – Cromatografia por
Exclusão de Tamanho; CFL – Cromatografia de Fase Quimicamente Ligada (NASCIMENTO, 2004)
2.3.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLA E ou HPLC)
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é a versão instrumental das
técnicas cromatográficas. Segundo Ciola (1998) a CLAE é uma técnica que emprega
um conjunto de equipamentos especiais, que poderão diferir em características e
grau de automação. Os aparelhos empregados para realizar a cromatografia a líquido
são chamados de cromatógrafos a líquido (Figura 3).
29
FIGURA 3 – Representação de um equipamento de CLAE
Fonte: http://www.lcresources.com/resources/getstart/2g01.htm
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência apresenta uma enorme aplicação
na área bioanalítica, de fitoterápicos, análises de alimentos, toxicológicas, forenses,
genoma, proteoma e na análise de íons inorgânicos. Por ser uma técnica de ampla
aplicabilidade e de fácil adaptação para determinações quantitativas acuradas, a
CLAE é umas das técnicas de separação mais utilizadas.
O cromatógrafo a líquido é um aparelho composto, basicamente, de seis
elementos. As características dos seus principais componentes estão descritas na
Tabela 1.
30
TABELA 1- Principais componentes da CLAE e algumas de suas características (GIL, 2005)
COMPONENTES CARACTERÍSTICAS
Reservatório de solventes: onde se encontra(m) o(s) solvente(s) da fase móvel.
Bomba de alta pressão sistema mecânico que impulsiona o solvente para a coluna
cromatográfica de forma a movimentá-lo independente da
gravidade ou capilaridade.
Injetor: dispositivo posicionado entre a coluna cromatográfica e a bomba.
Serve como sistema de entrada da amostra para a coluna.
Permite a introdução de um volume fixo de amostra dentro do
aparelho de CLAE.
Coluna cromatográfica: de comprimento (entre 10 e 30 cm) e diâmetros internos (entre 4
– 10 mm) variados. Suporta altas pressões. É o local onde se
encontram empacotadas as partículas de fase estacionária e
onde ocorre o processo de separação.
Detector: dispositivo eletroeletrônico que responde à variação da
composição do efluente da coluna gerando sinais elétricos. Os
detectores mais comuns empregados são: Uv-vis, fluorescência,
eletroquímico, massas.
Processador de dados (Pc
ou integrador)
sistema que analisa e processa os dados provenientes do
detector e os transforma em sinais gráficos chamados de
cromatogramas. Nestes aparecem os picos cromatográficos de
onde são calculadas as medidas de suas áreas ou alturas.
31
2.4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE FÁRMACOS DAS MATRIZES BIOLÓGICAS
As matrizes biológicas contêm numerosos e variados compostos, desde sais
inorgânicos a macroproteínas, sendo bastante complexas.
Os métodos bioanalíticos comumente envolvem extração do fármaco e seus
metabólitos da biomatriz (sangue, plasma, urina, etc) ou remoção de proteínas (clean
up) antes da separação por técnicas cromatográficas (NASCIMENTO, 2004).
2.4.1 Preparação das amostras
A análise de fármacos em fluidos biológicos normalmente é complicada pelas
baixas concentrações do analito, pela complexidade das matrizes biológicas e pelo
limitado volume das amostras disponíveis para a determinação (RASMUSSEN et al.,
2004) . A elevada concentração de proteínas e o grande número de compostos
endógenos presentes nesse tipo de matriz também dificultam a análise e podem
levar à precipitação ou desnaturação e adsorção no material de preenchimento da
coluna cromatográfica, com conseqüente aumento da pressão do sistema, mudanças
no tempo de retenção e decréscimo na eficiência da coluna. Devido a isso, apesar do
surgimento de técnicas modernas de separação, com as quais se pode obter alta
seletividade e baixos limites de detecção/quantificação, a preparação da amostra é a
primeira e mais crucial etapa na análise dos fármacos e inclui pré-concentração do
analito e clean up da amostra (QUEIROZ et al., 2001). Em geral, mais de um tipo de
técnica de extração e/ou concentração pode ser empregado para uma certa amostra.
A escolha da técnica a ser utilizada deve levar em conta as seguintes características:
32
• Ser simples;
• Ser rápida;
• Ter baixo custo;
• Fornecer extratos relativamente livres de interferentes;
• Ter alta recuperação, com boa exatidão e precisão para os analitos de
interesse.
2.4.2 Extração líquido-líquido (ELL ou LLE – liquid-liquid extraction )
A extração líquido-líquido baseia-se na diferente solubilidade do analito em
dois solventes imiscíveis. Este princípio é bastante utilizado na preparação de
amostras para análise cromatográfica, principalmente pelo baixo custo e fácil
operação. A ELL é eficiente na remoção de interferentes e aumenta a concentração
do analito na amostra. Geralmente adiciona-se um solvente orgânico (pouco polar)
imiscível à amostra aquosa (polar), num valor adequado de pH. A mistura é agitada e
posteriormente centrifugada. Remove-se a fase orgânica e seca-se sob fluxo de ar ou
nitrogênio. Resuspende-se o resíduo na amostra e injeta-se no sistema
cromatográfico (MORRINSON, 1990).
A Figura 4 mostra o procedimento geral empregado para extração com
solvente orgânico, diretamente do plasma. Mais de um passo de extração da fase
aquosa ou orgânica também pode ser realizado, caso haja problemas com
interferentes endógenos.
33
FIGURA 4 - Extração Líquido-Líquido
PI* = Padrão interno
2.4.3 Extração em fase sólida (EFS ou SPE – solid phase extraction )
A extração em fase sólida emprega solventes recheados em cartuchos ou
adsorvidos em discos e os mecanismos de retenção são idênticos àqueles
envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Essa técnica é bem compatível com
CLAE de fase reversa e é de fácil automação. Entretanto apresenta retenção
insuficiente de muitos compostos polares, seletividade limitada e elevado custo
operacional. Além disso, a quantidade de solventes orgânicos necessários para EFS
ainda é significativa, mesmo que seja menor que a usada em ELL (NASCIMENTO,
2004) (Figura 5).
Plasma + PI* + Tampão
+ Solvente extrator
Fase orgânica
Dissolver o resíduo na
fase móvel
Fase aquosa
agitação/centrifugação
desprezar
Evaporar o solvente
Injetar
34
FIGURA 5 - Procedimento de Clean-up e extração em fase sólida.
Fonte: www.biotage.com/graphics/9223.jpg
2.4.4 Microextração em fase sólida (MEFS ou SPME – solid phase
microextraction )
A microextração em fase sólida é uma técnica de extração que emprega uma
fibra ótica de sílica fundida recoberta com um filme fino de polímero ou de um
adsorvente sólido. Esta fibra ótica, junto com a fase extratora, é acondicionada dentro
da agulha de uma microseringa. Para a extração dos analitos, a fibra é colocada em
contato direto com a amostra ou na fase vapor de um frasco de “headspace” (solutos
voláteis); após a extração, os analitos presentes na fibra são dessorvidos e
introduzidos na instrumentação analítica requerida (CLAE ou CG). É um método mais
simples e mais rápido que a ELL e EFS, em geral são obtidos extratos mais limpos e
quase não se emprega solventes orgânicos para a dessorção. No entanto, apresenta
como desvantagens valores bastante reduzidos de recuperação, o que é indesejável
quando se deseja quantificar analitos a nível de traços (COLLINS et al., 2006, GILAR
et al., 2001).
35
2.4.5 Precipitação de proteínas
A precipitação de proteínas é bastante utilizada para a remoção de fármacos
em matrizes complexas. Este é o tipo de técnica mais simples uma vez que
apresenta apenas um passo principal. Um agente precipitante é adicionado ao
plasma e a amostra é então homogeneizada. Após a homogeneização, as proteínas
precipitadas são removidas através de centrifugação e uma alíquota do
sobrenadante é injetada no sistema cromatográfico. O esquema abaixo (Figura 6)
mostra o procedimento geral empregado para a remoção de fármacos diretamente do
plasma (KLINK, 2000).
FIGURA 6 - Precipitação de proteínas. *PI = padrão interno
Plasma + PI* +
Precipitante
Sobrenadante
Injetar
Precipitado
agitação/centrifugação
desprezar
retirar alíquota
36
2.4.6 Ultrafiltração
O método de ultrafiltração combina dois princípios físicos: a filtração
combinada com a centrifugação. As membranas utilizadas no processamento podem
ser de vários tipos, tais como celulose regenerada, polietersulfonas e outras. Este
método possui várias vantagens, tais como: rápido tempo de processamento;
recuperação máxima das amostras; conveniência na preparação; alto fator de
concentração; as amostras eluídas são adequadas para injeção direta no CLAE
(QUEIROZ et al., 2001).
São várias as aplicações para o método de ultrafiltração. Estas vão desde o
isolamento e concentração de DNA, anticorpos e remoção de proteínas ligadas ou
não ligadas a fármacos do soro e plasma.
37
2.5 VALIDAÇÃO
A validação é definida como um ato documentado que atesta se qualquer
procedimento, processo, equipamento, material, operação ou sistema realmente
conduza aos resultados esperados. Portanto a validação de procedimentos analíticos
e bioanalíticos têm por objetivo demonstrar que os métodos de ensaio utilizados
apresentam resultados que permitam avaliar a qualidade dos medicamentos,
conforme os parâmetros especificados (BRASIL, 2003; SWARTZ & KRULL, 1997).
De acordo com a Resolução RE n° 899, de 29 de maio de 2003, a validação
deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às
exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.
Para tanto, deve apresentar especificidade e seletividade, linearidade, intervalo,
precisão, limite de detecção, limite de quantificação e exatidão adequadas à análise.
2.5.1 Especificidade e seletividade
“ É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em
presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e
componentes da matriz” (BRASIL, 2003).
Um método é considerado específico se ele produz apenas uma resposta
para um simples analito. Como os métodos cromatográficos não produzem respostas
apenas para um analito de interesse, mas também para outras substâncias de
interesse, o termo seletividade é sempre mais apropriado neste contexto que
especificidade (NASCIMENTO, 2004).
38
2.5.2 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade seja
determinada pela análise de no mínimo cinco concentrações diferentes.
Os dados podem ser tratados por regressão linear pelo método dos mínimos
quadrados dos pontos médios de três curvas de calibração autênticas. O critério
mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser igual a 0,99 para métodos
analíticos e igual ou superior a 0,98 para métodos bioanalíticos.
2.5.3 Intervalo
É a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método
analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende da aplicação
pretendida do método.
2.5.4 Precisão
É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de
medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta divide-se em
três níveis:
Repetibilidade (precisão intra-corrida): Concordância entre os resultados
dentro de um curto período de tempo com o mesmo analito e mesma instrumentação.
39
A repetibilidade do método é verificada por no mínimo nove determinações,
ou seja, três concentrações: baixa, média e alta, com três réplicas cada ou mínimo de
seis determinações a 100% da concentração teste.
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os
resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas
diferentes e/ou equipamentos diferentes. Recomenda-se o mínimo de dois dias com
analistas diferentes.
Reprodutibilidade: concordância entre os resultados obtidos em
laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à
padronização de metodologia analítica.
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou
coeficiente de variação (CV%), segundo a equação 1.
(Equação 1)
Em que DP é o desvio padrão e CMD a concentração média determinada.
Não se admite valores superiores a 5% para métodos analíticos e 15% para métodos
bioanalíticos.
2.5.5 Limite de detecção (LOD)
É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser
detectada, porém não necessariamente quantificada, sob condições experimentais
estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções
DPR = DP x 100
CMD
40
de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível
detectável.
Em CLAE, a estimativa do limite de detecção pode ser feita com base na
relação três vezes o ruído da linha de base. Pode ser determinado pela equação 2:
(Equação 2)
Em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo, três
curvas de calibração construídas com as concentrações do fármaco próximas ao
suposto limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração.
2.5.6 Limite de quantificação (LOQ)
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada
com precisão e exatidão aceitáveis sob condições experimentais estabelecidas.
O Limite de Quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável
com precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação 3:
(Equação 3)
Em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo, três
curvas de calibração construídas com as concentrações do fármaco próximas ao
suposto limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração.
Também pode ser determinado por meio do ruído, considerando a
concentração que produza relação sinal-ruído superior a 10:1.
LD= DPa x 3
IC
LD= DPa x 10
IC
41
Nos métodos bioanalíticos, o Limite de Quantificação é estabelecido por meio
da análise de matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até
o menor nível quantificável com precisão e exatidão aceitáveis. Pode-se utilizar a
razão 5:1 entre o sinal e o ruído da linha de base, no entanto, o Limite de
Quantificação deve ser, no mínimo, cinco vezes superior a qualquer interferência da
amostra branco no tempo de retenção do fármaco, admitindo-se DPR até 20%.
2.5.7 Exatidão
É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor verdadeiro.
A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade
conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença percentual entre as
médias e o valor verdadeiro aceito, acrescido dos intervalos de confiança.
É determinado através de três concentrações: baixa, média e alta, com três
réplicas cada, perfazendo um total de nove determinações. E exatidão é expressa
pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a
concentração teórica correspondente (Equação 4). A exatidão deve estar entre 80 –
120% do valor nominal da concentração.
(Equação 4)
Exatidão = Concentração média experimental
Concentração teórica x 100
42
2.5.8 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Constatando-se a
susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão ser
controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.
2.5.9 Recuperação
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um método
analítico dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação do analito e
do padrão interno próximos a 100% são desejáveis, porém, admite-se valores
menores, no mínimo 60%, desde que a recuperação seja precisa e exata.
O teste deve ser realizado comparando-se resultados analíticos de amostras
extraídas a partir de três concentrações (baixa, média e alta), contemplando a faixa
de linearidade do método, com os resultados obtidos com soluções padrão não
extraídas, que representam 100% de recuperação.
O cálculo de recuperação deve ser feito em função da relação de área do
padrão extraído e não extraído, tanto para o analito como para o padrão interno
separadamente.
43
2.5.10 Estabilidade
O conhecimento da estabilidade de um analito é essencial para se garantir a
integridade da amostra. Os dados de estabilidade são necessários para mostrar que
a concentração do analito no momento da análise corresponde à sua concentração
no momento da coleta (CAUSON, 1997).
A Resolução n° 899 (BRASIL, 2003) recomenda as seg uintes condições para
estudo de estabilidade em métodos bioanalíticos:
• Estabilidade das soluções-padrão utilizadas para preparação diária da curva
de calibração;
• Estabilidade de amostras de amostras de plasma mantidas a -20° C e
submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento;
• Estabilidade à temperatura ambiente durante 4 horas, denominada
estabilidade de curta duração;
• Estabilidade pós-processamento, ou seja, estabilidade das amostras de
plasma processadas e mantidas por 24 horas e 48 horas à temperatura
ambiente;
• Estabilidade de longa duração, que deve exceder o intervalo de tempo
compreendido entre a coleta da primeira amostra e a análise da última de
acordo com o protocolo de estudo de bioequivalência.
44
2.6 PADRONIZAÇÃO INTERNA E EXTERNA
Dentre os métodos de quantificação, a padronização interna é a que possui
maior capacidade de eliminar erros técnicos, sendo selecionada para a quantificação
dos fármacos em fluidos biológicos. Este método consiste em comparar a relação
entre a área/altura obtida do composto e a do padrão interno, empregando diversas
concentrações do composto em estudo e uma concentração fixa do padrão interno.
Ou seja, adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão interno à amostra e
determina-se a relação entre as áreas/alturas do pico cromatográfico, eliminando os
erros decorrentes do procedimento de extração (BRASIL, 2003; CAUSON 1997).
O objetivo de usar um padrão interno durante a análise quantitativa é
minimizar os possíveis erros que porventura possam acontecer como, por exemplo,
perdas durante a extração e erros de injeção.
O padrão interno ideal corresponde a uma substância similar à substância a
ser quantificada, que tenha um tempo de retenção diferente ao fármaco analisado,
mas que seja próximo a ele, e que não influencie a análise (COLLINS et al, 2006).
Segundo Causon (1997), o padrão interno deve possuir propriedades químicas
semelhantes ao composto analisado, estar presente em concentrações similares, ter
tempo de retenção próximo ao composto problema sem causar interferência, ser
inerte e não fazer parte da amostra.
A padronização externa consiste em comparar a área ou altura do pico
correspondente a quantidades conhecidas do composto problema com a do mesmo
composto na amostra cuja concentração se deseja determinar (BRASIL, 2003).
Preparam-se soluções da substância a ser quantificada em diversas concentrações;
obtém-se o cromatograma correspondente a cada uma delas e relacionam-se as
áreas obtidas com as concentrações. Utilizando a equação da curva resultante,
45
pode-se calcular a concentração desta substância na amostra a partir da área da
substância obtida no cromatograma resultante de uma injeção separada. Este
método é sensível a erros de preparo das amostras e dos padrões, da injeção das
soluções padrão e das amostras. Por isso deve ser feito a cada análise.
2.7 DEFINIÇÕES
A intercambialidade entre vários produtos farmacêuticos deve resultar da
equivalência farmacêutica, bioequivalência e equivalência terapêutica (MARZO,
1999). As exigências internacionais relativas à bioequivalência de medicamentos
fizeram várias tentativas de harmonização, mas mesmo assim ainda existem
diferenças importantes entre as definições desses termos utilizadas pelos órgãos de
regulamentação de diversos países.
2.7.1 Biodisponibilidade
De acordo com o Food and Drug Administration (FDA, 2003), a
biodisponibilidade é definida como a velocidade e extensão pela qual a substância
ativa é absorvida da forma farmacêutica e torna-se disponível no sítio de ação. Para
formas farmacêuticas que não pretendem liberar o fármaco na corrente sanguínea, a
biodisponibilidade pode ser determinada por medidas que reflitam a velocidade e
extensão pela qual o princípio ativo torna-se disponível no local de ação.
Segundo o European Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA,
2001) biodisponibilidade consiste na velocidade e extensão pela qual a substância
ativa é liberada da forma farmacêutica e torna-se disponível na corrente sanguínea.
46
Para a ANVISA (BRASIL, 2003), biodisponibilidade é definida como a
velocidade e extensão de absorção de um princípio ativo em uma forma de dosagem,
a partir de sua curva de concentração versus tempo na circulação sistêmica ou sua
excreção na urina.
2.7.2 Biodisponibilidade absoluta
A biodisponibilidade absoluta consiste na fração da dose administrada que é
efetivamente absorvida pelo organismo. Pode ser determinada calculando-se a área
sob a curva de concentração plasmática do fármaco versus tempo, tendo-se como
referência uma injeção intravenosa, pois neste caso, a biodisponibilidade é de 100%
(STORPIRTIS, 1995).
2.7.3 Biodisponibilidade relativa
De acordo com a ANVISA, a biodisponibilidade relativa consiste no quociente
entre a quantidade e a velocidade do princípio ativo que chega à circulação sistêmica
a partir da administração extravascular de um produto de referência que contenha o
mesmo princípio ativo (BRASIL, 2003).
Para Storpirtis (1995), a biodisponibilidade relativa consiste no estudo
comparativo entre as biodisponibilidades de dois medicamentos administrados sob
condições iguais e padronizadas.
47
2.7.4 Bioequivalência
Segundo a ANVISA (BRASIL, 2003), dois medicamentos são considerados
bioequivalentes quando demonstrada a equivalência farmacêutica entre produtos
que, ao serem administrados na mesma dose molar, e nas mesmas condições
experimentais, não apresentam diferenças estatisticamente significativas em relação
à biodisponibilidade.
Bioequivalência é definida pela ausência de diferença significativa na
velocidade e extensão pela qual a substância ativa, presente em equivalentes
farmacêuticos, torna-se disponível no local de ação, quando administrado na mesma
dose molar e sob condições similares em um estudo apropriadamente desenhado
(FDA, 2003).
De acordo com a EMEA (2001), dois produtos são considerados
bioequivalentes quando estes forem equivalentes e suas biodisponibilidades, após a
administração da dose molar, forem de tal forma semelhantes, que garantam os
mesmos efeitos em relação à eficácia e segurança.
2.7.5 Equivalentes farmacêuticos
Equivalentes farmacêuticos são produtos farmacêuticos que contém o
mesmo fármaco, sob idêntica forma do sal ou éster e idêntica forma farmacêutica e
dosagem. Entretanto, os excipientes utilizados não são, necessariamente, os
mesmos. Ambos produtos devem satisfazer aos ensaios farmacopéicos indicados.
(BRASIL, 2004).
Equivalentes Farmacêuticos, de acordo com a EMEA (2001), são produtos
farmacêuticos que contém a mesma quantidade de fármaco(s) na mesma forma
farmacêutica e que cumprem requisitos de qualidade iguais ou comparáveis.
48
2.7.6 Equivalentes terapêuticos
Dois medicamentos são considerados terapeuticamente equivalentes se eles
são farmaceuticamente equivalentes e, após administração na mesma dose molar,
seus efeitos em relação à eficácia e segurança são essencialmente os mesmos, o
que se avaliam por meio de estudos de bioequivalência apropriados, ensaios
farmacodinâmicos, ensaios clínicos e estudos in vitro (correção in vivo/in vitro)
(BRASIL, 2003).
Segundo o EMEA (2001), considera-se um produto farmacêutico como
equivalente terapêutico quando este contém o mesmo fármaco e demonstre,
clinicamente, a mesma segurança e eficácia do produto cuja eficácia tenham sido
estabelecidas.
49
2.8 FATORES QUE INFLUENCIAM A BIODISPONIBILIDADE DE MEDICAMENTOS
A biodisponibilidade de medicamentos administrados por via oral pode ser
influenciada por diversos fatores fisiológicos e físico-químicos, sendo que as
características próprias do fármaco e de sua liberação a partir da forma farmacêutica
exercem grande influência na quantidade e na velocidade de absorção.
Considerando-se que a absorção ocorre somente após a solubilização do fármaco,
os processos de desintegração da forma farmacêutica sólida, a liberação e
dissolução do fármaco e sua permeabilidade através das membranas biológicas, são
etapas determinantes na biodisponibilidade (SHARGEL & YU, 1999).
De maneira geral, os fatores que influenciam a biodisponibilidade de
medicamentos são: fisiológicos relacionados ao trato gastrointestinal, características
físico-químicas do fármaco e características da forma farmacêutica e seus
excipientes.
2.8.1 Fatores fisiológicos relacionados ao trato ga strointestinal (TGI)
Dentre os fatores fisiológicos do TGI que podem influenciar a
biodisponibilidade de fármacos destacam-se a superfície de absorção; o pH dos
líquidos presentes; a velocidade de esvaziamento gástrico; a motilidade intestinal; a
estabilidade dos fármacos nos líquidos presentes e a influência dos alimentos.
As diferenças na constituição das membranas do estômago, intestino
delgado e intestino grosso determinam as variações na absorção dos fármacos. O
intestino delgado, em função de suas microvilosidades, apresenta maior eficiência de
absorção em relação ao estômago e intestino grosso, caracterizando a área de
absorção efetiva dos fármacos (SHARGEL & YU, 1999).
50
Um parâmetro importante que controla a absorção, distribuição, metabolismo
e excreção dos fármacos, consiste na habilidade da molécula em atravessar as
membranas biológicas. Para um fármaco atravessar as membranas biológicas e
atingir o seu sítio de ação, é necessário um equilíbrio entre suas propriedades
hidrofílicas e lipofílicas. De maneira geral, quanto maior a lipofilicidade, maiores serão
a absorção, o metabolismo, a ligação a proteínas plasmáticas e a distribuição
(PANCHAGNULA, 2000).
O tempo de permanência do fármaco no intestino delgado é determinado
pela motilidade intestinal. Assim, quanto maior o tempo de contato do fármaco com
seu sítio de absorção, maior será a quantidade absorvida (WILDING, 1999).
2.8.2 Características físico-químicas do fármaco
A solubilidade do fármaco pode ser considerada o principal fator relacionado
às características físico-químicas que influenciam a biodisponibilidade de
medicamentos. A dissolução do fármaco é um pré-requisito para absorção e
conseqüente resposta clínica da maioria dos fármacos apresentados em formas
farmacêuticas sólidas administradas por via oral (AMIDON et al., 1995).
A solubilidade do fármaco pode ser influenciada por alguns fatores, entre os
quais: características intrínsecas do próprio fármaco, como constante de dissociação
e lipossolubilidade; tamanho de partícula; forma cristalina e apresentação molecular
na forma de sais ou ésteres (SERRA, 1998).
De acordo com o princípio de partição de pH, apenas as formas menos
ionizadas, mais lipofílicas, podem ser absorvidas por difusão passiva, uma vez que a
membrana do TGI funciona como barreira lipídica. No entanto, esse princípio
apresenta limitações, pois o estômago, intestino e sangue não são compartimentos
fechados e estáticos e a absorção de um fármaco não depende somente do fato de
51
não estar ionizado, mas também de suas características de lipossolubilidade (KANO,
2002; SERRA, 1998).
2.8.3 Características da forma farmacêutica e seus excipientes
As formas farmacêuticas, os excipientes empregados na formulação, bem
como os processos de fabricação influenciam a velocidade de liberação e,
consequentemente, a absorção e biodisponibilidade dos fármacos. A velocidade de
liberação do fármaco das formas farmacêuticas administradas por via oral,
geralmente diminui na seguinte ordem: soluções, suspensões, pós, cápsulas,
comprimidos, comprimidos revestidos e/ou drágeas e comprimidos de liberação
modificada (AULTON, 2005).
As soluções são formas farmacêuticas de escolha quando uma absorção
rápida e completa é exigida. Para esta forma farmacêutica, a biodisponibilidade de
fármacos pode ser afetada por alguns fatores, como estabilidade do fármaco nos
líquidos do TGI, formação de complexo entre fármaco e algum excipiente ou a
incorporação do fármaco em micelas (AULTON, 2005).
A ocorrência de alterações na biodisponibilidade é, geralmente, maior no
caso de formas farmacêuticas sólidas, devido aos excipientes empregados e à
tecnologia empregada (FERRAZ, 1997).
As suspensões são empregadas para veicular fármacos pouco solúveis ou
insolúveis em meio aquoso. Alterações na biodisponibilidade de fármacos
administrados sob esta forma farmacêutica podem estar relacionadas com o
tamanho da partícula, forma cristalina do fármaco, complexação do fármaco com
algum excipiente, agentes tensoativos que, normalmente, favorecem a dissolução e
52
substâncias que aumentam a viscosidade, as quais retardam a absorção e interferem
no esvaziamento gástrico e na motilidade intestinal (AULTON, 2005).
2.9 PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS AVALIADOS
Para a avaliação da biodisponibilidade e bioequivalência de dois
medicamentos são determinados os parâmetros farmacocinéticos que melhor se
correlacionam com os efeitos terapêuticos no organismo (ARANCIBIA, 1991;
STORPIRTIS, 1995). Estes parâmetros relacionam-se com a quantidade de fármaco
absorvida e à velocidade do processo de absorção (STORPIRTIS, 1995).
Estes parâmetros são obtidos das curvas de concentração sangüínea do
fármaco versus tempo, e analisados estatisticamente para determinação da
bioequivalência (BRASIL, 2007).
Os seguintes parâmetros farmacocinéticos devem ser determinados (Figura 7):
a) Área sob a curva da concentração plasmática ou s érica versus tempo (ASC):
relaciona-se com a quantidade ou a extensão de absorção do fármaco. Pode ser
calculado pelo método trapezoidal e expresso em unidades de concentração vezes
tempo.
b) Área sob a curva do tempo zero ao tempo t (ASC0- t): relaciona-se com a
quantidade do fármaco absorvida do tempo zero ao tempo t, onde t é a última coleta
determinada experimentalmente.
53
c) Área sob a curva da concentração plasmática versus tempo, de zero ao
infinito (ASC0-inf): calculada do tempo zero ao tempo infinito, relaciona-se com a
quantidade ou a extensão de absorção do fármaco. A quantidade da absorção
sistêmica do fármaco é diretamente relacionada com ASC que é geralmente
calculado pelo método trapezoidal e expresso em unidades de concentração vezes
tempo. A ASC0-t deve ser igual ou superior a 80% da ASC0-inf.
d) Concentração máxima atingida no plasma (C max): concentração mais elevada
do fármaco atingido na circulação sangüínea após administração de um fármaco.
Relaciona-se à intensidade da resposta farmacológica. A Cmax ideal deve estar dentro
da janela terapêutica.
e) Meia vida de eliminação do fármaco (t 1/2): representa o tempo em que a
concentração do fármaco no plasma é reduzida à metade. Calcula-se através do
logaritmo neperiano (ln) de 2 (ln2= 0,693) dividido pela constante de eliminação t1/2 =
ln2/K.
f) Tempo correspondente à concentração máxima ating ida no plasma (T max):
tempo correspondente para que o fármaco atinja a concentração máxima (Cmax).
54
FIGURA 7 – Curva de concentração sérica em função do tempo. As setas indicam os parâmetros
farmacocinéticos determinados para avaliação da bioequivalência. Fonte:
www.psiquiatriageral.com.br/interacoes02.jpg
2.10 ENSAIOS DE BIODISPONIBILIDADE DO NAPROXENO REALIZADOS EM
ANIMAIS E HUMANOS
Na literatura estão descritos diversos ensaios pré-clínicos e clínicos do
naproxeno. Os primeiros ensaios aconteceram na década de 70, desde a síntese
desta molécula (VALENTOVIC, 2008).
Segundo Runkel et al. (1972), o ensaio de biodisponibilidade em ratos foi
realizado através da administração oral de uma dose de 3 mg/Kg de naproxeno com
coleta sanguínea feita através da veia jugular. Além de ratos, o autor e colaboradores
realizaram ensaios em cachorro, porco, macaco e humanos. Um dos gráficos de
concentração plasmática em função do tempo após a administração oral de 2,5
mg/Kg de naproxeno em cachorros, obtido neste estudo, encontra-se na Figura 8.
Em todas as espécies animais estudadas, o tempo de meia-vida do naproxeno variou
de 2 a 35 horas, e em humanos variou de 10 a 17 horas.
55
FIGURA 8 - Gráfico de concentração plasmática em função do tempo após a administração oral de 2,5
mg/Kg de naproxeno em cães da raça Beagle. Fonte: Hunkel et al., 1972.
Satterwhite e Boudinot (1988) desenvolveram um método de extração
líquido-líquido para determinação simultânea de naproxeno e cetoprofeno em plasma
de ratos. Este método utilizou cromatografia de alta eficiência com detecção no
ultravioleta e foi utilizado por outros autores para ensaios de biodisponibilidade com
essas moléculas (PATIL et al., 2005; MAZO et al., 1997).
Um estudo mais recente, realizado por Setiawati e colaboradores (2009),
avaliou a bioequivalência de duas formulações de comprimidos de naproxeno sódico
(Figura 9). O estudo foi randomizado e cruzado, incluindo 24 homens e mulheres.
Após a administração oral de 550 mg de naproxeno sódico, os valores obtidos foram
969,77 µg.h/mL, 1013,72 µg.h/mL, 75,92 µg/mL e 15,11 horas para ASCt, ASCinf,
Cmax e Tmax, respectivamente. Em estudos realizados com suspensões orais de
naproxeno em humanos, os valores encontrados foram: ASCt 721,73 µg.h/mL, Cmax
56
43,93 µg/mL e Tmax 1,83 h (CARRASCO-PORTUGAL et al., 2006; PALMA-AGUIRRE
et al., 2009).
FIGURA 9 - Perfil de concentração plasmática em função do tempo de naproxeno em humanos sadios
(n = 24), após a administração de comprimidos de naproxeno sódico (550 mg) teste e referência.
Fonte: Setiawati et al., 2009.
57
3 – OBJETIVOS
58
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
Realizar um estudo de controle de qualidade físico-químico e
biodisponibilidade relativa de suspensões orais de naproxeno sódico (25 mg/mL)
obtidas de farmácias de manipulação na cidade do Natal - RN.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Realizar ensaios de controle de qualidade do medicamento de referência e
dos medicamentos obtidos de diferentes farmácias de manipulação;
• Validar metodologia analítica para a determinação do teor das suspensões
estudadas;
• Validar metodologia bioanalítica para o estudo de biodisponibilidade relativa
do naproxeno sódico;
• Realizar estudos de biodisponibilidade relativa em ratos com o medicamento
de referência e obtidos de diferentes farmácias de manipulação.
59
4 – METODOLOGIA
60
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Equipamentos e acessórios
• Agitador Vortex QL – 901 BIOMIXER®
• Balança analítica GEHAKA® – AG200;
• Balança de barra tripla – ROHAUS®
• Balões volumétricos - VIDROLABOR® de 25, 50 e 100 mL
• Centrífuga SUPRA® 21K
• Coluna ACE® , 4,6 x 150 mm, 5 µm, C18;
• Cromatógrafo líquido de alta eficiência VARIAN®: bomba quaternária modelo
ProStar 240, auto injetor ProStar 410, detector PDA ProStar 335 e sistema de dados
(software) Galaxie Chromatography Data System versão 1.9.302.530;
• Máscara de proteção com filtros VO e GA – 3M 6003 – NIOSH®
• Insert para vial (100 µL de capacidade) com mola de polipropileno - MANDREL®
• Potenciômetro LABMETER® PHS – 3B;
• Pré-coluna ACE® 5 C18
• Pipetas automáticas de volume variável EPPENDORF® Research
• Pipetas volumétricas VIDROLABOR®
• Ponteiras descartáveis EPPENDORF® – brancas (0,5 – 20 µL), amarelas (2 – 200
µL) e azuis (50 – 1000 µL);
• Seringas descartáveis (1, 3, 5 e 10 mL) – BD®
• Sistema de purificação de água Milli-Q, MILLIPORE®;
61
• Sistema de filtração a vácuo SARTORIUS GOETTINGEN®
• Sonda uretral nº 8 - MEDSONDA®
• Tubos descartáveis (0,1 – 1,5 mL) EPPENDORF®
• Ultra-som UNIQUE® 1400;
• Unidade filtrante descartável, 0,45 µm de poro, MILLIPORE®;
• Vials de tampa rosqueada (2 mL de capacidade) - VARIAN®
4.1.2 Reagentes
• Acetonitrila para CLAE – J. T. BAKER® (Anexo VII)
• Ácido fosfórico p.a. - CRQ®
• Fosfato de sódio monobásico monohidratado p.a. VETEC®
• Soluções tampão pH 4,0 e 7,0 - QM® Reagentes
4.1.3 Produtos farmacêuticos
• Anestésicos:
- Vetarnacol® (Cloridrato de Ketamina) 5% - frasco de 100 mL
- Calmium® (Cloridrato de Xilazine) 2g/100 mL – frasco de 50 mL
• Heparina sódica (5000 UI/mL) - CRISTÁLIA®
• Padrão secundário de naproxeno lote N060719 teor de pureza 100,31% fornecido
por DEG Importação de Produtos Químicos LTDA, com validade até julho de 2010
(Anexo V).
• Padrão secundário de diclofenaco sódico lote ALL25640 teor de pureza 99,6%
fornecido por All Chemistry Produtos Naturais & Farmacêuticos, com validade até
junho de 2010 (Anexo VI).
62
• Flanax (naproxeno sódico suspensão 25 mg/mL) – ROCHE®
• Suspensões de naproxeno sódico (25 mg/mL) obtidas de farmácias de
manipulação.
63
4.2 MÉTODOS
O estudo foi realizado em duas etapas: uma fase em controle de qualidade
físico-químico (Capítulo I) e uma fase experimental em animais (Capítulo II). As
suspensões aprovadas nos ensaios de controle de qualidade participaram da
segunda etapa.
4.2.1 Amostragem
O número de estabelecimentos avaliados foi definido considerando todas as
farmácias de manipulação da cidade do Natal que foram registradas no Conselho
Regional de Farmácia – RN até o ano de 2008.
O número de amostra foi calculado através da equação 5 de acordo com a
Farmacopéia brasileira IV, 1988.
Nn = (Equação 5)
Em que: n = tamanho da amostra; N = total de estabelecimentos
Sendo assim, das trinta e nove farmácias de manipulação da cidade do Natal,
seis participaram do estudo. As farmácias foram selecionadas de modo aleatório
através de sorteio.
4.2.2 Considerações éticas
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN
(Parecer N° 178/2008) (Anexo I).
64
5 – CAPÍTULO I
65
ESTUDO COMPARATIVO DE CONTROLE DE QUALIDADE FÍSICO- QUÍMICO EM
SUSPENSÕES MAGISTRAIS CONTENDO NAPROXENO SÓDICO 25 mg/mL
Lílian Grace da Silva Solon1, Ana Isabel Maia de Oliveira1, Gerlane Coelho
Bernardo Guerra2, Aurigena Antunes de Araújo2, Luiz Alberto Lira Soares*3
1Departamento de Farmácia. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Natal, Brasil.
2Departamento de Biofísica e Farmacologia. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Natal, Brasil.
3Departamento de Farmácia. Universidade Federal de Pernambuco. Recife,
Brasil.
Unitermos: naproxeno, validação, controle de qualidade
*Correspondência:
Luiz Alberto Lira Soares
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, Faculdade de Farmácia, 2º andar,
CCS/UFRN. Petrópolis, Natal – RN – Brasil.
CEP: 59012-570
E-mail: [email protected]
66
RESUMO
O naproxeno é um fármaco amplamente utilizado para o tratamento de enfermidades
reumáticas e processos inflamatórios agudos e encontra-se disponível, no mercado
brasileiro na forma de comprimidos e suspensão industrializada ou produzida nas
farmácias de manipulação. Diante disto, o presente trabalho objetivou realizar estudo
de controle de qualidade comparativo entre a suspensão referência de naproxeno
sódico, Flanax®, denominada R e suspensões obtidas de seis farmácias de
manipulação na cidade do Natal, denominadas A, B, C, D, E e F na concentração de
25 mg/mL. Neste sentido, foram realizados ensaios para determinação do teor, pH,
homogeneidade, identificação, teor, volume e características organolépticas. O
método utilizado no doseamento mostrou precisão, exatidão, linearidade e
especificidade. As formulações obtidas nas farmácias B, C e E apresentaram um teor
abaixo das especificações, enquanto que a formulação F apresentou um teor acima
do recomendado pela Farmacopéia. Em relação ao pH, as suspensões C, E e F
apresentaram valores fora das especificações. No que diz respeito à
homogeneidade, detectou-se que as amostras obtidas das farmácias C e E
apresentaram aspecto espumoso após agitação e as partículas suspensas não se
distribuíram de forma homogênea ocorrendo rapidamente a sedimentação. Em
relação ao volume, observou-se que a maioria das amostras apresentou volume
compatível ao rotulado, exceto a amostra C. Assim, os resultados indicam a
necessidade de uma maior fiscalização pelos órgãos competentes de forma a
garantir a segurança do paciente e qualidade do medicamento produzido pela
farmácia de manipulação.
67
1 INTRODUÇÃO
O naproxeno é um antiinflamatório não esteroidal (AINE), analgésico e
antipirético, bastante utilizado para o tratamento de enfermidades reumáticas e
processos inflamatórios agudos (mialgia, dismenorréia, inflamação leve a
moderadamente grave do músculo esquelético e tecido mole) [3,8,10,12,14,16,19].
Age impedindo a síntese de prostaglandinas e tromboxanos a partir do ácido
araquidônico por inibir a enzima ciclooxigenase (COX). Quimicamente corresponde a
ácido (+)-6-metóxi-α-metil-2-naftalenoacético e a sua forma de sal é conhecida por
(+)-6-metóxi-α-metil-2-naftalenoacético sódico (Figura 1). Quando administrado por
via oral, o naproxeno sódico converte-se rapidamente a naproxeno e após a sua
absorção liga-se 99% às proteínas plasmáticas [9]. Os metabólitos do naproxeno são
excretados quase inteiramente na urina. Cerca de 30% do fármaco sofre
6-desmetilação e a maior parte é excretada como glicuronídio ou outros conjugados
[4]. Cerca de 10% é excretado na forma inalterada e menos de 3% de naproxeno e
seus metabólitos são eliminados pelas fezes [9]. As principais complicações
encontradas com o uso prolongado do naproxeno são efeitos gastrointestinais e
sobre o sistema nervoso central, prurido, icterícia, comprometimento da função renal,
ototoxicidade, angioedema, trombocitopenia e agranulocitose [2].
68
FIGURA 1- Fórmula estrutural do naproxeno sódico [(+)-6-metóxi-α-metil-2-naftalenoacético sódico].
Fonte: Goodman & Gilman, 2003.
No mercado brasileiro várias farmácias magistrais comercializam suspensões
contendo naproxeno sódico. Estes estabelecimentos possuem diversas vantagens
inerentes ao produto medicamentoso, dentre elas destacam-se a modificação da
forma farmacêutica e concentração do ativo, adaptando o medicamento à utilização
por idosos e crianças, principalmente; formulação de componentes ativos não
comercializados pela indústria farmacêutica; menor preço que o medicamento
industrializado e segurança quanto à ocorrência de automedicação [13]. Fatores
econômicos tornam interessante a utilização de genéricos, similares e manipulados
como alternativa aos produtos originais, desde que estes garantam eficácia e
segurança equivalentes. A Legislação Brasileira em vigor estabelece que para um
medicamento ser registrado como similar ou genérico é necessário que se comprove
a equivalência farmacêutica em relação ao medicamento de referência indicado pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), conforme o guia para realização
de estudo e elaboração de relatório de equivalência farmacêutica e perfil de
dissolução [ 5 ].
69
Entre as principais desvantagens encontradas nos medicamentos
manipulados estão o curto prazo de validade em decorrência da dificuldade na
obtenção de produtos estáveis [13]. Neste tipo de medicamento ainda não existe uma
padronização com relação aos excipientes utilizados entre as farmácias, e por isso
há uma grande preocupação com relação ao seu efeito terapêutico. Desde então a
ANVISA tem buscado medidas de segurança e adotado novos critérios para a
manipulação destes produtos [6]. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve
dois objetivos principais: validar a metodologia para o doseamento do naproxeno e
realizar um estudo comparativo de controle de qualidade entre a suspensão
industrializada de naproxeno sódico (Flanax®) e as obtidas de diferentes farmácias
de manipulação na cidade do Natal – RN, visando avaliar a qualidade destes
produtos magistrais.
70
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Amostras
Foram utilizadas suspensões de naproxeno sódico (25 mg/mL) de seis
diferentes farmácias de manipulação, denominadas de A, B, C, D, E e F. O
medicamento de referência utilizado foi Flanax® 25 mg/mL (Syntex S.A., México),
denominado “R”.
2.2 Substância Química de Referência
Naproxeno padrão secundário (lote N060719), teor de pureza 100,31%,
fornecido por DEG Importação de Produtos Químicos LTDA.
2.3 Reagentes
Ácido fosfórico (CRQ®), acetonitrila para CLAE (J. T. BAKER®), fosfato de
sódio monobásico monohidratado (VETEC®), soluções tampão pH 4.0 e 7.0 (QM®
Reagentes).
2.4 Validação do Método
A validação da metodologia analítica foi determinada segundo os critérios
descritos na Resolução 899 de 29 de maio de 2003 [7].
71
2.4.1 Linearidade
O ensaio de linearidade foi realizado na faixa de concentração 5 – 100 µg/mL,
utilizando concentrações de seis soluções padrão de calibração, sem réplicas,
analisados em triplicata. A correlação linear entre as concentrações foi estabelecida
através do método dos mínimos quadrados, sendo avaliada pelo coeficiente de
correlação (R2), que deve ser igual ou superior a 0,99.
2.4.2 Precisão e Exatidão
A precisão (intra-dia e inter-dia) e exatidão foram obtidas pela análise das
soluções de trabalho, em quintuplicata, em três concentrações estabelecidas (alta
100 µg/mL, média 50 µg/mL e baixa 5 µg/mL) de naproxeno. A precisão foi expressa
pelo desvio padrão relativo (DPR%) e a exatidão em percentual (%) de desvio das
concentrações médias observadas experimentalmente em relação ao valor nominal.
2.4.3 Especificidade
A especificidade do método foi avaliada por meio da pureza do pico de
naproxeno, obtendo-se espectros em cinco pontos do pico através da cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE/DAD).
72
2.5 Ensaios de Controle de Qualidade
2.5.1 Descrição das características físicas e organolépticas
As características físicas e organolépticas, cor, odor e homogeneidade das
suspensões, foram descritas de acordo com a Farmacopéia Brasileira IV [11]. Para
a aprovação, as mesmas deverão estar homogêneas e macroscopicamente livres
de partículas estranhas.
2.5.2 Determinação do volume
O volume das suspensões foi determinado em proveta e em seguida foi
comparado ao volume rotulado.
2.5.3 pH
O pH das suspensões de naproxeno foi determinado em potenciômetro
previamente calibrado, em triplicata, seguindo as normas da Farmacopéia
Americana [20], que considera que estas preparações deverão apresentar valores
de pH entre 2,2 e 3,7.
73
2.5.4 Doseamento do naproxeno
O doseamento do naproxeno foi realizado por meio de cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando cromatógrafo VARIAN® com detector de
arranjo de diodos (DAD) modelo ProStar 335, bomba quaternária ProStar 240, auto
injetor ProStar 410 e sistema de dados (software) Galaxie Chromatography Data
System versão 1.9.302.530. Foi utilizada uma coluna ACE C-18, 15 cm de
comprimento, 4,6 cm de diâmetro interno e partículas de 5 µm. A fase móvel foi
constituída de acetonitrila e tampão fosfato de sódio monobásico 0,01 M, na
proporção de 50:50. O tampão teve pH 4.0 ± 0,2, ajustado com ácido fosfórico. O
fluxo isocrático foi 1,2 mL/min e o volume de injeção 20 µL. A detecção ocorreu no
ultravioleta a 280 nm. O padrão e as amostras foram preparados na concentração
de 50 µg/mL, utilizando a fase móvel como solvente. A especificação de teor para
suspensão de naproxeno é de 90,0% a 110,0% da quantidade declarada [20].
2.5.5 Identificação
Foi utilizada a mesma metodologia descrita para o doseamento, sendo
comparados os tempos de retenção e perfil dos picos.
74
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método de doseamento por CLAE demonstrou linearidade, apresentando
coeficiente de correlação (r) igual a 0,9998, e equação da reta: y = 17,235 x +
10,132 (Figura 2). Esta faixa de linearidade foi adequada à aplicação do método na
determinação do teor de naproxeno nas amostras de suspensão.
y = 17,235x + 10,132R2 = 0,9998
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (µg/mL)
Áre
a (m
AU
.Sec
)
FIGURA 2 – Representação gráfica da curva padrão de naproxeno obtida por CLAE (n = 3).
A variação da precisão intra-dia e inter-dia para a menor concentração variou
de 1,72 a 2,36%. Todos os resultados encontraram-se dentro das especificações
exigidas pela norma brasileira de métodos analíticos, cujo desvio padrão relativo
deve ser menor ou igual a cinco (DPR ≤ 5%). Para a exatidão intra-dia os valores
encontrados foram de 91,44%; 96,22% e 100,41%, para a baixa, média e alta
concentração respectivamente, as quais se apresentaram dentro dos limites
preconizados pela ANVISA (80% ≤ exatidão ≤ 120%) (Tabela 1).
75
TABELA 1: Valores de precisão (intra-dia e inter-dia) e exatidão das soluções de trabalho de naproxeno
(n = 5).
Concentração nominal
(µg/mL)
Concentração média
experimental
(µg/mL)
Precisão
(DPR%)
Exatidão (%)
Intra-dia
5 4,57 1,72 91,44
50 48,11 2,43 96,22
100 100,41 0,80 100,41
Inter-dia
5 4,71 2,36 94,15
50 46,76 1,86 93,52
100 99,22 0,72 99,22
No teste de identificação, os espectros obtidos em cinco pontos do pico no
cromatograma de naproxeno (Figura 3) são similares, demonstrando tratar-se do
mesmo cromóforo.
76
FIGURA 3 – Espectros do naproxeno obtidos em cinco pontos diferentes do pico.
No ensaio de descrição das características físicas e organolépticas as
amostras foram avaliadas em relação à cor, odor, homogeneidade e quanto à
presença de partículas estranhas. O resultado da análise encontra-se detalhado na
Tabela 2.
77
TABELA 2 - Descrição das características físicas e organolépticas das amostras de suspensão oral de
naproxeno
Amostra
Cor
Odor
Homogeneidade
Partículas
estranhas
R Amarelo Laranja H A
A Branco Menta H A
B Amarelo Laranja H A
C Branco Menta NH A
D Branco Menta H A
E Vermelho Morango NH A
F Branco Menta H A
H = amostra homogênea; NH = amostra não-homogênea; A = ausência de partículas estranhas
Após a realização do teste de homogeneidade observou-se que as amostras C
e E estavam fora das especificações da Farmacopéia Brasileira pois apresentaram
aspecto espumoso após agitação, as partículas suspensas não se distribuíram de
forma homogênea já que rapidamente ocorreu sedimentação. A não homogeneidade
das suspensões pode implicar em falha terapêutica uma vez que a dose não está
sendo administrada corretamente, levando o paciente no início do tratamento a
receber uma dose sub-terapêutica e ao longo do tratamento doses mais elevadas.
A resolução brasileira RE n° 67/2007, que dispõe so bre Boas Práticas de
Manipulação, preconiza que seja determinado o volume das formas farmacêuticas
líquidas não-estéreis antes do envase. O volume das suspensões foi determinado
através de proveta e o valor obtido foi comparado ao rotulado. A maioria das
amostras apresentou volume compatível com o rotulado, exceto a amostra C que
teve uma diferença de +5 mL devido a erro de aferição do volume durante a
manipulação deste medicamento.
78
A análise de pH foi realizada de acordo com a Farmacopéia Americana [20], a
qual estabelece o valor de pH entre 2,2 e 3,7 para suspensão oral de naproxeno
sódico. Três amostras tiveram os valores de pH fora das especificações
recomendadas (Tabela 3). O pH é um dos fatores mais importantes no processo de
formulação uma vez que influencia diretamente na solubilidade, estabilidade e
absorção do fármaco [1].
Em relação a determinação do teor de naproxeno nas suspensões estudadas
observou-se que apenas as amostras R, A e D se encontraram dentro das
especificações da Farmacopéia Americana que considera que o teor de naproxeno
não deve ser menor que 90% ou maior que 110% do valor apresentado no rótulo.
Neste sentido, podemos destacar a amostra E por apresentar o teor de apenas
21,29%, valor considerado muito abaixo do especificado, e ainda, as amostras B e C
com teor também abaixo e a amostra F com valor acima das esecificações (Tabela
3).
TABELA 3 – Valores de pH e teor encontrados nas amostras de suspensão. Cada valor representa
a média ± desvio padrão relativo (n = 3).
Amostra pH Teor Resultado
R 3,10 ± 3,01 96,32 ± 0,69 DDE
A 3,28 ± 1,57 97,59 ± 0,78 DDE
B 2,72 ± 0,21 76,43 ± 1,45 FDE
C 4,84 ± 0,89 82,59 ± 0,16 FDE
D 2,96 ± 0,35 99,27 ± 0,76 DDE
E 1,74 ± 3,15 21,29 ± 3,53 FDE
F 4,38 ± 0,44 123,72 ± 1,09 FDE
DDE = dentro das especificações; FDE = fora das especificações
79
O doseamento de substâncias ativas em medicamentos é considerado um
dos ensaios mais importantes no controle de qualidade físico-químico, tendo em
vista que possibilita o conhecimento da real concentração do fármaco presente na
amostra a qual está diretamente relacionada a dose que será administrada ao
paciente e conseqüentemente com a ação terapêutica. Portanto quando o teor está
abaixo do especificado o paciente receberá uma dose sub-terapêutica que pode
ocasionar falência do tratamento. Por outro lado, quando o teor se encontra acima
do recomendado pode levar a efeitos adversos potencialmente graves,
principalmente em fármacos que possuem uma margem terapêutica estreita [2].
Os cromatogramas do naproxeno padrão secundário e das suspensões
possuíram o mesmo perfil e tempos de retenção próximos: 4,24 minutos para o
padrão secundário e 4,25 minutos para a suspensão (Figuras 4 e 5). O
cromatograma mostrado, referente à suspensão R, representa o comportamento
de todas as outras suspensões analisadas.
80
FIGURA 4 – Cromatograma do naproxeno padrão secundário (50 µg/mL) obtido por CLAE. Tempo de
retenção 4,24 minutos.
FIGURA 5 – Cromatograma da amostra referência de suspensão oral de naproxeno sódico (50 µg/mL)
obtido por CLAE. Tempo de retenção 4,25 minutos.
81
4 CONCLUSÕES
O método utilizado para o doseamento de suspensões de naproxeno sódico
por CLAE mostrou especificidade, linearidade, precisão e exatidão.
No teste de descrição das características físicas e organolépticas, foram
observadas modificações nas características dos produtos, tais como diferenças na
cor ou odor das preparações. Quanto ao teste de homogeneidade as suspensões C e
E foram reprovadas.
Com relação ao teste de pH, três amostras apresentaram resultados fora das
especificações (C, E e F) e quanto ao teor, as amostras B, C e E apresentaram
valores abaixo e a amostra F apresentou valor acima do especificado.
Entre seis suspensões estudadas, apenas três foram aprovadas em todos os
testes a que foram submetidas (R, A e D). Com isso, o estudo indicou a necessidade
de uma maior fiscalização pelos órgãos competentes e reforça também a importância
dos ensaios de controle de qualidade do produto manipulado final. A qualidade
destes medicamentos deve estar sempre associada às Boas Práticas de
Manipulação, seguindo aos procedimentos operacionais de forma a garantir a
segurança do paciente e a qualidade do medicamento produzido pela farmácia de
manipulação.
82
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85
6 – CAPÍTULO II
86
PHARMACOKINETIC PROFILES OF COMPOUNDED NAPROXEN SOD IUM
ORAL SUSPENSIONS ADMINISTERED TO RATS BY A SIMPLE I SOCRATIC
HPLC METHOD
Lílian Grace da Silva Solon1, Gerlane Coelho Bernardo Guerra2, José
Pérez-Urizar3, Aurigena Antunes de Araújo*2, Luiz Alberto Lira Soares4
1Department of Pharmacy.Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Natal, Brazil.
2Department of Biophysics and Pharmacology. Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. Natal, Brazil.
3Pharmacology and Physiology Laboratory. Universidad Autónoma de
San Luis Potosí. SLP, Mexico.
4Department of Pharmacy.Universidade Federal de Pernambuco. Recife,
Brazil.
Key words: Validation; HPLC; Pharmacokinetics; Rat plasma; Naproxen
*Corresponding author:
A. A. Araújo
Departamento de Biofísica e Farmacologia
Centro de Biociências
Av. Senador Salgado Filho, S/N - Lagoa Nova
59078-900 – Natal - RN, Brasil
E-mail: [email protected]
87
ABSTRACT
The purpose of this study was to validate a simple and specific bioanalytical
method for determining naproxen concentrations in rat plasma samples by
HPLC and to evaluate the pharmacokinetic profiles of naproxen sodium oral
suspensions obtained from compounding pharmacies. Three suspensions were
investigated one reference (Flanax®) and two compounded formulations (test 1
and test 2). Analysis was run at a flow rate of 1.2 mL.min-1 with a mobile phase
of acetonitrile : NaH2PO4 0.01 M pH 4.00 (50:50, v/v) at 280 nm, using a C18
column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm). The calibration curve was linear (R2 = 0.9987)
over the range of 0.25 - 200 µg.mL-1. The precision for inter and intra-day
analysis ranged from 2.46% to 12.39%. Accuracies using the quality control
samples of 0.5, 15, 75 and 150 µg.mL-1 ranged from 86.7% to 101.1%. For
analysis of pharmacokinetic properties, the naproxen suspension was orally
administered to rats and blood samples were drawn at 10, 20, 40, 60 min, 3, 4,
6, 24 and 48 hours after dosing. The plasma pharmacokinetic parameters, Cmax,
Tmax and AUCt were 191.25 ± 11.17 µg.mL-1, 1.00 ± 0.106 h and 2438.16 ±
291.34 µg.h.mL-1 for the reference drug, 188.22 ± 24.78 µg.mL-1, 1.06 ± 0.092 h
and 1755.02 ± 228.90 µg.h.mL-1 for test 1, and 160.50 ± 10.58 µg.mL-1, 0.66 ±
0.102 h and 1955.28 ± 142.80 µg.h.mL-1 for test 2. No significant differences
were found based on analysis of variance, with mean values and 90% CI of
test2/reference ratio (Cmax 83.92% and AUCt 80.19%). For test1/reference ratio,
the result was Cmax 98.41% and AUCt 71.98%. Based on these results, it can be
concluded that the validated method was successfully applied to this study; the
test 1 formulation failed to demonstrate a bioequivalence to the reference drug;
however, the test 2 and reference naproxen sodium oral suspension were
bioequivalent in terms of the rate and extent of absorption under these
conditions.
88
1. Introduction
According to Anfarmag (Associacao Nacional de Farmaceuticos
Magistrais) the turnover of compounded medicines is very high in Brazil. In
2008, the sales amounted to R$1.2bil [26]. The large consumption of these
medicines by the Brazilian population has raised the suspicion of the quality and
safety of these drugs, since cases of toxicity and death were reported by the
National Agency of Health Vigilance (ANVISA) [2]. Compounded medicines
have possible risks of variable bioavailability due to differences between
formulations. Despite frequent inspections of Brazilian compounding
pharmacies, there is not a strict quality control that involves in vivo tests.
Structurally naproxen is a propionic acid derivative related to the
arylacetic group of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) with a chiral
center. The (+) form is the active isomer. Naproxen and naproxen sodium are
known chemically as (+)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthaleneacetic acid and
(+)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthaleneacetic acid, sodium salt, respectively [20].
This drug is indicated for the treatment of rheumatic disorders, dysmenorrhoea
and for the relief of mild to moderate pain. Member drugs of the NSAID group act
by inhibiting prostaglandin biosynthesis and share several adverse effects
including gastrointestinal bleeding and ulceration [3,4,16,17]. Naproxen is
administered by the oral route as an immediate release and as a slow release
preparation (tablet and suspension). Naproxen is approximately 99% bound to
plasma proteins is metabolized by demethylation and undergoes phase II
metabolism of glucuronide conjugation [1,11,27,30]. The pharmacokinetic
parameters of naproxen following an administration of 250 mg of naproxen
sodium oral suspension obtained from previous bioavailability studies in humans
are 721.73 ± 18.47 for AUC72h, 43.93 ± 1.83 for Cmax and 2.38 ± 0.21 for Tmax
[28].
Several high-performance liquid chromatography (HPLC) methods have
been developed for naproxen determination in human or rat plasma for
pharmacokinetic studies [5,9,10,13,14,18,24,34]. Nevertheless, there is a need
to improve these methods in terms of ease of sample handling and analysis
time. Many naproxen products are used in worldwide, but there is no
bioavailability data concerning naproxen compounded formulations.
89
The aim of this study was to validate a simple and specific bioanalytical
method to determine naproxen concentrations in rat plasma samples and to
investigate the pharmacokinetic parameters of three different oral suspensions
of naproxen sodium (one manufactured suspension and two compounded
formulations) in order to compare their bioavailability.
2. Experimental
2.1. Chemicals and reagents
The reference material naproxen with a purity 100.3% was purchased
from DEG Importação de Produtos Químicos LTDA, Brazil. The internal
standard, diclofenac sodium {2-[2-(2,6-dichlorophenylamino) phenyl] acetic acid}
with a purity 99.6% was obtained from All Chemistry Produtos Naturais &
Farmacêuticos, Brazil. All other chemicals were of HPLC grade. Milli-Q water
(Millipore Corporation, Bedford, MA) was used for NaH2PO4 buffer preparation.
The reference naproxen formulation was Flanax® (25 mg mL-1) produced by
Syntex S.A., Mexico. The two test naproxen sodium oral suspensions, test 1
(suspension A, 25 mg mL-1) and test 2 (suspension D, 25 mg mL-1) were
obtained from two different compounding pharmacies, A and D respectively, in
Natal, Brazil.
2.2. Equipment and analysis conditions
Analyses were performed with a Varian ProStar HPLC system (Varian,
USA) including a quaternary pump (ProStar 240 model), auto-sampler (ProStar
410 model), variable wavelength PDA detector (ProStar 335 model), a
thermostated column compartment and the Varian software Galaxie
Chromatography Data System, Version 1.9.302.530.
Chromatographic separations were via an ACE C18 column (150 mm x
4,6 mm, 5 µm, ACE, USA) coupled with a ACE RP guard column (4 mm x 4,6
mm, 5 µm, ACE, USA) at room temperature. Elution for the analytes were
through isocratic flow of acetonitrile : NaH2PO4 0.01 M pH 4,00 (50:50, v/v). The
mobile phase was filtered through a 0.45 µm filter and degassed before use. The
90
flow rate of the mobile phase was maintained at 1.2 mL min-1. The detection
wavelength was set at UV 280 nm and the injection volume was 20 µL.
2.3. Stock and working standard solutions
The stock solution of naproxen (1 mg mL-1) and the internal standard (1
mg mL-1) were prepared by dissolving the appropriate amount of the pure solid in
acetonitrile. Both stock solutions were stored in a – 80 °C freezer. The working
standard solutions of naproxen were prepared fresh by step-wise dilutions of the
above stock solution with the mobile phase to provide a calibration concentration
range of 0.25 – 200 µg mL-1 when spiked into drug-free rat plasma. The working
internal standard solution was prepared from the stock by dilution with mobile
phase to 50 µg mL-1.
Four quality control samples (QC), were prepared from the stock
solutions by spiking naproxen into drug-free rat plasma to obtain final
concentrations of 0.5, 15, 75 and 150 µg mL-1. Routine calibration curves
consisting of 0.25, 1, 5, 10, 20, 40, 100 and 200 µg mL-1 calibrators were
generated together with the QC for computation of naproxen concentrations in
rat samples using peak area ratios of naproxen and internal standard.
2.4. Animals handling and sample collection
Wistar rats weighing 280 – 300 g were obtained from the Bioscience
Center of Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Natal, Brazil). They
were acclimated and housed in cages at a temperature of 25 ºC with free access
of standard laboratory food and water. Twelve hours before the initiation of
experiments, food was withheld, but animals had free access to water. All
handling and experimentation were according to protocols approved by the
institutional care and use of laboratory animals committee.
Naproxen sodium suspension was orally administered to rats at a dose
of 50 mg kg-1. The animals were anesthetized with 15 mg kg-1 of xilazine
hydrochloride (20 mg mL-1) and 100 mg kg-1 of ketamina hydrochloride (50 mg
mL-1) through an i.p. route. Blood samples were taken from the tails at time
intervals of 10, 20, 40, 60 min, 3, 4, 6, 24 and 48 h. At each time point, blood
91
samples were collected from five rats to compute the mean concentration. Since
only a maximum of 3 - 4 samples of 500 µL each could be sampled from a rat
over a short time, three groups of five rats were needed to complete the full
sampling intervals. The blood samples were collected into heparin-coated tubes
and maintained on ice for a short time before spinning in a microcentrifuge at 4
ºC to harvest the plasma samples, which were immediately stored at – 80 ºC
until analysis.
2.5. Clean up of plasma samples
150 µL of plasma obtained from dosed animals was mixed with 25 µL of
internal standard solution, 50 µL of NaH2PO4 0.5 M pH 2,2 and NaCl for 1
minute. 250 µL of acetonitrile was then added and the sample vortexed for 3
minutes. For the calibration and quality control samples, 25 µL of their respective
working standards prepared in acetonitrile : NaH2PO4 0.01 M pH 4.00 (50:50,
v/v) were added to each 150 µL of free-drug plasma before mixing with internal
standard solution. NaCl and acetonitrile in the mixture precipitated the plasma
proteins. The mixture was then centrifuged at 10,000 rpm at 4 ºC for 5 minutes,
and the supernatant containing the extracted naproxen and the internal standard
was then filtered through 0.45 µm and transferred to the auto-sampler of the
HPLC for analyses.
2.6. Method validation
The method was validated according to the “Guidance for Industry”
under the section of “Bioanalytical Method Validation” by the Food and Drug
Administration of USA [7,15].
92
2.6.1. Selectivity and linearity
The selectivity of the method was assessed by determining that
endogenous substances and the anesthetics present in rat plasma do not
co-elute with naproxen and the internal standard in the HPLC method.
Normal and hemolysate plasma samples from at least six untreated rats
were used to verify the selectivity of the bioanalytical method.
To evaluate the linearity of the calibration curves, eight calibration
standards containing naproxen at nominal concentrations of 0.25, 1, 5, 10, 20,
40, 100 and 200 µg mL-1 were prepared as described in section 2.3. The
standard calibration curves were constructed using naproxen/internal standard
peak-area ratios vs. the nominal concentration by linear regression.
2.6.2. Precision, accuracy and recovery
Assay precision was assessed by determining the coefficients of
variation (CV) of the four QC samples (concentrations of 0.5, 15, 75 and 150 µg
mL-1) within the same analysis (n=5, intra-day precision) and over a series of
analyses (n=5, inter-day precision). Both intra-day and inter-day precision were
calculated with the following formula:
Relative accuracy was determined by calculating the percent accuracy
by the equation:
The precision and accuracy of the first calibrator of 0.25 µg mL-1, lower
limit of quantification (LLOQ) were also evaluated.
The recovery experiments in this study were performed by comparing
peak areas of naproxen and internal standard in spiked plasma samples,
mean measured concentration
nominal concentration Accuracy % = =
standard deviation
mean CV% = X 100
X 100
93
extracted by the method described in section 2.5. The compounds of interest at
concentrations corresponding to 100% recovery were added to similarly
post-extracted blank plasma.
2.6.3. Stability
The stability of naproxen in rat plasma was tested in three freeze-thaw
cycles with QC samples at four concentration levels. These samples were stored
frozen at – 20ºC and analyzed on days 0, 1 and 5 to give the evaluations.
Specifically, the long term stability of the samples when stored at – 80 ºC
for up to 4 months was analyzed, since this is the temperature at which the
samples were stored before analysis. To assess the stability of the samples
between the time of extraction and the HPLC run, the samples were analyzed at
the time of extraction and the values were compared to the 10 and 24 h
post-extraction values of the same samples stored at room temperature. These
tests provide the validation for using the auto-sampler when analyzing multiple
samples.
2.7. Pharmacokinetic and statistical analyses
Pharmacokinetic analysis of naproxen was carried out according to a
standard non-compartmental method using the WinNonlin software (Pharsight
Co., CA, Version 2.0). Cmax and Tmax were obtained directly from the observed
data. The AUCt was calculated by the trapezoidal method. The AUCinf was
calculated as AUCt + Ct/Ke, where Ct was the last quantifiable concentration, Ke
was the terminal elimination rate constant and was determined by least-squares
regression analysis during the terminal log-linear phase of the
concentration-time curve. The T1/2 was calculated as 0.693/Ke.
Statistical analyses of variance (ANOVA) of AUCt, AUCinf and Cmax were
calculated after transformation of the data to their logarithmic (ln) values. Using
the error variance (S2) obtained from the ANOVA, the 90% confidence intervals
(CI) were calculated.
94
3. Results
3.1. Method validation
3.1.1. Selectivity and linearity
Fig. 1 shows representative HPLC chromatograms of control, blank
plasma (A) and hemolysate plasma (B) from untreated rats, low QC, blank
plasma sample spiked with 0.5 µg mL-1 of naproxen (C), a calibrator, 100 µg
mL-1 (D), both with spiked internal standard and finally a plasma sample obtained
1 h after naproxen sodium oral suspension administration in Wistar rats (E). Fig.
1 D shows a steady baseline, the naproxen peak was symmetrical and well
separated from the plasma peak. Naproxen and internal standard were well
separated using the above described chromatographic condition with retention
times of 4.26 and 8.23 min respectively. No interfering peaks from endogenous
substances in the control plasma samples of different rat or other reagents were
detected under the conditions employed.
The peak area ratio (naproxen/internal standard) as a function of the
nominal naproxen concentrations over a wide range of 0.25 - 200 µg mL-1 was
linear. The regression coefficient R2 was 0.9987. The weighted linear regression
equation was: y = 0.014x + 0.0343.
95
Figure 1: HPLC chromatograms of blank plasma (A), hemolysate plasma (B), QC sample spiked with naproxen at 0.5 µg mL-1 and internal standard (C), a calibrator spiked with naproxen at 100 µg mL-1 and internal standard (D), and plasma sample 1 h after administration of naproxen (E). Peak 1: naproxen at about 4.26 minutes; Peak 2: internal standard at about 8.23 minutes.
96
3.1.2. Precision, accuracy and recovery
The intra-day and inter-day precision and accuracy for the plasma
naproxen are summarized in Table 1. The intra-day and inter-day variability for
the different QC were minimal, ranging from 2.46% to 12.39%, indicating
excellent precision. Accuracies using the same QC ranged from 86.7% to
101.1%. All these variabilities were well within acceptable limits. Precision and
accuracy for the LLOQ of 0.25 µg mL-1 were 17.6% and 98%, respectively.
The recovery from spiked plasma was calculated by comparing peak
areas with QC samples (n=3) at four different concentration levels. The mean
recoveries for naproxen in four QC samples (0.5, 15, 75 and 150 µg mL-1) were
74.51%, 95.16%, 96.07% and 98.69%, respectively. Recovery of the internal
standard was 94.2%. The lower recovery for the 0.5 µg mL-1 QC was probably
due to the low concentration and loss of naproxen through non-specific binding
to precipitated protein.
Table 1: Intra-day and Inter-day assays precision and accuracy for naproxen in rat plasma (n = 5)
Nominal concentration
(µg mL-1)
Measured concentration
(µg mL-1)
± S.D. Precision
(CV%)
Accuracy
(%)
Intra-day
0.5 0.467 0.024 5.24 93.5
15 12.99 0.750 5.77 86.7
75 73.71 2.238 3.03 98.3
150 151.62 3.730 2.46 101.1
Inter-day
0.5 0.426 0.060 12.30 98.5
15 13.39 1.302 9.71 89.3
75 70.07 8.683 12.39 93.4
150 149.05 4.281 2.87 99.3
97
3.1.3. Stability
The results of stability of naproxen in rat plasma after three freeze-thaw
cycles and the long term storage are shown in Table 2. There were no significant
changes (-3.37 to +3.36% for freeze-thaw cycles and -2.24 to -10.40% for long
term stability). The samples remained within acceptable limits of precision and
accuracy. These results indicated that naproxen was stable for least 5 days in
rat plasma stored at – 20 ºC and for least 4 months when stored at – 80ºC. In
addition the extracted samples were stable at room temperature for the periods
under which determinations were made, which were 10 and 24 h later (not
shown).This is important because samples can be stored in an auto-sampler at
room temperature until measurement without compromising the concentration of
naproxen.
98
Table 2: Stability of naproxen in rat plasma after three freeze-thaw cycles at – 20 ºC and after long term stability at – 80 ºC (n = 3)
Nominal
concentration (µg mL-1)
Measured concentration (µg mL-1) ± S.D. % Change
Fresh samples Three freeze-thaw cycle
0.5 0.507 ± 0.034 0.501 ± 0.069 - 1.18%
15 14.92 ± 0.85 13.82 ± 0.95 - 7.37%
75 72.57 ± 3.65 75.01 ± 8.29 + 3.36%
150 152.72 ± 6.55 148.29 ± 4.27 - 2.90%
Fresh samples Long term stability
0.5 0.453 ± 0.021 0.417 ± 0.058 - 7.94%
15 14.89 ± 1.44 13.34 ± 1.24 - 10.40%
75 70.23 ± 5.34 68.65 ± 7.96 - 2.24%
150 151.66 ± 9.17 147.58 ± 4.75 - 2.69%
99
3.2 Pharmacokinetic evaluation
In this study, the pharmacokinetic parameters AUCt, AUCinf and Cmax,
Tmax and T1/2 were used to compare the formulations. The results of Cmax and
AUCt were 191.25 ± 11.17 µg.mL-1 and 2438.16 ± 291.34 µg.h.mL-1 for
reference drug, 188.22 ± 24.78 µg.mL-1 and 1755.02 ± 228.90 µg.h.mL-1 for test
1, 160.50 ± 10.58 µg.mL-1 and 1955.28 ± 142.80 µg.h.mL-1 for test 2 (Table 3).
Mean plasma concentrations versus time profiles of naproxen after
administration of two tests and reference formulations in rats (n = 5) are shown
in Fig. 2. The mean plasma concentration-time curve of the formulations were
comparable.
As showed in Table 4, the 90% confidence intervals for geometric mean
ratios of test2/reference for AUCt and Cmax were within the acceptable limits (80
– 125%) of bioequivalence which implies that the bioequivalence criteria were
met [8]. For test1/reference ratio, the result was Cmax 98.41% and AUCt 71.98%.
Table 3: Pharmacokinetic parameters of naproxen after oral administration of naproxen sodium suspension in rat, each value represents the mean ± S.D. (n=5)
Pharmacokinetic
parameters
Reference
suspension
Suspension A
(Test 1)
Suspension D
(Test 2)
AUCt (µg.h.mL-1) 2438.16 ± 291.34 1755.02 ± 228.90 1955.28 ± 142.80
AUCinf (µg.h.mL-1) 2465.97 ± 291.56 1766.93 ± 229.03 1984.10 ± 133.73
Cmax (µg.mL-1) 191.25 ± 11.17 188.22 ± 24.78 160.50 ± 10.58
Tmax(h) 1.00 ± 0.106 1.06 ± 0.092 0.66 ± 0.102
T1/2 (h) 9.98 ± 1.26 5.49 ± 0.50 8.68 ± 1.05
AUCt/AUCinf (%) 98.86 ± 0.327 99.31 ± 0.141 97.75 ± 0.842
100
Figure 2: Mean plasma concentration-time profiles of naproxen in wistar rats (n=5) after oral administration of naproxen sodium suspension: reference versus test 1 (A) and reference versus test 2 (D).
101
Table 4: The ratio of log-transformed values of Cmax and AUCt and the corresponding CI 90%.
Naproxen sodium oral suspension 25 mg mL-1
Pharmacokinetic
parameter
Test 1/Reference (%)
(90% CI)
Test 2/Reference (%)
(90% CI)
Cmax (µg.mL-1)
98.41
(85.63 – 111.19)
83.92
(74.30 – 83.98)
AUCt (µg.h.mL-1)
71.98
(56.13 – 70.82)
80.19
(66.22 – 92.93)
4. Discussion and Conclusions
The bioanalytical method described above was simple and rapid for the
determination of naproxen in rat plasma. A one-step protein precipitation
provided a simple, rapid and economic procedure. Other methods described in
the literature use sophisticated techniques for the quantification of naproxen in
biological matrices, like LC-MS, fluorescence spectroscopy and capillary
electrophoresis [19,21,22,29,31,32,33]. Despite the high sensitivity of these
techniques, there is high cost as well as a lot of time spent with clean up and
extraction of drug. This HPLC analysis method showed excellent precision,
accuracy, stability, specificity and recovery. Therefore, this method was suitable
and applied to monitor the concentration of naproxen in rat plasma.
For comparing the bioavailability between formulations, three groups of
five animals were used for each administered formulation of naproxen sodium
oral suspension. The number of animals was suitable for this pharmacokinetic
study [12].
The peak plasma concentration represents the maximum plasma drug
concentration obtained after oral administration of drug. Cmax provides an
indication that the drug is sufficiently systemically absorbed to provide the
therapeutic response [3]. In the reference and test 1 formulations, Cmax was
achieved within 1 h. This value is consistent with the values previously reported
by other investigators [6,28]. For test 2 formulation, the Tmax was 0.66 h
suggesting that a rapid absorption of naproxen is occurred.
102
The AUCt value of naproxen was more than 80% compared to the value
of AUCinf (%AUCt / AUCinf ratio > 80%, 99.31% for test 1, 97.75% for test 2 and
98.86% for the reference suspension), indicating that the sampling time was
sufficiently long to ensure an adequate description of the absorption phase.
Since the 90% CI for AUCt and Cmax ratio for reference and test 1
formulation were not inside the 80-125% interval proposed by the US Food and
Drug Administration Agency, it suggests that naproxen formulation elaborated
by the compounding pharmacy A was not bioequivalent to the Flanax®
formulation. Nevertheless, the test 2 and reference naproxen sodium oral
suspension were bioequivalent in terms of the rate and extent of absorption in
these conditions. When two formulations of the same drug are bioequivalent in
rate and extent of absorption, it is assumed that they are therapeutically
equivalent [8].
It is important to point out that there is no in vivo monitoring of these
compounded medicines in Brazil. This pitfall can be solved by using this proven
method for quantification of naproxen in rat plasma.
5. Acknowledgment
This work was supported by Brazilian government research grants
(CAPES and CNPq).
103
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107
7 – CONCLUSÃO
108
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo permitiram as seguintes
considerações:
• O método utilizado para o doseamento de suspensões de naproxeno sódico
por CLAE mostrou especificidade, linearidade, precisão e exatidão;
• Das sete suspensões analisadas, observou-se que duas não se apresentaram
de forma homogênea e três tiveram os valores de pH fora das especificações
farmacopéicas;
• Quanto ao teor, quatro suspensões se apresentaram fora das especificações
da Farmacopéia Americana;
• A suspensão referência (Flanax®) e duas suspensões obtidas de farmácias de
manipulação apresentaram resultados satisfatórios em todos os testes de
controle de qualidade físico-químico a que foram submetidas, sendo, portanto,
selecionadas para a segunda etapa do estudo: o ensaio in vivo;
• O método bioanalítico para a determinação de naproxeno em plasma de ratos
foi validado, apresentando especificidade, linearidade, precisão, exatidão,
adequada recuperação e estabilidade.
• Quando comparado os valores de ASCt e ASCinf nos perfis de concentração
plasmática em função do tempo das suspensões, obteve-se um valor acima de
80%, o que indicou um tempo de coleta de plasma suficiente para descrever a
taxa de absorção de cada produto;
• O índice de confiança de 90% para as razões de Cmax e ASCt esteve dentro do
intervalo de 80 – 125% proposto pelo FDA para apenas uma suspensão. Esta,
obtida da farmácia de manipulação D, foi considerada bioequivalente para a
taxa de absorção nas condições propostas por este estudo.
109
8 - REFERÊNCIAS
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ZAKERI-MILANI, P., BARZEGAR-JALALI, M., TAJERZADEH, H., AZARMI, Y.,
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ZOLNER, W.J. A Process Verification Model for Quality Assurance in a
Compounding Pharmacy. International Journal of Pharmaceutical Compounding,
2008; v. 12, n. 3, p. 247.
131
9 - ANEXOS
132
ANEXO I Parecer N°178/2008 – aprovação pelo comitê de ética
em pesquisa da UFRN
133
134
ANEXO II Relatório emitido pelo Galaxie Chromatography Data System
135
136
137
138
139
ANEXO III PDA 2D e 3D View
140
Cromatograma em terceira dimensão do padrão secundário naproxeno (50 µg/mL).
Tempo de retenção 4,24 minutos
Cromatograma em segunda dimensão do padrão secundário naproxeno (50 µg/mL)
Tempo de retenção 4,24 minutos
141
Cromatograma em terceira dimensão de amostra de plasma de rato coletado
após 1 hora da administração da suspensão referência de naproxeno sódico
Cromatograma em segunda dimensão de amostra de plasma de rato coletado
após 1 hora da administração da suspensão referência de naproxeno sódico
142
ANEXO IV Planilhas do software WinNonLin 2.0
143
144
145
146
147
ANEXO V Certificado de análise do padrão secundário naproxeno
148
149
ANEXO VI Certificado de análise do padrão secundário diclofenaco
150
151
ANEXO VII Certificado de análise do solvente acetonitrila grau HPLC
152